DE102017218253A1

DE102017218253A1 - Präparatives Verfahren zur Isolierung von natürlichen Fruchtsäuren

Info

Publication number: DE102017218253A1
Application number: DE102017218253.9A
Authority: DE
Inventors: Renate Richter; Paul Pietsch
Original assignee: Hochschule Anhalt (fh) Hochschule fur Angewandte Wissenschaften; Hochschule Anhalt Fh Hochschule fur Angewandte Wss
Current assignee: Hochschule Anhalt (fh) Hochschule fur Angewandte Wissenschaften; Hochschule Anhalt Fh Hochschule fur Angewandte Wss
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-04-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein präparatives Verfahren zur Isolierung von Fruchtsäuren mittels Umkehrphasenchromatographie, ein Fruchtsäurekonzentrat umfassend L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure, wobei das Fruchtsäurekonzentrat eine Fraktion eines Fruchtsafts oder eines Fruchtsaftkonzentrats ist, und die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung eines Fruchtsäurekonzentrats.

Description

Die Erfindung betrifft ein präparatives Verfahren zur Isolierung von Fruchtsäuren mittels Umkehrphasenchromatographie, ein Fruchtsäurekonzentrat umfassend L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure, wobei das Fruchtsäurekonzentrat eine Fraktion eines Fruchtsafts oder eines Fruchtsaftkonzentrats ist, und die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung eines Fruchtsäurekonzentrats.
Aufgrund der steigenden Nachfrage auf dem Lebensmittelmarkt, der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie nach wertgebenden, natürlichen Inhaltsstoffen, wie Vitaminen, Farbstoffen, Aromen, Fettsäuren und Fruchtsäuren werden neue Verfahren zur Isolierung natürlicher Inhaltsstoffe gebraucht.
Ziel ist unter anderem die Entwicklung von Verfahren zur spezifischen Isolierung von ausgewählten Fruchtinhaltsstoffen wie Fruchtsäuren, insbesondere Citronensäure.
Bisherige Verfahren zur Gewinnung von Fruchtsäuren sind fermentative Verfahren, wie das Emersverfahren, das aerobe Submersverfahren oder die Fermentation von Paraffinen Beim aeroben Submersverfahren dienen Melasse oder Traubenzucker als Substrat. Bei einem alternativen Verfahren mit speziellen Heferassen werden Paraffine (aus Erdöl) als Quelle eingesetzt. Die erzielten Ausbeuten sind höher als bei der Kohlenhydratfermentation. Nachteilig ist die gleichzeitige Bildung von Isocitronensäure und Oxalsäure in zum Teil erheblichem Ausmaß. Bei beiden Produktionsverfahren erfolgt die Produktgewinnung über die Ausfällung der als Nebenprodukt entstandenen Oxalsäure durch Zugabe von Kalk, Abtrennen der Oxalsäuresalzes, nochmalige Kalkzugabe und Freisetzen der Citronensäure mit Schwefelsäure aus dem gebildeten Calciumcitrat (Moeller und Strehlitz 2008). Nachteile dieser Verfahren sind hohe Energiekosten, eine hohe Umweltbelastung (Schwermetalle und Gips) und die Kontamination durch Oxalsäure. Weiterhin ist ein Fermentationsprozess nachteilig, da die Ausbeute, Produktqualität und Reinheit durch zahlreiche Faktoren wie der Rohstoffqualität, dem pH-Wert und dem Temperaturbereich, Stickstoffquellen, Metallionen und Nebenprodukten der Fermentation (u. a. niedermolekularen Alkoholen) beeinflusst werden.
