DE102011057183A1

DE102011057183A1 - Neue organisch-anorganische Kompositmaterialien durch Biomineralisation

Info

Publication number: DE102011057183A1
Application number: DE102011057183A
Authority: DE
Inventors: Dr. Weiß Ingrid; Eva Weber; Magdalena Eder; Prof. Dr. Arzt Eduard; Andreas Simon Schneider
Original assignee: Leibniz Institut fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
Current assignee: Leibniz Institut fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-07-25
Also published as: WO2013098164A2; US20140360403A1; WO2013098164A3; EP2797949A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von organisch-anorganischen Kompositmaterialien, wobei in mindestens eine Wirtszelle aus der Klasse der Schleimpilze mindestens ein biomineralisierend wirkendes Protein und/oder Polypeptid kodierendes rekombinantes Polynukleotid eingebracht wird und das exprimierte Protein und/oder Polypeptid die Bildung anorganischer Partikel in einer extrazellulären Matrix der Wirtszelle beeinflusst sowie die Verwendung solcher organisch-anorganischer Kompositmaterialien.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von organisch-anorganischen Kompositmaterialien durch Biotechnologie und Biomineralisation sowie ihre Verwendung.
Unter Biomineralisierung oder Biomineralisation versteht man ganz allgemein die Bildung anorganischer Festkörper durch Lebewesen, insbesondere unter Steuerung der Struktur, Größe und Anordnung der anorganischen Festkörper durch eine organische Matrix. Die dabei entstehenden Materialien werden auch als Biominerale bezeichnet. Biominerale sind daher Kompositmaterialien aus einer anorganischen Komponente (einem anorganischen Feststoff), meistens in der Größenordnung von wenigen Nano- bis zu einigen Mikrometern, und einer organischen Komponente, meistens ein organisches Polymer. Eine besondere Eigenschaft dieser Kompositmaterialien ist ihre Struktur. So besitzen diese Kompositmaterialien häufig nicht nur eine Strukturierung auf der Ebene der anorganischen Festkörper durch deren Form, Größe oder Morphologie, sondern auch übergeordnete Strukturen, wie beispielsweise durch die Anordnung der anorganischen Festkörper entlang von Fasern oder innerhalb von Schichten. Solche Kombinationen von Strukturen mit unterschiedlichen Größenordnungen werden auch als hierarchische Strukturen bezeichnet. Dabei handelt es sich oft um anisotrope Strukturen. Die Struktur oder Anisotropie des organischen Materials findet sich auf diese Weise in der Anordnung oder Struktur der anorganischen Festkörper wieder.
Der Begriff Biomineral bedeutet nicht, dass die anorganische Komponente immer ähnlich einem Mineral kristallin ist, sondern es kann sich auch um amorphe oder teilkristalline Festkörper handeln.
Bei der organischen Komponente handelt es sich um Biopolymere, das sind im weitesten Sinne biologisch vorkommende Polymere, für Kompositmaterialien sind dies bevorzugt stabilisierende Substanzen wie beispielsweise Lignin, Kollagen, Chitin oder Cellulose, die von so genannten Stützgewebezellen generiert werden.
Bekannte Beispiele für solche organisch-anorganische Kompositmaterialien sind Skelete von Muscheln, Schnecken, Seeigel, aber auch die Knochen der Säugetiere, Eierschalen oder das Exoskelett der Arthropoden. In vielen Fällen ergibt die Kombination einer organischen Matrix mit einer anorganischen Komponente, welche oft eine bestimmte Struktur oder Form aufweist, nicht nur eine erstaunliche Festigkeit sondern auch ein hohes Maß an Elastizität, welche die reine anorganische oder organische Komponente nicht aufweisen würde.
Einen Überblick über den aktuellen Stand der Forschung über die am Aufbau von Biomineralen beteiligten Proteine und weitere organische Substanzen gibt ein aktueller Übersichtsartikel (Weiss I. M. und Marin F. Met. Ions. Life Sci. 2008, 4, 71–136, The Role of Enzymes in Biomineralization Processes). Die Bedeutung der organischen Matrix und Kombination von verschiedenen Proteinen zur selektiven räumlich gerichteten Anordnung von Aragonit ist in einer weiteren Veröffentlichung beschrieben (Weiss I. M., ChemBioChem 2010, 11, 297–300). Diese Literaturstellen werden hiermit explizit zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
So wurden für einige Kompositmaterialien bereits einige der zur Bildung beitragenden Proteine isoliert und charakterisiert. Dabei handelt es sich häufig um Proteine, welche zur Bindung von Ionen befähigt sind und auf diese Weise die Bildung von Festkörpern aus Lösungen begünstigen können, insbesondere auch unter Steuerung der Morphologie des anorganischen Festkörpers.
So beschreibt beispielsweise das Dokument WO 2007/125127 A2 die selektive Herstellung von Aragonit durch rekombinant gewonnenes Perlucin.
Allerdings können auch andere Prozesse die Bildung der Kompositmaterialien beeinflussen. So können Proteine chemische Reaktionen, wie Reduktionen, Oxidationen oder andere Reaktionen, katalysieren, die zur Bildung der anorganischen Struktur beitragen. Beispiele hierfür sind Silicateine, welche die Bildung von Polymeren der Kieselsäure katalysieren. Andere Proteine können die Konzentration von für die Bildung der anorganischen Festkörper benötigten Vorstufen erhöhen. So können Carboanhydrasen durch Hydratisierung von CO₂ Bikarbonat zur Bildung von Karbonaten zur Verfügung stellen.
Natürlich kann ein biomineralisierendes Protein auch mehrere Domänen mit unterschiedlichen Funktionen für die Biomineralisierung beinhalten und so beispielsweise sowohl über Bindemöglichkeiten von Ionen als auch über Reaktionszentren für chemische Reaktionen verfügen. So beinhaltet beispielsweise Nacrein, ein Protein das bei der Herstellung von Perlmutt eine Rolle spielt, zwei Carboanhydrasedomänen und eine mögliche Bindedomäne für Kalziumionen.
Neben der Bindung der Ionen ist auch die Kontrolle anderer Parameter zur gezielten Steuerung der Biomineralisierung von Bedeutung. So beeinflusst beispielsweise auch die Struktur der Hydrathülle an der Bildungsstelle des anorganischen Festkörpers oder die lokale Konzentration an Ionen die Struktur des entstehenden Festkörpers.
An der Herstellung der zum Teil hochkomplexen Strukturen der Natur ist daher oft eine ganze Reihe von Proteinen beteiligt. Allerdings können auch einzelne Proteine in geringen Mengen als Kristallisationskeim zur Bildung von Kristallen dienen.
Wie bereits ausgeführt, führt die Einlagerung von anorganischen Materialien in organischen Matrizes unter Bildung eines organisch-anorganischen Kompositmaterials zu neuen Eigenschaften. Allerdings weisen die meisten Biopolymere keine anorganischen Komponenten oder nur einen geringen Gehalt an anorganischen Komponenten auf.
Aus dem Dokument WO 98/36084 A2 ist bekannt, dass der Einbau von kalziumbindenden Proteinen das Wachstum von Pflanzen verbessern kann. Dabei wurde auch ein Hydroxyapatit induzierendes Enzym in Pflanzenzellen eingebracht. Allerdings wurde das Protein innerhalb der Pflanze exprimiert. Es kam zu keiner Biomineralisation.
Die Aufgabe der Erfindung war es ein Verfahren zur Herstellung neuartiger organisch-anorganischer Kompositmaterialien bereitzustellen, welche sich auf einfache Weise in selbstreproduzierenden Systemen herstellen lassen. Das Verfahren ermöglicht es insbesondere bereits bekannte Strukturen aus Biopolymeren mit anorganischen Komponenten auszustatten.
Lösung
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindung umfasst auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinationen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die biomineralisierende Systeme über ein Verfahren identifiziert werden können, in dem in mindestens eine Wirtszelle aus der Klasse der Schleimpilze (Eumycetozoa) mindestens ein rekombinantes Polynukleotid eingebracht wird, wobei das rekombinante Polynukleotid mindestens ein Protein und/oder Polypeptid kodiert und das erste rekombinante Polynukleotid zur Expression des kodierten Proteins und/oder Polypeptides in der Wirtszelle geeignet ist. Das Protein und/oder Polypeptid wird in der Wirtszelle exprimiert. Danach wird das exprimierte Protein auf eine biomineralisierende Wirkung hin untersucht. Dies bedeutet, dass das exprimierte Protein und/oder Polypeptid die Bildung anorganischer Partikel in einer extrazellulären Matrix der Wirtszelle beeinflusst, insbesondere stimuliert bzw. erhöht.
