CN117250250A - 标示分析物分子的飞行时间质谱分析 - Google Patents

标示分析物分子的飞行时间质谱分析 Download PDF

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Abstract

一种分析标示分析物离子的方法包括：碎裂标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子；使用在第一操作模式下操作的飞行时间质量分析仪来分析这些分析物碎片离子；以及使用在第二操作模式下操作的该飞行时间质量分析仪来分析这些报告离子或这些互补离子。在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进，并且在该第二操作模式下，致使离子沿具有第二长度的飞行路径行进，其中该第二长度大于该第一长度。

Description

标示分析物分子的飞行时间质谱分析
技术领域
本发明涉及分析离子的方法，并且具体地涉及使用飞行时间(ToF)质量分析仪分析标示分析物分子和/或离子的方法。
背景技术
化学标记是用于分析物定量的长期工具，最简单的形式涉及将峰强度与标示已知浓度标准的峰强度进行比较。当多个不同化学标记(诸如多个同位素)可用于不同质量时，可将若干样品一起混合并且在单一高通量、多路复用工作流中分析它们。
该组内的一个重要应用是串联质量标记(TMT)方法(Thompson等人,分析化学(Anal.Chem.)，2003年，第75卷，第1895-1904页)，销售为TMT或iTRAQ(相对定量同量异位标记)。这是一种串联方法，由此多路复用标记肽具有相同的m/z，因此通过液相色谱共洗脱，并且通过四极滤质器共分离。然而，在碎裂后，生成并检测具有不同m/z的特性1,2,6报告离子以进行定量。肽碎片的同时检测允许在同一步骤中进行肽识别。
据信，仍然存在改进分析标示分析物分子的方法的余地。
发明内容
第一方面提供了一种分析标示分析物离子的方法，该方法包括：
碎裂标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子；
使用在第一操作模式下操作的飞行时间质量分析仪来分析该分析物碎片离子，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进；以及
使用在第二操作模式下操作的该飞行时间质量分析仪来分析这些报告离子或这些互补离子，在该第二操作模式下，致使离子沿具有第二长度的飞行路径行进，其中该第二长度大于该第一长度。
实施方案提供了分析标示分析物分子的方法，诸如用同量异位标记(例如“串联质量标记”(TMT)或“相对和绝对定量同量异位标记”(iTRAQ))标示的生物分子。每个标记可包括报告区和平衡区，使得每个标示分析物分子可包括报告区、平衡区和分析物分子。为了分析标示分析物分子，可首先将它们电离以产生标示分析物离子，并且然后碎裂标示分析物离子。当标示分析物离子被碎裂时，报告离子可与分析物分子碎片离子一起产生(其中报告离子是报告区的离子)。附加地或另选地，可产生互补离子(其中互补离子是组合的平衡区和分析物分子的离子)。
在该方法中，使用质量分析仪来分析分析物碎片离子和报告离子或互补离子，即以便确定它们的质荷比(m/z)和/或强度。分析物碎片离子的所得的m/z和/或强度信息可用于识别分析物分子，并且报告离子或互补离子的m/z和/或强度信息可用于对分析物分子定量。
在分析标示分析物分子的常规质谱(MS)方法中，在同一质量分析仪扫描中一起分析分析物碎片离子和报告离子。这可能需要非常高分辨率的质量分析仪，特别是当使用高度多路复用同量异位标记组时，并且特别是在m/z谱的报告离子出现的下端部处。因此，分析标示分析物分子的常规方法通常使用高分辨率静电离子阱质量分析仪(诸如静电轨道阱，并且更具体地，如由Thermo Fisher Scientific制造的OrbitrapTMFT质量分析仪)执行。尽管这些分析仪特别恰当地适于标示分析物分子的分析，但是它们通常以相对慢的重复率操作，特别是当与飞行时间(ToF)质量分析仪相比时。这导致相对慢的实验循环和相对低的通量。
尽管一些常规飞行时间(ToF)质量分析仪可提供足够高的分辨率来分辨分析物碎片离子和报告离子(或互补离子)两者，但此类分析仪是相对复杂的和/或必须具有长的离子飞行路径以便能够在合理空间电荷弹性效应的情况下这样做。
在各种实施方案的方法中，使用飞行时间(ToF)质量分析仪来分析这些分析物碎片离子和这些报告离子(或这些互补离子)，该ToF质量分析仪可在(至少)两个不同的操作模式(即第一操作模式和第二操作模式)下操作，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进，在该第二操作模式下，致使离子沿具有更大第二长度的飞行路径行进。在第二操作模式下增加离子飞行路径的长度具有增加分析仪的分辨率的效应，但减小了可被分析的离子的m/z范围。在通过增加离子穿过离子路径的循环段所采用的穿过次数来实现增加的路径长度的情况(如下文进一步描述)下，这是因为较低m/z的离子可能超越较高m/z的离子(即与之重叠)，使得一些离子(具有在某一明确m/z范围之外的m/z)已经采用的穿过循环段的次数可能变得不确定，从而使得一些峰的m/z变得不确定。附加地或另选地，当以恒定重复率操作分析仪时，对于较长的离子飞行路径长度，特定重复中的高m/z离子在下一重复开始之前将不具有足够的时间到达检测器。第二操作模式因此可称为“缩放”操作模式(因为分析仪实际上在m/z谱的更窄m/z区上“放大”)。
尽管m/z范围的这种损失在分析标示分析物分子的常规方法中将是一个问题(因为感兴趣分析物碎片离子可具有相对高的m/z，而报告离子可具有相对低的m/z)，但是本发明人现在已经认识到通过使用第一操作模式来分析分析物碎片离子并且使用第二操作模式来分析报告离子(或互补离子)，这个问题被规避。这是因为宽m/z范围第一操作模式特别适于分析分析物碎片离子(其通常在相对宽的m/z范围内出现)，并且对应地窄m/z范围但更高分辨率第二(“缩放”)操作模式特别适于分析报告离子(其通常在相对窄的m/z范围内在相对低的m/z处出现)或互补离子。此外，这具有放宽在第一(“正常”)操作模式下的所需分辨率的效应，因为这样的主要原因的事实在于，报告离子(和互补离子)在m/z上非常紧密间隔。
因此，本发明人已经认识到，具有可变路径长度的飞行时间(ToF)质量分析仪特别恰当地适于分析标示分析物分子。使用ToF分析仪来分析标示分析物离子(例如代替静电离子阱分析仪)继而促进增加的仪器重复率和实验吞吐量。因此，应当理解，实施方案提供了分析标示分析物分子的改进方法。
另一方面提供了一种分析标示分析物分子的方法，该方法包括：电离标示分析物分子以产生标示分析物离子，以及使用本文所述的方法来分析这些标示分析物离子。这些方面和实施方案可并且在实施方案中确实包括本文所述的任选特征中的任何一个或多个特征或每个特征。
在各个方面和实施方案中分析的分析物分子可以是用于分析的任何合适的分子，诸如有机分子、生物分子、DNA、RNA、蛋白质、肽、核酸等。在实施方案中，分析物分子是肽。
分析物分子可用一组化学标示物(诸如一组同量异位标记)标示。一组同量异位标记是一组标记分子，该组标记分子具有(近似)相同质量但在标示分析物离子的碎裂后产生具有不同质量的特性报告离子。合适的同量异位标记包括串联质量标记(TMT)和相对和绝对定量同量异位标记(iTRAQ)。每个标记可(至少)包括报告区和平衡区，例如使得每个标示分析物分子(至少)包括报告区、平衡区和分析物分子(例如肽)。实施方案特别适于分析用高度多路复用同量异位标记组(诸如TMT10、16或18)标示的分析物分子，其中报告离子通道之间的最小间距可以是大约几mDa，例如约6mDa。实施方案还可用于较低多路复用同量异位标记组(诸如TMT6和8)，其具有大约1Da的报告离子通道间距。
该方法可使用分析仪器诸如质谱仪来执行。该分析仪器可(至少)包括离子源、滤质器、碎裂装置和飞行时间质量分析仪(如下文进一步详细描述)。该分析仪器可包括耦接到离子源的分离装置。
可在溶液中提供标示分析物分子，可使用分离装置分离溶液，并且可将所分离溶液提供到离子源以进行电离。离子源可电离标示分析物分子以产生标示分析物离子。
标示分析物离子最初可由在MS1操作模式下操作的仪器分析，以便提供MS1数据。MS1数据可包括一个或多个离子峰，其中每个离子峰对应于具有特定m/z(即特定前体)的标示分析物离子。
标示分析物离子可然后由在MS2操作模式下操作的仪器进行分析，以便提供MS2数据。从MS1数据识别的每个感兴趣前体可用于限定滤质器的m/z窗口。滤质器可然后顺序地步进通过每个m/z窗口，以便顺序地选择每个感兴趣前体。碎裂装置可在碎裂操作模式下操作，使得经质量过滤标示分析物离子被碎裂。当标示分析物离子被碎裂时，报告离子可与分析物分子碎片离子一起产生(其中报告离子是报告区的离子)。附加地或另选地，可产生互补离子(其中互补离子是组合的平衡区和分析物分子的离子)。
然后使用飞行时间分析仪来分析所得的分析物碎片离子和报告离子或互补离子。分析物碎片离子的所得的质荷比(m/z)和/或强度信息可用于识别分析物分子，并且报告离子或互补离子的质荷比(m/z)和/或强度信息可用于对分析物分子定量。
使用第一操作模式来分析分析物碎片离子，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进，并且使用第二操作模式来分析报告离子或互补离子，在该第二操作模式下，致使离子沿具有更大第二长度的飞行路径行进。
该飞行时间质量分析仪可包括一个或多个离子反射器。在该第一操作模式下，可致使离子在该一个或多个离子反射器中进行n个反射，其中n是≥0的整数。在该第二操作模式下，可致使离子在该一个或多个离子反射器中进行m个反射，其中m是>n的整数。一般来讲，“离子反射器”可以是例如离子镜、反射器、离子偏转器、透镜或类似物。
该飞行时间质量分析仪可以是多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，该MR-ToF质量分析仪包括：
两个离子镜，该两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，漂移方向Y与第一方向X正交；
离子注入器，该离子注入器用于将离子注入离子镜之间的空间中，离子注入器被定位为接近离子镜的第一端部；和
检测器，该检测器用于在离子已经在这些离子镜之间完成多个反射之后检测这些离子，该检测器被定位为接近这些离子镜的该第一端部。
使用在该第一操作模式下操作的该分析仪来分析分析物碎片离子可包括：
将分析物碎片离子从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到这些离子镜的该第一端部；以及然后致使这些离子行进到该检测器以进行检测。
使用在该第二操作模式下操作的该分析仪来分析报告离子或互补离子可包括：
(i)将报告离子或互补离子从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子完成第一循环，在该第一循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)
沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第一端部往回漂移；
(ii)接近这些离子镜的该第一端部反转这些离子的该漂移方向速度，使得致使这些离子完成另外的循环，在该另外的循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，
(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第一端部往回漂移；