Ein weiteres Verfahren zur Citronensäuregewinnung ist die Fällung als Calciumcitrat (Moeller und Strehlitz 2008). Der Citronensaft wird mit konzentrierter Ammoniaklösung versetzt, eingedickt und filtriert. Das leicht lösliche Ammoniumcitrat wird durch Fällung mit Calciumchlorid in schwer lösliches Calciumcitrat umgewandelt und filtriert. Durch die Behandlung mit Schwefelsäure entsteht Calciumsulfat (Gips) und Citronensäure. Durch den Einsatz von Lösungsmitteln, zeitaufwendigen Verfahrens- bzw. Filtrationsschritten ist dieser Herstellungsschritt aus ökonomischen und lebensmittelrechtlichen Aspekten nachteilig. Weiterhin fallen zahlreiche Mengen von Calciumsulfat an, die einen kostenintensiven Entsorgungsschritt notwendig machen.
US 5426220 A und US 4334095 A beschreiben die Lösungsmittelextraktion von Citronensäure aus einer wässrigen Lösung mit Hilfe eines mit Wasser unmischbaren organischen Extraktionsmittels in einer mehrstufigen Gegenstrom-Extraktionsoperation. In der Regel werden nicht wasserlösliche Amine mit mindestens 20 Kohlenstoffatomen eingesetzt (z. B. Trilaurylamin, Tricaprylylamin). Hierbei entsteht ein Salzkomplex aus Amin und Citronensäure. Die Citronensäure wird durch eine wässrig, chemisch und Temperatur geführte Rückextraktion aus diesem Salzkomplex gewonnen. Nachteilig ist der Einsatz eines organischen Lösungsmittels.
Eine Alternative bietet die Elektrodialyse zur Isolierung von natürlichen Fruchtsäuren. Mit Hilfe von lonenaustauschermembranen lassen sich ionogene Bestandteile in wässrigen Lösungen unter Anlegung einer elektrischen Potentialdifferenz abtrennen (Strathmann und Chmiel 1984).
DE 19755426 A1 beschreibt die selektive Abtrennung von Oxalsäure gegenüber Citronen- und Weinsäure aus Rharbarbersaft. Als Konzentrierungsverfahren verwendeten Ling et al. die Elektrodialyse zur Anreicherung von Citronensäure um das Doppelte aus einer Lösung mit 21 g/L (Ling et al. 2002). Belafi-Bakó et al. fraktionieren L-Äpfelsäure aus einem Fermentationsmedium mittels Elektrodialyse (Belafi-Bakó et al. 2004).
Eine Alternative zur Trennung von natürlichen Fruchtinhaltsstoffen bieten chromatographische Verfahren, wobei eine große Herausforderung in der Ermittlung geeigneter Trennmaterialien mit einer ausreichenden Selektivität besteht. Herkömmliche Verfahren nutzen verschiedenste Ionenaustauscher.
EP 1 348 037 B2 beschreibt ein Verfahren zur chromatographischen Trennung von Kohlenhydraten, insbesondere Mono-, Di- oder Oligosacchariden und Zuckeralkoholen, unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes.
Das Dokument McFeeters et al. offenbart die Verwendung der Umkehrphasenchromatographie unter wässrigen Bedingungen zur Trennung von Zuckern und organischen Säuren, insbesondere Fruchtsäuren (McFeeters et al. 1984).
Ein Verfahren zur Isolierung von natürlichen Fruchtsäuren aus Fruchtsaft oder Fruchtsaftkonzentraten wird nicht beschrieben.
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Isolierung von Fruchtsäuren aus Fruchtsaft oder Fruchtsaftkonzentraten bereitzustellen.
Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein natürliches Fruchtsäurekonzentrat mit einem hohen Fruchtsäuregehalt bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein präparatives Verfahren zur Isolierung von Fruchtsäuren mittels Chromatographie umfassend die Schritte

