CN116417328A - 分析仪器的离子累积控制 - Google Patents
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Abstract
公开了一种操作例如质谱仪之类的分析器的方法。所述分析仪器包括第一离子存储器和布置在所述第一离子存储器下游的第二离子存储器。所述方法包括确定所述第二离子存储器的目标累积时间是否大于阈值累积时间。当确定所述目标累积时间小于所述阈值累积时间时,使用基于所述目标累积时间的累积时间在所述第二离子存储器内累积离子。当确定所述目标累积时间大于所述阈值累积时间时,使用基于所述目标累积时间与所述阈值累积时间之间的差的第一累积时间在所述第一离子存储器内累积离子,将累积在所述第一离子存储器内的所述离子传递到所述第二离子存储器,并且使用基于所述阈值累积时间的第二累积时间在所述第二离子存储器内累积另外的离子。
Description
技术领域
本发明涉及质谱法领域,特别是将离子累积在离子阱中的质谱法,例如使用例如静电轨道阱之类的静电阱的傅里叶变换(FT)质谱法。
背景技术
许多类型的质谱仪都采用离子阱。例如,来自赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司的OrbitrapTM仪器采用弯曲线性离子阱(“C阱”)以及静电轨道阱来提供高分辨率的准确质量分析。C阱和静电轨道阱设置在离子源下游,由此经由布置在离子源与C阱之间的各种离子光学装置将离子传输到C阱(并且从C阱传输到静电轨道阱)。
通常需要精确控制在离子阱中累积的离子总数量,例如将离子数量优化为低于但尽可能接近离子阱的极限,例如离子阱的空间电荷极限。离子阱中累积的离子数量又通过使用门来控制,以控制离子进入阱的累积时间(例如,填充时间)。在商业仪器中,可以提供相对复杂和快速的离子门以能够足够精确地控制进入阱的累积时间。
现代质谱仪以越来越快的重复率运行,从而在更短的实验中实现高性能,并且处理更多的样品。通常,对重复率的主要限制是仪器灵敏度,因为收集足够的样品离子进行分析通常需要一定的累积时间,如处理这些离子进行分析所需的时间、分析时间本身和/或电子设备在分析物目标之间切换所需的时间。
据信,用于质量分析的设备和方法仍有改进的余地。
发明内容
第一方面提供了一种操作分析仪器的方法,所述分析仪器包括第一离子存储器和第二离子存储器,其中第二离子存储器布置在第一离子存储器下游,所述方法包括:
确定第二离子存储器的目标累积时间是否大于阈值累积时间;
当确定目标累积时间小于阈值累积时间时:使用基于目标累积时间的累积时间在第二离子存储器内累积离子;以及
当确定目标累积时间大于阈值累积时间时:使用基于目标累积时间与阈值累积时间之间的差的第一累积时间在第一离子存储器内累积离子,将累积在第一离子存储器内的离子传递到第二离子存储器,并且使用基于阈值累积时间的第二累积时间在第二离子存储器内累积另外的离子。
实施例提供了一种操作例如质谱仪之类的分析仪器的方法。所述仪器包含可布置在离子源下游的(第二)离子存储器(例如,离子阱)。离子可以经由布置在离子源与第二离子存储器之间的一个或多个离子光学装置(并且经由第一离子存储器)从离子源传输到第二离子存储器,并且可以在第二离子存储器内累积,例如接着从第二离子存储器中喷射到质量分析器中进行分析。所述仪器可以包含相对快速(并且相对精确)的离子门,所述离子门被配置成控制离子进入第二离子存储器的累积时间。所述仪器可以按循环方式操作,例如使得连续批次的离子各自在第二离子存储器中累积,并且接着被传递到质量分析器并由其进行分析。
在每个仪器循环期间,离子可以根据所述循环的目标累积时间累积在第二离子存储器中。可以针对每个循环(或针对每组多个循环)确定(例如,估计)目标累积时间,使得在目标累积时间的持续时间内累积离子将(大致)提供在所述循环内将在第二离子存储器中累积的离子的期望数量。离子的期望数量可以例如低于但尽可能接近第二离子存储器和/或质量分析器的极限,例如空间电荷极限。
在每个仪器循环期间,仪器可以以离子在第二离子存储器中累积的模式和离子(未到达第二离子存储器并且)不在第二离子存储器中累积的模式操作。
例如,在每个仪器循环期间,第二离子存储器可以在累积操作模式和非累积(即关闭)操作模式下操作。可能需要第二离子存储器在每个循环期间以其非累积模式操作(至少)某一最少时间量,例如允许累积的离子有时间被处理和/或传递到质量分析器进行分析等。
另外或替代地,在每个仪器循环期间,布置在离子源与第二离子存储器(例如滤质器)之间的一个或多个离子光学装置中的一个或多个可以在将离子传输到第二离子存储器(并在其中累积)的模式,以及不将离子传输到第二离子存储器(并且因此不到达第二离子存储器并且不在第二离子存储器中累积)的模式下操作。例如,在每个循环期间,可以控制滤质器以使得其传输窗口(的中心质荷比(m/z))在多个不同的m/z值之间切换。在传输窗口保持在特定m/z值的时间期间,质荷比对应于窗口的m/z的离子被滤质器传输。在改变滤质器的传输窗口的时间期间,离子不会被滤质器传输。
因此,在每个仪器循环期间,仪器可以以离子在第二离子存储器中累积小于或等于最大累积时间的某一时间量的模式操作,其中最大累积时间基于总循环时间与仪器在离子(未到达第二离子存储器并且)未在第二离子存储器中累积的模式(或多个模式)下操作的(例如必要的)时间之间的差。
在某些实验中,使用相对较高的重复率操作仪器可能是有益的。这可以是例如仪器耦合到例如液相色谱分离装置之类的分离装置的情况,特别是在分离装置以相对短的梯度(例如几分钟或几十分钟)操作的情况。在这种情况下,使用相对较高的重复率操作仪器可以允许仪器对相对快速的洗脱峰进行适当采样。
然而,本发明人现在已经认识到,当仪器的重复率增加时,其灵敏度可能会显著降低。这是因为当仪器的重复率增加时,每个循环可用的时间就会减少。然而,在仪器必须以在每个循环期间(如上文所描述)离子不会在第二离子存储器中累积至少某一(例如固定的)最少时间量的模式(或多个模式)操作的情况下,增加重复率需要减少每个循环中可用的最大累积时间。减少最大累积时间又会减少离子存储器内累积的离子数量,并且因此会降低仪器的灵敏度。
在本文所描述的方法中,针对第二离子存储器限定阈值累积时间。阈值累积时间可以基于(例如,可以等于或大致等于)最大累积时间,即总循环时间与必要的非累积时间之间的差。阈值累积时间可以替代地设置为小于最大累积时间的值。
当第二离子存储器的目标累积时间小于(或等于)阈值累积时间时,例如以‘正常’方式使用目标累积时间在第二离子存储器内累积离子。因此,与第二离子存储器相关联的相对快速(且精确)的门在其累积(例如打开)模式下操作达基于(例如等于)目标累积时间的时间(并且否则在其非累积模式(例如,关闭)模式下操作),使得离子在第二离子存储器内直接累积达基于(例如,等于)目标累积时间的时间。
然而,当第二离子存储器的目标累积时间大于阈值累积时间时,在第二离子存储器内累积离子利用布置在仪器内在第二离子存储器上游(即与第二离子存储器相比更靠近离子源)的第一离子存储器。特别地,使用基于(例如,等于或大致等于)目标累积时间与阈值累积时间之间的差的第一累积时间在第一离子存储器内初始累积离子。也就是说,在第一离子存储器内“预累积”离子。接着将预累积的离子从第一离子存储器传递到第二离子存储器。接着,使用基于(例如,等于或大致等于)阈值累积时间的第二累积时间在第二离子存储器内直接累积另外的离子(即除了预累积的离子之外)。以此方式,离子在第二离子存储器内累积达基于(例如等于或大致等于)目标累积时间的时间。
有利地,以此方式预累积离子意味着最大可允许的目标累积时间可以增加到大于阈值累积时间(即大于总循环时间与必要的非累积时间之间的差),并且例如可以接近总循环时间。这又意味着可以提高仪器的重复率,而无需显著降低灵敏度。
此外,本文所描述的方法可以以不需要对现有仪器进行物理修改的方式来实施。在实施例中,第一离子存储器设置在布置在离子源与第二离子存储器之间的一个或多个离子光学装置中的离子光学装置内,并且利用(已经)存在于仪器中的相对缓慢(并且相对不精确)的离子门。例如,第一离子存储器可以形成在一个或多个离子光学装置的离子导向器(例如转移离子导向器)内,并且相对缓慢(并且相对不精确)的离子门可以是所述离子导向器的出射透镜。