Dieses Verfahren ermöglicht ein einfaches Screening von Proteinen auf ihre mögliche biomineralisierende Wirkung. So kann beispielsweise eine Wirtszelle ausgewählt werden, welche beispielsweise aufgrund ihrer schnellen Generationsfolge ein schnelles Screening verschiedener Proteine erlaubt. Nachdem diese gefunden wurden, können die gefundenen Sequenzen in die zweite Wirtszelle übertragen werden.
So können in der mit dem Verfahren eine große Anzahl von Möglichkeiten und Varianten von Proteinen getestet werden, beispielsweise Größe der Proteine, Anordnung funktioneller Gruppen, mechanischer Flexibilität und Lösemittel-Kompatibilität der Grundstruktur und in Kombination mit einer organischen Matrix.
Die organische Komponente des organisch-anorganischen Kompositmaterials besteht daher mindestens aus der extrazellulären Matrix der Zelle. Als anorganische Komponente enthält das Kompositmaterial bevorzugt anorganische Partikel.
Die Erfindung ermöglicht es u.a. auch bereits bekannte Biopolymere mit neuen Eigenschaften auszustatten. Das Verfahren kann dabei schon bekannte Strukturen nutzen, insbesondere die hierarchische Struktur vieler Biopolymere sowie deren charakteristische Wechselwirkung mit wässrigen Lösungen (dies beinhaltet sowohl feste als auch gel- oder schleimartige extrazelluläre Matrices, bestehend aus evolutiv optimierten Kombinationen von unterschiedlichen Biopolymeren). Durch die Ausnutzung natürlicher Prozesse ist das Verfahren besonders energieeffizient. Gleichzeitig erlaubt es durch den potentiellen Einsatz von effizienten Screening-Techniken eine schnelle und gezielte Anpassung der Eigenschaften des organisch-anorganischen Kompositmaterials.
Da die organisch-anorganischen Kompositmaterialien auf selbstreproduzierbaren Systemen aufbauen, können sie außerdem ohne Aufwand vervielfältigt und hergestellt werden.
Unter "biomineralisierend" im Sinne der Anmeldung wird allgemein die Fähigkeit verstanden, einen kontrollierten Phasenübergang eines anorganischen Materials zu bewirken. Es kann sich dabei um die Bildung eines anorganischen Materials aus einer Lösung, aber auch um eine Veränderung der Morphologie oder Modifikation (einschliesslich Phasen-Übergänge, z.B. amorph/kristallin) eines anorganischen Materials handeln. Bevorzugt ist eine Bildung eines anorganischen Materials. Das gebildete Material kann dabei auch amorph oder teilkristallin sein.
Unter einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid im Sinne der Anmeldung wird ein Protein und/oder Polypeptid verstanden, welches durch die Bindung von Ionen, wobei die Bindung auch die Begünstigung der Bildung eines Kristallisationskeims umfasst, und/oder durch eine chemische Reaktion, wobei chemische Reaktion auch Elektronenübertragungsprozesse wie Oxidation oder Reduktion mit einschließt, die Erzeugung von anorganischen Festkörpern bewirkt. Ein solches Protein kann daher entweder selbst biomineralisierend wirken, es kann aber auch andere Substanzen, insbesondere Proteine oder Polymere, dahingehend modifizieren oder beeinflussen, dass diese beginnen biomineralisierend zu wirken, beispielsweise durch Modifikation der organischen Matrix oder Veränderung der lokalen Konzentration an Vorstufen für die anorganischen Partikel. Eine solche Modifikation kann beispielsweise Glykosidierung, Phosphorylierung, Sulfatisierung, Hydroxylierung, Acetylierung oder Deacetylierung sein. Bevorzugt sind Proteine, welche für sich biomineralisierend wirken.
Biomineralisierende Wirkung umfasst ferner die Bindung des Proteins oder Polypeptids an bereits vorhandene Grenzflächen anorganischer Festkörper, deren Morphologie, Modifikation, oder Phase als Folge der Bindung verändert wird. Vergleichbare Effekte sind von sogenannten Anti-Freeze-Proteinen, die sowohl in Tieren als auch in Pflanzen vorkommen, bereits bekannt. Dieser Effekt kann unter bestimmten Umständen eine Auflösung oder Verlagerung des anorganischen Festkörpers in andere Gewebeteile des Organismus zur Folge haben.
Unter "kultivieren" im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird die Vermehrung der Wirtszelle verstanden, wobei das auch eine Differenzierung der vermehrten Wirtszellen mit einschließt, beispielsweise in unterschiedliche Gewebe einer Pflanzenzelle oder Differenzierung in Stamm- und Fruchtkörperzellen.
"Exprimieren" oder "Expression" bedeutet die Herstellung des durch ein Polynukleotid kodierten Proteins und/oder Polypeptids in der gewählten Wirtszelle. Dies beinhaltet Transkription und Translation der Information auf dem Polynukleotid. Das gebildete Protein und/oder Polypeptid kann dabei noch zusätzlich durch posttranslationale Prozesse in der Zelle weiter modifiziert werden.
Unter "Auslösen" der biomineralisierenden Wirkung wird die Nutzung der biomineralisierenden Wirkung des Proteins verstanden. Dies kann zum einen im Rahmen der Expression des Proteins in der Zelle geschehen oder bei der Einlagerung in die Zellwand. Es sind aber auch weitere Behandlungen der Zelle mit Vorstufen für ein Biomineral, beispielsweise Lösungen von Ionen, umfasst. Es kann auch nötig sein, diese Ionen schon während der Kultivierung der Wirtszelle zuzugeben.
Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.
Um die Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid zu erhalten, können entsprechend der Art der Zelle alle dem Fachmann bekannten Techniken und Methoden verwendet werden. Dies beinhaltet beispielsweise transformieren, transfizieren oder transduzieren der Zelle mit Plasmiden, Phagemiden, Cosmiden, retrovirale oder adenovirale Vektoren oder Partikeln, Nanopartikeln oder Liposomen, welche das Polynukleotid enthalten. Das Polynukleotid kann dabei auch in das Genom der Zelle eingebaut werden. Die Sequenz des Polynukleotids kann entsprechend der günstigsten Codonnutzung der verwendeten Zelle optimiert sein. Die Sequenz kann auch zusätzliche regulatorische Elemente beinhalten, die die Stabilität des Polynukleotids in der Zelle erhöhen oder reduzieren.
Um eine größere Menge und/oder um, wie bereits beschrieben, eine bestimmte hierarchische Struktur des organisch-anorganischen Kompositmaterials zu erzeugen, ist es zweckmäßig die Wirtszelle, gegebenenfalls vor der Expression, zu kultivieren, d.h. die Vermehrung der Zelle anzuregen, wobei es dabei auch zu einer Differenzierung der Wirtszelle oder einem Teil der vermehrten Wirtszellen zu einem bestimmten Gewebe oder einem Zelltyp kommen kann.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das exprimierte Protein in die extrazelluläre Matrix der Wirtszelle eingelagert.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung kommt es erst, insbesondere durch die Einlagerung des exprimierten Proteins, in der extrazellulären Matrix zur Bildung der anorganischen Partikel. Dies kann gegebenenfalls auch durch Zuführen von Vorstufen der anorganischen Partikeln zur Wirtszelle und/oder zur extrazellulären Matrix unterstützt oder begünstigt werden. Die Zuführung der Vorstufen kann vor, während und/oder nach der Expression erfolgen. Bevorzugt ist eine Behandlung der extrazellulären Matrix mit den Vorstufen. Abhängig von dem exprimierten Protein und/oder Polypeptid kann es sich bei den Vorstufen um Lösungen von Salzen, wie beispielsweise Kalziumchlorid, oder um chemische Vorstufen, wie beispielsweise Alkoxysilane, handeln. Dabei kann es sich auch nur um die Zuführung eines Teils der für die Erzeugung der anorganischen Partikel benötigten Stoffe handeln, beispielsweise bestimmte Kationen oder Anionen. Es kann auch eine Kombination von Vorstufen eingesetzt werden. Die Lösungen können auch komplexierte Kationen oder Anionen enthalten. Bevorzugt sind dabei Halogenide (z. B. Fluoride, Chloride, Bromide, Iodide), Sulfate, Phosphate, Hydroxide, Sulfide, Carbonate, Hydrogencarbonate, Salze von Karbonsäuren (z. B. Citrate, Oxalate, Tartrate oder Malate) mit Metallen oder Halbmetallen der 1. bis 16. Gruppe des Periodensystems, besonders bevorzugt Li, Ca, Mn, Fe, Zr, Ti, Ba, Si, Al, Zn, Sr, Mg, Mo, Co, Ni, Ag, Au, Ga, Se oder Cu. Es können auch Gemische von Vorstufen eingesetzt werden.