a) Bereitstellen einer Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat,
b) Bereitstellen eines Chromatographiesystems umfassend eine stationäre Phase und eine wässrige mobile Phase, wobei die stationäre Phase eine Umkehrphase mit polarer Selektivität ist, eine Partikelgröße von 5 µm bis 50 µm und einen Säuleninnendurchmesser von 8 mm bis 1,0 m aufweist, wobei die wässrige mobile Phase einen pH-Wert von pH 6 bis pH 7 aufweist,
c) Injektion der Lösung in das Chromatographiesystem, und
d) Elution mindestens einer Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure.

Vorteilhaft werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren natürliche Fruchtsäuren mit hohen Ausbeuten, bevorzugt mit einer Ausbeute von 90 % bis 100 % bezogen auf die Fruchtsäure in der Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder Fruchtsaftkonzentrat, und einer hohen Produktivität, bevorzugt mit einer Produktivität an Feststoff von mindestens 40 g/(min·l) isoliert.
Erfindungsgemäß erfolgt das Verfahren mit einer Reihenfolge der Schritte a), b), c) und d) oder b), a), c) und d).
Erfindungsgemäß wird unter einem präparativen Verfahren ein Verfahren zur Isolierung von reinen Verbindungen aus Mischungen verschiedener Verbindungen verstanden. Unter reinen Verbindungen werden Verbindungen mit oder ohne Lösemittel verstanden, bevorzugt mit einem Gehalt im Bereich von 50 % bis 100 % (m/v); deren Gehalt an weiteren Verbindungen maximal 5 % (m/v), bevorzugt maximal 1,5 % (m/v) beträgt.
Erfindungsgemäß werden unter Fruchtsäuren natürlich in Früchten, Fruchtsäften und/oder Fruchtsaftkonzentraten vorkommende organische Hydroxycarbonsäuren oder Dicarbonsäuren verstanden. In einer Ausführungsform ist die mindestens eine Fruchtsäure aus Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Oxalsäure und/oder Weinsäure ausgewählt.
Bevorzugt ist die mindestens eine Fruchtsäure L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure.
Unter Chromatographie wird ein Verfahren zur Trennung von Mischungen verschiedener Verbindungen durch die unterschiedliche Verteilung der Verbindungen zwischen einer stationären und einer mobilen Phase verstanden. Bevorzugt ist die Chromatographie eine Flüssigchromatographie. In einer Ausführungsform ist die Chromatographie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Vorteilhaft weist eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie einen geringen Verbrauch der mobilen Phase auf.
Unter Fruchtsaft oder Fruchtsaftkonzentrat wird eine Flüssigkeit umfassend mindestens eine Frucht verstanden, deren Fruchtgehalt mindestens 100 % beträgt.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens ist die Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat aus Zitronensaft, Zitronensaftkonzentrat, Sauerkirschsaft oder Sauerkirschsaftkonzentrat ausgewählt.
Bevorzugt weist die Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat 0,5 °Brix bis 50 °Brix auf, bevorzugt 25 °Brix bis 37,5 °Brix. Unter „°Brix“ wird eine Maßeinheit für die relative Dichte einer Flüssigkeit verstanden Die Bestimmung der relativen Dichte einer Flüssigkeit erfolgt mit einem Refraktometer.
Besonders bevorzugt ist die Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat ein Sauerkirschsaftkonzentrat mit 25 °Brix oder ein Zitronensaftkonzentrat mit 37,5 °Brix.
Unter einer stationären Phase wird eine unbewegliche feste oder flüssige Substanz verstanden, an der durch Wechselwirkungen eine Trennung von Mischungen verschiedener Verbindungen im chromatographischen Verfahren stattfindet. Bevorzugt ist die stationäre Phase eine feste Substanz in Form einer gepackten Säule.
Unter einer Umkehrphase wird eine unpolare und/oder hydrophobe stationäre Phase verstanden, wobei als mobile Phase eine polare Substanz verwendet wird. Bevorzugt sind Umkehrphasen Kieselgel oder Polymere mit unpolaren Seitenketten. In einer Ausführungsform sind Umkehrphasen aus Kieselgelen mit Alkylgruppen, bevorzugt Butylgruppen, Octylgruppen, Octadecylgruppen oder Phenylgruppen ausgewählt.
Unter polarer Selektivität wird eine stationäre Phase verstanden, welche eine hohe Selektivität bei polaren Verbindungen aufweist, bevorzugt eine stationäre Phase mit einem Kohlenstoffgehalt von maximal 18 % (m/m).
Bevorzugt weist die stationäre Phase einen Kohlenstoffgehalt von 11 % bis 17 % (m/m), besonders bevorzugt 13 % (m/m), auf.
In einer Ausführungsform weisen Umkehrphasen mit polarer Selektivität kovalent gebundene polare funktionelle Gruppen auf. In einer Ausführungsform erfolgt die kovalente Bindung der funktionellen Gruppen innerhalb der unpolaren Seitenketten und/oder endständig an der unpolaren Seitenkette. In einer Ausführungsform sind Umkehrphasen mit polarer Selektivität aus Kieselgelen mit Alkylamingruppen, Alkylcyanogruppen oder Alkyldiolgruppen ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform weisen Umkehrphasen mit polarer Selektivität Kieselgel oder Polymere mit einer geringen Dichte unpolarer Seitenketten und/oder kurzen unpolaren Seitenketten auf.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens weist die stationäre Phase eine monomere Octadecylmodifizierung auf. Vorteilhaft ist die monomere Octadecylmodifizierung hydrophob. Weiterhin vorteilhaft weist die monomere Octadecylmodifizierung eine pH-Stabilität im Bereich von pH 1 bis pH 9 auf. Vorteilhaft wird mittels stationärer Phase mit monomerer Octadecylmodifizierung eine hohe Selektivität der Isolierung mindestens einer Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure erreicht.