此外,本发明人已经认识到,在这些情况下,仅当目标累积时间超过阈值累积时间时在第一离子存储器内使用离子的预累积才是有益的。这意味着当目标累积时间相对较短时,只有与第二离子存储器相关联的相对快速且精确的门用于控制总累积时间。与第一离子存储器相关联的相对缓慢且不精确的门仅在目标累积时间相对较长时使用,在这种情况下,由于使用更不精确的门而产生的误差成比例地更小。因此,实施例提供了对第二离子存储器内累积的离子数量的高度精确控制。
因此,应理解,实施例提供改进的用于质量分析的设备和方法。
分析仪器可以是质谱仪,例如包括离子源。离子可以从离子源中的样品产生。可以经由布置在离子源与第二离子存储器之间的一个或多个离子光学装置将离子从离子源传递到第二离子存储器。
一个或多个离子光学装置可以包括一个或多个离子导向器、一个或多个透镜、一个或多个门等的任何合适布置。一个或多个离子光学装置可以包含用于转移离子的一个或多个转移离子导向器,和/或用于质量选择离子的一个或多个质量选择器或过滤器,和/或用于冷却离子的一个或多个离子冷却离子导向器,和/或用于使离子碎裂或反应的一个或多个碰撞或反应池等。一个或多个离子导向器或每个离子导向器可以包括例如四极离子导向器、六极离子导向器之类的多极离子导向器、分段多极离子导向器、叠环式离子导向器等。
分析仪器可以包括可以布置在第二离子存储器下游的一个或多个质量分析器。在第二离子存储器中累积的离子可以被传递到质量分析器并且接着由质量分析器进行分析,例如以便确定离子的质谱。
质量分析器可以包括任何合适类型的质量分析器,例如特别是离子阱质量分析器和/或飞行时间质量分析器。
如果存在,离子阱质量分析器可以是静电轨道阱质量分析器。质量分析器可以具有沿轴布置的内部电极和沿轴间隔开并围绕内部电极的两个外部检测电极。捕获在质量分析器内的离子可以以某一频率进行振荡,所述频率可以取决于离子的质荷比并且可以使用镜像电流检测进行检测。离子可以在静电场中沿轴基本上执行谐波振荡,同时围绕内部电极运行。质量分析器可以是来自赛默飞世尔科技公司的OrbitrapTM质量分析器。OrbitrapTM质量分析器的更多细节可以在例如第5,886,346号美国专利中找到。
如果存在,飞行时间质量分析器可以是任何合适类型的飞行时间质量分析器,例如特别是多反射飞行时间质量分析器。质量分析器内的离子可能会在一对离子镜之间振荡,直到它们到达检测器为止。离子可以以由离子的质荷比确定的飞行时间行进通过质量分析器。多反射飞行时间质量分析器可以任选地是第9,136,101号美国专利中描述的倾斜镜类型。
在一些实施例中,仪器包含静电离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器,例如第10,699,888号美国专利中所描述的。
所述仪器包含第一离子存储器和第二离子存储器,其中第二离子存储器布置在第一离子存储器下游(即,与第一离子存储器相比距离子源更远)。
第一离子存储器布置在离子源下游,并且可以被配置成从离子源接收离子。第一离子存储器可以形成布置在离子源与第二离子存储器之间的一个或多个离子光学装置的一部分。第一离子存储器可以形成在一个或多个离子光学装置的离子导向器中,例如形成在转移离子导向器中。在特定实施例中,第一离子存储器形成在一个或多个离子光学装置的所谓“弯曲平极(flatapole)”离子导向器中,其可以是第9,536,722号美国专利中描述的设计。
第二离子存储器被布置在离子源下游,并且可以被配置成经由一个或多个离子光学装置(并且经由第一离子存储器)从离子源接收离子。第二离子存储器可以是离子阱。离子阱可以包括任何合适的离子阱,例如线性离子阱或弯曲的线性离子阱(C阱)。离子阱也可以由多个离子阱的组合形成。离子阱可用于在将累积的离子注入质量分析器之前对其进行冷却。离子阱可以配置成使得离子可以脉冲方式从离子阱喷射到质量分析器。
离子阱可以具有轴并且可用于将离子从正交于轴的离子阱喷射到质量分析器。在注入静电轨道阱质量分析器的情况下,合适的离子阱的示例是弯曲的线性阱(C阱),例如WO2008/081334中所描述的。另外或替代地,离子阱可用于在平行于的轴的方向上将离子从离子阱喷射到质量分析器。在一些实施例中,离子可以喷射到第一(例如静电离子阱)质量分析器,或者喷射到第二(例如飞行时间)质量分析器,例如第10,699,888号美国专利中所描述的。
第一离子存储器可以在透射模式和累积模式下操作。在透射模式下,离子可以穿过第一离子存储器,而不会在第一离子存储器内累积。在累积模式下,离子可以在第一离子存储器内累积,而不穿过第一离子存储器。第二离子存储器可以在累积模式和关闭(非累积)模式下操作。在累积模式下,离子可以在第二离子存储器内累积。在关闭模式下,可以防止离子进入第二离子存储器,即,离子不在第二离子存储器内累积。
第一离子存储器可具有被配置成控制离子在第一离子存储器中的累积时间的至少一个第一门。至少一个第一门可用于通过以累积模式操作至少一个第一门达期望时间量来控制离子在第一离子存储器中的累积时间,而否则以透射模式操作至少一个第一门。
至少一个第一门可以包括单个门,但至少一个门可以包括多个(例如两个)门。在存在多个门的情况下,可以存在入射门和出射门。在至少一个第一门包括单个门的情况下,以透射模式操作第一离子存储器可包括以打开模式操作单个门,并且以累积模式操作第一离子存储器可包括以关闭模式操作单个门。
在特定实施例中,至少一个第一门是其中形成第一离子存储器的转移离子导向器的出射透镜。第一离子存储器可以通过向出射透镜施加合适的不同电压而以其透射/累积模式操作,例如由此在累积模式下施加到出射透镜的电压使得离子被捕获在离子导向器内,并且在透射模式下施加到出射透镜的电压不会使得离子被捕获在离子导向器内。
第二离子存储器可具有被配置成控制离子在第二离子存储器中的累积时间的至少一个第二门。至少一个第二门可用于通过以累积模式操作至少一个第二门达期望时间量来控制离子在第二离子存储器中的累积时间,而否则以关闭模式操作至少一个第二门。
至少一个第二门可以包括单个门或多个(例如两个)门。在存在多个门的情况下,可以存在入射门和出射门。在至少一个第二门包括单个门的情况下,以累积模式操作第二离子存储器可以包括以打开模式操作单个门,并且以关闭模式操作第二离子存储器可以包括以关闭模式操作单个门。在至少一个第二门包括多个(例如两个)门的情况下,以累积模式操作第二离子存储器可以包括以打开模式操作入射门和以关闭模式操作出射门;并且以关闭模式操作第二离子存储器可以包括以关闭模式操作入射门。
在特定实施例中,至少一个第二门是专用离子门,其被配置成准确地控制离子进入第二离子存储器的累积时间(然而,如上文所描述的,至少一个第一门是离子导向器出射透镜)。因此,至少一个第二门的响应时间(即离子门从完全关闭到完全打开(反之亦然)所花费的时间)可以比至少一个第一门的响应时间更快。例如,至少一个第二门的响应时间可以是约几微秒或几十微秒,而至少一个第一门的响应时间的响应时间可以是约几百微秒。因此,至少一个第二门的准确度可以大于至少一个第一门的准确度。
所述仪器可以按循环方式操作,例如使得连续批次的离子各自在第二离子存储器中累积,并且接着由质量分析器进行分析。所述仪器的合适重复率可以是约几十赫兹或几百赫兹。
如上文所描述的,针对第二离子存储器限定了阈值累积时间,其中阈值累积时间可以基于(例如可以等于、大致等于或小于)仪器的总循环时间与仪器在离子不(并非)在第二离子存储器中累积的模式(或多个模式)下操作的每循环时间之间的差。
离子不(并非)在第二离子存储器中累积的模式可以包含(i)第二离子存储器的关闭模式(非累积模式),即当累积的离子被处理和/或传递到质量分析器进行分析时,和/或(ii)布置在第二离子存储器上游的滤质器的非透射模式,即当滤质器的m/z窗口被改变时。因此,仪器在离子不在第二离子存储器中累积的模式下操作的每循环时间可以包括(i)第二离子存储器在非累积(关闭)操作模式下操作,同时在第二离子存储器中累积的离子被处理和/或传递到质量分析器进行分析的每循环(例如固定的)时间,和/或(ii)滤质器在非透射操作模式下操作的每循环时间。
当确定目标累积时间小于阈值累积时间时,使用基于目标累积时间的累积时间在第二离子存储器内累积离子。累积时间可以等于目标累积时间或可以大致等于目标累积时间(例如,以便考虑其它仪器延迟、切换时间等)。
当确定目标累积时间大于阈值累积时间时,使用基于目标累积时间与阈值累积时间之间的差的第一累积时间在第一离子存储器内累积离子。第一累积时间可以等于目标累积时间与阈值累积时间之间的差或者可以大致等于目标累积时间与阈值累积时间之间的差(例如,以便考虑其它仪器延迟,切换时间等)。