In einer anderen Weiterbildung des Verfahrens werden die anorganischen Partikel in der Wirtszelle gebildet und danach in die extrazelluläre Matrix der Wirtszelle einlagert. Auch hierbei kann die Zuführung von Vorstufen gemäß den vorstehenden Angaben erforderlich sein.
Das vom rekombinanten Polynukleotid kodierte exprimierte Protein und/oder Polypeptid kann ein zur Wirtszelle xenogenes (heterologes) oder homologes Protein sein, bevorzugt handelt es sich um ein zur Wirtszelle xenogenes Protein. Es kann sich auch nur um einen Teil eines Proteins handeln.
Bei dem vom Polynukleotid kodierten Protein und/oder Polypeptid kann es sich um beliebige Proteine und/oder Polypeptige handeln. Bevorzugt sind es Sequenzen, welche mindestens eine der in Tabelle 1 genannten Strukturen enthalten(Die +–Zeichen in Tabelle 1 geben die Stärke der Wechselwirkung der Strukturen an).
Bei dem Protein und/oder Polipeptid kann es sich auch um ein Protein und/oder Polypeptid handeln, was mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid aus einem Tier, einer Pflanze, einem Pilz oder einem Bakterium aufweist. Solche Proteine gehören bevorzugt zu der Klasse der Hydrolasen (EC-Klasse 3), Transferasen (EC-Klasse 2) oder Oxidoreduktasen (EC-Klasse 1) oder Lektine. Sie können aber auch bestimmte Sequenzen aufweisen, welche Ionen binden können oder polare Brücken aufbauen können, beispielsweise die Sequenzen aus Tabelle 1.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Protein und/oder Polipeptid ausgewählt aus Tabelle 2. Bevorzugt sind Proteine und/oder Polypeptide mit mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie mit einem Protein, wie sie in Tabelle 2 wiedergegeben sind. Es kann sich auch nur um Teile der vorstehend genannten Proteine handeln.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist das kodierte Protein ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Ansocalcin, Ovocleidin-17, Perlucin, SM32, N16.1, Silicatein a, Silicatein b, Nacrein, Lustrin A, Amelogenin und Enamelin. Beispiele für diese Enzyme sind in Tabelle 3 aufgelistet. Besonders bevorzugt sind Ovocleidin-17, N16.1 und Perlucin.
In einer vorteilhaften Weiterbildung enthält das eingebrachte Polynukleotid mindestens einen nicht-kodierenden regulatorischen Abschnitt genannt Promotor zur Steuerung der Expression des kodierenden Abschnitts für das Protein und/oder Polypeptid. Der Promoter ermöglicht es insbesondere, die Expression des kodierten Proteins und/oder Polypeptids auf bestimmte Zellen zu beschränken oder an eine bestimmte Differenzierung der Zelle zu koppeln. Durch gezielte Auswahl oder Veränderung der Promotor-Sequenz läßt sich die Expression des Proteins an Umgebungsparameter wie Ionenstärke oder Temperatur koppeln sowie durch Abwesenheit oder Zugabe spezieller Substanzen chemisch inhibieren oder induzieren. Diese Möglichkeit der Steuerung ist essentiell, da das kodierte Protein unter bestimmten Umständen schädlich für die Zelle sein kann und/oder eine biomineralisierende Wirkung ebenfalls von Umgebungsparameter wie Ionenstärke oder Temperatur koppeln sowie durch Abwesenheit oder Zugabe spezieller Substanzen abhängig sein kann.
In einer vorteilhaften Weiterbildung enthält das rekombinante Polynukleotid zusätzlich mindestens einen Nukleotidsequenz-Abschnitt (im Folgenden bezeichnet als für das Signalpeptid kodierend), welche eine Aminosäurensequenz zur Steuerung der Lokalisierung und/oder dem Zeitpunkt der Expression des Proteins und/oder Polypeptids kodiert. Dabei kann diese Nukleotidsequenz ein Polypeptid kodieren, welches vollständig oder mindestens zu 80%, 90 %, bevorzugt 95 % oder 99 % homolog zu einer Aminosäuresequenz der Wirtszelle ist. Es kann sich aber auch um eine xenogene oder synthetische Aminosäuresequenz handeln. Es kann auch nur ein Teil eines solchen Polypeptids sein. Besonders bevorzugt ist ein vollständig zu einem Polypeptid aus der Wirtszelle homologe Aminosäuresequenz. Bevorzugt handelt es sich bei der Aminosäuresequenz um eine Signalsequenz. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Organismen dem Fachmann bekannt und erlauben beispielsweise im Falle von Pflanzen die Expression und/oder Lokalisierung in bestimmten Pflanzenteilen. Es ist besonders wichtig, hier konkret zwischen der nicht-codierenden Promotor-Polynukleotid-Sequenz und der für das Signalpeptid codierenden, also zur Translation vorgesehenen Polynukleotid-Sequenz zu unterscheiden. Die Auswahl und Anpassung beider Sequenzen an die gewünschte spätere biomineralisierende Wirkung des Proteins erfolgt nach jeweils unterschiedlichen Kriterien unter Berücksichtigung der unterschiedlichen entwicklungsbiologischen und zellphysiologischen Gegebenheiten in den entsprechenden Wirtsorganismen.
Signalsequenzen oder Signalproteine sind in der Regel Peptide oder Aminosäuresequenzen, die den Bestimmungsort oder Expressionsort eines Proteins innerhalb einer Zelle bestimmen. Typischerweise besitzen Proteine, deren Bestimmungsort sich außerhalb der Zelle, in Biomembranen oder in Kompartimenten befindet, Signalsequenzen. So kann, abhängig von der Signalsequenz, bspw. der Transport in den extrazellulären Raum oder der Zellmembran veranlasst werden. Die Signalsequenz kann nach dem Transport oder beim Durchtritt durch eine Membran oder Einlagerung in eine Membran prozessiert, typischerweise abgeschnitten werden, beispielsweise durch eine Signalpeptidase. Im sekretierten Zustand kann das Protein entweder mit oder ohne Signalsequenz vorliegen. Das Vorhandensein der Signalsequenz muss nicht notwendigerweise die Funktionalität des biomineralisierend wirkenden Proteins beeinflussen. Es kann sich um eine Signalsequenz zur Sekretion des exprimierten Proteins in die extrazelluläre Matrix der Wirtszelle. Es kann sich auch im Falle von höheren Organismen um eine Signalsequenz zur Expression und/oder Einlagerung des exprimierten Proteins in die Zellwand der Wirtszelle handeln. Dies ist im Fall von pilzlichen und pflanzlichen Zellen bevorzugt.
Unter Sekretion im Sinne der Anmeldung wird der Transport oder die Abgabe des exprimierten Proteins und/oder Polypeptids in ein Kompartiment außerhalb der das Zytoplasma abgrenzenden Zellmembran oder die extrazelluläre Matrix verstanden.
Mit Vorteil kodiert das rekombinante Polynukleotid das mindestens eine Protein und/oder Polypeptid und die Aminosäuresequenz zur Steuerung der Lokalisierung und/oder dem Zeitpunkt der Expression des Proteins und/oder Polypeptids derart, dass im Translationsprodukt beide miteinander fusioniert vorliegen. Dabei können zwischen den beiden Sequenzen auf dem Polynukleotid noch bis zu 30 Nukleotide eingefügt sein. Bevorzugt ist die Nukleotidsequenz der Signalsequenz in Transkriptionsrichtung vor der Nukleotidsequenz des Proteins und/oder Polypeptids eingefügt. Es kann auch eine dem Protein angehörende funktionelle Proteindomäne (z.B. der Normalfall für transmembrane Proteine) die Lokalisierung steuern. Dadurch ist die Aminosäuresequenz zur Beeinflussung der Sekretion am N-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert. Besonders wenn eine Wechselwirkung mit intrazellulären Signalwegen gewünscht ist, könnte es vorteilhaft sein, das Protein als transmembranes Protein ohne eigene Signalsequenz sondern bevorzugt mit korrekt orientierter Membraninsertionsdomäne zu versehen. Dann wäre die intrazelluläre Steuerungsdomäne am N-terminus lokalisiert.