Besonders bevorzugt ist die stationäre Phase Nucleodur C18 Gravity-SB (Firma Machery Nagel).
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens weist die stationäre Phase ein Endcapping auf. Unter einem Endcapping wird die Modifizierung von Silanolgruppen des Kieselgels durch Umsetzung mit kurzkettigen Silanen, bevorzugt Trimethylsilan, verstanden.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens weist die stationäre Phase kein polares Endcapping auf. Unter einem polaren Endcapping wird die Modifizierung von Silanolgruppen des Kieselgels durch Umsetzung mit kurzkettigen Silanen mit polaren funktionellen Gruppen, z. B. Dimethylsilan mit einer polaren funktionellen Gruppe, verstanden, wobei die Hydrophilie der stationären Phase erhöht wird.
Erfindungsgemäß weist die stationäre Phase eine Partikelgröße im Bereich von 5 µm bis 50 µm auf, bevorzugt im Bereich von 5 µm bis 16 µm. Unter Partikelgröße wird der durchschnittliche Durchmesser der Partikel der stationären Phase verstanden.
Erfindungsgemäß weist die stationäre Phase einen Säuleninnendurchmesser im Bereich von 8 mm bis 1,0 m, bevorzugt 40 mm, auf. Unter Säuleninnendurchmesser wird der Durchmesser einer gepackten Säule der stationären Phase verstanden.
Bevorzugt weist die stationäre Phase eine Partikelgröße von 5 µm bei stationären Phasen mit einem Säuleninnendurchmesser im Bereich von 10 mm bis 40 mm auf. Weiterhin bevorzugt weist die stationäre Phase eine Partikelgröße im Bereich von 10 µm bis 50 µm bei stationären Phasen mit einem Säuleninnendurchmesser im Bereich von 40 mm bis 1,0 m auf.
In einer Ausführungsform weist die stationäre Phase eine Porenweite im Bereich von 60 Å bis 2000 Å, bevorzugt 110 Å bis 120 Å, auf. Unter Porenweite wird der durchschnittliche Durchmesser der Poren der stationären Phase verstanden.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens weist die stationäre Phase eine Porosität von 0,6 bis 0,8 auf, bevorzugt bei stationären Phasen mit einem Säuleninnendurchmesser im Bereich von 10 mm bis 40 mm. Unter Porosität wird das Verhältnis des Volumens der Poren zum gesamten Volumen der stationären Phase verstanden. Die Bestimmung der Porosität kann aus dem Verhältnis des Volumens der mobilen Phase V_mobil und des Säulenvolumens V_gesamt bzw. mittels der Totzeit t₀ der Säule und der Strömungsgeschwindigkeit v berechnet werden: $ε = \frac{V_{mobil}}{V_{gesamt}} = \frac{ν \cdot t_{0}}{V_{gesamt}} .$
Die Bestimmung der Totzeit t₀ der Säule erfolgt mittels einer Substanz, die nicht in die Poren der stationären Phase eindringt und nicht wechselwirkt, z. B. Dextran T 2000 mit einer mittleren Molmasse von 1.950.000 g/mol.
Unter einer mobilen Phase wird eine bewegliche flüssige Substanz verstanden. Vorteilhaft löst und transportiert die mobile Phase die zu trennende Mischung von Verbindungen im chromatographischen Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die wässrige mobile Phase Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, besonders bevorzugt ist die wässrige mobile Phase Wasser.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens erfolgt die Injektion der Lösung in das Chromatographiesystem in Schritt c) unter Konzentrations- und/oder Volumenüberladung der Chromatographiesäule. Unter einer Konzentrationsüberladung wird eine Erhöhung der Konzentration einer Probe bei konstantem Injektionsvolumen verstanden. Unter einer Volumenüberladung wird eine Erhöhung des Injektionsvolumens einer Probe bei konstanter Konzentration verstanden. In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens erfolgt die Injektion der Lösung in das Chromatographiesystem in Schritt c) mit einer Konzentrationsüberladung im Bereich von 0,5 °Brix bis 50 °Brix und/oder mit einer Volumenüberladung in Abhängigkeit von dem Säulenvolumen, bevorzugt im Bereich von 20 µl bis 6,1 I, besonders bevorzugt im Bereich von 10 ml bis 6 I.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Injektion der Lösung in das Chromatographiesystem in Schritt c) durch Stackinjektion. Unter Stackinjektion wird die mehrfache, geschachtelte Injektion einer Probe verstanden. Vorteilhaft erfolgt durch eine Stackinjektion eine Verringerung von Zeit und Lösemittelverbrauch.
In einer Ausführungsform des präparativen Verfahrens werden Schritt c) und Schritt d) kontinuierlich oder diskontinuierlich, bevorzugt diskontinuierlich, durchgeführt.