(iii)任选地重复步骤(ii)一次或多次；以及然后
(iv)致使这些离子行进到该检测器以进行检测。
该多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪可还包括被定位为接近这些离子镜的该第一端部的偏转器或透镜。该偏转器或透镜可在第一离子镜与第二离子镜之间(在X方向上)近似等距地定位。该偏转器或透镜可沿离子路径布置在离子束从注入器注入之后所经历的第一离子镜反射(在第一离子镜中)之后，但在离子束的第二离子镜反射(在第二离子镜中)之前。对应地，该偏转器或透镜可沿离子路径布置在离子束在到达检测器之前所经历的最终离子镜反射(在第二离子镜中)之前，但在离子束的倒数第二离子镜反射(在第一离子镜中)之后。
使用在该第一操作模式下操作的该分析仪来分析分析物碎片离子可包括：
将分析物碎片离子从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；以及然后致使这些离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测。
使用在该第二操作模式下操作的该分析仪来分析报告离子或互补离子可包括：
(i)将报告离子和互补离子从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子完成第一循环，在该第一循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(ii)使用该偏转器或透镜来反转这些离子的该漂移方向速度，使得致使这些离子完成另外的循环，在该另外的循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，
以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(iii)任选地重复步骤(ii)一次或多次；以及然后
(iv)致使这些离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测。
该多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪可包括任何合适类型的MR-ToF。例如，分析仪可包括具有一组周期性透镜的MR-ToF，该组周期性透镜被配置为保持离子束沿其飞行路径聚焦，例如如在文章A(Verenchikov等人，应用溶液化学与建模杂志(Journal ofApplied Solution Chemistry and Modelling)，2017年，第6卷，第1-22页)中所述。
然而，在特定实施方案中，分析仪为例如美国专利号9,136,101中描述的类型的倾斜镜型多反射飞行时间质量分析仪，该美国专利的内容以引用的方式并入本文。因此，这些离子镜可沿其在漂移方向Y上的长度的至少一部分、大多数或所有长度在X方向上彼此相距非恒定距离。离子朝向离子镜的第二端部的漂移方向速度可以与由两个离子镜彼此相距的非恒定距离产生的电场相对。该电场可致使离子接近离子镜的第二端部反转离子的漂移方向速度并且沿漂移方向朝向偏转器往回漂移。
另选地，分析仪可为例如英国专利号2,580,089中描述的类型的单聚焦透镜型多反射飞行时间质量分析仪，该英国专利的内容以引用的方式并入本文。因此，偏转器可以为第一偏转器，并且分析仪可以包括被定位为接近离子镜的第二端部的第二偏转器。该第二偏转器可被配置为致使离子接近离子镜的第二端部反转离子的漂移方向速度并且沿漂移方向朝向第一偏转器往回漂移。为此，可以例如以英国专利号2,580,089中描述的方式将合适的电压施加到第二偏转器。
分析分析物碎片离子的步骤可包括：例如通过将每个第一离子包注入ToF分析仪中分析一个或多个第一离子包。分析报告离子或互补离子的步骤可包括：例如通过将每个第二离子包注入ToF分析仪中分析一个或多个不同的第二离子包。因此，对于每个感兴趣前体，分析仪可执行两次(或多次)扫描，即使得使用与报告离子或互补离子不同的分析仪扫描来分析分析物碎片离子。
在这些实施方案中，每个第一离子包可仅包括分析物碎片离子，或者可包括分析物碎片离子连同报告离子和/或互补离子。在第一离子包包括报告离子和/或互补离子的情况下，这些离子可任选地由偏转器偏转，使得它们不到达检测器(而所有分析物碎片离子中的大多数分析物碎片离子确实到达检测器)。每个第二离子包可仅包括报告离子和/或互补离子，或者可包括报告离子和/或互补离子连同分析物碎片离子。在第二离子包包括分析物碎片离子的情况下，这些离子可任选地由偏转器偏转，使得它们不到达检测器(而所有报告离子或互补离子中的大多数离子确实到达检测器)。
该方法可包括：使用第一组一个或多个仪器参数来生成和/或处理和/或分析每个第一离子包，以及使用不同的第二组一个或多个仪器参数来生成和/或处理和/或分析每个第二离子包。该第一组一个或多个仪器参数可被配置为：当生成和/或处理和/或分析分析物碎片离子(相对于报告离子或互补离子)时提供改进的灵敏度和/或分辨率，并且该第二组一个或多个仪器参数可被配置为：当生成和/或处理和/或分析报告离子或互补离子(相对于分析物碎片离子)时提供改进的灵敏度和/或分辨率。
该组一个或多个仪器参数可包括，例如，施加到该仪器的部件中的任何一个或多个部件的一个或多个(RF或DC)电压，诸如例如：离子源、离子入口、任何一个或多个离子转移装置、滤质器、碎裂装置、和/或分析仪(例如，其离子注入器、离子反射器、和/或检测器)等。在特定实施方案中，该组一个或多个仪器参数包括：(i)碎裂装置的一个或多个碎裂参数，诸如碰撞能量；和/或(ii)滤质器的透射窗口的宽度。
因此，例如，该方法可包括：使用第一滤质器透射窗口宽度来生成每个第一离子包(即其中滤质器用于选择被碎裂的特定感兴趣前体，并且其中所得的碎片离子用于形成每个第一离子包)；以及使用不同的第二滤质器透射窗口宽度来生成每个第二离子包(即其中滤质器用于选择被碎裂的特定感兴趣前体，并且其中所得的碎片离子用于形成每个第二离子包)，例如其中第一滤质器透射窗口宽度宽于第二滤质器透射窗口宽度。使用较宽的滤质器透射窗口宽度有益地为分析物碎片离子的分析提供增加的灵敏度，而使用较窄的滤质器透射窗口宽度有益地减少对报告离子或互补离子的分析的干扰。第一滤质器透射窗口宽度可替代地窄于第二滤质器透射窗口宽度。
该方法可包括：使用一个或多个第一碎裂参数(诸如第一碰撞能量)来生成每个第一离子包(即其中使用该一个或多个第一碎裂参数(诸如第一碰撞能量)来碎裂特定感兴趣前体，并且其中所得的碎片离子用于形成每个第一离子包)；以及使用一个或多个第二碎裂参数(诸如不同的第二碰撞能量)来生成每个第二离子包(即其中使用一个或多个第二碎裂参数(诸如第二碰撞能量)来碎裂特定感兴趣前体，并且其中所得的碎片离子用于形成每个第二离子包)。一个或多个第一碎裂参数(诸如第一碰撞能量)可被配置为有效地产生分析物碎片离子(相对于报告离子或互补离子)，并且一个或多个第二碎裂参数(诸如第二碰撞能量)可被配置为有效地产生报告离子或互补离子(相对于分析物碎片离子)。较高的碰撞能量通常有益于生成低m/z碎片离子，诸如报告离子，而较低的碰撞能量通常有益于生成中等范围或高m/z碎片离子，诸如分析物碎片离子。因此，第一碰撞能量例如在生成和分析报告离子的情况下可低于第二碰撞能量。另一方面，与用于生成分析物碎片离子的碰撞能量相比，相对较低的碰撞能量通常用于生成互补离子。因此，第一碰撞能量例如在生成和分析互补离子的情况下可高于第二碰撞能量。
在另选实施方案中，分析分析物碎片离子和分析报告离子或互补离子的步骤可包括：例如通过将每个离子包注入ToF分析仪中分析一个或多个单个离子包。因此，对于每个感兴趣前体，分析仪可执行单次扫描，即使得使用与报告离子或互补离子相同的扫描来分析分析物碎片离子。在这些实施方案中，每个离子包可包括分析物碎片离子连同报告离子和/或互补离子。
该分析仪可包括：离子路径，该离子路径包括循环段；离子注入器，该离子注入器用于将离子注入该离子路径中；至少一个离子反射器，该至少一个离子反射器沿该离子路径布置；和检测器，该检测器布置在该离子路径的该端部处。
该方法可包括：
(i)将包括分析物碎片离子和报告离子或互补离子的离子包从该离子注入器注入该离子路径中，使得这些分析物碎片离子和这些报告离子或这些互补离子两者沿该离子路径行进到该离子反射器；
(ii)致使(仅)这些分析物碎片离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该离子反射器来致使(仅)这些报告离子或这些互补离子沿该离子路径的该循环段完成一个或多个循环；以及然后
(iv)致使这些报告离子或这些互补离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测。
该方法可包括：
(i)将包括分析物碎片离子和报告离子或互补离子的离子包从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子完成第一循环，在该第一循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(ii)致使(仅)这些分析物碎片离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该偏转器或透镜来反转(仅)这些报告离子或这些互补离子的该漂移方向速度，使得致使这些离子完成另外的循环，在该另外的循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(iv)任选地重复步骤(iii)一次或多次；以及然后
(v)致使这些报告离子或这些互补离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测。
根据另一个方面，提供了一种操作飞行时间(ToF)质量分析仪的方法，该ToF质量分析仪包括：
离子路径，该离子路径包括循环段；
离子注入器，该离子注入器用于将离子注入该离子路径中；
至少一个离子反射器，该至少一个离子反射器沿该离子路径布置；和
检测器，该检测器布置在该离子路径的该端部处；
该方法包括：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从该离子注入器注入该离子路径中，使得这些第一离子和这些第二离子沿该离子路径行进到该离子反射器；
(ii)致使(仅)这些第一离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该离子反射器来致使(仅)这些第二离子沿该离子路径的该循环段完成一个或多个(例如另外的)循环；以及然后
(iv)致使这些第二离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测。
这些方面和实施方案可并且在实施方案中确实包括本文所述的任选特征中的任何一个或多个特征或每个特征。
在这些方面和实施方案中，该ToF分析仪可以是循环分析仪。该离子路径包括循环段，其中离子可当沿该离子路径从该离子注入器行进到该检测器时零次或多次(重复)穿过该循环段。例如，该离子路径可包括第一非循环段、布置在该第一非循环段下游的循环段、以及布置在该循环段下游的第二非循环段。该ToF分析仪包括沿该离子路径布置的至少一个离子反射器，诸如偏转器。该离子反射器可用于例如通过合适地向离子反射器施加(例如脉冲)电压致使离子沿该离子路径的该循环段完成一个或多个(另外的)循环。