Mögliche Signalsequenzen und Transmembransequenzen sind abhängig von der verwendeten Wirtszelle dem Fachmann bekannt.
Beispiele für Signalsequenzen oder Proteine, welche solche Sequenzen enthalten finden sich in Tabelle 4, wobei Ecmb, bzw. das Sigalpeptid daraus, bevorzugt ist.
Bevorzugte Fusionsproteine enthalten Sequenzen mit mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einem Fusionsprotein aus einem Protein aus Tabelle 3 mit Signalpeptiden aus Tabelle 4, wobei Ecmb, bzw. das Sigalpeptid daraus, bevorzugt ist.
Bei der Wirtszelle handelt es sich um eine Zelle aus der Klasse der Schleimpilze (Eumycetozoa), vorzugsweise der Gattung Dictyostelium, insbesondere der Art Dictyostelium discoideum.
Dies sind Wirtszellen, in denen induziert werden kann, sich zu übergeordneten multizellulären Einheiten zusammenzusetzen. Dies ist beispielsweise für Dictyostelium discoideum der Fall. Abhängig vom Entwicklungszustand des Schleimpilzes können auf einfache Weise unterschiedliche Bedingungen für die Wirkung des Proteins simuliert werden. Dabei kann die Expression durch die geeignete Wahl des Promotors auf einen bestimmten Entwicklungszustand ausgerichtet werden.
Im Falle von Dictyostelium bildet sich bei der Entwicklung des Pilzstamms eine Außenhülle aus Zellulose und Glykoproteinen. Diese zeigt Ähnlichkeiten mit den pflanzlichen Zellmembranen. Auch können auf einfache Weise die Wirksamkeit in sehr unterschiedlichen Zellstadien untersucht werden (lebende Zellen/Zellaggregate/ruhende Zellen/sich bewegende Zellen/absterbende Zellen/tote Zellen). Daher können auch gleichzeitig verschiedene biomineralisierende Wirkungen ein und desselben Proteins unbekannter Wirkung als Funktion der Randbedingungen getestet werden.
Die Expression des auf dem rekombinanten Polynukleotid kodierten Proteins und/oder Polypeptids kann an eine Änderung der Kultivierungsbedingungen, die Zugabe einer Substanz und/oder an einen bestimmten Zustand der Wirtszelle gekoppelt sein. Ein Zustand kann dabei ein bestimmter Abschnitt der Zellentwicklung und/oder eine Reaktion auf einen externen oder internen Reiz sein, wie beispielsweise eine bestimmte Differenzierung der Wirtszellen, die zum Aufbau der extrazellulären Matrix führt, die die organische Komponente des organisch-anorganischen Kompositmaterials bildet. Die Expression kann daher auf bestimmte Wirtszellen beschränkt sein, bevorzugt auf die Wirtszellen, welche diese extrazelluläre Matrix ausbilden. Bevorzugt wird die Expression entsprechend den oben angegebenen Bedingungen mit Hilfe eines auf die Wirtszelle abgestimmten Promotors gesteuert. Solche Promotoren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Das exprimierte Protein und/oder Polypeptid kann nach der Translation noch modifiziert werden, beispielsweise durch Glykosidierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Alkylierung, Hydroxylierung oder dgl. Diese Modifikationen können die biomineralisierende Eigenschaft des Proteins und/oder Polypeptids verändern und/oder (erst) hervorrufen.
Ebenso wie die Expression, kann die Sekretion des exprimierten Proteins und/oder Polypeptids an eine Änderung der Kultivierungsbedingungen, die Zugabe einer Substanz und/oder an einen bestimmten Zustand der Zelle gekoppelt sein, wenn beispielsweise eine bestimmte Differenzierung der Zelle erreicht ist, die den Aufbau der extrazellulären Matrix einleitet. Die Sekretion kann daher auf bestimmte Zellen beschränkt sein. Bevorzugt auf die Zellen, welche die extrazelluläre Matrix ausbilden. Dies ist beispielsweise durch die Wahl des Signalpeptids und/oder des zugehörigen Promotors möglich. Mit Vorteil werden die Expression und die Sekretion durch zwei unterschiedliche Signale ausgelöst.
Die biomineralisierende Wirkung des Proteins und/oder Polypeptids kann auf vielfältige Weise untersucht werden. So kann es erforderlich sein, Vorstufen für anorganische Festkörper bei der Kultivierung zuzugeben. Auch kann es erforderlich sein, bestimmte andere Stoffwechselvorgänge in der Wirtszelle zu verringern oder zu verstärken, beispielsweise um eine höhere Konzentration an Vorstufen bereitzustellen. Es können noch weitere rekombinante Proteine kodierende Polynukleotide in der Wirtszelle enthalten sein, bzw. weitere xenogene, rekombinante Proteine und/oder Polypeptide, insbesondere Proteine und/oder Polypeptide, die biomineralisierend wirken. So können diese Proteine auch die extrazelluläre Matrix modifizieren und/oder die Interaktion des biomineralisierend wirkenden Proteins und/oder Polypeptids modifizieren.
Außerdem kann es auch, beispielsweise um bestimmte Morphologien oder Strukturen zu erzeugen, erforderlich sein, das organisch-anorganische Kompositmaterial mindestens einmal mit mindestens einer Vorstufe zur Bildung eines anorganischen Materials zu behandeln. Dies kann beispielsweise dazu genutzt werden, die Größe der gebildeten Partikel zu verändern oder mit einer weiteren Lage eines anderen anorganischen Feststoffs, wobei es sich auch um eine andere Morphologie handeln kann, zu beschichten. Die Behandlung kann dabei mit lebenden Zellen durchgeführt werden. Es ist aber auch möglich, die Wirtszellen zum Beispiel zu trocknen oder zu lyophilisieren und dann eine, ggf. weitere, Untersuchung der biomineralisierenden Wirkung durchzuführen.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfasst die Untersuchung der biomineralisierenden Wirkung das In Kontaktbringen der Wirtszelle mit einer Lösung mindestens eines Salzes. Bevorzugt handelt es sich dabei um Lösungen von Salzen, wie beispielsweise Kalziumchlorid, oder um chemische Vorstufen, wie beispielsweise Alkoxysilane. Die Lösungen können auch komplexierte Kationen oder Anionen enthalten. Bevorzugt sind dabei Halogenide (z. B. Fluoride, Chloride, Bromide, Iodide), Sulfate, Phosphate, Hydroxide, Sulfide, Carbonate, Hydrogencarbonate, Salze von Karbonsäuren (z. B. Citrate, Oxalate, Tartrate oder Malate) mit Metallen oder Halbmetallen der 1. bis 16. Gruppe des Periodensystems, besonders bevorzugt Li, Ca, Mn, Fe, Zr, Ti, Ba, Si, Al, Zn, Sr, Mg, Mo, Co, Ni, Ag, Au, Ga, Se oder Cu. Es können auch Gemische von Vorstufen eingesetzt werden. Bevorzugte Verbindungen sind Chloride, Carbonate oder Sulfate, bevorzugt von Li, Ca, Fe, Ba, Zr oder Ti.
Nach der optionalen Behandlung der Wirtszelle (Trocknung, Gefriertrocknung) kann die biomineralisierende Wirkung des exprimierten Proteins auf vielfältige Art und Weise untersucht werden. So können beispielsweise optische Eigenschaften, wie Brechungsindex oder Drehwert, oder auch der Gehalt an anorganischen Substanzen untersucht werden. Ebenso können die Proben durch lichtmikroskopische Untersuchungen, beispielsweise mit polarisiertem Licht, auf besondere kristalline Strukturen untersucht werden. Ebenso können auch andere Methoden wie Raman-Spektroskopie verwendet werden. Gerade optische Verfahren eignen sich besonders zum Screenen großer Bibliotheken.
In einer Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren mit einer Bibliothek von rekombinanten Polynukleotiden durchgeführt. Eine solche Bibliothek kann beispielsweise eine durch errorprone PCR hergestellte Bibliothek eines biomineralisierend wirkenden Proteins sein. Aufgrund der einfachen Durchführung des Verfahrens, insbesondere bei der Verwendung von Pilzzellen, besonders bevorzugt von Dictyostelium, ist es auf diese Weise möglich eine Vielzahl von potentiell biomineralisierend wirkende Proteine zu untersuchen und auf ihre Wirkung in einem mehrzelligen Organismus hin zu untersuchen. Die in diesem Verfahren gewonnen Kenntnisse über vorteilhafte Sequenzen können dann auf höhere Organismen übertragen werden, welche häufig deutlich aufwändiger zu kultivieren sind. Gleichzeitig lassen sich auch biomineralisierende Bedingungen einfacher untersuchen. Als Ausgangsproteine werden bevorzugt Proteine der Tabelle 2, besonders bevorzugt der Tabelle 3 verwendet.