Bevorzugt umfasst die Elution mindestens eine Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure in Schritt d) die Vereinigung der mindestens einen Fraktion umfassend die mindestens eine Fruchtsäure. Unter einer Fraktion wird ein Teil einer Mischung verschiedener Verbindungen, insbesondere der Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat, verstanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weist die mindestens eine Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure einen Gehalt an L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure von 50 % bis 99 % (m/v), bevorzugt einen L-Äpfelsäuregehalt von 50 % bis 97 % (m/v) oder einen Citronensäuregehalt von 85 % bis 97 % (m/v), auf. In einer Ausführungsform des Verfahrens weist die mindestens eine Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure einen Gehalt an Glucose von maximal 1,5 % (m/v), einen Gehalt an Fructose von maximal 1,5 % (m/v) und einen Gehalt an Saccharose von maximal 1,5 % (m/v), bevorzugt einen Gehalt an Glucose, Fructose und Saccharose von maximal 1,5 % (m/v), besonders bevorzugt einen Gehalt an Glucose von 0 % bis 1,2 % (m/v), einen Gehalt an Fructose von 0 % bis 1,1 % (m/v) und einen Gehalt an Saccharose von 0 % bis 0,5 % (m/v), auf. In einer Ausführungsform des Verfahrens weist die mindestens eine Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure einen Gehalt an Ascorbinsäure und/oder an Polyphenolen von maximal 0,5% (m/v), bevorzugt von maximal 0,1 % (m/v), auf.
In einer Ausführungsform des Verfahrens erfolgt Schritt d) unter Rückführung der mobilen Phase.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren mindestens einen weiteren Schritt, wobei der weitere Schritt zwischen Schritt c) und Schritt d) erfolgt und eine Elution mindestens einer weiteren Fraktion umfassend mindestens einen Zucker ist, wobei der mindestens eine Zucker ausgewählt ist aus Glucose, Fructose und/oder Saccharose.
Vorteilhaft wird mittels des Verfahrens eine hohe Selektivität der Trennung mindestens einer Fraktion umfassend mindestens einen Zucker und mindestens einer Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure erreicht.
Unter einem Zucker wird ein süß schmeckendes Kohlenhydrat, insbesondere ein Monosaccharid oder Disaccharid, verstanden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die mindestens eine weitere Fraktion umfassend mindestens einen Zucker weiterhin Sorbit.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren mindestens einen weiteren Schritt, wobei der weitere Schritt aus einer Konzentrierung und/oder Reinigung, bevorzugt einer Filtration und/oder Vakuumverdampfung, ausgewählt ist. Bevorzugt umfasst das Verfahren eine Konzentrierung und/oder Reinigung der mindestens einen Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure, besonders bevorzugt einer Filtration und/oder Vakuumverdampfung der mindestens einen Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Fruchtsäurekonzentrat umfassend L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure, wobei das Fruchtsäurekonzentrat eine Fraktion eines Fruchtsafts oder eines Fruchtsaftkonzentrats ist, wobei das Fruchtsäurekonzentrat einen L-Äpfelsäuregehalt und/oder Citronensäuregehalt von 50 % bis 99 % (m/v) aufweist, wobei das Fruchtsäurekonzentrat einen Glucosegehalt, Fructosegehalt und/oder Saccharosegehalt von maximal 1,5% (m/v) aufweist.
Vorteilhaft ist das Fruchtsäurekonzentrat natürlich und/oder weist natürliche Inhaltsstoffe auf. Weiterhin vorteilhaft weist das Fruchtsäurekonzentrat keine Modifizierungen oder Zusätze von Verbindungen auf, welche durch biotechnologische oder chemische Synthese hergestellt wurden.
Vorteilhaft weist das Fruchtsäurekonzentrat einen Gehalt an Ascorbinsäure und/oder an Polyphenolen von maximal 0,5 % (m/v), bevorzugt von maximal 0,1 % (m/v), auf.
In einer Ausführungsform umfasst das Fruchtsäurekonzentrat weiterhin Wasser.
Bevorzugt besteht das Fruchtsäurekonzentrat aus L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure, Glucose und/oder Fructose und/oder Saccharose, und Wasser, besonders bevorzugt aus L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure und Wasser.
In einer Ausführungsform ist das Fruchtsäurekonzentrat ein Citronensäurekonzentrat, ein L-Äpfelsäurekonzentrat oder ein Citronensäure- und L-Äpfelsäurekonzentrat.
In einer Ausführungsform umfasst das Citronensäurekonzentrat Citronensäure. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das L-Äpfelsäurekonzentrat. L-Äpfelsäure oder L-Äpfelsäure und Citronensäure.
Erfindungsgemäß weist das Fruchtsäurekonzentrat einen Gehalt an L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure von 50 % bis 99 % (m/v) auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Fruchtsäurekonzentrat einen L-Äpfelsäuregehalt von 50 % bis 97 % (m/v) oder einen Citronensäuregehalt von 85 % bis 97 % (m/v) auf.
Erfindungsgemäß weist das Fruchtsäurekonzentrat einen Gehalt an Glucose von maximal 1,5 % (m/v), einen Gehalt an Fructose von maximal 1,5 % (m/v) und einen Gehalt an Saccharose von maximal 1,5 % (m/v) auf, bevorzugt einen Gehalt an Glucose, Fructose und Saccharose von maximal 1,5 % (m/v) auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Fruchtsäurekonzentrat einen Glucosegehalt von 0 % bis 1,2 % (m/v), einen Fructosegehalt von 0 % bis 1,1 % (m/v) und einen Saccharosegehalt von 0 % bis 0,5 % (m/v) auf.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder eines Chromatographiesystems umfassend eine stationäre Phase, wobei die stationäre Phase eine Umkehrphase mit polarer Selektivität ist, eine Partikelgröße von 5 µm bis 50 µm und einen Säuleninnendurchmesser von 8 mm bis 1,0 m aufweist, zur Herstellung eines Fruchtsäurekonzentrats, bevorzugt eines Citronensäurekonzentrats und/oder L-Äpfelsäurekonzentrats.
Für die Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
Figurenliste
Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.
Dabei zeigt die