这些累积的离子被传递到第二离子存储器,并且接着使用基于阈值累积时间的第二累积时间在第二离子存储器内累积另外的离子。第二累积时间可以等于阈值累积时间或者可以大致等于阈值累积时间(例如以便考虑其它仪器延迟、切换时间等)。
第二累积时间可以紧跟在第一累积时间之后,或者在第一累积时间与第二累积时间之间可以存在(短的)延迟,例如以允许电子设备切换和/或离子被传递到第二离子存储器的时间。第二累积时间和第一累积时间的总和可以等于或大致等于目标填充时间。
在实施例中,使用基于目标累积时间的累积时间在第二离子存储器内累积离子包括在所述累积时间期间以其透射操作模式操作第一离子存储器,使得离子在所述累积时间期间穿过第一离子存储器,而不会在第一离子存储器中累积。使用基于目标累积时间的累积时间在第二离子存储器内累积离子还可以包括在所述累积时间期间以其累积模式操作第二离子存储器,使得离子在所述累积时间期间在第二离子存储器内累积。
使用第一累积时间在第一离子存储器内累积离子可以包括在第一累积时间期间以其累积模式操作第一离子存储器,使得离子在第一累积时间期间在第一离子存储器内累积。
将累积在第一离子存储器中的离子传递到第二离子存储器可以包括以其透射模式操作第一离子存储器,使得将累积在第一离子存储器中的离子传递到第二离子存储器。将累积在第一离子存储器中的离子传递到第二离子存储器还可以包括以其累积模式操作第二离子存储器,使得从第一离子存储器传递到第二离子存储器的离子在第二离子存储器内累积。
使用第二累积时间在第二离子存储器内累积另外的离子可以包括在第二累积时间期间以其透射模式操作第一离子存储器,使得离子在第二累积时间期间穿过第一离子存储器,而不会在第一离子存储器内累积。使用第二累积时间在第二离子存储器内累积另外的离子还可以包括在第二累积时间期间以其累积模式操作第二离子存储器,使得离子在第二累积时间期间在第二离子存储器内累积。
一个或多个离子光学装置可以包含第一滤质器,例如第一四极滤质器。在这种情况下,第一离子存储器可以布置在第一滤质器上游。如上文所描述的,在控制滤质器以使其传输窗口(的中心质荷比(m/z))在每个仪器循环期间在多个不同的m/z值之间切换的情况下,这允许第一离子存储器在滤质器的传输窗口被改变的时间期间,即当离子未被滤质器传输时用于进行预累积。
一个或多个离子光学装置还可以包含第二滤质器,例如第二四极滤质器。例如,第二滤质器可以是相对低分辨率的“预过滤器”,而第一滤质器可以是相对高分辨率的分析滤质器。在这种情况下,第一离子存储器可以布置在第一滤质器与第二滤质器之间。这允许第二滤质器用于执行对进入第一离子存储器的离子的质量选择,例如以防止第一离子存储器的过度填充。
所述方法可以包括第一滤质器根据离子的质荷比过滤离子,其中第一滤质器使用具有宽度>约2Da、>约3Da、>约5Da或>约10Da的隔离窗口过滤离子。隔离窗口可具有不大于约50Da的宽度。所述方法可以包括使过滤后的离子碎裂或反应,使得在第二离子存储器中累积的离子是碎裂离子。所述方法可以包括将累积在第二离子存储器中的碎裂离子传递到质量分析器,并且使用质量分析器对碎裂离子进行质量分析。因此,在实施例中,质量分析是MS2质量分析。质量分析器可以是静电离子阱质量分析器,并且可以使用<100毫秒,例如64毫秒,或<50毫秒,例如32毫秒、16毫秒或8毫秒的分析器瞬态来执行质量分析。所述仪器可以以>约10赫兹、>约20赫兹、>约40赫兹、>约60赫兹或>约80赫兹的重复率操作。
所述方法可以包括执行独立于数据的采集(DIA)方法,其中采集一组MS2碎裂谱,例如在感兴趣的m/z范围内进行扫描。因此,所述方法可以包括将感兴趣的质量范围分割成多个前体质量片段(例如,每个前体质量片段具有不大于5Da的质量范围),并且对于每个前体质量片段:(i)使前体质量分段内的前体离子碎裂,以及(ii)通过以下方式对碎裂离子执行MS2质量分析:在第二离子存储器中累积碎裂离子,将累积的碎裂离子传递到质量分析器,以及对碎裂离子进行质量分析。
每个质量分析都可能产生时变瞬态信号。例如MS2质谱(或MS1质谱)之类的质谱可以通过使用反卷积技术对瞬态信号进行反卷积而从每个时变瞬态信号产生。在特定实施例中,反卷积技术是高分辨率反卷积技术,例如“相位约束谱反卷积方法”(也称为ΦSDM),即在Grinfeld等人的“用于傅里叶变换质谱法的相位约束谱反卷积(Phase-constrainedspectrum deconvolution for Fourier transform mass spectrometry)”,《分析化学(Anal.Chem.)》,89(2):1202-1211(2017年)以及编号为EP 3,086,354的欧洲专利申请中所描述的,所述欧洲专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
因此,在实施例中,ΦSDM反卷积技术应用于相对短的MS2瞬态信号,其中仪器以相对高的重复率操作。在这些情况下,预累积方法允许在短瞬态时长下维持占空比,从而减轻灵敏度损失(如上文所描述的),而ΦSDM反卷积技术恢复了由短瞬态时长引起的分辨率损失。
如在编号为EP 3,086,354的欧洲专利申请中所描述的,在这些实施例中,对瞬态信号执行傅立叶变换以产生第一组复振幅,其中所述复振幅中的每个复振幅对应于第一组频率中的相应频率。第一组频率可以在频率上具有相等间隔。产生第二组复振幅,其中这些复振幅中的每个复振幅对应于第二组频率中的相应频率。第二组频率可以在频率上具有相等间隔。第二组频率的间隔可以小于第一组频率的间隔(或所述第二组频率的间隔最小)。第二组频率的间隔可以小于瞬态信号的持续时间的倒数(或所述第二组频率的间隔最小)。第二组复振幅可以覆盖(或跨越或对应于)与第一组复振幅的频率范围相同的频率范围,并且因此第二组可以含有比第一组更多的复振幅。因此,第二组复振幅可以提供更大的分辨率。
可以对第二组复振幅进行优化以产生改进的第二组复振幅。来自改进的第二组复振幅中的至少一些复振幅可用于产生质谱。改进的第二组复振幅可以提供更好质量的质谱。
优化第二组复振幅可以包括基于(或依赖于)目标函数改变第二组复振幅中的至少一个复振幅。例如,为了获得目标函数的基本极值,可以改变至少一个复振幅。任选地,来自第二组的所有复振幅可以作为优化步骤的一部分而被改变,或者子集可以作为优化步骤的一部分而被优化。
可以根据约束执行优化。也就是说,对于第二组复振幅中的至少一些复振幅,可以相对于一个或多个预期相位对至少一些复振幅中的每个复振幅的相位施加约束。预期相位可能是频率依赖性的。目标函数可取决于第一组复振幅中的一个或多个复振幅和第二组复振幅中的一个或多个复振幅。对于第一组频率中的每个频率,目标函数可以将第二组的一个或多个复振幅与来自第一组的相应复振幅相关(如通过使目标函数成为第二组的一个或多个复振幅和来自第一组的相应复振幅的函数)。所述约束可以应用于作为优化步骤的一部分而变化的第二组的所有复振幅,或者应用于那些复振幅的子集。
通过产生和优化第二组复振幅,瞬态可以被认为被分解为更精细的频率网格。由于第二组复振幅不与第一组复振幅结合作为这些振幅的线性组合,分辨率随着第二组频率的网格间隔减小而增加。这使得所得质谱的准确度大大提高。换句话说,ΦSDM方法可以被认为以两组频率进行操作。第一组频率可以包括最小间隔为1/T的频率,其中T是瞬态信号的持续时间。第二组频率可以包括最小间隔小于1/T的频率。第二组频率可以含有作为子集的第一组。由于第二组频率的最小间隔小于第一组频率的最小间隔,因此第二组复振幅可以提供更大的分辨率。
应理解,“复数”应理解为与可以用实部和虚部表示的数有关。虚部可以是零,即复数,如本文所使用,涵盖实数。
ΦSDM方法的一个优点是所产生质谱的可积分性。换句话说,所有峰的强度,包括已解析和未解析的,都是守恒的。这样,避免了由相邻峰的干扰引起的常规傅里叶变换方法的抑制效果。因此,在需要高度准确的强度信息的情况下,ΦSDM方法特别有用。此外,可以对较短的瞬态进行计算,从而提高仪器的速度和吞吐量。
在一些实施例中,执行傅立叶变换的步骤包含在频域中对傅立叶变换瞬态信号加窗,其中第一组复振幅对应于加窗的傅立叶变换瞬态信号。所述加窗可以包括将加窗函数应用于第一组复振幅。通常,应用加窗函数包含通过相应频率下的加窗函数的值来缩放第一组复振幅中的每个复振幅。另外或替代地,加窗可以包括丢弃其相应频率在一个或多个预定义范围之外的复振幅。例如,其相应频率高于瞬态信号的奈奎斯特(Nyquist)频率的第一组复振幅中的复振幅可以被丢弃和/或设置为零。