Ausgehend von den festgestellten Eigenschaften wird entschieden, ob mit diesem Protein auch eine weitere optionale Stufe des Verfahrens durchgeführt wird.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird nach der Durchführung des Verfahrens, bevorzugt nach der Identifizierung von biomineralisierenden Sequenzen mit Hilfe des Verfahrens, das Verfahren erneut in einer zweiten Wirtszelle durchgeführt.
Dafür wird ein zweites rekombinantes Polynukleotid in eine zweite Wirtszelle eingebracht, wobei das Polynukleotid das Protein und/oder Polypeptid aus der ersten Stufe des Verfahrens kodiert, und dieses Polynukleotid zur Expression des kodierten Proteins und/oder Polypeptids in der zweiten Wirtszelle geeignet ist. Die zweite Wirtszelle wird danach kultiviert und die biomineralisierende Wirkung des exprimierten Proteins ausgelöst. Diese Verfahrensschritte werden im Folgenden auch als zweite Stufe (Stufe II) bezeichnet. Die vorherige Identifikation des Proteins wird als erste Stufe (Stufe I) bezeichnet.
Das zweite rekombinante Polynukleotid kodiert das bei der ersten Durchführung des Verfahrens verwendete Protein. Es kann dabei nötig sein, die Sequenz des Polynukleotids an die Codonnutzung der zweiten Wirtszelle anzupassen.
Liegt für diese Stufe II des Verfahrens bereits eine auf dem erifndungsgemäßen Verfahren gewonnene Vorauswahl an Sequenzen für potentiell biomineralisierend wirkende Proteine vor (z.B. Tabelle 2), kann durch entsprechende Wahl des Klonierungssystems (Stand der Technik: z.B. Gateway-Cloning und mittels PCR) schnell zwischen den Wirtszellen gewechselt werden. Dieser schnelle Wechsel wird dadurch möglich, dass für die Untersuchung der biomineralisierenden Wirkung ein universell einsetzbares System vorhanden ist, bestehend aus dem ersten Wirtsorganismus mit definierter Struktur der extrazellulären Matrix als Wirkungsort für die zu testenden Protein/Polypeptid/Matrix-Kombinationen und ein dazugehöriges passendes Promotor-Signalpeptid-Gateway-Kassetten-System. Wichtig für die Funktionalität des Systems ist auch, dass der Wirtsorganismus induziert werden kann, sich zu übergeordneten multizellulären Einheiten zusammenzusetzen.
Mit Vorteil handelt umfasst das zweite rekombinante Polynukleotid ebenfalls eine Signalsequenz zur Beeinflussung der Lokalisierung und/oder Steuerung der Expression in der zweiten Wirtszelle. Bevorzugt kodiert das zweite Polynukleotid ein Fusionsprotein aus dem biomineralisierend wirkenden Protein einer auf die zweite Wirtszelle abgestimmte und der Signalsequenz, wobei ein kurzer Linker aus 3 bis 18 Nukleotiden zwischen den beiden Sequenzen sein kann. Falls bei der ersten Durchführung des Verfahrens ein Fusionsprotein verwendet wurde, so ist es möglich, dass das in der zweiten Durchführung verwendete zweite rekombinante Polynukleotid eine andere Signalsequenz aufweist. Dies kann nötig sein, um in der zweiten Wirtszelle die Lokalisierung und/oder Expression des kodierten Fusionsproteins zu beeinflussen.
Alle in dem Verfahren Fusionsproteine können natürlich noch weitere Sequenzen mit bestimmten Eigenschaften aufweisen. Dies können beispielsweise durch Aminosäuren kodierbare Tags oder Label sein. Dies können fluoreszierende Label sein, wie z.B. GFP (Green fluorescent Protein). Es kann sich auch um Affinitätslabel, wie His-Tag, HA-Tag, Streptavidin oder ähnliche Tag handeln. Es können auch Kombinationen von Tags eingesetzt werden. Solche Label können dazu genutzt werden, die Lokalisierung und Expression der Proteine zu analysieren.
In einer Weiterbildung der Erfindung wird als Wirtszelle in der zweiten Stufe des Verfahrens eine pflanzliche Zelle verwendet, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana, thellungiella halophila), Tabak, faserbildende Pflanzen (Bambus, Lein (Linum), Hanf, Baumwolle, Jute (Corchorus), Sisal-Agave (Agave sisalana), Kokospalmen), Gräser (Reis, Mais, Gerste, Weizen, Hirse, Miscanthus), Hölzer (Pappeln, Eukalyptus, Kiefern, Kiefergewächse), bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana, thellungiella halophila), Tabak, faserbildende Pflanzen (Bambus, Lein (Linum), Hanf, Baumwolle, Jute (Corchorus), Sisal-Agave (Agave sisalana), Kokospalmen).
Zum Einbringen des zweiten Polynukleotids können in Abhängigkeit von der zweiten Wirtszelle alle dem Fachmann bekannten Techniken verwendet werden. So kann das zweite Polynukleotid beispielsweise Sequenzen aufweisen, welche eine Integration in das Genom der zweiten Wirtszelle erlauben, beispielweise über T-DNA-Insertion oder homologe Rekombination. Es können aber auch Transfektionsmethoden wie PEG-vermittelte Transfektion oder Bombardierungsmethoden, welche beispielsweise für Gräser (Poaceae, monocots) verwendet werden, genutzt werden.
Im Falle einer pflanzlichen zweiten Wirtszelle können auch nur ein Teil der Zellen der gewählten Pflanze als Wirtszelle ausgesucht werden, beispielsweise die Blätter oder die Wurzeln.
Desweiteren betrifft die Erfindung ein organisch-anorganisches Kompositmaterial, das als organische Komponente eine extrazellulären Matrix mindestens einer Wirtszelle enthält, in deren extrazelluläre Matrix durch Expression mindestens eines rekombinanten biomineralisierend wirkenden Proteins und/oder Polypeptids anorganische Partikel eingelagert wurden. Das Protein und/oder Polypeptid kann dabei auch Bestandteil der organischen Komponente des Kompositmaterials sein.
In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das mindestens eine exprimierte Protein und/oder Polypeptid xenogen zur Wirtszelle.
Bei dem exprimierten Protein und/oder Polypeptid kann es sich um ein Protein und/oder Polypeptid handeln, was mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid aus einem Tier, einer Pflanze, einem Pilz oder einem Bakterium aufweist. Bevorzugt sind Proteine und/oder Polypeptide mit mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie mit einem Protein wie in Tabelle 2 dargestellt. Besonders bevorzugt sind Proteine mit mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie mit den Proteinen aus Tabelle 2, bevorzugt aus Tabelle 3.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist das exprimierte Protein und/oder Polypeptid ein Fusionsprotein aus mindestens einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid und einer Aminosäurensequenz zur Beeinflussung der Sekretion des Fusionsproteins in die extrazelluläre Matrix. Die Aminosäuresequenz kann ein Polypeptid sein, welches vollständig oder mindestens zu 80 %, 90%, bevorzugt 95 %, 98 %, 99 % oder vollständig homolog zu einem Polypeptid der Wirtszelle ist. Es kann sich aber auch um ein xenogenes Polypeptid handeln. Bevorzugt ist ein Polypeptid, das zu mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 98 %, 99 % oder vollständig homolog zu einen Polypeptid der Wirtszelle ist. Es kann auch nur ein Teil eines solchen Polypeptids sein. Besonders bevorzugt ist ein vollständig zu einem Polypeptid aus der Wirtszelle homologes Polypeptid. Bevorzugt handelt es sich bei dem Peptid um ein Signalpeptid zur Beeinflussung der Lokalisierung und/oder Expression. Das Signalpeptid ist bevorzugt am N-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert. Dabei können zwischen dem Signalpeptid und dem biomineralisierenden Protein und/oder Polypeptid noch weitere Aminosäuren eingefügt sein.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist das organisch-anorganische Kompositmaterial durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich. Das Kompositmaterial kann dabei nach Stufe I oder Stufe II erhalten werden.
In einer bevorzugten Weiterbildung besitzt das organisch-anorganische Kompositmaterial eine hierarchische Struktur, bevorzugt eine anisotrope hierarchische Struktur.