1 das Chromatogramms von Zitronensaftkonzentrat entsprechend dem präparativen Verfahren zur Isolierung von Citronensäure (Ausführungsbeispiel 1).

Ausführungsbeispiel 1: Präparatives Verfahren zur Isolierung von Citronensäure

Die Isolierung von Citronensäure erfolgt ausgehend von einem Zitronensaftkonzentrat mit 50 °Brix mittels Flüssigchromatographie und der Verfahrensparameter entsprechend Tabelle 1. Tabelle 1: Präparatives Verfahren zur Herstellung von Frucht-Citronensäure

Lösung umfassend Fruchtsaft oder Fruchtsaftkonzentrat	Zitronensaftkonzentrat (ZSK, 50 °Brix)
Stationäre Phase	Nucleodur C18 Gravity-SB (250 x 32 mm, 5 µm)
Mobile Phase	Wasser
Fließgeschwindigkeit (ml/min)	21,4
Temperatur (°C)	22
Injektionsvolumen (ml)	10
Injektionsverfahren	„Stack“-Injektion nach jeweils 365 ml Elutionsvolumen

Das Zitronensäurekonzentrat mit 50 °Brix wird auf 37,5 °Brix verdünnt und in das Chromatographiesystem MPLC-RID (Medium-Pressure-Chromatographiesystem) BioLogic DuoFlow 10-System (Bio-Rad Laboratories) injiziert. Vorteilhaft weist die verwendete Umkehrphase eine hohe Selektivität zwischen den Fruchtsäuren und Zuckern auf.
Beim Stack-Injektionsverfahren wird nach der ersten Injektion und einem Elutionsvolumen von 365 ml eine weitere Injektion von 10 ml für ZSK durchgeführt. Weitere Injektionen sind nach jeweils 365 ml Injektionsvolumen möglich. 1 zeigt das entsprechende Chromatogramm mit der Elution der mindestens einen Fraktion umfassend mindestens einen Zucker 1, insbesondere Glucose und Fructose, und der Elution der mindestens einen Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure 2, insbesondere Citronensäure.
Nach einem Elutionsvolumen von 125 ml beginnt die Fraktionssammlung bis zum Ende des chromatographischen Laufs bei 460 ml. Die Fraktion 1 umfasst ein Volumen von 50 ml, Fraktion 2 bis 5 jeweils 10 ml und Fraktion 6 bis 10 jeweils 50 ml.
Die durch das Stack-Injektionsverfahren (siehe Tabelle 2) gesammelten Citronensäure-reichen Fraktionen 3 bis 7 werden zusammengeführt. Das Citronensäurekonzentrat wird aus der Lösung der gesammelten Fraktionen durch Vakuumverdampfung auf ein Fünftel des Gesamtvolumens erzeugt.
Das Kristallisat wird nach den folgenden Verfahrensschritten hergestellt: Erwärmung und Verdünnung des Citronensäurekonzentrats bei einer Temperatur von unter 100 °C, Einstellung der Lösung auf die Sättigungstemperatur, langsames Abkühlen zur Erreichung des Sättigungszustandes, Zugabe von Saatkristallen, Abkühlen der Lösung bei konstanter Kühlrate (1 K/h) sowie Filtration und Waschung der Kristalle. Tabelle 2: Analysendaten der Fraktionen aus dem präparativen Batch-Verfahren

Fraktion	V_Fraktion (ml)	c_D- Fructose (g/L)	c_D- Glucose (g/L)	c_Saccharose (g/L)	Anteil an Gesamtzucker (%)	c_{Citronensäure} (g/L)	Anteil Citronensäure (%)
1	50	0,01	0,008	0,002	97,5		-
2	10	-	-	0,0005	2,5	1,7	0,6
3	10	-	-			40,9	13,3
4	10	-	-			50,7	16,5
5	10	-	-			14,2	23,1
6	50	-	-			7,8	12,7
7	50	-	-			5,0	8,1
8	50	-	-			3,1	5,0
9	50	-	-			2,5	4,0
10	50	-	-			1,1	1,8

Insgesamt werden im präparativen Batchverfahren durch „Stack“-Injektion 0,9 L ZSK entsprechend Tabelle 3 verarbeitet. Für die Citronensäureisolierung werden insgesamt 54 L Wasser benötigt. Der Eluentenverbrauch für die Citronensäure beläuft sich auf 170 ml/g. Durch den Konzentrierungsschritt werden 83 % des Wassers dem Prozess zurückgeführt Demzufolge verringert sich der Eluentenverbrauch auf 21 ml/g Citronensäure. Die Ausbeute der Citronensäure beträgt 90 %. Die Konzentration der Citronensäure in der Citronensäurelösung betrug 11 g/L, was einer Produktverdünnung von ca. 28 entspricht. Tabelle 3: Prozessdaten des Verfahrens zur Gewinnung von Citronensäure (CS)

Parameter	Prozessdaten
V_ZSK(L)	872
V_Eluent(L)	54
Anteil an recycelbarem Prozesswasser (%)	83
Rec_CS (%) m_CS (g)	90 316
c_CS in gesammelten Fraktionen (g/L)	11
Verd (-)	28
Pr (g/h L_Solid)	43
V_{CS-Fraktionen} (L)	30
EC (ml/g)	170
EC nach Konzentrierung (ml/g)	21