有利地,这可以允许增加处理速度和减少计算负担,因为后续处理可以仅限于感兴趣的区域。对于足够稀疏的频谱或足够稀疏的感兴趣片段,可以仅在封装这些区域的频谱窗口内进行计算。
另一方面提供了一种存储计算机软件代码的非暂时性计算机可读存储介质,所述计算机软件代码在处理器上执行时执行上文所描述的方法。
另一方面提供了一种用于例如质谱仪之类的分析仪器的控制系统,所述控制系统被配置成使分析仪器执行上文所描述的方法。
另一方面提供了一种分析仪器,例如质谱仪,其包括上文所描述的控制系统。
另一方面提供了一种分析仪器,例如质谱仪,其包括:
第一离子存储器;
第二离子存储器,其中第二离子存储器布置在第一离子存储器下游;以及
控制系统,其被配置成:
确定所述第二离子存储器的目标累积时间是否大于阈值累积时间;
当确定所述目标累积时间小于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间的累积时间使得在所述第二离子存储器内累积离子;并且
当确定所述目标累积时间大于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间与所述阈值累积时间之间的差的第一累积时间使得在所述第一离子存储器内累积离子,使得将累积在所述第一离子存储器内的所述离子传递到所述第二离子存储器,并且使用基于所述阈值累积时间的第二累积时间使得在所述第二离子存储器内累积另外的离子。
这些方面和实施例可以并且在实施例中确实包含本文所描述的任选特征中的任意一个或多个或每一个。
附图说明
现在将参考附图更详细地描述各种实施例,在附图中:
图1示意性地示出了可以根据实施例操作的质谱仪;
图2示意性地示出了可以根据实施例操作的质谱仪;
图3示意性地示出了可以根据实施例操作的质谱仪;
图4示出了操作图2或图3的质谱仪的已知方法;
图5A示出图4的方法,图5B示出了根据实施例的操作图2或图3的质谱仪的方法,并且图5C示出了根据实施例的操作图2或图3的质谱仪的方法;
图6示出了根据实施例的操作质谱仪的方法;
图7示出了根据实施例的操作质谱仪的方法;
图8示出了在根据实施例操作时施加到图2或图3的质谱仪的分流透镜、弯曲平极出射透镜和C阱出射透镜的电压;
图9示出使用图2的质谱仪在启用和未启用预累积模式的情况下操作进行分析时对荧蒽的离子电流的估计;
图10A示出使用图2的质谱仪在禁用预累积模式的情况下操作所获得的分离m/z524MRFA肽的碎裂谱,并且图10B示出使用图2的质谱仪在启用预累积模式的情况下操作所获得的分离m/z 524MRFA肽的碎裂谱;
图11示出使用图2的质谱仪在启用和未启用预累积模式的情况下操作所获得的离子电流损耗与重复率的关系图;
图12示出使用图2的质谱仪在启用和未启用预累积模式的情况下操作所获得的对200纳克海拉细胞(HeLa)消化物进行一小时色谱分离所鉴定的肽和蛋白质组的数量的逐一比较;并且
图13A示出使用图3的质谱仪在禁用预累积模式的情况下以200赫兹操作所获得的分离m/z 524MRFA肽的碎裂谱,并且图13B示出使用图3的质谱仪在启用预累积模式的情况下以200赫兹操作所获得的分离m/z 524MRFA肽的碎裂谱。
具体实施方式
图1示意性地示出了可以根据实施例操作的质谱仪。如图1所示,质谱仪包含离子源10、一个或多个离子转移级20、离子阱30和质量分析器40。
离子源10被配置成从样品中产生离子。离子源10可以是任何合适的连续或脉冲离子源,例如电喷雾电离(ESI)离子源、MALDI离子源和大气压电离(API)离子源、等离子体离子源、电子电离离子源、化学电离离子源等。可以提供和使用多于一个的离子源。离子可以是待分析的任何合适类型的离子,例如小的和大的有机分子、生物分子、DNA、RNA、蛋白质、肽、它们的碎裂片段等。
离子源10可耦合到例如液相色谱分离装置或毛细管电泳分离装置(未示出)之类的分离装置,使得在离子源10中电离的样品来自分离装置。
离子转移级20布置在离子源10下游并且可以包含大气压接口和一个或多个离子导向器、透镜和/或其它离子光学装置,其被配置成使得由离子源10产生的一些或全部离子可以从离子源10转移到离子阱30。离子转移级20可以包含任何合适数量和配置的离子光学装置,例如任选地包含一个或多个RF和/或多极离子导向器、用于冷却离子的一个或多个离子导向器、一个或多个质量选择离子导向器等。
离子阱30布置在离子转移级20下游并且被配置成接收和累积来自离子源10的离子(经由一个或多个离子转移级20)。离子阱30可以包括任何合适类型的离子阱,例如多极(例如四极)离子阱。
在一些实施例中,离子阱30在离子进入阱的轴向方向(从而限定阱轴)上是细长的。离子可以通过将RF电压施加到阱的捕获(例如杆)电极而被径向地捕获在阱30中。离子阱30可以是或可以包含弯曲的线性离子阱(C阱),即其中捕获杆电极是弯曲的。然而,离子阱30可以是或可以包含任何其它合适类型的离子阱,例如线性离子阱。
离子阱30包含入射透镜或门32和出射透镜或门34。入射透镜32可以以离子(来自离子源10)可以通过入射透镜并进入离子阱30的打开模式操作,或者以离子(来自离子源10)不能通过入射透镜32并且不进入离子阱30的关闭模式操作。当入射透镜32以其关闭模式操作时,已经在离子阱30内的离子将不能经由入射透镜32离开离子阱。类似地,出射透镜34可以以离子可以通过出射透镜并离开离子阱30的打开模式操作,或者以离子不能通过入射透镜并且不离开离子阱的关闭模式操作。入射透镜32(出射透镜34)可以通过向入射透镜32(出射透镜34)施加合适的电压来关闭或打开。
通过以其关闭模式操作出射透镜34,同时以其打开模式操作入射透镜32,可将来自离子源10的离子累积在离子阱30中。在离子进入离子阱30所需的离子填充时间之后,可以关闭入射透镜32(通过改变施加到入射透镜32的电压),使得离子不能从离子阱30中通过,并且使得来自离子的离子源10不能再进入离子阱30。因此,质谱仪被配置成使得离子可以以可调整的累积时间(填充时间)累积在离子阱30中。通过控制离子进入阱的填充时间,其中进入阱30的离子通量是已知的或可以是近似的,可以控制离子阱30中累积的离子的总数量。
一旦累积在离子阱30中,离子阱内的离子可以被喷射到质量分析器40中。离子可以在轴向方向上从离子阱30中喷射出来,或者离子可以在与离子阱的轴正交的方向上从离子阱30中喷射出来(正交喷射),例如通过向离子阱30施加一个或多个合适的DC电压。
质量分析器40布置在离子阱30下游并且被配置成从离子阱30接收离子。质量分析器被配置成分析离子以确定它们的质荷比和/或质量,即产生离子的质谱。质量分析器40可以是离子阱质量分析器,例如静电轨道阱,并且更具体地是由赛默飞世尔科技公司制造的OrbitrapTM FT质量分析器。替代地,质量分析器40可以是飞行时间(ToF)质量分析器,例如多反射飞行时间(mr-ToF)质量分析器。
应注意,图1仅仅是示意性的,并且质谱仪可以并且在实施例中确实包含任意数量的一个或多个额外部件。例如,在特定实施例中,质谱仪包含碰撞或反应池。所述仪器可包含单个质量分析器,或多于一个的(例如两个)质量分析器。
同样如图1所示,质谱仪处于例如适当编程的计算机之类的控制单元50的控制下,所述控制单元控制质谱仪的各种部件的操作,并且例如设置要施加到质谱仪的各种部件的电压。控制单元50还可以接收和处理来自包含检测器在内的各种部件的数据,例如对检测到的信号执行傅里叶变换。控制单元50尤其被配置成确定用于将离子注入质量分析器40以进行分析扫描的设置(例如离子阱30填充时间等)。
可以操作质谱仪,使得来自离子源10的连续批次的离子各自由质量分析器40进行分析。每批离子首先在离子阱30中累积,并且接着将累积的离子(或例如从累积的离子衍生的碎裂离子)注入质量分析器40。
可能期望由质量分析器40分析的每批离子包含尽可能多的离子,例如以便改进质谱的统计。然而,在相对高的离子浓度下可能会出现非期望的空间电荷效应,并且可能会限制质量分辨率和质量准确度。因此,离子阱30中累积的离子总数量被控制以优化注入质量分析器40的离子数量低于但尽可能接近质量分析器40的极限,例如质量分析器40的空间电荷极限。累积在离子阱30中的离子总数量也可以或替代地被控制为低于离子阱30的极限,例如离子阱30的空间电荷极限。通常,应该存储5x103与1x106之间的基本电荷,例如1x104与1x106之间,或1x105与5x105之间。