在该方法中，将包括第一离子和第二离子的离子包注入该离子路径中，使得这些离子沿该离子路径行进到该离子反射器。在到达该离子反射器之前，这些第一离子和这些第二离子可沿循相同的离子路径，并且可零次或一次或多次穿过离子路径的循环段。然后，致使(仅)这些第一离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测，而该离子反射器用于在致使这些离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测之前致使(仅)这些第二离子沿该离子路径的该循环段完成一个或多个(例如，另外的)循环。这可通过以合适的定时合适地脉冲调制施加到该离子反射器的电压的幅值来完成，使得致使仅这些第二离子完成一个或多个(例如，另外的)循环，而这些第一离子未完成。
这些第一离子可以是具有在第一相对宽范围内的m/z的离子。这些第二离子可以是具有在不同的第二相对窄范围内的m/z的离子。该第二范围可与该第一范围重叠并且可被该第一范围涵盖。
根据另一个方面，提供了一种操作多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪的方法，该MR-ToF质量分析仪包括：
两个离子镜，该两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，漂移方向Y与第一方向X正交；
离子注入器，该离子注入器用于将离子注入离子镜之间的空间中，离子注入器被定位为接近离子镜的第一端部；
检测器，该检测器用于在离子已经在离子镜之间完成多个反射之后检测该离子，检测器被定位为接近离子镜的第一端部；和
偏转器或透镜，该偏转器或透镜被定位为接近这些离子镜的该第一端部；
该方法包括：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子完成第一循环，在该第一循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(ii)致使(仅)这些第一离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该偏转器或透镜来反转这些第二离子的该漂移方向速度，使得致使(仅)这些第二离子完成另外的循环，在该另外的循环中，这些第二离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(iv)任选地重复步骤(iii)一次或多次；以及然后
(v)致使这些第二离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测。
这些方面和实施方案可并且在实施方案中确实包括本文所述的任选特征中的任何一个或多个特征或每个特征。
另外方面提供了一种存储计算机软件代码的非暂时性计算机可读存储介质，该计算机软件代码当在处理器上执行时，执行上述方法。
另一方面提供了一种用于分析仪器诸如质谱仪的控制系统，该控制系统被配置为致使该分析仪器执行上文所描述的方法。
另一方面提供了一种分析仪器，例如质谱仪，其包括上文所描述的控制系统。
另一方面提供了一种分析仪器，例如质谱仪，其包括：
碎裂装置；
飞行时间(ToF)质量分析仪，该ToF质量分析仪能够在第一操作模式和第二操作模式下操作，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进，在该第二操作模式下，致使离子沿具有第二长度的飞行路径行进，其中该第二长度大于该第一长度；和
控制系统，该控制系统被配置为当该仪器用于分析标示分析物离子时：
致使该碎裂装置碎裂这些标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子；
致使该飞行时间质量分析仪使用该第一操作模式来分析该分析物碎片离子；以及
致使该飞行时间质量分析仪使用该第二操作模式来分析这些报告离子或这些互补离子。
另一方面提供了一种飞行时间(ToF)质量分析仪，该ToF质量分析仪包括：
离子路径，该离子路径包括循环段；
离子注入器，该离子注入器用于将离子注入该离子路径中；
至少一个离子反射器，该至少一个离子反射器沿该离子路径布置；和
检测器，该检测器布置在该离子路径的该端部处；
其中该分析仪被配置为通过以下方式分析离子：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从该离子注入器注入该离子路径中，使得这些第一离子和这些第二离子沿该离子路径行进到该离子反射器；
(ii)致使(仅)这些第一离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该离子反射器来致使(仅)这些第二离子沿该离子路径的该循环段完成一个或多个(例如另外的)循环；以及然后
(iv)致使这些第二离子从该离子反射器行进到该检测器以进行检测。
另一方面提供了一种多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，该MR-ToF质量分析仪包括：
两个离子镜，该两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，漂移方向Y与第一方向X正交；
离子注入器，该离子注入器用于将离子注入离子镜之间的空间中，
离子注入器被定位为接近离子镜的第一端部；
检测器，该检测器用于在离子已经在离子镜之间完成多个反射之后检测该离子，检测器被定位为接近离子镜的第一端部；和
偏转器或透镜，该偏转器或透镜被定位为接近这些离子镜的该第一
端部；并且其中该分析仪被配置为通过以下方式分析离子：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从该离子注入器注入这些离子镜之间的该空间中，其中这些离子完成第一循环，在该第一循环中，这些离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(ii)致使(仅)这些第一离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测；
(iii)使用该偏转器或透镜来反转这些第二离子的该漂移方向速度，使得致使(仅)这些第二离子完成另外的循环，在该另外的循环中，这些第二离子沿循在该方向X上在这些离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从该偏转器或透镜沿该漂移方向Y朝向这些离子镜的该第二端部漂移，(b)接近这些离子镜的该第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿该漂移方向Y往回漂移到该偏转器或透镜；
(iv)任选地重复步骤(iii)一次或多次；以及然后
(v)致使这些第二离子从该偏转器或透镜行进到该检测器以进行检测。
另一方面提供了一种分析仪器，诸如质谱仪，其包括上述飞行时间(ToF)质量分析仪或多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪。
这些方面和实施方案可并且在实施方案中确实包括本文所述的任选特征中的任何一个或多个特征或每个特征。
附图说明
现在将参考附图更详细地描述各个实施方案，其中：
图1示意性地示出了基础TMT C8H16N+报告离子，其中m/z为126；
图2示意性地示出了根据实施方案的分析仪器；
图3示意性地示出了根据实施方案的分析仪器；
图4示意性地示出了根据实施方案的多反射飞行时间质量分析仪；
图5示意性地示出了根据实施方案的多反射飞行时间质量分析仪；
图6示意性地示出了根据实施方案的操作多反射飞行时间质量分析仪的方法；
图7示出了根据实施方案的DDA方法；
图8示出了根据实施方案的具有TMT报告离子的5倍缩放和未缩放的肽碎片离子的方法；
图9示出了根据实施方案的DDA方法；
图10A示出了多反射飞行时间质量分析仪的常规单次穿过操作模式的分辨率对离子数的曲线图，并且图10B示出了多反射飞行时间质量分析仪的3倍缩放操作模式的分辨率对离子数的曲线图；并且
图11示出了分辨率和信号对穿过多反射飞行时间质量分析仪的次数的曲线图。
具体实施方式
化学标记是用于分析物定量的长期工具，最简单的形式涉及将峰强度与标示已知浓度标准的峰强度进行比较。当多个不同化学标记(诸如多个同位素)可用于不同质量时，可将若干样品一起混合并且在单一高通量、多路复用工作流中分析它们。
该组内的一个重要应用是串联质量标记(TMT)方法(Thompson等人,分析化学，2003年，第75卷，第1895-1904页)，销售为TMT或iTRAQ(相对定量同量异位标记)。这是一种串联方法，由此多路复用标记肽具有相同的m/z，因此通过液相色谱共洗脱，并且通过四极滤质器共分离。然而，在碎裂后，生成并检测具有不同m/z的特性1,2,6报告离子以进行定量。肽碎片的同时检测允许在同一步骤中进行肽识别。该方法的一大优点在于因多路复用水平的因素简化了全质谱和共分离的灵敏度。
TMT 6-plex的早期商业具体实施如图1所示产生m/z从126至131的报告离子，其中通过用13C取代生成的同位素质量分离。最新的进展是10-plex方法，该方法添加用15N取代氮，相对于仅13C报告物产生微小的6.32mDa质量缺陷，使可访问取代标记的数量倍增，并且将报告区分成一系列同量异位双体(McAlister等人，分析化学，2012年，第84卷，第7469-7478页)。还已经证实甚至更高水平的多路复用诸如18-plex。
然而，该方法存在特性缺点。共分离的同量异位肽之间的干扰可污染报告离子通道，从而阻碍准确定量并且阻止具有较短、分离较差的LC梯度的快速实验循环。可使用附加分离和碎裂级(MS3)来去除干扰，但是这也影响速度和灵敏度。由专门飞行时间(ToF)仪器提供的高分辨率分离将是更优化的解决方案，特别是在利用四极分离按顺序应用的情况下。
第二个问题在于10-plex且更大型方法的报告离子双体在m/z 127下需要约50K分辨率来区分和测量。这超出了大多数飞行时间(ToF)分析仪设计的范围，并且对能够实现这种分辨率的先进ToF分析仪施加严格的、空间电荷相关的动态范围限制。
迄今为止，TMT 10-plex方法已经在OrbitrapTMFT仪器上运行，这些仪器善于在低m/z处实现高分辨率。然而，实现这种分辨率所需的采集时间限制了采集速率并且限制了测量的数量。在OrbitrapTM分析仪的情况下，改进的数据处理方法诸如Phi-SDM已经用于迅速地极大提高分辨率(Bekker-Jenson等人，分子与细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)，2020年，第14卷，第716-729页)空间电荷效应也可引起OrbitrapTM仪器中的报告离子双体的合并/聚结，尽管这需要通常受自动增益控制(AGC)程序限制的高离子负载(Werner等人，分析化学，2014年，第86卷，第3594-3601页)。
TMT方法的一个重要改进是TMT互补离子定量(Johnson等人，蛋白质组研究杂志(J.Proteome Res.)，2021年，第20卷，第3043-3052页)。这里，不是从报告离子定量，而是以低断裂能生成减去报告离子的标记肽并对其进行测量。在报告物分离后，标记仍包含“平衡”组分，其通常用于平衡所有标记离子的质量，但在无报告组分的情况下，这形成互补离子通道的镜像分布。这些通道可具有类似于报告离子分布的相对强度，并且因此可用于定量。一个优点在于，因为它们仍然附接有原始肽，所以它们对来自共分离肽的干扰更稳健。然而，成本在于，由于互补离子比报告物重得多，但通道之间具有相同的质量差异，因此需要高得多的分辨率来分辨通道。迄今为止，此过程已经限于具有1Da间距的8通道TMT方法，而通常需要50K分辨率的等效16通道间距在应用于重10倍的离子的情况下可能无疑需要500K。
少数飞行时间(ToF)分析仪实现足够的分辨率以与更高的TMT多路复用方法相容。此类分析仪中的分辨率通常受离子飞行路径的长度以及由离子到达检测器的到达时间范围和检测器的自身时间响应两者产生的峰宽度限制。后一种固定响应在分析仪分辨率中形成质量依赖性，并且阻碍诸如TMT报告区的低m/z测量(与OrbitrapTM分析仪相反的趋势)。