Weiterhin erfolgt eine Vakuumkonzentration der Citronensäurefraktion. Eine Gegenüberstellung der Analysendaten aus dem Rohstoff ZSK und dem Produkt des Citronensäurekonzentrates ist in Tabelle 4 aufgelistet. Tabelle 4: Vergleich der Analysendaten von Zitronensaftkonzentrat (ZSK) und Citronensäurekonzentrat

	ZSK (Rohstoff)	Citronensäurekonzentrat (Produkt)	Citronensäurekristallisat
lösliche TS (°Brix)	49,6 +/- 0,6	-
Citronensäure (%)	41,0 +/- 0,8	85,9 +/- 0,9	97,8 +/- 1,1
Citronensäure in TS (%)	83 +/- 1,0	97 +/- 0,7	97,8 +/- 1,1
D-Fructose (%)	7,5 +/- 0,2	1,2 +/ -0,4	0,47 +/- 0,4
D-Glucose (%)	5,3+/-0,1	1,1 +/- 0,3	nd
Saccharose (%)	1,1 +/- 0,2	nd	nd
Wasser (%)	50 +/- 0,5	11 +/- 0,4	0,6 +/- 0,1

Das Citronensäurekonzentrat setzt sich aus 86 % Citronensäure, 2,3 % Gesamtzucker (D-Fructose, D-Glucose und Saccharose) und 11 % Wasser zusammen. Das entspricht einem Gehalt an Citronensäure von ca. 97 % in der Trockensubstanz.
Ausführungsbeispiel 2: Präparatives Verfahren zur Isolierung von L-Äpfelsäure

Die Isolierung von L-Äpfelsäure erfolgt ausgehend von einem Sauerkirschsaftkonzentrat mit 25 °Brix mittels Flüssigchromatographie mit MPLC-RID (Medium-Pressure-Chromatographiesystem) BioLogic DuoFlow 10-System (Bio-Rad Laboratories) und der Verfahrensparameter entsprechend Tabelle 5. Tabelle 5: Präparatives Verfahren zur Herstellung von natürlicher L-Äpfelsäure

Rohstoff	Sauerkirschsaftkonzentrat (ZSK, 25 °Brix)
präparative Säule	Nucleodur C18 Gravity-SB (250 x 32 mm, 5 µm, Spezialanfertigung)
Eluent	Wasser
Fließgeschwindigkeit (ml/min)	21,4
Temperatur (°C)	22
Injektionsvolumen (ml)	5
Injektionsverfahren	„Stack“-Injektion nach jeweils 365 ml Elutionsvolumen

Analog dem Verfahren zur Isolierung von Citronensäure (siehe Ausführungsbeispiel 1) wird ein Batchverfahren mit „Stack-Injektion“ zur Isolierung von L-Äpfelsäure angewandt (siehe Tabelle 5). Die präparativen Methodenparameter entsprechen der Isolierung von Citronensäure mit Ausnahme des Injektionsvolumens von 5 ml. Als Rohstoff fungierte Sauerkirschsaftkonzentrat. In Tabelle 6 sind die Analysendaten von dem Rohstoff und dem Produkt L-Äpfelsäurekonzentrat. verglichen. Der Gehalt der L-Äpfelsäure im Konzentrat wird durch Verdampfen erhöht und die L-Äpfelsäure als Kristallisat isoliert werden. Tabelle 6: Vergleich der Analysendaten von Sauerkirschsaftkonzentrat und L-Äpfelsäurekonzentrat

	Sauerkirschsaftkonzentrat (Rohstoff)	L-Äpfelsäurekonzentrat. (Produkt)
lösliche TS (°Brix)	24,9 +/- 0,6	-
Äpfelsäure (%)	2,8 +/- 0,1	50,0 +/- 0,9
Äpfelsäure in TS (%)	10,8 +/- 1,0	97 +/- 0,5
D-Fructose (%)	9,4 +/- 0,1	1,0 +/- 0,2
D-Glucose (%)	9,3 +/- 0,1	1,1 +/- 0,3
Sorbit (%)	3,7 +/- 0,1	1,2 +/- 0,2
Wasser (%)	75 +/- 0,5	50 +/- 0,4

Zitierte Nichtpatentliteratur

Moeller L, Strehlitz B (2008) Aus Süß wird Sauer. Optimierung der Citronensäureherstellung mit der Hefe Yarrowialipolytica. BIOforum. 2: 24-26.
Strathmann H, Chmiel H (1984) Die Elektrodialyse - ein Membranverfahren mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Chemie Ingenieur Technik. 56: 214-220.
Ling L-P, Leow H-F, Sarmidi MR (2002) Citric acid concentration by electrodialysis: ion and water transport modelling. Journal of Membrane Science. 199: 59-67.
Belafi-Bakó K, Nemestóthy N, Gubicza L (2004) A study on applications of membrane techniques in bioconversion of fumaric acid to L-malic acid. Desalination. 162: 301-306.
McFeeters RF, Thompson RL, Fleming HP (1984) Liquid chromatographic analysis of sugars, acids, and ethanol in lactic acid vegetable fermentations. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67: 710-714.