然而,可能是来自离子源10的离子通量变化很大的情况。在离子源10耦合到例如液相色谱或毛细管电泳装置之类的分离装置的情况下尤其如此,其中来自离子源10的离子通量可以随时间变化几个数量级。
因此,尽管进入阱30的离子通量是可变的,但实施例使用所谓的自动增益控制(AGC)技术来精确控制在离子阱30中累积的离子总数量。这些技术通常依赖于对由离子阱30正在接收的当前离子电流或离子通量的准确且可靠的实时估计。然后,通过控制离子阱30的填充时间T,可以适当地控制在离子阱30中累积(并注入到质量分析器40中)的离子总数量或电荷总量。
因此,对于每批离子,可基于对离子阱30正在接收的当前离子电流或离子通量的估计来确定目标累积时间T,并且离子可在离子阱30中累积达等于目标累积时间T的时间量。
图2和3更详细地示出可以根据实施例操作的两个示例质谱仪。应理解,图2和3中所示的仪器是非限制性示例,并且可以有多种变型。
在图2所描绘的实施例中,仪器的离子源10是电喷雾电离(ESI)离子源。所述仪器包含真空界面,所述真空界面包含转移管21、离子漏斗22、四极预过滤离子导向器23和“弯曲平极”离子导向器24。弯曲平极离子导向器24可以是第9,536,722号美国专利中所描述的设计。
所述仪器还包含呈四极滤质器26形式的滤质器、呈弯曲的线性离子阱(“C阱”)形式的离子阱30a和呈离子路由多极碰撞池(“IRM”)形式的碰撞池30b。来自离子源10的离子可以通过打开和关闭位于电荷检测器组件27中的门控电极在C阱30a和/或碰撞池30b中累积,所述电荷检测器组件布置在C阱30a与滤质器26之间。
所述仪器还包含呈轨道离子阱质量分析器形式的质量分析器40a。如图2所示,轨道阱40a包括沿轨道阱轴伸长的内部电极41和一对分开的外部电极42、43,所述一对外部电极围绕内部电极41并在其间定义捕获体,在所述捕获体中通过围绕内部电极41进行轨道运动来捕获和振荡离子,向所述内部电极施加捕获电压,同时沿阱的轴来回振荡。一对外部电极42、43用作检测电极,以检测由捕获体中的离子的振荡引起的图像电流,从而提供检测信号。
外部电极42、43典型地被用作检测电极的差分对,并且耦合到差分放大器(未在图2中示出)的相应输入,所述差分放大器又形成数字数据采集系统的一部分以接收检测信号。可以使用傅立叶变换来处理检测信号以在阱内获得离子的质谱。
一旦累积在离子阱30a和/或碰撞池30b中,离子就可以被喷射到质量分析器40a中。为此,离子可以在正交于阱的轴的方向上从阱30a喷射(正交喷射),例如通过将一个或多个合适的DC电压施加到离子阱30a。离子可经由一个或多个透镜和偏转电极注入到质量分析器40a中。质量分析器40a布置在离子阱30a下游并且被配置成从离子阱30a接收离子(经由一个或多个透镜和偏转电极)。
碰撞或反应池30b布置在离子阱30a下游。收集在离子阱30a中的离子可以在不进入碰撞或反应池30b的情况下被正交地喷射到质量分析器40a,或者离子可以被轴向地传输到碰撞或反应池30b以进行处理,然后将处理后的离子返回到离子阱30a以用于随后正交喷射到质量分析器40a。所述处理可以包括,例如,通过与碰撞池30b中的碰撞气体和/或试剂碰撞来使离子碎裂,或者通过与确实使得离子碎裂的较低能量的气体碰撞来进一步冷却离子。
转到图3,图3中描绘的质谱仪与图2的质谱仪基本上类似。然而,图3中描绘的质谱仪包含额外的飞行时间(ToF)质量分析器,其形式为多反射飞行时间(ToF)质量分析器40b,已添加到仪器的后部。这种杂交仪器在第10,699,888号美国专利中有更详细的描述。在图3所描绘的仪器中,分析器是第9,136,101号美国专利中描述的倾斜镜式分析器,但可应理解,可以使用任何类型的ToF分析器。
如图3所示,仪器包含多极离子导向器31以允许离子从碰撞池30b转移到飞行时间质量分析器40b。飞行时间质量分析器40b包含提取阱44,由此离子经由多极离子导向器31从碰撞池30b传送到提取阱44。离子在提取阱44中累积和冷却。
提取阱44可以并入两个捕获区,一个处于相对较高的压力下用于进行快速离子冷却,并且另一个处于第二低压区域用于离子提取。离子在高压区冷却,并且接着转移到低压区,在那里它们经由一对偏转器45脉冲喷射到ToF分析器中。离子在一对镜46之间振荡,这些镜相对彼此倾斜,使得离子路径缓地慢偏转并重新定向回到检测器47。校正条状电极48抵消了原本由反射镜的不平行引起的离子聚焦损失。
现代质谱仪以越来越快的重复率运行,从而允许在更短的实验中实现高性能,并且处理更多的样品。对重复率的主要限制是仪器灵敏度,因为收集足够的样品离子进行分析通常需要一定的累积时间,如处理这些离子进行分析所需的时间、分析时间本身和/或电子设备在分析物目标之间切换所需的时间。
在图2所描绘的仪器中,由电喷雾电离(ESI)离子源10产生的离子在由四极滤质器26进行质量选择之前必须穿过真空界面,即转移管21、离子漏斗22、四极预过滤器离子导向器23和弯曲平极离子导向器24,并且在离子阱30a和/或碰撞池30b中累积和/或碎裂。离子接着可以被传递回C阱30a并且被脉冲喷射到质量分析器40a中,在那里它们被分析。在常规操作中,在40赫兹的最大允许重复率下或每25毫秒时,最大累积时间仅为10毫秒,占空比仅为40%。
在质量分析器40a中测量的离子越长,分析器的分辨率越高并且灵敏度越高。对于通常主导大多数应用的MS2(离子碎裂)测量,不需要非常高的分辨率,但需要高重复率和灵敏度。因此,对于这些测量,通常使用相对短的16毫秒质量分析器瞬态,以m/z 200提供大约7500的分辨率。较短的瞬态仍然可行,但此时仪器操作开销和良好分辨光谱所需的离子累积时间将仪器的重复率限制在大约40赫兹。
仪器的操作可以并行化以最大化效率。值得注意的是,质量分析器40a中的离子测量周期本身非常耗时,并且通常与C阱30a和碰撞池30b中的离子加载和处理过程分离。进一步的并行化阶段是剩余离子光学器件的电压切换以及离子通过它们转移到离子门。
图4示出了这些主要的并行操作及其大致定时。值得注意的是,离子累积时间完全与相对缓慢的离子处理操作有关。
如上文所描述的,商用仪器的重要特征是精确控制注入C阱30a和质量分析器40a的离子数量,此过程称为自动增益控制(AGC)。这是在C阱30a之前通过电荷检测组件27内的非常快速的束偏转离子门对填充时间的精细控制来执行的。所述门通常准确到大约30微秒(或更小),但更先进的双门设计(例如第8,026,475号美国专利中描述的)准确到大约1-2微秒。如上文所描述的,由于离子束强度的巨大变化以及C阱30a和质量分析器40a的有限动态范围,需要这种精确控制。
本发明人现在已经认识到现有仪器设计的问题在于当仪器以相对高的重复率操作时存在相对差(<50%)的占空比。这会降低快速和/或低样品负载实验的灵敏度,并且会阻止获得更高的静态重复率。出现此问题的主要原因可在图4中看到。离子累积时间与C阱/IRM离子处理和重置串联运行,这是非常耗时的操作,并且会阻止C阱30a进行离子累积。
虽然这个问题在飞行时间仪器(例如图3中描绘的仪器)中可能不那么严重,但这些仪器有自己的计时问题。特别地,本发明人已经认识到问题在于用于切换前端电子部件和四极部件26以适应不同的m/z目标离子并将它们转移到C阱30a的潜在的长时间周期。在图3所描绘的仪器中,提取阱44中离子的转移和处理在相对长的时间段,大约3毫秒内阻塞阱。结合大约1毫秒来准备四极部件26,这在所需的200赫兹/5毫秒重复率下留给离子累积的时间非常少。
实施例解决了由于不可并行仪器操作强加的对离子累积时间的限制而在高重复率下灵敏度损失的问题。具体地,实施例解决了与C阱/IRM离子处理和重置序列产生的时间开销以及仪器前端(即离子漏斗/预过滤器/弯曲平极部件/四极部件)的m/z目标切换和离子转移时间相关联的问题。
根据各种实施例,在一个或多个离子转移级20内添加并联离子累积级。可以在一个或多个离子转移级20的任何合适的级内提供预累积级。例如,参考图2和3,离子漏斗、预过滤器23、弯曲平极离子导向器24或滤质器26可以作为预累积离子阱操作。在其它仪器设计中,可以这种方式使用等效或类似的离子转移级(例如,双级离子漏斗的第二部分)。预累积离子的过程可以与C阱/IRM组件的慢速离子处理操作并行运行。这允许显著的额外有效填充时间。