常规ToF分析仪通常并入离子注入装置诸如正交加速器或提取阱、检测器和用于将离子聚焦到检测器表面的离子镜。它们通常还可包括在离子源之后的透镜或偏转器，其被配置为适当地使射束成形和引导射束。
由Wollnik(DE3025764C2)引入具有极高分辨率的更先进的ToF分析仪，该ToF分析仪并入一对离子镜，在该对离子镜之间，所捕获离子在被释放到检测器之前可经历多次振荡。该系统的缺点在于，因为较轻的离子超越较重的离子/与之重叠，所以质量分析变得极其复杂。一般来讲，以限制质量范围为代价、经由增加停留时间来增加目标离子的分辨率可称为“放大”。
Nazarenki(SU1725289)的离子镜的伸长产生了“开放阱”或“多反射飞行时间(MR-ToF)”分析仪，其具有消除重叠问题的固定Z字形飞行路径。Verentchikov通过在镜之间并入合周期性透镜来进行改进和商业化，这些周期性透镜定期校正与离子振荡正交的离子分散(英国专利号2,403,063)。
Sudakov(WO2008/047891)、Stewart(美国专利号10,964,520)以及最值得注意的Grinfeld(美国专利号9,136,101)已经提出了控制这种离子分散的后续方法。后一种方法涉及轻微倾斜离子镜，使得在所注入离子在所伸长镜之间在漂移方向上漂移时允许所注入离子扩展。在每次穿过倾斜镜和支撑带状电极的情况下，离子往回偏转，最终使它们的漂移速度完全反转并且聚焦到在镜系统的起始侧处的检测器上。该分析仪的示意图在图4中示出(并且在下面更详细地描述)。
此类分析仪能够分辨TMT报告物，但在合理空间电荷弹性的情况下这样做必须相对大(约1m2)。因为峰的基线分辨率由于拖尾或其他效应而较不容易实现，所以双体中的两个峰的可检测比率仍可能受到限制。
覆盖这一大类分析仪的特殊操作模式先前由Verenchikov等人报告，称为“缩放模式”(Verenchikov等人，应用溶液化学与建模杂志，2017年，第6卷，第1-22页)。这里，早期放置在离子路径中的偏转器可切换到捕获电压，从而迫使离子沿镜经历多次上下穿过，每次包含镜之间的相同数量的振荡。因此，飞行路径的极大延伸展示了高达500,000的极大增大的分辨率，但顾名思义，诱导质量范围的严重损失。
本文所述的实施方案解决了分辨并因此对TMT报告双体或类似同量异位碎片标记内的峰准确定量的困难，特别是在应用于多反射飞行时间(MR-ToF)分析仪(和其他ToF分析仪)时。
如上所述，OrbitrapTM仪器通常用于TMT方法，但这些仪器可一定程度地遭受以如此高分辨率操作所需的缓慢重复率。这也迫使发生较慢的实验循环和较低的通量，尽管不总是清楚是这种情况还是因共洗脱和共分离肽造成的前体目标的污染占主要因素。
大多数ToF分析仪分辨能力太差以至于根本无法与更高的多路复用TMT方法相容，并且甚至相对大的MR-ToF系统也可能难以在更高的离子负载下维持该分辨率，从而限制了动态范围和可表征的双体峰的比率。诸如正交加速器的高重复率注入装置降低了每发空间电荷负担，但与提取阱相比，这些可带来相当大的灵敏度成本，并且可需要具有去卷积(诸如经由编码的频繁脉冲调制)的先进操作方法来使此类源与多反射ToF分析仪的长飞行时间相容。耐受空间电荷的分析仪(诸如图4中所描绘的倾斜镜分析仪)可与这些方法相容，但仍期望改进的性能。
因此，特定实施方案涉及改进多反射飞行时间(MR-ToF)分析仪对用于定量的TMT报告离子的分辨率和空间电荷弹性并因此改进其动态范围，其中对用于识别的肽碎片具有最小影响。
根据本文所述的实施方案，缩放模式仅用于TMT报告(或互补)离子，并且规则操作模式例如在数据依赖性TMT方法内用于肽碎片识别。如下面更详细描述，报告离子(或互补离子)和碎片离子可在单独的扫描中或在单次合并扫描中进行分析。缩放模式使TMT报告物的可实现的分辨率倍增，并且因此还改进了分析仪的空间电荷弹性和动态范围。
图2示意性地示出了可用于根据实施方案执行方法的分析仪器，诸如质谱仪。如图2所示，分析仪器包括离子源10、滤质器20、碎裂装置30和飞行时间(ToF)质量分析仪40。
离子源10被配置为从样品中生成离子。离子源10可耦接到分离装置，诸如液相色谱分离装置或毛细管电泳分离装置(未示出)，使得在离子源10中离子化的样本来自分离装置。离子源10可以是任何合适的离子源，诸如与分离装置相容的离子源。在实施方案中，离子源10是电喷雾电离(ESI)离子源、大气压电离(API)离子源、化学电离离子源、电子碰撞(EI)离子源或类似物。
滤质器20布置在离子源10下游，并且可被配置为从离子源10接收离子。滤质器20可被配置为根据离子的质荷比(m/z)来过滤所接收离子，例如使得仅m/z窗口内的离子由滤质器20向前透射，而滤质器的m/z窗口之外的离子由滤质器20拒绝并且不向前透射。滤质器的透射窗口的m/z宽度和中心m/z例如通过合适地控制施加到滤质器20的RF和DC电压是可控的(可变的)。因此，例如，滤质器可能够在一种透射操作模式下操作，由此在相对宽的m/z窗口内的大多数或所有离子由滤质器20向前透射，并且可能够在过滤操作模式下操作，由此仅在相对窄的m/z窗口(以期望m/z为中心)内的离子由滤质器20向前透射。滤质器20可以是任何合适类型的滤质器，诸如四极滤质器。
碎裂装置30布置在滤质器20下游，并且可被配置为接收由滤质器20透射的大多数或所有离子。碎裂装置30可被配置为选择性地碎裂所接收离子中的一些或所有离子，即以便产生碎片离子。碎裂装置30可能够在碎裂操作模式下操作，由此大部分或所有所接收离子被碎裂以便产生碎片离子(其然后可从碎裂装置30向前透射)，并且可能够在非碎裂操作模式下操作，由此大部分或所有所接收离子被向前透射而未被(有意地)碎裂。还可能通过致使
离子绕过碎裂装置30实现非碎裂操作模式。碎裂装置30还可能够在一个或多个中间操作模式下操作，例如由此碎裂程度是可控的(可变的)。碎裂装置30还可能够在更高阶(MSN)碎裂操作模式下操作，例如由此碎片离子由碎裂装置30进一步碎裂一次或多次。
碎裂装置30可以是可用于碎裂标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子的任何合适类型的碎裂装置，诸如例如碰撞诱导解离(CID)碎裂装置、电子诱导解离(EID)碎裂装置、光解离碎裂装置等。许多其他类型的碎裂是可能的。
在实施方案中，碎裂装置30是碰撞诱导解离(CID)碎裂装置。因此，碎裂装置可包括可填充有例如维持处于相对高压力的碰撞气体的碰撞池。可通过控制(改变)致使离子进入碰撞池的动能在碰撞池中选择性地碎裂离子。在碎裂操作模式下，可使离子加速，使得它们以相对高的动能进入碰撞池，这可致使所加速离子中的大多数或所有离子碎裂。在非碎裂操作模式下，可致使离子以相对低的动能进入碰撞池，这可能不足以致使离子中的大多数或所有离子碎裂。在中间模式下，可致使离子以中间动能进入碰撞池。
ToF分析仪40可布置在碎裂装置30下游，并且可被配置为接收从碎裂装置30向前透射的大多数或所有离子。该仪器还可能被配置成使得：例如如果仪器被配置成使得在非碎裂操作模式下致使离子绕过碎裂装置30，ToF分析仪40可从滤质器20接收离子。因此，一般来讲，ToF分析仪40可被配置为从仪器的各种上游级接收离子，这些离子可包括未碎裂的(“前体”或“母体”)离子、碎片(“产品”或“子体”)离子、碎裂的碎片(“孙体”)离子等。
ToF分析仪40被配置为分析所接收离子以便确定它们的质荷比(m/z)。为此，ToF分析仪40被配置为使离子沿分析仪40的漂移区(其中漂移区被维持处于高真空(例如<1×10- 5mbar))内的离子路径穿过，并且测量离子沿离子路径穿过所花费的时间(漂移时间)。离子可通过电场加速进入漂移区，并且可由布置在离子路径端部处的离子检测器检测。加速可致使具有相对低的m/z的离子实现相对高的速度，并在具有相对高的m/z的离子之前到达离子检测器。因此，离子在由它们的速度和离子路径的长度确定的时间之后到达离子检测器，这使得能够确定离子的m/z。到达检测器的每个离子或离子组可被检测器采样，并且来自检测器的信号可被数字化。处理器然后可确定指示离子或离子组的飞行时间和/或m/z的值。可收集和组合针对多个离子的数据，以生成飞行时间(“ToF”)谱和/或质谱。
ToF质量分析仪40可以是任何合适的ToF分析仪。一般来讲，ToF分析仪40可包括布置在离子路径起点处的离子注入器和布置在离子路径终点处的离子检测器。分析仪40可被配置为通过确定离子在检测器处的到达时间(即，离子从注入器行进并经由离子路径到达检测器所花费的时间)来分析离子。
离子注入器可以是任何合适的形式，诸如例如一个或多个(例如，正交的)加速电极。然而，在特定实施方案中，离子注入器包括离子阱。离子阱可被配置为(从碎裂装置30)接收离子，并且可被配置为例如通过在积累时间段期间积累离子来积累离子包。离子阱可被配置为(例如，通过使离子包沿离子路径加速)将每个所积累离子包注入离子路径，于是包的离子可沿离子路径行进到检测器。
检测器可以是任何合适的离子检测器，诸如一个或多个转换倍增电极，任选地然后一个或多个电子倍增器、一个或多个闪烁器和/或一个或多个光子倍增器等。检测器可被配置为检测在检测器处接收的离子，并且可被配置为产生指示在检测器处接收的离子强度作为(到达)时间的函数的信号。然后可根据所测量到达时间确定离子的m/z。
离子路径可具有任何合适的形式，诸如在线性ToF分析仪的情况下是线性的，或者在包括反射或多反射飞行时间(MR-ToF)分析仪的ToF分析仪的情况下包括一个或多个反射器。离子路径可包括循环段。
在特定实施方案中，分析仪40是多反射飞行时间(MR-ToF)分析仪。因此，分析仪40可包括两个离子镜，该两个离子镜
在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，该漂移方向Y与该第一方向X正交。离子注入器可被定位为接近离子镜的第一端部，并且可被配置为将离子注入离子镜之间的空间中。检测器可被定位为接近离子镜的第一端部，并且可被配置为在离子已经完成离子镜之间的多个反射之后检测离子。分析以可被配置为通过将离子从离子注入器注入离子镜之间的空间中分析离子，于是离子可采用在方向X上在离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿漂移方向Y朝向离子镜的第二端部漂移，(b)接近离子镜的第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿漂移方向Y朝向离子镜的第一端部往回漂移。然后可致使离子行进到检测器以进行检测。
应当注意的是，图2仅是示意性的，并且分析仪器可并且在实施方案中确实包括任何数量的一个或多个附加部件。例如，仪器将典型地包括一个或多个离子转移级，该一个或多个离子转移级布置在各种示出的部件10、20、30、40之间并且被配置为将离子从一个部件转移到下一个部件。一个或多个离子转移级可包括一个或多个离子导向器、透镜和/或其他离子光学装置的任何合适的布置。
如图2所示，仪器可在控制单元50(诸如适当编程的计算机)的控制下，该控制单元可被配置为控制仪器的各种部件(包括滤质器20、碎裂装置30和分析仪40)的操作，例如以便致使仪器在特定操作模式下操作和/或执行本文所述的方法。根据本文所述的实施方案，控制单元50还可接收和处理来自各种部件的数据(例如包括来自分析仪40等的质谱数据)。
仪器可能够在各种操作模式(包括MS1操作模式和MS2操作模式)下操作。
在MS1(或“全质量扫描”)操作模式下，滤质器20在其透射操作模式下操作，并且碎裂装置30在其非碎裂操作模式下操作，例如使得未碎裂的(“前体”或“母体”)离子的宽m/z范围(例如全质量范围)由分析仪40分析。