Mit Vorteil besteht die organische Komponente des organisch-anorganischen Kompositmaterials abhängig von der Wirtszelle im Wesentlichen aus einem Biopolymer, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Polysaccharide oder filamentöse Proteine, wie z.B. Cellulose oder Stärke, Lignin, Kollagen, Lipide, Polyglucosamine, wie Chitin oder Chitosan, Pektine oder deren Derivate, besonders bevorzugt Polysacharide wie Cellulose und deren Derivate. Die organische Komponente kann auch Kombinationen mehrerer unterschiedlicher Biopolymere enthalten.
Der Anteil der anorganischen Komponente kann zwischen 1 und 98 Gew.-% der Trockenmasse des organisch-anorganischen Kompositmaterials liegen, bevorzugt zwischen 2 Gew.-% und 50 Gew.-%.
Die anorganischen Partikel können einen maximalen Durchmesser zwischen 3 und 10000 nm, bevorzugt zwischen 20 und 1000 nm, besonders bevorzugt zwischen 200 und 500 nm aufweisen. Sie können dabei eine amorphe, teilkristalline oder kristalline Morphologie aufweisen. Bevorzugt sind teilkristalline oder kristalline Partikel, besonders bevorzugt kristalline Partikel. Die Partikel können dabei jede beliebige Form aufweisen, so sind auch plättchenförmige Formen möglich. Mit Vorteil weisen die Partikel eine sphärische oder kantige Form auf.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung beinhalten die Partikel Oxide, Hydroxide, Karbonate, Phosphate, Fluoride, Sulfide, Sulfate und/oder Salze von Karbonsäuren wie Citrate, Oxalate, Tartrate oder Malate, insbesondere solche Verbindungen mit Metallen oder Halbmetallen der 1. bis 16. Gruppe des Periodensystems, bevorzugt Li, Ca, Mn, Fe, Zr, Ti, Ba, Si, Al, Zn, Sr, Mg, Ba, Mo, Co, Ni, Ag, Au, Ga, Se oder Cu.. Dies beinhaltet auch Verbindungen mit oxidischen Anionen, wie Titanate oder Wolframate. Bevorzugt werden dabei Partikel aus Eisenoxid (Fe_xO_y), Manganoxid (Mn_xO_y), Siliziumdioxid, Silikaten, Kupferoxid (Cu₂O), Eisensulfid (Fe_xS_y) Kalziumkarbonat und/oder Kalziumphosphat, wobei alle Verbindungen sowohl hydratisiert als auch noch anteilig weitere Kationen, wie beispielsweise Alkalioder Erdalkaliionen, oder weitere Anionen, wie beispielsweise Halogenidionen, enthalten können. Beispiele für gebildete Minerale sind Calcit, Vaterit, Aragonit, Hydroxylapatit, Fluorapatit oder Magnetit.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine rekombinante Nukleinsäure, welche ein Fusionsprotein aus mindestens einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid oder Teile davon und mindestens einer Aminosäuresequenz, bevorzugt einem Signalpeptid, zur Beeinflussung der Sekretion des Fusionsproteins kodiert und einen zugehörigen Promotor enthält. Die Nukleinsäure kann in Form einer DNA, cDNA, RNA oder Gemischen davon vorliegen. Die Nukleinsäure kann auch ein oder mehrere Introns enthalten und/oder als Teil eines Vektors vorliegen. Mit Vorteil enthält die Nukleinsäure noch einen Promotor für das kodierte Fusionsprotein. Die Nukleinsäure kann auch nur Teile der genannten Proteine, Polypeptide und/oder Aminosäuresequenzen kodieren.
Mit Vorteil besitzt das kodierte Protein und/oder Polypeptid mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einem Protein und/oder Polypeptid wie in Tabelle 2 oder bevorzugt in Tabelle 3 dargestellt. Es werden durch das beschriebene Verfahren in Stufe I aus einem Pool von verschiedensten potentiell biomineralisierend wirkenden Proteinen und/oder Polypeptiden bzw. der entsprechenden Polynukleotidsequenzen speziell diejenigen identifiziert, die biomineralisierend wirken.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes Protein und/oder Polypeptid, das ein Fusionsprotein aus mindestens einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid und mindestens einer Aminosäuresequenz, bevorzugt einem Signalpeptid, zur Beeinflussung der Sekretion des Fusionsproteins enthält. Bevorzugt ist ein Protein und/oder Polypeptid mit mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einem Protein und/oder Polypeptid aus der Tabelle 2, bevorzugt aus Tabelle 3, und einer Aminosäuresequenz zur Steuerung der Sekretion des Proteins und/oder Polypeptids beinhaltet. Es können auch nur Teile der Proteine und/oder Polypeptide aus Tabelle 2, bevorzugt aus Tabelle 3, enthalten sein. Die Aminosäuresequenz kann mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % sequenzhomolog zu einem Protein und/oder Polypeptid aus der Wirtszelle sein, es kann sich aber auch um ein synthetisches Peptid handeln, bevorzugt ist eine vollständig homologe Aminosäuresequenz in Bezug zum biomineralisierenden Spenderorganismus oder zur Wirtszelle (Empfängerorganismus, gentechnisch veränderter Organismus, etc.), jedoch für die Signalsequenz in Bezug zur Wirtszelle. Die Signalsequenz wird für die Homologieberechnung nicht in Betracht gezogen.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist die Signalsequenz weist die Signalsequenz mindestens 80 %, 90 %, bevorzugt 95 %, 99 % oder 100 % Sequenzhomologie zu einer Signalsequenz aus Tabelle 4 auf.
Mit Vorteil ist die Aminosäuresequenz, die zur gezielten Lokalisation im Gewebe des Ziel-Organismus führt, am N-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert. Zwischen den beiden Sequenzen können noch weitere, bis zu 10 Aminosäuren, eingefügt sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Wirtszelle, bevorzugt aus der Klasse der Schleimpilze (Eumycetozoa), welche eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung enthält. Die Wirtszelle kann beispielswiese dadurch erhalten werden, dass sie transfiziert, infiziert oder transduziert wird, beispielsweise durch Behandlung mit Plasmiden, Phagemiden, Cosmiden, retrovirale oder adenovirale Vektoren oder Partikeln, Nanopartikeln oder Liposomen, welche die Nukleinsäure gemäß der Erfindung enthalten. Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt. Die kann auch Wirtszelle zu einem der für Stufe II genannten Organismen gehören.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäure zur Herstellung eines erfindungsgemäßen organisch-anorganischen Kompositmaterials.
Die erfindungsgemäßen organisch-anorganischen Kompositmaterialien sind in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften auf vielfältige Art und Weise verwendbar. Da sie auf natürliche Prozesse aufbauen, sind sie mit geringem Energieaufwand herstellbar, insbesondere wenn eine entsprechende zur eigenständigen Reproduktion befähigte Wirtszelle (z.B. bei Pflanzen in Form von Samen oder Saatgut) vorliegt.
Eine wichtige Eigenschaft ist die durch die Einlagerung erhöhte Festigkeit und Härte. Dies erlaubt den Einsatz als Baumaterial, beispielsweise bei modifizierten Hölzern. Auch aus einem solchen Kompositmaterial hergestellte Fasern können beispielsweise für Seile, Textilien und dgl. verwendet werden. Ebenso können zerkleinerte organisch-anorganische Kompositmaterialien als Zusätze für Beschichtungen dienen. So können auch die optischen Eigenschaften kleiner Partikel genutzt werden, um diesen Materialien neue optische Eigenschaften zu verleihen. Es kann sich auch dadurch ein Vorteil ergeben, dass die anorganischen Partikel sich durch Behandlung mit wässrigen Lösungen herauslösen lassen und durch die entstehenden Hohlräume neue Eigenschaften entstehen (z.B. Leichtbau).
Ebenso kann die organische Matrix beispielsweise durch thermische Behandlung entfernt werden und so ein anorganisches Material mit bestimmter Morphologie und/oder Struktur erhalten werden.
Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. So umfassen beispielsweise Bereichsangaben stets alle – nicht genannten – Zwischenwerte und alle denkbaren Teilintervalle.
Methoden
Rekombinante DNA-Technik
Zur Manipulation von DNA wurden Standardmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook, J. et al. (1989) In. Molecular cloning: A Laboratory Manual beschrieben sind.
Die Enzyme wurden aus kommerziellen Quellen bezogen und entsprechend den Herstelleranweisungen eingesetzt.