参考图2和3,在特定实施例中,平行离子累积级设置在弯曲平极离子导向器24内。弯曲平极离子导向器24特别适合用作大容量捕获装置,因为它结合了四极RF捕获场和用于引导离子的叠加DC梯度。弯曲平极离子导向器24还拥有端透镜25,所述端透镜可以进行电压切换以充当粗略离子门。
因为与电荷检测组件27中的专用离子门相比,端透镜25(或其它仪器设计中的等效物)是相对缓慢的装置,因此它只能粗略地控制离子定时,并且因此不适合在短填充时间内执行精确的AGC。因此,为了保持AGC准确性,如果所需填充时间低于例如对应于所需重复率可以经由现有技术累计方法支持的最大填充时间之类的阈值填充时间,则可以禁用使用弯曲平极端透镜25的预累积。
这可以通过将通过打开的离子门27的填充时间定义为主填充时间,并且将弯曲平极离子导向器24内的额外填充时间定义为辅助填充时间来完成。然后将总填充时间分配到主级,直到达到最大值(例如大约10毫秒),并且接着将剩余时间分配到辅助级。通过这种方式,保持了线性,并且仅在很长的填充时间内损失了绝对AGC精度,在这种情况下,这变成了小的比例损失。
因此,在实施例中,在两个独立的位置控制离子累积。对于图2和3中所示的质谱仪,离子累积已经在C阱/IRM 30中执行,并且由位于电荷检测器组件27内的门控电极控制。额外的累积级被实施用于弯曲平极部件24内的离子累积,并且由施加到弯曲平极出射透镜25的电压控制。这个额外的捕获序列可以与在C阱/IRM 30内处理的前一离子包并行运行,否则离子将被丢弃和浪费。
图5示出现有技术操作顺序(图5A)与本实施例(图5B)之间的比较。每个箭头描述离子在一系列操作中通过仪器的大致运动,并且每个并行操作系列都有单独的箭头。应理解,图5是简化的描述,因为仪器实际上非常复杂,但充分示出了最相关的阶段。在图5B中,仅向弯曲平极部件24添加了辅助填充时间。然而,由于它被添加到了短暂的第一阶段,在这个阶段在时间上与其它两个阶段相等并开始占据主导地位之前,还有很多空闲时间。
应注意,图5的描述的限制是,它示出平行的主填充时间和辅助填充时间,而实际上它们从同一源10抽取离子并且总的来说必须比总的重复率短。
图5C示出使用本文所描述的技术变得可行的替代定时。在图5C中,主填充时间可以缩短到2毫秒,并且重复率增加到大约75赫兹。使用现有技术的累积方法将发生的不可接受的占空比损失通过相对长的辅助填充周期来消除。
有益的是,可以在扫描之间无缝地禁用预累积方案。如上文所描述的,要足够准确地控制离子数量,需要将强离子电流的填充时间控制在大约30微秒或更短。然而,根据实施例的经由透镜25的门控比这慢得多(因此作为不太准确的门控开关(guillotine)),通常需要大约100微秒来打开/关闭。因此,对于目标填充时间相对短的强离子束,期望完全不进行任何预累积过程。在实施例中,在预累积由主填充时间之前的次填充时间控制的情况下,比主填充时间的最大值短的填充时间将给出为零的辅助填充时间,因此弯曲平极部件24的出射透镜25一直不会关闭。对于超过此最大值的填充时间,接着可以开始引入辅助填充时间。
图6示出在主填充与辅助填充之间划分总离子累积时间的优先顺序。本质上,在使用辅助填充之前,主填充应达到或接近最大值。以此方式,辅助填充的不准确性仅影响长时间累积的离子电流测量,其中定时误差成比例地小,因此对总体误差的影响相对较小。
此外,应使用此方法最大化离子负载随填充时间变化的线性响应。然而,应注意,可以提供和使用对切换点周围的小误差的校正。例如,为了考虑到弯曲平极出射透镜25的切换时间,可能需要在其最短填充时间上添加小(例如大约100微秒)的额外打开时间。
图7示出了根据实施例的方法。如图7所示,首先将期望累积时间T与离子阱的阈值累积时间Tt进行比较(步骤101),并且确定期望累积时间T是否大于阈值累积时间Tt(步骤102)。如上文所描述的,阈值累积时间Tt可以设置为等于、大致等于或小于仪器的总循环时间与仪器在离子不(并非)在离子阱30中累积的模式(或多个模式)下操作的每循环时间之间的差。
如果期望累积时间T小于或等于阈值累积时间Tt,则使用期望累积时间T将离子累积在主离子阱中(步骤103),即以“正常”方式。
然而,如果期望累积时间T大于阈值累积时间Tt,则使用辅助累积时间在辅助离子阱中预累积离子,所述辅助累积时间大致等于期望累积时间T与阈值累积时间Tt之间的差(即T减去Tt)(步骤104)。接着将累积在辅助离子阱中的这些离子传递到主离子阱(步骤105)。最后,使用大致等于阈值累积时间Tt的累积时间在主离子阱中累积额外的离子(以补充在辅助阱中累积并传递到主阱的离子)(步骤106)。因此,离子的总累积时间大致等于所需的累积时间,即(T-Tt)+Tt=T。
返回到图5,在仪器的早期预滤质器(例如弯曲平极部件24)级提供预累积的另一个优点可以从如何打破相对长的“电子开关+离子转移”阶段中看出。自然地,离子从源10行进到弯曲平极部件24所花费的时间比从源10行进到IRM 30b所花费的时间少。如果例如四极电子设备是最慢的部分,则电子设备切换时间也可以得到改善,如现有商用仪器上的情况。这可以将通常花费>4毫秒的阶段减少到总共只需要1或2毫秒的并行化阶段。
此外,在实施例中,预累积级在预过滤器23下游。有利的是,预过滤器23允许对进入弯曲平极部件24的离子进行粗略的质量选择,从而将不需要的离子所带来的空间电荷负载减少,例如减少大约90%,从而防止当以累积模式运行时装置的过度填充,否则这也可能阻碍主滤质器26的作用。
预累积方法的简单版本被编程并应用于图2所示类型的OrbitrapTM仪器。在所述方法中,对于所有碎裂谱,主填充时间设置为固定的10毫秒,并且辅助填充时间设置为由仪器重复率定义的剩余可用时间。
图8示出了打开和关闭分离透镜27(“束控制”)和弯曲平极出射透镜25的定时,它们控制主累积时间和次累积时间,以及C阱出射透镜的操作定时。如图8所示,在主注入过程(“束控制”)结束时,弯曲平极出射透镜25从-10V的传输电压设置为+10V的捕获电压。当离子被加载到IRM 30b时施加到C阱出射透镜的电压从小的负电压移动到当离子从IRM 30b返回到C阱30a时的轻微的正斜升电压。然后在分析器40注入循环开始时将电压脉冲化至+250V,并且接着将其设置为复位。
图9示出在预累积模式下从禁用切换到启用时对荧蒽的离子电流的估计。在图9中,使用轨道离子阱质量分析器40根据质量分析测量估计离子电流。可以看出,由于占空比加倍,离子电流大致加倍。
图10示出分离m/z 524MRFA肽的碎裂谱,其中预累积被设置为禁用状态(图10A)和启用状态(图10B)。可以看出,两个碎裂谱图在存在的碎裂离子和相对离子丰度方面非常类似。然而,当由于占空比增加而激活预累积时,“归一化最大峰”值,即最大峰的离子电流测量值增加了一倍以上。
图11示出当启用或禁用预累积方法时离子电流损失(归一化为48赫兹)与重复率的比较。如上文关于图5C所描述的,通过降低主填充时间来增加仪器重复率,从而使循环时间从21毫秒降至13毫秒。经由估计的总填充时间和离子峰信噪比测量背景离子的电流,从而可以估计具有更高重复率的信号的变化。
可以看出,在没有预累积的情况下,仪器的灵敏度在高重复率下迅速下降,但在启用预累积的情况下,灵敏度仅损失70Hz以上的信号的大约10%。据认为,这可能与从弯曲平极部件24清除捕获离子的效率有关,并且当仅使用短的主填充时间(<3毫秒)时让它们通过四极部件26。
图12示出了蛋白质组学应用中使用的预累积方法,在这种情况下,以几个不同的方法参数对200纳克海拉细胞消化物的复杂样品进行一小时色谱分离。图12示出预累积和标准方法的鉴定的肽和蛋白质组数量的逐一比较。左侧的数据适用于以120K MS1和15KMS2分辨率以及23毫秒填充时间操作的仪器。中间的数据适用于以60K MS1和7.5K MS2分辨率以及10毫秒填充时间操作的仪器。右侧的数据适用于以120K MS1和7.5K MS2分辨率以及10毫秒填充时间操作的仪器。
尽管这些长时间、高浓度的分离对此技术来说相对不利(因为信号和时间不是如此极端的限制因素),但已鉴定的肽和蛋白质组的数量明显且持续增加。在一个示例中,MS1分辨率为120K,并且MS2分辨率为7.5K,肽鉴定的改进幅度高达29%。
简单的预累积方法被移植到图3所示类型的飞行时间质谱仪。所述仪器在200Hz下操作,定时开销为3毫秒,大约是使用弯曲平极捕获级进行快速前体切换和离子转移的下限(没有的下限甚至更高,3.5-4毫秒)。剩余的2毫秒设置为离子注入时间。