在MS2操作模式下，滤质器20在其过滤操作模式下操作，并且碎裂装置30在其碎裂操作模式下操作，例如使得所选择窄m/z范围的前体离子被碎裂并且所得的碎片(“产品”或“子体”)离子由分析仪40分析。在MS2操作模式下，滤质器的(窄)m/z窗口的中心可在多个不同m/z值中的每个m/z值之间顺序地改变，例如以便顺序地选择(并且碎裂)具有相应不同m/z的多个不同前体离子中的每个前体离子。在数据依赖性采集(DDA)MS2操作模式下，多个不同m/z值可对应于从对应MS1数据识别的多个不同前体离子(即，全质量扫描)。在数据独立性采集(DIA)MS2操作模式下，多个不同m/z值可取自预定(固定)列表，即无需参考MS1数据。
仪器还可能够在一个或多个更高阶碎裂(MSN)操作模式(诸如例如MS3操作模式)下操作，由此前体离子被碎裂，所得的碎片离子中的至少一些碎片离子本身被碎裂，并且第二代碎片离子(“孙体离子”)由分析仪40分析。
ToF分析仪40能够在至少两个操作模式(即第一操作模式和第二操作模式)下操作，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的(在离子注入器与离子检测器之间的)飞行路径行进，在该第二操作模式下，致使离子沿具有更大第二长度的(在离子注入器与离子检测器之间的)飞行路径行进。在第二操作模式下增加离子飞行路径的长度具有增加分析仪的分辨率的效应，但减小了可被分析的离子的m/z范围。第二操作模式因此可称为“缩放”操作模式(因为分析仪实际上在m/z谱的更窄m/z区上“放大”)。ToF分析仪40可能够任选地在一个或多个另外的操作模式下操作，在这些操作模式下，致使离子沿具有一个或多个不同长度的(在离子注入器与离子检测器之间的)飞行路径行进。
飞行时间(ToF)质量分析仪可被配置为以任何合适的方式具有可变的路径长度。一般来讲，ToF分析仪40可具有被配置为反射离子的一个或多个离子反射器(诸如一个或多个离子镜和/或一个或多个反射器)。可通过增加离子在被检测之前采用的一个或多个离子反射器中的反射的数量来延长离子路径。
因此，例如，在第一操作模式下，离子可在被检测之前不由离子反射器反射，并且在第二操作模式下，离子可在被检测之前由一个或多个离子反射器反射一次或多次。另选地，在第一操作模式下，离子可在被检测之前由一个或多个离子反射器反射一次或多次，并且在第二操作模式下，离子可在被检测之前由一个或多个离子反射器反射更多次(与在第一模式下相比)。例如，ToF分析仪可能够在第一(“V”)操作模式与第二(“W”)操作模式之间切换，在该第一操作模式下，离子在其被检测之前在离子反射器(反射器)中反射一次，在该第二操作模式下，离子在被检测之前(在两个离子反射器中)经历三个反射。
可同样或替代地通过增加离子在被检测之前采用的离子路径的循环段中的穿过的数量来延长离子路径。
在特定实施方案中，分析仪40是多反射飞行时间(MR-TOF)质量分析仪，其能够在单次穿过“正常”操作模式和多次穿过“缩放”操作模式下操作(如下文详细描述)。
图3更详细地示意性示出了适于执行各种实施方案的方法的质谱仪。仪器是并入(在美国专利号9,136,101中描述的类型的)MR-ToF分析仪40、四极滤质器20和OrbitrapTM分析仪60的混合仪器。仪器还包括电喷雾源10、碰撞池30和用于完整质谱仪的各种离子导向器等。应理解，图3所示的仪器是非限制性示例，并且可以有多种变型。
在图3所描绘的实施方案中，仪器的离子源10是电喷雾电离(ESI)离子源。仪器包括真空界面，该真空界面包括转移管21、离子漏斗22、四极预过滤离子导向器23和所谓的“弯曲平顶”离子导向器24。离子导向器24可以是美国专利号9,536,722中所描述的设计。
仪器还包括呈四极滤质器20形式的滤质器、呈弯曲的线性离子阱(“C-Trap”)形式的离子阱31和呈离子路由多极碰撞池(“IRM”)形式的碰撞池30。来自离子源10的离子可通过打开和关闭位于电荷检测器组件26中的门控电极在C-Trap 31和/或碰撞池30中积累，该电荷检测器组件布置在C-Trap 31与滤质器20之间。
仪器包括呈多反射飞行时间(ToF)质量分析仪形式的飞行时间(ToF)质量分析仪40。在图3所描绘的仪器中，分析仪是美国专利号9,136,101中描述的倾斜镜型分析仪，但可应理解，可使用任何类型的ToF分析仪。
如图3所示，仪器包括多极离子导向器32以允许离子从碰撞池30转移到飞行时间质量分析仪40。飞行时间质量分析仪40包括提取阱41，由此离子经由多极离子导向器32从碰撞池30传送到提取阱41。离子在提取阱41中积累和冷却。
提取阱41可并入两个捕获区，一个处于相对较高的压力下用于进行快速离子冷却，并且另一个处于第二低压力区用于离子提取。离子在高压力区中冷却，并且然后转移到低压力区，在那里它们经由一对偏转器42脉冲喷射到ToF分析仪中。离子在一对镜43之间振荡，这些镜相对彼此倾斜，使得离子路径缓慢地偏转并重新定向回到检测器44。校正条状电极45抵消了原本由镜的不平行诱导的离子聚焦损失。
还如图3所示，仪器可任选地包括呈静电质量分析仪60形式的第二质量分析仪，诸如轨道离子阱质量分析仪，并且更具体地是如由Thermo Fisher Scientific制造的OrbitrapTMFT质量分析仪。在美国专利号10,699,888中更详细地描述了这种混合生成的仪器，该美国专利的内容以引用的方式并入本文。
离子可收集在离子阱31中，并且然后可与OrbitrapTM分析仪60正交地喷射用于分析而不进入碰撞或反应池30，或者离子可轴向地透射到碰撞或反应池30。透射到碰撞或反应池30的离子可通过与碰撞池30中的碰撞气体和/或试剂碰撞来碎裂，或者仅通过与确实致使离子碎裂的较低能量的气体碰撞来冷却。一旦积累在碰撞池30中，离子可被喷射到质量分析仪40中以进行分析(经由多极离子导向器32)，或者被喷射到OrbitrapTM分析仪60中以进行分析(经由C-trap 31)。
图4和图5示意性地示出了可变路径长度分析仪40的示例性实施方案的细节。在这些实施方案中，分析仪40是多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，其能够在单次穿过“正常”操作模式和多次穿过“缩放”操作模式下操作。
如图4和图5所示，多反射飞行时间分析仪40包括一对离子镜43a、43b，该一对离子镜在第一方向X上间隔开并彼此面对。离子镜43a、43b在第一端部与第二端部之间沿正交漂移方向Y伸长。
可呈离子阱形式的离子源(注入器)41布置在分析仪的一个端部(第一端部)处。离子源41可被布置和配置为从碎裂装置30接收离子。在被注入离子镜43a、43b之间的空间中之前，离子可在离子源41中积累。如图4和图5所示，可以相对小的注入角度或漂移方向速度从离子源41注入离子，形成Z字形离子轨线，由此镜43a、43b之间的不同振荡在空间中分离。
一个或多个透镜和/或偏转器可沿离子路径布置在离子源41与由离子首先遇到的离子镜43b之间。例如，如图4和图5所示，第一平面外透镜46、注入偏转器42a和第二平面外透镜47可沿离子路径布置在离子源41与由离子首先遇到的离子镜43b之间。其他布置将是可能的。通常，一个或多个透镜和/或偏转器可被配置为适当地调节、聚焦和/或偏转离子束，即，使得导致其采用通过分析仪的期望轨迹。
分析仪40还包括另一个偏转器42b，其沿离子路径布置在离子镜43a、43b之间。如图4和图5所示，偏转器42b可沿离子路径、在离子镜43a、43b之间、在离子束的第一离子镜反射之后(在离子镜43b中)以及在离子束的第二离子镜反射之前(在另一离子镜43a中)近似等距地布置。
分析仪还包括检测器44。检测器44可为任何合适的离子检测器，其被配置为检测离子并且例如记录与离子在检测器处的到达相关联的强度和到达时间。合适的检测器包括例如一个或多个转换倍增电极，任选地然后一个或多个电子倍增器等。
在分析仪的“正常”操作模式下，离子从离子源41以这样的方式注入离子镜43a、43b之间的空间中，使得离子采用在X方向上在离子镜43a、43b之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从偏转器42b沿漂移方向Y朝向离子镜43a、43b的相反(第二)端部漂移，(b)接近离子镜43a、43b的第二端部反转漂移方向速度，以及然后(c)沿漂移方向Y往回漂移到偏转器42b。然后可致使离子从偏转器42b行进到检测器44以进行检测。
在图4的分析仪中，离子镜43a、43b均相对于X和/或漂移Y方向倾斜。可替代地，离子镜43a、43b中的仅一个离子镜倾斜，并且例如离子镜43a、43b中的另一个离子镜与漂移Y方向平行地布置。一般来讲，离子镜沿其在漂移方向Y上的长度的大多数或所有长度在X方向上彼此相距非恒定距离。离子朝向离子镜的第二端部的漂移方向速度与由两个镜彼此的非恒定距离产生的电场相对，并且该电场致使离子接近离子镜的第二端部反转其漂移方向速度并且沿漂移方向朝向偏转器往回漂移。
图4所描绘的分析仪还包括一对校正带状电极45。沿漂移长度行进的离子在每次穿过镜43a、43b时被轻微偏转，并且附加带状电极45用于校正由镜之间的变化距离形成的飞行时间误差。例如，带状电极45可被电偏置，使得镜之间的离子振荡的周期沿整个漂移长度基本上恒定(尽管两个镜之间的非恒定距离)。离子最终发现自己被反射回漂移空间并聚焦在检测器44处。
在美国专利号9,136,101中给出了图4的倾斜镜型多反射飞行时间质量分析仪的另外的细节，该美国专利的内容以引用的方式并入本文。
在图5的分析仪中，离子镜43a、43b彼此平行。在该实施方案中，为了致使离子接近离子镜的第二端部反转其漂移方向速度并且沿漂移方向朝向偏转器往回漂移，分析仪包括位于离子镜43a、43b的第二端部处的第二偏转器48。
还如图5所示，在该实施方案中，透镜可包括在注入偏转器42a和/或偏转器42b中。因此，允许离子束在遇到长焦距透镜之前扩展一小段进入分析仪，该长焦距透镜具有使离子束沿其长度聚焦的效应。透镜可为安装在偏转器42b内的椭圆漂移聚焦(会聚)透镜。也可包括透镜的第二偏转器48用于反转离子束方向，同时保持对焦距属性的控制。
在英国专利号GB 2,580,089中给出了图5的单透镜型多反射飞行时间质量分析仪的另外的细节，该英国专利的内容以引用的方式并入本文。
在图4和图5所描绘的分析仪中，允许离子束针对其飞行路径的大部分(在漂移方向Y上)相对宽阔地扩展。这例如与多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪相反，这些MR-ToF质量分析仪使用一组周期性透镜来沿其整个飞行路径聚焦离子束，例如如在文章A(Verenchikov等人，应用溶液化学与建模杂志，2017年，第6卷，第1-22页)中所述。允许离子束针对其飞行路径的大部分宽阔地扩展的显著优点在于，减小空间电荷效应，这对于飞行时间分析仪来说可能是一个显著问题，特别是当分析标示分析物离子时。然而，本文所述的实施方案也适用于其他MR-ToF分析仪设计，诸如Verenchikov型MR-ToF分析仪。
在图4和图5所描绘的实施方案中，离子束在漂移维度Y上相对宽阔的事实意味着偏转器42b应当能够接受这种宽束而不引入削波或不均匀偏转。合适的偏转器设计为梯形或棱柱状偏转器。
因此，偏转器42b可包括布置在离子束上方的梯形或棱柱状电极以及布置在离子束下方的另一个梯形或棱柱状电极。电极可被定位在偏转的平面外，从而允许它们被容易地制成足够宽以接受宽离子束(至少与将位于离子束的任一侧的更常规的偏转板相比)。电极可相对于离子束成角度，使得当将合适的(DC)电压施加到电极时，所得的电场诱导离子束的偏转。离子可在成角度的电极的边缘处经历相对强的电场，诱导产生偏转。合适的偏转电压大约为±数伏、±数十伏或±数百伏。偏转器应(并且在实施方案中)被配置成使得其可致使离子束偏转期望(选择)的角度。离子束由偏转器偏转的角度可以是可调节的，例如通过调节对偏转器施的(DC)电压的大小。