Confocale Laser Scanning Mikroskopie, Leica DMR, die Anregung von GFP erfolgte mit einem Argon Laser bei 488 nm. Die GFP Emission wurde zwischen 507–512 nm detektiert.
LC PolScope mit dem CRI Imaging System, in Verbindung mit einem Zeiss Observer Z1.
Klonierungssystem
Die Vektoren wurden auf Grundlage des Gateway Kloniersystems entwickelt. Zur Einführung der Zielsequenz aus einem Eingangsvektor (entry vector) in den Zielvektor (destination vector) wird die Reaktion der LR-Klonase verwendet. Dabei kommt es zur Rekombination zwischen Eingangsvektor mit attL1 und attL2 Seiten und dem Zielvektor mit attR1 und attR2 Rekombinationsstellen.
Ansatz für BP/LR Reaktion:
Zunächst wurden 7 µl PCR Produkt bzw. Eingangsvektor mit 1 µl Zielvektor in einem Eppendorf Gefäß vorgelegt. Die Klonase wurde kurz geschüttelt und 2 µl zu jedem Ansatz hinzugegeben. Die Rekombination erfolgte über Nacht bei 25 °C. Um die Reaktion zu stoppen, wurden 1 µl Proteinase K zum Ansatz gegeben und 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Expression in Dictyostelium
Konstruktion des Vektors
Zur Einführung der Proteine in die Zelle wurden die Vektoren pDM353 (Seq.-ID Nr. 33; Veltman, D.M., Akar, G., Bosgraaf, L. & Van Haastert, P.J.M.A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid 61, 110–118 (2009); Veltman, D.M. Extrachromosomal expression vector. Gateway. G418 resistance. C-terminal GFP tag. http://dictybaseorg/db/cgi-bin/dictyBase/SC/plasmid_detailspl?id=546 (2009). Fig. 9a, Fig. 9b) und EcmB-Gal (Jermyn, K.A. & Williams, J.G. An analysis of culmination in Dictyostelium using prestalk and stalk-specific cell autonomous markers. Development 111, 779–87 (1991); Williams, J.G. Galactosidase fusion expression vector (prestalk marker). http://dictybase.org/db/cgi-bin/dictyBase/SC/plasmid_details.pl?id=51 (1991). Fig. 11) von dem DictyStockCenter (Fey, P. et al. dictyBase - a Dictyostelium bioinformatics resource update. Nucleic Acids Research 37, D515–519 (2009); www.dictybase.org. About Dicty Stock Center (DSC)) erhalten und als Template für die weiteren Schritte verwendet. Desweiteren kann das EcmB-Gen auch aus dem Vector pDd56 erhalten werden.
Durch PCR-Klonierung wurden XhoI und BglII Restriktionssequenzen, welche den actin15 Promoter von pdM353 begrenzen in ein DNA-Fragment eingeführt, welches den EcmB-Promotor, eine NcoI-Restriktionssequenz, die Kozak-Sequenz, das ATG-Startkodon und das Signalpeptid des ecmb Genprodukt enthält, eingeführt (10). Die aufgereinigte DNA wurde phosphoryliert und mit T4-Polynukleotidkinase (Fermentas) in einem Verhältnis von 4:1 in einen mit SmaI-geschnittenen, dephosphorylierten pBluescript SK-Vektor (Strategene) einkloniert und sequenziert. Dadurch konnte ein stabiler Vektor erhalten werden.
Der Gateway-Zielvektor wurde durch konventionelles Klonieren des Actin 15-Promotor enthaltenden pDM353 und dem vorhergehend hergestellten Teilbereich <EcmB promotor ... signal peptide> enthaltenden pBluescript SK-erhalten. Der Promotor des Vektors wurde durch Verwendung der XhoI und BglII Restriktionsstellen ausgetauscht.
Die vorgestellte Methode und die Verfügbarkeit der pDM-Vektoren (Veltman, D.M., Akar, G., Bosgraaf, L. & Van Haastert, P.J. M.A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid 61, 110–118 (2009)) erlaubt es auf einfache Weise Fusionsproteine mit Labels, wie GFP oder Immunioaffinitätslabeln, herzustellen.
Der schematische Aufbau des Vektors ist in 10 gezeigt.
Die Klonierungsstrategie einzelner Bestandteile bezogen auf die Signalsequenz aus ecmb sind in den 12, 13, 14, 15 (Seq.-ID 25, 26, 27, 28, 29, 30), 19 gezeigt.
Der Vektor kann auch zusätzlich eine Cellulosebindedomäne enthalten (St15) Dafür finden sich in den in den 16, 17, 18 und 20 weitere Angaben. Diese Domäne enthält auch ein Signalpeptid, welches ebenfalls verwendet werden kann. Weitere Primer sind in Tabelle 5 gelistet und anhand ihrer Bezeichnung einfach zuzuordnen.
Die Arbeiten wurden mit Standardprotokollen durchgeführt. Weitere Primer finden sich in Tabelle 5. Die Singalsequenzen wurden mit unterschiedlichen Schnittstellen und zum Teil auch um eine Aminosäure erweitert (Signalpeptiderweiterung) in den Vektor eingebracht.
Herstellung der Biomineralisierend wirkenden Proteine
Die folgende Vorschrift kann allgemein für unterschiedliche Proteine für Dictyostelium verwendet werden:
Die Protein-Sequenzen wurden bioinformatisch in DNA-Sequenzen "rücktranslatiert" unter Berücksichtigung von Codon-Usage Parametern mit Hilfe der Leto-Software (Entelechon, Regensburg, Germany). Die entsprechenden synthetischen Gene wurden von der Fa. Entelechon käuflich erworben und als Ausgangspunkt für PCR-Klonierung verwendet. Dies ist beispiel in der 21 für Perlucin gezeigt. Weitere Angaben finden sich auch im Codon usage Table aus Nucleic Acids Research 2000, Vol 28, No10, Vervoot et al. „Optimizing heterologous expression in dictyostelium: importance of 5' codon adaptation” auf das hiermit verwiesen wird.
Ein synthetisch hergestelltes Gen (pENTR/D-TOPO_SP-Perlucin_opt, Entelechon, Regensburg, Deutschland), welches das nacre-specific C-type lectin biomineralization protein Perlucin (Swiss-Prot: P82596.3) kodiert wurde mit folgenden Primern amplifiziert: ("DreamTag" DNA Polymerase Fermentas PCR-Verlängerung bei 68 °C):
Primer 1, forward ME_CACC_Per_for_1 (Seq-ID Nr. 31):
CACCGGATGTCCTTTGGGTTTTCACC
Primer 2, reverse EW_Per_rev_1 (Seq-ID Nr. 32):
TCTTTGTTGCAGATTGGCGTGAAGC
Templat: pENTR/D-TOPO_SP-Perlucin_opt (Entelechon)
Das PCR-Produkt wurde in einen pENTR/D-TOPO Vektor (9) mit Hilfe des Stratagene gateway cloning Kits einkloniert (Invitrogen. pENTR^TM Directional TOPO^® Cloning Kits-Five-minute, directional TOPO^® Cloning of blunt-end PCR products into an entry vector for the Gateway^® System. User Manual Version G, 25-0434 (2006)). Dabei wurde eine der folgenden Zelllinien verwendet:

– One Shot^® E. coli Zellen (TOP10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 recA1 araD139 Δ(ara-leu) 7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG; oder
– Mach1^TM-T1^R: F- Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 hsdR(r_k ^–, m_k ⁺) ΔrecA1398 endA1 tonA (confers resistance to phage T1)

Die Zellen wurden transformiert, selektiert und analysiert. Mit den Zellen, welche den pENTR/D-TOPO Vektor enthielten, wurde die LR-Reaktion mit dem vorstehend hergestellten Gateway Zielvektor mit Hilfe des Gateway^® LR Clonase^TM II enzyme Mix (Stratagene) durchgeführt.