图13示出进行和不进行预累积的碎裂MRFA的信号比较。图13表明,对于这些定时,当使用预累积时,离子信号增加了一倍以上。对于独立于数据的累积,前体选择仅以很小的步骤移动,这些定时开销可能会减少到约1.5毫秒,并且占空比优势将更为温和,但仍相当可观。
应理解,实施例涉及按顺序使用两个填充时间,任选地不准确的填充时间用于预累积,而准确的填充时间用于主离子阱(C阱/IRM)累积。这允许无缝切换操作,其中并行扫描与非并行扫描混合以实现短填充时间或AGC预扫描,以保持准确的离子群控制和线性度。
有益的是,这可以为快速(例如40Hz)实验提供加倍的仪器灵敏度,并且还消除更快采集的主要瓶颈,允许在高达75Hz的频率下进行灵敏测量。通过优化,仍然可以达到80-100赫兹的更高速率。此技术无需更改硬件即可应用于现有仪器。所述方法特别适用于快速、低样品负载的实验。
尽管上面已经描述了各种具体实施例,但是各种替代实施例是可能的。
例如,虽然上面的各种实施例是根据ObitrapTM仪器描述的,但是实施例适用于其它仪器设计。如上文参考图1所描述的,通用仪器布局包括离子源、界面、门、阱和分析器。预累积可能发生在界面的一部分,或者至少在控制累积的门之前。在这些实施例中,可以使用界面离子光学装置代替用于预累积的弯曲平极部件24,所述界面离子光学装置可以包含范围广泛的多极离子导向器/阱,连同叠环、离子漏斗或离子毯式装置。
在这些实施例中,所述仪器可以包括滤质器,例如在界面与门之间。滤质器可以位于门之前或之后,但为了准确门控工作,必须有至少一个离子门与预累积装置分开。这存在于一些q-ToF仪器中,这些仪器可能会在离子积聚在其碰撞池中之前对离子进行门控,接着碰撞池充当阱。
门也可以集成到阱中,例如,在ToF提取之前,门控由碰撞池的出射透镜控制。
如上文所描述的,各种实施例的“预累积”方法可以显著提高分析仪器的灵敏度。然而,在OrbitrapTM分析器的上下文中出现了相关问题,因为在相对较高的重复率下,即在相对较短(例如8毫秒或16毫秒)的OrbitrapTM分析器瞬态,灵敏度优势最为明显(尽管在32毫秒时,所述方法仍提供大约1/3的离子信号增加)。对于这些瞬态时长,OrbitrapTM分析器的分辨率相对较低,特别是在m/z 200时为3750和7500,并且在更高的m/z时迅速下降。
对于上文所描述的独立于数据的采集(DIA)方法,灵敏度增益超过了分辨率下降带来的损失。然而,独立于数据的采集(DIA)方法正变得越来越突出,特别是在高吞吐量的情况下,它们显示出优异的结果。在OrbitrapTM仪器上,DIA方法几乎从不使用16毫秒瞬态,而是通常使用32毫秒或64毫秒,即使是短LC梯度也是如此。虽然在这些方法中对低水平物种的敏感性当然是重要的考虑因素,但分辨率是关键因素,7500对于某些应用来说可能太低。为了区分复杂谱中的干扰峰,可能需要更高的分辨率,碎裂质量准确度也是这些方法在低信噪比下的重要因素。
因此,由于高分辨率和灵敏度要求限制了重复率,导致OrbitrapTM分析器在高通量DIA实验中表现相对较差,因此出现了问题。
OrbitrapTM分析器信号处理的一项重大进步是开发了所谓的“相位约束频谱反卷积”方法或“ΦSDM”,例如在Grinfeld等人的“用于傅里叶变换质谱法的相位约束谱反卷积(Phase-constrained spectrum deconvolution for Fourier transform massspectrometry)”,《分析化学》,2017年,89,1202-1211以及编号为EP 3,086,354的欧洲专利申请中所描述的,所述欧洲专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。虽然在计算上比标准“eFT”法更昂贵,但它具有使给定瞬态时长的分辨率倍增的特性,可以更可靠地分配峰丰度和位置,并减少干扰峰的影响。
ΦSDM“超分辨率”谱处理对分离的DIA蛋白质组学实验具有实质性的有益影响。然而,仅ΦSDM的缺点是它对提高仪器的灵敏度没有任何作用,因此,尽管它在较短的OrbitrapTM分析器瞬态下提供了高分辨率,但在常规方法中,灵敏度仍会下降。因此,它与常规的16毫秒和8毫秒瞬态不兼容,其中OrbitrapTM分析器占空比下降,离子累积时间和信号/噪声的正常减少是由更快的重复率所要求的(如上文所描述)。这种限制可能比对大量处理能力的要求更为繁重。
在实施例中,将上文所描述的预累积方法和ΦSDM过程组合,特别是对于高吞吐量DIA法。这种组合也可以用于类似DIA的DDA方法,例如隔离窗口很宽且挑战类似的情况。预累积方法允许在短瞬态时长下维持占空比,减轻灵敏度损失,而ΦSDM技术会恢复分辨率损失。这两种方法共同将瞬态下限从32毫秒降低到16毫秒甚至8毫秒,从而实现高重复率,达到甚至>70赫兹,这对于高通量和/或短LC梯度分析是有益的。
在这些实施例中,可以使用如图2或图3中所示的OrbitrapTM质谱仪,其耦合到液相色谱装置以提供分离的样品,通常是生物蛋白质样品的胰蛋白酶消化物。如上文所描述的,这些仪器通常具有通过提取阱(C阱)30a的操作来阻止离子累积的配置。
同样上文所描述的,图5B和5C示出用于16毫秒和8毫秒的瞬态预累积的经过修改的仪器操作顺序和定时。通过首先将离子注入弯曲平极部件24中,产生了可以在C阱/IRM30忙碌时运行第二平行离子累积级。在40Hz操作时,占空比增加一倍以上,并且在75Hz时,占比增加五倍。离子捕获和释放通过切换弯曲平极出射透镜25上的电压来控制,例如从+10V切换到-10V。
然后可以经由ΦSDM技术分析收集到的OrbitrapTM分析器瞬态数据(MS和/或MS/MS谱)。
所述仪器可以操作其它常规DIA方法,由此在整个质量范围内的预编程扫描中获取一系列预累积MS/MS碎裂谱,并且进行任选的全MS扫描以定量前体。全MS扫描不需要使用预累积技术,但可以这样做。
ΦSDM技术可应用于MS和/或MS/MS谱。当使用长瞬态时,使用外部处理器的ΦSDM可能会降低整个系统的速度,这与全MS扫描的情况一样。因此,在一些实施例中,ΦSDM技术仅用于MS/MS扫描(而不用于MS扫描),即以便保持速度。
可以特别受益于组合技术的实验包含使用短LC梯度的实验,例如需要高重复率的小于30分钟(例如3-15分钟)的实验,以及使用大量样品(例如约50-2000纳克)的实验。非常低的样品负载(例如<10纳克或<1纳克)会产生短瞬态可能加剧的敏感性问题,并且因此通常使用宽隔离窗口和长瞬态进行研究。隔离窗口同样最好不要非常窄,尽管对于DIA可以使用低至2。对于MS/MS,OrbitrapTM分析器的瞬态时长可能约为8-32毫秒,以便通过预累积和ΦSDM的组合提供特别的改进。全MS OrbitrapTM分析器瞬态可能更长,例如32-128毫秒。
在一些实施例中,ΦSDM技术可仅应用于质谱的特定区域,例如质谱的特别拥挤的区域,例如前体区域或低信号/噪声峰的区域,这些区域将受益于更高质量准确度。在这种情况下,可以首先产生规则的轮廓谱,并且询问要应用ΦSDM的区域。这样的过滤器可以帮助减少所述方法的计算负载。
应理解,预累积方法和ΦSDM技术的结合使OrbitrapTM仪器与短瞬态兼容,并且由此与快速DIA实验兼容。这种好处是协同的,因为两者必须一起使用才能发挥作用。常规OrbitrapTM仪器通常不适合高扫描速率,特别是对于DIA实验,因为占空比、信号的损失和分辨率的相应损失会引起间隔很近的峰之间的干扰。通过应用预累积方法,解决了占空比问题,但分辨率仍然降低。然而,应用ΦSDM技术可以将其恢复到正常、合适的水平。
应理解,由于较短的瞬态,仍可能存在离子累积时间的损失,然而对于短LC梯度,这不是什么大问题,因为离子电流通常相当高。
尽管这些实施例特别适用于DIA方法,但它们也可能对高通量DDA有益,其中隔离窗口足够宽以至于谱复杂,分辨率变得很重要。
其它类似的高分辨率反卷积技术可以以相同的方式使用,例如最小二乘法拟合方法,即如Kozhinov等人(2022年)的文章“超分辨率质谱法能够在MS2水平上实现快速、准确和高度复用的蛋白质组学(Super-resolution mass spectrometry enables rapid,accurate,and highly-multiplexed proteomics at the MS2-level)”,生物学预印本资料库(bioRxiv)中所描述的。此技术报告了与ΦSDM在属性和性能上的一些类似之处。
尽管已经参考各种实施例描述了本发明,但是应理解,在不脱离如所附权利要求中所阐述的本发明的范围的情况下可以进行各种改变。