在实施方案中，多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪能够在多次穿过“缩放”操作模式下操作。在该操作模式下，使离子在分析仪内在漂移方向Y上进行多个循环。增加循环数N增加了离子在分析仪内(在注入器41与检测器44之间)采用的离子路径的长度，从而增加了分析仪的分辨率。在Verenchikov分析仪中，这可通过控制入射透镜上的电压来完成。对于图4和图5所描绘的分析仪，通常用于减小注入角度和/或优化单次漂移穿过内的振荡数量的位于分析仪前部的偏转器42b(也)可用于反转离子的漂移方向速度，使得致使离子完成通过分析仪的另外的循环。
因此，在多次穿过“缩放”操作模式下，致使离子在分析仪40内完成多个(N个)循环，其中在每个循环中，离子在漂移方向Y上从偏转器42b(或入射透镜)朝向离子镜43a、43b的相反(第二)端部漂移，并且然后回到偏转器42b(或入射透镜)。在每个循环中，离子还在X方向上在离子镜之间完成多个反射。因此，在每个循环中，离子采用穿过离子镜43a、43b之间的空间的Z字形离子路径。
在图4和图5所描绘的分析仪中，可通过将离子从注入器41注入离子镜43a、43b之间的空间中来发起初始循环。离子可在离子镜中的一个离子镜43b中被反射并且然后可行进到偏转器42b。可将适当的(例如相对小的)电压施加到偏转器42b，使得致使离子在朝向离子镜的第二端部的方向上离开偏转器42b。在离开偏转器42b后，离子采用在方向X上在离子镜43a、43b之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从偏转器42b沿漂移方向Y朝向离子镜的第二端部漂移，(b)接近离子镜的第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿漂移方向Y往回漂移到偏转器42b。
在离子已经完成这个初始循环之后，通过使用偏转器42b反转离子(接近离子镜的第一端部)的漂移方向速度来发起每个另外的循环。为此，可对偏转器42b施加适当的电压，该电压致使离子以与离子初始进入偏转器42b的漂移方向速度相反的漂移方向速度离开偏转器42b。可在预期离子将返回到达偏转器42b的时间段期间施加该电压。反转离子的漂移方向的合适的偏转电压大约为数百伏。
偏转器可用于反转离子的漂移方向速度一次或多次。因此，方法可包括：致使离子在分析仪内完成多个(N个)循环，其中第一循环通过将离子注入离子镜之间的空间中来发起，并且在离子已经完成第一循环之后，每个另外的循环可通过使用偏转器反转离子的漂移方向速度来发起。
在离子已经在分析仪内完成期望(多个)数量(N个)循环之后，允许离子从偏转器42b行进到检测器44以进行检测。为此，可将适当的电压施加到偏转器42b，使得致使离子在朝向检测器44的方向上离开偏转器42b。离子可在行进到检测器44(并且由该检测器检测)之前在离子镜中的一个(另一个)离子镜43a中被反射。
图6示意性地示出了该缩放操作模式。如图6所示，离子从离子阱源41通过偏转器42a并且以相对高的角度在镜之间注入。在第一半振荡之后，离子穿过第二棱柱形偏转器42b，该第二棱柱形偏转器将注入角度减小几乎一半。振荡离子然后沿细长镜长度向上漂移，并且例如在图4的分析仪的情况下通过镜的设定倾斜而返回。当离子返回到该第二偏转器42b时，电压可从大约-150V的注入/提取电势切换到大约+350V的捕获电势，这将离子束往回反射到分析仪主体中以进行第二次穿过。在离子已经橫越期望数量(N个)穿过之后，偏转器42b被往回切换到注入/提取电势并且离子逃逸到检测器44。
实施方案涉及分析标示分析物分子(诸如用同量异位标记标示的肽)的方法。分析物分子可用一组同量异位标记标示。同量异位标记及其用途描述于文献中(参见，例如，Thompson等人，分析化学，2003年，第75卷，第1895-1904页)。一组同量异位标记是一组标记分子，该组标记分子具有(近似)相同质量但在标示分析物离子的碎裂后产生具有不同质量的特性报告离子。合适的同量异位标记包括串联质量标记(TMT)和相对和绝对定量同量异位标记(iTRAQ)。每个标记可(至少)包括报告区和平衡区，例如使得每个标示分析物分子(至少)包括报告区、平衡区和分析物分子(例如肽)。
可在溶液中提供标示分析物分子，可使用分离装置分离溶液，并且可将来自分离装置的所分离溶液提供到离子源10以进行电离。离子源10可电离标示分析物分子以产生标示分析物离子。
标示分析物离子可任选地最初在MS1操作模式下进行分析，以便提供MS1数据。MS1数据可包括一个或多个离子峰，其中每个离子峰对应于具有特定m/z(即特定前体)的标示分析物离子。
标示分析物离子可然后在MS2操作模式下进行分析，以便提供MS2数据。从MS1数据识别的每个感兴趣前体可用于限定滤质器20的m/z窗口。滤质器20可然后顺序地步进通过对应于每个感兴趣前体的每个m/z窗口。在该MS2操作模式下，碎裂装置30以碎裂操作模式操作。因此，经质量过滤标示分析物离子在碎裂装置30中被顺序地碎裂。当标示分析物离子被碎裂时，报告离子可与分析物分子碎片离子一起产生(其中报告离子是报告区的离子)。
附加地或另选地，可产生互补离子(其中互补离子是组合的平衡区和分析物分子的离子)。互补离子的产生需要仔细地将碰撞能量控制到例如相对低的值。这种低碰撞能量也可产生一些肽碎片(但是比在相对高的碰撞能量下效率低)。另选地，可使用两个不同的碰撞能量，即低碰撞能量可用于产生互补离子，而高碰撞能量可用于产生肽碎片。因此，对于每个感兴趣前体，可以不同碰撞能量向碎裂装置30中提供两次注入。所得的碎片离子可在单次注入(作为单个离子包)或两次注入(作为两个离子包)中注入分析仪40中(并且进行分析)。
使用分析仪40分析分析物碎片离子和报告离子或互补离子。
参考图3所描绘的仪器，在实施方案中，多路复用和标记的样品从液相色谱(LC)分离装置传送到电喷雾离子源10，进行电离并且穿过真空以到达四极20。
为了执行全质量扫描(MS1)，四极20被配置为最小化其分离水平并且将离子传输到C-Trap 31和OrbitrapTM分析仪60或者传输到MR-ToF分析仪40以进行分析。
为了执行碎片扫描(MS2)，从MS1扫描(数据依赖性采集(DDA))识别的或从固定列表(数据独立性采集(DIA))运行的合适的前体以增强的能量发送到碰撞池30并且被碎裂。碎片然后传送到MR-ToF分析仪40以进行分析，其中TMT报告离子峰被测量以进行定量，并且肽碎片被检测以识别前体。
图7示出了该DDA过程。如图7所示，首先使用OrbitrapTM分析仪60或ToF分析仪40执行MS1扫描(步骤60)。对于图3的仪器设计，OrbitrapTM分析仪60对于执行MS1前体识别可能是有利的，但是可单独使用ToF分析仪40，并且OrbitrapTM分析仪60不是仪器的必要部分。
接下来，从MS1扫描选择前体离子(步骤62)，并且使用ToF分析仪40对该前体离子执行MS2扫描(步骤64)。如步骤66所示，然后重复该过程，直到从MS1扫描识别的前体离子的列表被详尽使用。一旦前体离子的列表被详尽使用，则执行新MS1扫描，并且该过程重复其本身。
该DDA过程对于本文所述的TMT方法是有利的(并且DIA过程可能是不利的)。这是因为四极分离宽度倾向于太宽而不能以足够的速度盲目覆盖约300-1100质量范围(如通常在DIA方法中所进行的)以与来自分离装置的色谱峰的时间标度相容，同时非常窄的分离窗口是优选的以最小化共分离的肽之间的干扰。然而，互补离子方法具有较少的这种干扰的困难，并且与DIA更相容。
在实施方案中，可以或可以不在MS1扫描内应用上述缩放模式。然而，根据实施方案，将缩放模式应用于MS2扫描。
就这一点而言，需注意，报告离子在质谱中出现得非常早，事实上低于仪器通常可被设定来检测大多数前体的碎片离子。它们也在几个m/z单位内紧密间隔。这样的结果是缩放模式可有利地仅应用于报告离子，并且剩余的碎片离子可不中断地穿过仪器。还可能将缩放模式仅应用于也在几个m/z单位内紧密间隔的互补离子。
因此，在实施方案中，使用在第一操作模式下操作的飞行时间质量分析仪40来分析分析物碎片离子，在该第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进。使用在第二操作模式下操作的飞行时间质量分析仪40来分析报告离子或互补离子，在该第二操作模式下，致使离子沿具有更大第二长度的飞行路径行进。已经认识到，分析仪的宽m/z范围正常操作模式特别适于分析肽碎片离子(其通常在相对宽的m/z范围内出现)，并且窄m/z范围但更高分辨率缩放操作模式特别适于分析报告离子(其通常在相对窄的m/z范围内在相对低的m/z处出现)或互补离子。
分析物碎片离子的所得的m/z和/或强度信息可用于识别分析物分子，并且报告离子或互补离子的m/z和/或强度信息可用于对分析物分子定量。
在具有20m-25m飞行路径的图3和图4的MR-ToF仪器中，所有所注入离子在约100μs内相对快速地穿过第二偏转器42b。m/z为约128的TMT报告离子将在约250μs之后返回到偏转器42b，从而为偏转器42b切换到内部捕获缩放模式留下大的开销时间。报告离子可然后在几微秒内被反射回仪器中，并且偏转器42b可切换回其透射模式，于是允许肽碎片离子与从它们的第二次穿过返回的TMT报告离子一起离开系统。这具有在高于500μs的某处(在实际实验中为570μs，尽管这随着分析仪调整而显著变化)将报告区移位的效应，这应被数据分析软件理解。
在一些实施方案中，多个短偏转器电压脉冲可与TMT报告离子的返回对准，使得这些离子多次穿过分析仪，以实现甚至更高水平的性能。
图8示出了报告离子被发送以五次穿过分析仪40的方案。如图8所示，随着TMT报告离子的返回，施加到偏转器42b的电压从其注入/提取电势(约-150V)脉冲调制到其捕获电势(约+350V)，使得仅报告离子被发送以五次穿过分析仪40，而肽碎片离子经受正常单次穿过分析仪40。
因此，在实施方案中，该方法包括：将包括分析物碎片离子和报告离子或互补离子的离子包从离子注入器41注入离子镜43a、43b之间的空间中。致使离子完成第一循环，在该第一循环中，离子沿循在方向X上在离子镜43a、43b之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从偏转器42b或透镜沿漂移方向Y朝向离子镜的第二端部漂移，(b)接近离子镜的第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿漂移方向Y往回漂移到偏转器42b或透镜。然后，允许仅分析物碎片离子区域从偏转器42b或透镜行进到检测器44以进行检测。偏转器42b或透镜用于反转(仅)报告离子或互补离子的漂移方向速度，使得致使这些离子完成另外的循环，在该循环中，这些离子沿循在方向X上在离子镜43a、43b之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从偏转器42b或透镜沿漂移方向Y朝向离子镜的第二端部漂移，(b)接近离子镜的第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿漂移方向Y往回漂移到偏转器42b或透镜。该步骤可任选地重复，例如使得致使报告离子或互补离子在分析仪40中完成期望数量N个穿过。最后，致使报告离子或互补离子从偏转器42b或透镜行进到检测器44以进行检测。
虽然此操作模式在TMT分辨率方面具有更大益处，但已经针对多次穿过在实验上注意到信号损失(参见图11)，并且偏转器电压的凹口变为质谱中的凹口。尽管分辨率随穿过次数而增加，但信号损失也增加，并且凹口变得越来越可能捕捉到肽碎片离子并且生成假正峰。该操作需要相对快速的偏转器切换，正如偏转器42b本身内的最小停留时间，尽管这通常为大约1μs，据信电源切换的速度更为显著。可在每仪器的基础上校准和优化棱镜电压开关的定时。