Bezugszeichenliste

1: mindestens eine Fraktion umfassend mindestens einen Zucker
2: mindestens eine Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5426220 A [0006]
US 4334095 A [0006]
DE 19755426 A1 [0008]
EP 1348037 B2 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Moeller L, Strehlitz B (2008) Aus Süß wird Sauer. Optimierung der Citronensäureherstellung mit der Hefe Yarrowialipolytica. BIOforum. 2: 24-26 [0075]
Strathmann H, Chmiel H (1984) Die Elektrodialyse - ein Membranverfahren mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Chemie Ingenieur Technik. 56: 214-220 [0075]
Ling L-P, Leow H-F, Sarmidi MR (2002) Citric acid concentration by electrodialysis: ion and water transport modelling. Journal of Membrane Science. 199: 59-67 [0075]
Belafi-Bakó K, Nemestóthy N, Gubicza L (2004) A study on applications of membrane techniques in bioconversion of fumaric acid to L-malic acid. Desalination. 162: 301-306 [0075]
McFeeters RF, Thompson RL, Fleming HP (1984) Liquid chromatographic analysis of sugars, acids, and ethanol in lactic acid vegetable fermentations. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67: 710-714 [0075]

Claims

Präparatives Verfahren zur Isolierung von Fruchtsäuren mittels Chromatographie umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat, b) Bereitstellen eines Chromatographiesystems umfassend eine stationäre Phase und eine wässrige mobile Phase, wobei die stationäre Phase eine Umkehrphase mit polarer Selektivität ist, eine Partikelgröße von 5 µm bis 50 µm und einen Säuleninnendurchmesser von 8 mm bis 1,0 m aufweist, wobei die wässrige mobile Phase einen pH-Wert von pH 6 bis pH 7 aufweist, c) Injektion der Lösung in das Chromatographiesystem, und d) Elution mindestens einer Fraktion umfassend mindestens eine Fruchtsäure.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Fruchtsäure Citronensäure und/oder L-Äpfelsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat ausgewählt ist aus Zitronensaft, Zitronensaftkonzentrat, Sauerkirschsaft oder Sauerkirschsaftkonzentrat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung umfassend mindestens einen Fruchtsaft oder ein Fruchtsaftkonzentrat 0,5 °Brix bis 50 °Brix aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase eine monomere Octadecylmodifizierung aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase einen Kohlenstoffgehalt von 11 % bis 17 % (m/m) aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase eine Porosität von 0,6 bis 0,8 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) und d) kontinuierlich oder diskontinuierlich, bevorzugt diskontinuierlich, durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mindestens einen weiteren Schritt umfasst, wobei der weitere Schritt zwischen Schritt c) und Schritt d) erfolgt und eine Elution mindestens einer weiteren Fraktion umfassend mindestens einen Zucker ist, wobei der mindestens eine Zucker ausgewählt ist aus Glucose, Fructose und/oder Saccharose.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mindestens einen weiteren Schritt umfasst, wobei der weitere Schritt ausgewählt ist aus einer Konzentrierung und/oder Reinigung, bevorzugt eine Filtration und/oder Vakuumverdampfung.
Fruchtsäurekonzentrat umfassend L-Äpfelsäure und/oder Citronensäure, wobei das Fruchtsäurekonzentrat eine Fraktion eines Fruchtsafts oder eines Fruchtsaftkonzentrats ist, wobei das Fruchtsäurekonzentrat einen L-Äpfelsäuregehalt und/oder Citronensäuregehalt von 50 % bis 99 % (m/v) aufweist, wobei das Fruchtsäurekonzentrat einen Glucosegehalt, Fructosegehalt und/oder Saccharosegehalt von maximal 1,5 % (m/v) aufweist.
Fruchtsäurekonzentrat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Fruchtsäurekonzentrat ein Citronensäurekonzentrat und/oder L-Äpfelsäurekonzentrat. ist.
Fruchtsäurekonzentrat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Fruchtsäurekonzentrat einen L-Äpfelsäuregehalt von 50 % bis 97 % (m/v) oder einen Citronensäuregehalt von 85 % bis 97 % (m/v) aufweist.
Fruchtsäurekonzentrat nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fruchtsäurekonzentrat einen Glucosegehalt von 0 % bis 1,2 % (m/v), einen Fructosegehalt von 0 % bis 1,1 % (m/v) und einen Saccharosegehalt von 0 % bis 0,5 % (m/v) aufweist.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder eines Chromatographiesystems umfassend eine stationäre Phase, wobei die stationäre Phase eine Umkehrphase mit polarer Selektivität ist, eine Partikelgröße von 5 µm bis 50 µm und einen Säuleninnendurchmesser von 8 mm bis 1,0 m aufweist, zur Herstellung eines Fruchtsäurekonzentrats, bevorzugt eines Citronensäurekonzentrats und/oder L-Äpfelsäurekonzentrats.