Claims (25)
1.一种操作分析仪器的方法,所述分析仪器包括第一离子存储器和布置在所述第一离子存储器下游的第二离子存储器,所述方法包括:
确定所述第二离子存储器的目标累积时间是否大于阈值累积时间;
当确定所述目标累积时间小于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间的累积时间在所述第二离子存储器内累积离子;以及
当确定所述目标累积时间大于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间与所述阈值累积时间之间的差的第一累积时间在所述第一离子存储器内累积离子,将累积在所述第一离子存储器内的所述离子传递到所述第二离子存储器,并且使用基于所述阈值累积时间的第二累积时间在所述第二离子存储器内累积另外的离子。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述仪器包括至少一个第一门和至少一个第二门,所述至少一个第一门被配置成控制离子在所述第一离子存储器中的累积时间,所述至少一个第二门被配置成控制离子在所述第二离子存储器中的累积时间,其中所述至少一个第二门的响应时间比所述至少一个第一门的响应时间快。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述仪器包括离子源和布置在所述离子源与所述第二离子存储器之间的一个或多个离子光学装置,其中所述一个或多个离子光学装置被配置成将来自所述离子源的离子传输到所述第二离子存储器,并且其中所述第一离子存储器布置在所述一个或多个离子光学装置内。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述第一离子存储器形成在所述一个或多个离子光学装置的转移离子导向器中。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述第二离子存储器是离子阱,例如线性离子阱。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述仪器包含布置在所述第二离子存储器上游的第一滤质器,并且其中所述第一离子存储器布置在所述第一滤质器上游。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述仪器包含布置在所述第一滤质器上游的第二滤质器,其中所述第二滤质器的分辨率小于所述第一滤质器的分辨率,并且其中所述第一离子存储器布置在所述第一滤质器与所述第二滤质器之间。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其进一步包括所述第一滤质器根据其质荷比过滤离子,其中所述第一滤质器使用宽度>约2Da的隔离窗口过滤离子。
9.根据权利要求8所述的方法,其进一步包括使过滤后的离子碎裂或反应,其中累积在所述第二离子存储器中的所述离子是碎裂离子。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述仪器包括布置在所述第二离子存储器下游的质量分析器,并且其中所述方法包括将累积在所述第二离子存储器中的离子传递到所述质量分析器,并且使用所述质量分析器分析所述离子。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述质量分析器是静电离子阱质量分析器或飞行时间质量分析器。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中分析所述离子的所述质量分析器产生时变瞬态信号,并且其中所述方法进一步包括使用相位约束谱反卷积法(ΦSDM)从所述时变瞬态信号产生质谱。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述时变瞬态信号具有<50毫秒的持续时间。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述仪器以循环方式操作,并且其中所述阈值累积时间基于所述仪器的总循环时间与所述仪器在离子不在所述第二离子存储器中累积的模式下操作的每循环时间之间的差。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述仪器在离子不在所述第二离子存储器中累积的模式下操作的所述每循环时间包括在所述第二离子存储器中累积的离子被处理和/或传递到质量分析器以进行分析的同时所述第二离子存储器在非累积操作模式下操作的每循环时间。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其进一步包括以>20赫兹、>40赫兹、>60赫兹或>80赫兹的重复率操作所述仪器。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中使用基于所述目标累积时间的累积时间在所述第二离子存储器内累积离子包括:
在所述累积时间内以透射操作模式操作所述第一离子存储器,使得离子在所述累积时间期间穿过所述第一离子存储器,而不会在所述第一离子存储器内累积;以及
在所述累积时间期间以累积模式操作所述第二离子存储器,使得离子在所述累积时间期间在所述第二离子存储器内累积。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中使用所述第一累积时间在所述第一离子存储器内累积离子包括:
在所述第一累积时间期间以累积模式操作所述第一离子存储器,使得离子在所述第一累积时间期间在所述第一离子存储器内累积。
19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中将累积在所述第一离子存储器中的所述离子传递到所述第二离子存储器包括:
以透射模式操作所述第一离子存储器,使得累积在所述第一离子存储器中的离子被传递到所述第二离子存储器;以及
以累积模式操作所述第二离子存储器,使得从所述第一离子存储器传递到所述第二离子存储器的离子在所述第二离子存储器内累积。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中使用所述第二累积时间在所述第二离子存储器内累积另外的离子包括:
在所述第二累积时间内以透射模式操作所述第一离子存储器,使得离子在所述第二累积时间内穿过所述第一离子存储器,而不会在所述第一离子存储器内累积;以及
在所述第二累积时间期间以累积模式操作所述第二离子存储器,使得离子在所述第二累积时间期间在所述第二离子存储器内累积。
21.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中当确定所述目标累积时间等于所述阈值累积时间时,所述方法包括使用基于所述目标累积时间的累积时间在所述第二离子存储器内累积离子。
22.一种存储计算机软件代码的非暂时性计算机可读存储介质,所述计算机软件代码在处理器上执行时执行根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法。
23.一种用于例如质谱仪之类的分析仪器的控制系统,所述控制系统被配置成使所述分析仪器执行根据权利要求1至21中任一权利要求所述的方法。
24.一种分析仪器,例如质谱仪,其包括根据权利要求23所述的控制系统。
25.一种分析仪器,例如质谱仪,其包括:
第一离子存储器;
第二离子存储器,其中所述第二离子存储器布置在所述第一离子存储器下游;以及
控制系统,其被配置成:
确定所述第二离子存储器的目标累积时间是否大于阈值累积时间;
当确定所述目标累积时间小于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间的累积时间使得在所述第二离子存储器内累积离子;并且
当确定所述目标累积时间大于所述阈值累积时间时:使用基于所述目标累积时间与所述阈值累积时间之间的差的第一累积时间使得在所述第一离子存储器内累积离子,使得将累积在所述第一离子存储器内的所述离子传递到所述第二离子存储器,并且使用基于所述阈值累积时间的第二累积时间使得在所述第二离子存储器内累积另外的离子。
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