到达检测器的离子的焦平面位置应与检测器表面对准以实现最佳分辨率。然而，对于缩放模式与非缩放常规模式，焦平面位置可移位。通常，可通过镜电压的轻微扰动来执行焦平面的调节，但是这在具有混合轨迹的离子一起飞过分析仪时通常是不可行的。
就这一点而言，需注意，该方法的优点在于，仅缩放的报告离子需要最高分辨率，而肽碎片离子所需的分辨率要求低得多。因此，在一些实施方案中，可仅针对缩放的离子优化焦平面。可同样或替代地利用以下事实：报告离子是谱中的最低m/z离子，最早从阱41出现，并且因此可暴露于阱41内(诸如，例如，缓慢上升的提取脉冲)、注入光学器件46、42a、47、42b内、镜43a、43b的边缘内和/或检测器44处的不同受控电压以调节焦平面而不影响其他离子。可同样或替代地采用m/z依赖性离子能量校正方法，例如如美国专利号10,727,039中所述，该美国专利的内容以引用的方式并入本文。可同样或替代地将具有受控频率和相位的小振荡电压施加到与低m/z报告离子的振荡共振的镜43a、43b，从而给出仅影响报告离子的焦平面调节。
图9示出了根据另外的实施方案的工作流，其中不是在与肽碎片相同的扫描中进行报告离子测量，而是替代地在单独的扫描中测量它们。
如图9所示，首先执行MS1全质量扫描(步骤70)，并且从MS1扫描选择前体离子(步骤72)。接下来，使用缩放模式执行第一MS2扫描以检测TMT报告离子(步骤74)，并且然后使用常规操作模式执行第二MS2扫描以检测肽碎片离子(步骤76)。步骤74和76的次序可反转。如步骤78所示，然后重复该过程，直到从MS1扫描识别的前体离子的列表被详尽使用。一旦前体离子的列表被详尽使用，则执行新MS1扫描，并且该过程重复其本身。
因此，在实施方案中，将分析物碎片离子作为注入分析仪40中的一个或多个第一离子包进行分析，并且将报告离子或互补离子作为注入分析仪40中的不同的一个或多个第二离子包进行分析。
该方法具有可例如通过以下针对两个MS2扫描中的每个MS2扫描优化仪器设定的优点：针对分辨率调整镜43a、43b和/或针对报告离子和肽碎片离子的不同目标质量范围优化RF和DC电压，例如以便针对两个扫描中的每个扫描优化碰撞能量，针对两个扫描中的每个扫描优化施加到离子阱41的注入电压，和/或针对两个扫描中的每个扫描优化滤质器的分离窗口。
在这些实施方案中，类似于图8所示的方法的凹口方法仍可任选地用于TMT扫描，不同之处在于并非将偏转器42b设定为在凹口之间透射离子，而是替代地将其设定为极端电压以从谱移除所有肽碎片离子。
这些实施方案在原始灵敏度和采集速度方面具有附加成本，然而MR-ToF分析仪40的最大采集速度比在50Hz下操作的OrbitrapTM分析仪高许多倍，并且一些灵敏度可通过碰撞能量的单独优化(更高的能量对于低m/z离子诸如报告离子更好，但是对于中/高m/z碎片离子较不优选)、捕获RF等来重新获得。有利地，四极20分离窗口可针对TMT扫描变窄以移除干扰，并且针对肽扫描而变宽以便使灵敏度最大化。一般来讲，约10,000个检测离子对于肽识别是优选的，但是报告离子定量需要少得多，特别是鉴于由ToF分析仪提供的单次离子水平检测。
图10示出了使用从FlexmixTM样品生成的MRFA离子的针对单次穿过和缩放模式的图4的分析仪的空间电荷诱导分辨率损失的实验结果。可以看出，不仅顶端分辨率在缩放模式下粗略加倍，而且对空间电荷的弹性也几乎加倍(即，实现50K分辨率要求的峰中的离子数量几乎为两倍多)。
图11示出了其中改变缩放模式水平(即，离子沿分析仪上下漂移的穿过次数)的实验的曲线图。可以看出，在这种分析仪设计的情况下，3次穿过对于实现高分辨率和最小信号损失是最佳的。然而，其他MR-ToF分析仪设计可能表现得不同，例如先前已经在并入周期性透镜的分析仪上观察到500K分辨率(例如，如在英国专利号2,403,063中所述)。
从上文应当理解，实施方案提供一种方法，在该方法中，缩放模式用于增强TMT报告区(或互补离子区)的检测。这可作为其自身具有优化分离窗口、碰撞能量等的扫描来完成，或者可例如经由偏转器42b电压的凹口切换集成到更宽的扫描中。
根据实施方案，可使用MR-ToF分析仪经由缩放模式来识别TMT报告离子，该MR-ToF分析仪不以另外的方式满足在期望动态范围>50K分辨率的要求。报告区通常包含数千个离子，而MR-ToF分析仪可能够以总共仅一千个离子分离100:1TMT双体。这转化为相当有限的动态范围，在该范围内，能够观察到较小的峰。图10和图11示出了使用缩放模式来避开这些限制的固有优点。
如上所述，将缩放模式TMT扫描集成到标准主扫描中意味着不会发生重复率或灵敏度的损失。然而，这是任选的，并且单独进行这些扫描可能是有利的，因为ToF分析仪已经比所要求的快得多。由于需要高质量色谱分离，可执行相对长/慢通量实验循环。这可通过具有有着较低干扰的单独窄分离窗口报告离子扫描来改进。灵敏度然后成为更显著的问题，但是这可通过更优化的仪器设定来补救。
缩放模式还可将分辨率提高到足以使16-plex或18-plex互补离子TMT方法成为可能。这些方法目前在任何ToF系统中都是不可能的。分辨率改进对于较低多路复用互补离子也是有价值的，例如以分辨出化学噪声和共分离的肽，从而允许更大的分离宽度和甚至更高的通量。
尽管上面已经描述了各种具体实施例，但是各种替代实施例是可能的。
例如，本文所述的方法可在并入能够例如通过改变离子穿过分析仪所采用的反射的数量改变离子飞行路径长度的ToF分析仪的任何仪器上执行。例如，这可以是从零(线性ToF)反射到单个反射。这也可涉及低灵敏度W形离子飞行路径与高灵敏度低分辨率V形离子飞行路径之间的切换。一般来讲，所有多反射和多转向ToF可用于执行本文所述的方法。
参考关于图9描述的实施方案，代替图9所示的报告离子扫描和肽碎片离子扫描的交错序列，可进行TMT报告离子扫描的序列，之后进行肽碎片离子扫描的序列。如果存在当从常规模式切换到缩放模式时必须进行的相对慢的电压移位，则这可能是有益的。例如，稳定的电源可能花费许多毫秒来调节。
可执行更有效的方法，其中通过一次MS2扫描识别标示分析物，并且然后进行第二次MS2扫描以对标记定量。
可从MS1扫描检测到类似水平的干扰。报告离子中的化学干扰来自共分离的标记肽的碎裂。原则上，在与目标肽相同的质量分离窗口内，应当可以在MS1扫描中看到这些干扰肽峰。基于MS1扫描(或通常将仍示出大量未碎裂的前体离子的分析物MS2扫描)，可动态地设定分离窗口以平衡透射并且最小化干扰。
MS2 TMT扫描(或组合的TMT/前体扫描)可由MS3扫描替代，该MS3扫描较不敏感但对于低干扰定量更好。这种方法可由包含用于进一步分离和碎裂的装置(诸如线性离子阱)的仪器或通过使离子往回穿过四极20来执行。再次，这里存在使用用于碎片离子检测的更灵敏的方法和用于改进的报告离子定量的更清洁的方法的优势。
上述凹口切换方法可更广泛地应用于在其他应用范围中挑选出需要高分辨率的目标分析物。
例如，凹口切换模式可用于从未知的背景挑选出目标。这对于蛋白质DIA/DDA可能是有用的，其中可以缩放模式分析前体，以最佳地分辨同位素包络(其需要高分辨率)，同时可正常地检测较低m/z碎片离子(具有较低分辨率要求)。甚至标准肽和/或常规m/z离子DDA/DIA也可能受益，因为在MS2谱中获得了不同前体的更好的质量准确度和分离。如果期望以最大性能检测目标离子，则诸如SIM扫描的目标应用也可能受益，但也期望任何碎片的质量。
一般来讲，这些方法可应用于任何应用，其中相对于未知或低丰度离子的背景，一个或若干目标离子(已知或由先前扫描确定)需要高分辨率/动态范围，其中期望不经受由缩放模式诱导的m/z测量不确定性或灵敏度损失。
尽管已经参考各种实施方案描述了本发明，但是应当理解，在不脱离所附权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可进行各种改变。

Claims (24)

1.一种分析标示分析物离子的方法，所述方法包括：
碎裂标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子；
使用在第一操作模式下操作的飞行时间质量分析仪来分析所述分析物碎片离子，在所述第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进；以及
使用在第二操作模式下操作的所述飞行时间质量分析仪来分析所述报告离子或所述互补离子，在所述第二操作模式下，致使离子沿具有第二长度的飞行路径行进，其中所述第二长度大于所述第一长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述飞行时间质量分析仪包括一个或多个离子反射器；
在所述第一操作模式下，致使离子在所述一个或多个离子反射器中进行n个反射，其中n是≥0的整数；并且
在所述第二操作模式下，致使离子在所述一个或多个离子反射器中进行m个反射，其中m是>n的整数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述飞行时间质量分析仪是多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，所述MR-ToF质量分析仪包括：
两个离子镜，所述两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，所述漂移方向Y与所述第一方向X正交；
离子注入器，所述离子注入器用于将离子注入所述离子镜之间的空间中，所述离子注入器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；和
检测器，所述检测器用于在离子已经在所述离子镜之间完成多个反射之后检测所述离子，所述检测器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；
其中使用在所述第一操作模式下操作的所述分析仪来分析分析物碎片离子包括：
将分析物碎片离子从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述离子镜的所述第一端部；以及然后
致使所述离子行进到所述检测器以进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用在所述第二操作模式下操作的所述分析仪来分析报告离子或互补离子包括：
(i)将报告离子或互补离子从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子完成第一循环，在所述第一循环中，
所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第一端部往回漂移；
(ii)接近所述离子镜的所述第一端部反转所述离子的所述漂移方向速度，使得致使所述离子完成另外的循环，在所述另外的循环中，
所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第一端部往回漂移；
(iii)任选地重复步骤(ii)一次或多次；以及然后
(iv)致使所述离子行进到所述检测器以进行检测。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中：
所述多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪还包括被定位为接近所述离子镜的所述第一端部的偏转器或透镜；并且
使用在所述第二操作模式下操作的所述分析仪来分析报告离子或互补离子包括：
(i)将报告离子或互补离子从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子完成第一循环，在所述第一循环中，
所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)沿所述漂移方向Y从所述偏转器或透镜朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(ii)使用所述偏转器或透镜来反转所述离子的所述漂移方向速度，使得致使所述离子完成另外的循环，在所述另外的循环中，所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(iii)任选地重复步骤(ii)一次或多次；以及然后
(iv)致使所述离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中分析所述分析物碎片离子的所述步骤包括分析一个或多个第一离子包，并且分析所述报告离子或所述互补离子的所述步骤包括分析不同的一个或多个第二离子包。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括：使用第一组一个或多个仪器参数来生成和/或处理和/或分析每个第一离子包，以及使用不同的第二组一个或多个仪器参数来生成和/或处理和/或分析每个第二离子包。
8.根据权利要求6或7所述的方法，还包括：使用第一滤质器透射窗口宽度来生成每个第一离子包，以及使用不同的第二滤质器透射窗口宽度来生成每个第二离子包。
9.根据权利要求6、7或8所述的方法，还包括：使用第一碰撞能量来生成每个第一离子包，以及使用不同的第二碰撞能量来生成每个第二离子包。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中分析所述分析物碎片离子和分析所述报告离子或所述互补离子的所述步骤包括分析一个或多个单个离子包。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分析仪包括：
离子路径，所述离子路径包括循环段；
离子注入器，所述离子注入器用于将离子注入所述离子路径中；
至少一个离子反射器，所述至少一个离子反射器沿所述离子路径布置；和
检测器，所述检测器布置在所述离子路径的端部处；
其中所述方法包括：
(i)将包括分析物碎片离子和报告离子或互补离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子路径中，使得所述分析物碎片离子和所述报告离子或所述互补离子沿所述离子路径行进到所述离子反射器；
(ii)致使所述分析物碎片离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测；
(iii)使用所述离子反射器来致使所述报告离子或所述互补离子沿所述离子路径的所述循环段完成一个或多个循环；以及然后(iv)致使所述报告离子或所述互补离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测。
12.根据从属于权利要求5的权利要求10或11所述的方法，还包括：
(i)将包括分析物碎片离子和报告离子或互补离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子完成第一循环，在所述第一循环中，所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(ii)致使所述分析物碎片离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测；
(ii)使用所述偏转器或透镜来反转所述报告离子或所述互补离子的所述漂移方向速度，使得致使这些离子完成另外的循环，在所述另外的循环中，这些离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(iv)任选地重复步骤(iii)一次或多次；以及然后
(v)致使所述报告离子或所述互补离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
在MS1操作模式下分析标示分析物离子以便产生MS1数据，以及识别所述MS1数据中的一个或多个感兴趣前体；
其中碎裂标示分析物离子的所述步骤包括顺序地选择和碎裂每个所识别感兴趣前体。
14.一种分析标示分析物分子的方法，所述方法包括：电离标示分析物分子以产生标示分析物离子，以及使用根据前述权利要求中任一项所述的方法来分析所述标示分析物离子。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括：使用来自所述分析物碎片离子的所述分析的质荷比(m/z)和/或强度信息来识别所述分析物分子，以及使用来自所述报告离子或所述互补离子的所述分析的质荷比(m/z)和/或强度信息来对所述分析物分子定量。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标示分析物离子是用同量异位标记标示的肽的离子。
17.一种操作飞行时间(ToF)质量分析仪的方法，所述ToF质量分析仪包括：
离子路径，所述离子路径包括循环段；
离子注入器，所述离子注入器用于将离子注入所述离子路径中；
至少一个离子反射器，所述至少一个离子反射器沿所述离子路径布置；和
检测器，所述检测器布置在所述离子路径的所述端部处；
所述方法包括：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子路径中，使得所述第一离子和所述第二离子沿所述离子路径行进到所述离子反射器；
(ii)致使所述第一离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测；
(iii)使用所述离子反射器来致使所述第二离子沿所述离子路径的所述循环段完成一个或多个循环；以及然后
(iv)致使所述第二离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述飞行时间(ToF)质量分析仪是多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，所述MR-ToF质量分析仪包括：
两个离子镜，所述两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，所述漂移方向Y与所述第一方向X正交；
其中所述离子注入器被配置为将离子注入所述离子镜之间的空间中，并且所述离子注入器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；
其中所述检测器被配置为在离子已经在所述离子镜之间完成多个反射之后检测所述离子，并且所述检测器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；以及
其中所述离子偏转器包括偏转器或透镜，所述偏转器或透镜被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；
其中所述方法包括：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子完成第一循环，在所述第一循环中，所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(ii)致使所述第一离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测；
(iii)使用所述偏转器或透镜来反转所述第二离子的所述漂移方向速度，使得致使所述第二离子完成另外的循环，在所述另外的循环中，所述第二离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(iv)任选地重复步骤(iii)一次或多次；以及然后
(iv)致使所述第二离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测。
19.一种存储计算机软件代码的非暂态计算机可读存储介质，所述计算机软件代码当在处理器上执行时致使分析仪器执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。
20.一种用于分析仪器的控制系统，所述控制系统被配置为致使所述分析仪器执行根据权利要求1-18中任一项所述的方法。
21.一种分析仪器，诸如质谱仪，包括根据权利要求20所述的控制系统。
22.一种分析仪器，诸如质谱仪，包括：
碎裂装置；
飞行时间(ToF)质量分析仪，所述ToF质量分析仪能够在第一操作模式和第二操作模式下操作，在所述第一操作模式下，致使离子沿具有第一长度的飞行路径行进，在所述第二操作模式下，致使离子沿具有第二长度的飞行路径行进，其中所述第二长度大于所述第一长度；和
控制系统，所述控制系统被配置为当所述仪器用于分析标示分析物离子时：
致使所述碎裂装置碎裂所述标示分析物离子以产生分析物碎片离子和报告离子或互补离子；
致使所述飞行时间质量分析仪使用所述第一操作模式来分析所述分析物碎片离子；以及
致使所述飞行时间质量分析仪使用所述第二操作模式来分析所述报告离子或所述互补离子。
23.一种飞行时间(ToF)质量分析仪，包括：
离子路径，所述离子路径包括循环段；
离子注入器，所述离子注入器用于将离子注入所述离子路径中；
至少一个离子反射器，所述至少一个离子反射器沿所述离子路径布置；和
检测器，所述检测器布置在所述离子路径的所述端部处；
其中所述分析仪被配置为通过以下方式分析离子：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子路径中，使得所述第一离子和所述第二离子沿所述离子路径行进到所述离子反射器；
(ii)致使所述第一离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测；
(iii)使用所述离子反射器来致使所述第二离子沿所述离子路径的所述循环段完成一个或多个循环；以及然后
(iv)致使所述第二离子从所述离子反射器行进到所述检测器以进行检测。
24.根据权利要求23所述的分析仪，其中：
所述飞行时间(ToF)质量分析仪是多反射飞行时间(MR-ToF)质量分析仪，所述MR-ToF质量分析仪包括：两个离子镜，所述两个离子镜在第一方向X上间隔开并且彼此相对，每个镜通常在第一端部与第二端部之间沿漂移方向Y伸长，所述漂移方向Y与所述第一方向X正交；
所述离子注入器被配置为将离子注入所述离子镜之间的空间中，并且所述离子注入器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；
所述检测器被配置为在离子已经在所述离子镜之间完成多个反射之后检测所述离子，并且所述检测器被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；以及
所述离子偏转器是偏转器或透镜，所述偏转器或透镜被定位为接近所述离子镜的所述第一端部；
其中所述分析仪被配置为通过以下方式分析离子：
(i)将包括第一离子和第二离子的离子包从所述离子注入器注入所述离子镜之间的所述空间中，其中所述离子完成第一循环，在所述第一循环中，所述离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
(ii)致使所述第一离子从所述偏转器或透镜行进到所述检测器以进行检测；
(iii)使用所述偏转器或透镜来反转所述第二离子的所述漂移方向速度，使得致使所述第二离子完成另外的循环，在所述另外的循环中，所述第二离子沿循在所述方向X上在所述离子镜之间具有多个反射的Z字形离子路径，同时：(a)从所述偏转器或透镜沿所述漂移方向Y朝向所述离子镜的所述第二端部漂移，(b)接近所述离子镜的所述第二端部反转漂移方向速度，以及(c)沿所述漂移方向Y往回漂移到所述偏转器或透镜；
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