Der erhaltene Vektor wurde in Dictyostelium discoideum AX3-ORF⁺ Zellen (Manstein, D.J., Schuster, H.-P., Morandini, P. & Hunt, D.M. Cloning vectors for the production of proteins in Dictyostelium discoideum. Gene 162, 129–134 (1995)) transformiert mit Hilfe von literaturbekannten Methoden (Nellen, W., Silan, C. & Firtel, R. A. DNA-mediated transformation in Dictyostelium discoideum: regulated expression of an actin gene fusion. Mol Cell Biol 4, 2890–8 (1984); Pang, K.M., Lynes, M.A. & Knecht, D.A. Variables Controlling the Expression Level of Exogenous Genes in Dictyostelium. Plasmid 41, 187–197 (1999); Gaudet, P., Pilcher, K.E., Fey, P. & Chisholm, R.L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols 2, 1317–1324 (2007); www.dictybase.org. Transformation of Dictyostelium by calcium phosphate precipitation. http://dictybase.org/techniques/transformation/calcium_phosphat e.html (2010); www.dictybase.org. Transformation of Dicty by electroporation. http://dictybase.org/techniques/transformation/knecht_electropo ration_protocol.html (2010)). Individuelle Klone wurden durch mehrere Selektionsschritte in Gegenwart von G418 (10–100µg/ml) erhalten und zur Entwicklung einer Zelldichte von 1 × 10⁹ ml^–1 kultiviert und dann ausplatiert (100–200µl/100mm-Platte) auf Minimal Medium wie KK2 (Fey, P., Kowal, A.S., Gaudet, P., Pilcher, K.E. & Chisholm, R.L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protocols 2, 1307–1316 (2007); www.dictybase.org. Protocols for Dictyostelium discoideum development. http://dictybase.org/techniques/media/dicty_development.html (2010)) oder MES Agar ergänzt mit CaCl₂ and MgCl₂. Zellulose Stiele formten sich nach 16 Stunden und wurden bis zu 3 Tage lang kultiviert und in regelmäßigen Abständen untersucht.
Die Präsenz des Gens und des Proteins in der Wirtszelle konnten durch PCR und Western-Blot nachgewiesen werden.
1 zeigt den Nachweis der Gene in einem Klon durch Colony PCR.
Die 2a und 2b zeigen den Nachweis der Proteine durch Coomassie-Gele und Westernblots.
Lokalisierung des Proteins
Entsprechend der verwendeten Signalsequenz ist das exprimierte Protein vor allem in den Köpfen des Schleimpilzes lokalisiert.
Dies ist in 3 anhand der Fluoreszenz des GFP deutlich zu erkennen (schwarze Kreise in 3).
Präzipitation von Kalziumcarbonat
Zur Präzipitation von Kalziumkarbonat an Dictyostelium-Klonen wurde auf die Dictyostelium-Cellulose-Produkte 500 µl CaCl₂-Lösung (20 mM, steril filtriert) gegeben und in einen Exsikkator gegeben. In den gleichen Exsikkator wurde ein Becherglas mit 5 g Ammoniumcarbonat, welches mit einer Alufolie mit drei Löchern (Durchmesser ca. 5 mm) bedeckt war. Die Proben wurden bis zu 3 Tage bei 22 °C inkubiert. Durch die Diffusion von Ammoniumcarbonat-Dampf wird die Kristallisation kommt es zur Kristallisation von Kalziumcarbonat in der Lösung.
6 zeigt die in der Leerprobe erhaltenen regelmäßigen Kristalle mit einem Durchmesser von 30–45 µm.
7 zeigt die mit dem Wildtyp erhaltenen Kristalle. In 8 sind die mit dem Klon erhaltenen Kristalle. Insbesondere in den Bildern, welche die Doppelbrechung der Kristalle zeigen, ist eine deutliche Schichtstruktur der Kristalle des Klons zu erkennen, welche sich bei dem Wildtyp nicht findet.
Als alternatives Protokoll (nach Wheeler et al. Science 1981, 212, 1397–1398) wurde CaCl₂ und NaHCO₃ in 2 mM Glygly bei pH 8.5 verwendet.
4 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der erhaltenen Kristalle. Dabei ist zu erkennen, dass sich die Kristalle am Schleimpilz und im Außenraum deutlich unterscheiden.
Ein weiteres Experiment zum Funktionsnachweis beruht darauf, die Dictyostelium-Cellulose-Produkte zu ernten, das darin enthaltene Wasser durch Gefriertrocknung zu entfernen (Fluoreszenz des GFP bleibt dabei erhalten, dies zeigt dass die Methode schonend genug ist, das biomineralisierend wirkende Protein im Kompositmaterial zu konservieren), und in Ca- bzw. Carbonathaltigen Lösungen quellen zu lassen. Auf diese Weise erhaltene Präzipitate im Zellulose-Komposit unterscheiden sich zwischen Wildtyp und Klon in der optischen Analyse mittels LC-PolScope.

Die gleichzeitige Aufnahme der Fluoreszenz zeigt, dass auch die erhaltenen Kristalle fluoreszieren, was darauf hindeutet, dass das exprimierte Protein sich auch in den Kristallen findet und daher in den biomineralisierenden Prozess eingebunden ist (5). Tabelle 1

Aminosäuren-motiv	Proteinbeispiel	Direkter Kontakt zwischen Aminsosäuren (A-A)	Wasservermittelter Kontakt
Asp (Poly-D)	RP-1 Caspartin MSP-1 Aspein Asp-rich family	–/– (D-K) (D-R)	+++++
Asn (N), Gly (G)	Caspartin	Moderat	Moderat
GDN/GNN	Nacrein	D-N	(geladene/ polare Amino säure)
Poly-G	MSI-60 MSI-31	G-G
G-rich	MSI-7
N-rich	MSP-1 LustrinA AP-24
Ala (poly-A)	MSI-60	+++++	Moderat
A-rich	AP-24	Hydrophobe Amino-säure	Keine Unter scheidung
Ser (S-rich)	MSI-31	+ (nur Cys) S-C	+++++ S-P
Ser/Pro (SP-rich) P-rich	Mucoperlin Lustrin A	–/– Kein direkter P-X (X = geladene Aminosäure	+++++ Stark bevorzugt P-S
Ser/Gly (GS-repeats)	MSP-1 Lustrin	Moderat S-C	Moderat S-P
Thr (T-rich)	AP-24	Moderat	Moderat
Val (V-rich)	MSI-31	+++++ Hydrophobe Amino säure	Moderat Keine Unter scheidung
His (H-rich)	EP fluid protein (Mytilus edulis)	+++++ Hydrophobe Aminosäure	+++++ Geladene/ polare Aminosäuren
Cys (C-rich)	LustrinA AP-4 Perlustrin	++ C-H, C-S, C-M Hydrophobe Aminosäure	++++ Bevorzugt Keine Unterscheidung

Bezeichnung	Organismus		NBCI-Number	SEQ-ID NO.
Ansocalcin	Gans	Anser anser anser	P83300	1
Ovocleidin-17 (OC17)	Huhn	Gallus gallus	Q9PRS8	2 DNA: 20
Perlucin	Seeohr	Haliotis laevigata	P82596	3
SM32	Seeigel	Strongylocentrotus purpuratus	NP_999803	4
N16.1	Auster	Pinctada fucata	Q9TVT2	5 DNA: 19
Silicatein a	Porifera	Suberites domuncula	Q2MEV3	6
Silicatein b	Porifera	Suberites domuncula	Q50IU7	7
Nacrein	Auster	Pinctada fucata	Q27908	8
Lustrin A	Seeohr	Haliotis rufescens	O44341	9
Amelogenin	Mensch	Homo sapiens	Q99217/Q99218	10/11
Enamelin	Mensch	Homo sapiens	Q9NRM1/Q8IWP4	12/13

Tabelle 3

Protein	Datenbank-ID	Seq.-ID
EcmB (Extracellular Matrix protein ST310)	Dictybase DDB_G0269132	18
Signalpeptid aus EcmB		16 DNA: 14
Signalpeptid aus EcmB mit Erweiterung		17 DNA: 15
St15	Dictybase DDB0229932	22
Signalpeptid aus St15		15

Tabelle 4

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/125127 A2 [0008]
WO 98/36084 A2 [0014]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Weiss I. M. und Marin F. Met. Ions. Life Sci. 2008, 4, 71–136, The Role of Enzymes in Biomineralization Processes [0006]
Weiss I. M., ChemBioChem 2010, 11, 297–300 [0006]
Sambrook, J. et al. (1989) In. Molecular cloning: A Laboratory Manual [0090]
Seq.-ID Nr. 33; Veltman, D.M., Akar, G., Bosgraaf, L. & Van Haastert, P.J.M.A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid 61, 110–118 (2009) [0096]
Veltman, D.M. Extrachromosomal expression vector. Gateway. G418 resistance. C-terminal GFP tag. http://dictybaseorg/db/cgi-bin/dictyBase/SC/plasmid_detailspl?id=546 (2009). Fig. 9a, Fig. 9b [0096]
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http://dictybase.org/techniques/transformation/knecht_electropo ration_protocol.html (2010) [0108]
Fey, P., Kowal, A.S., Gaudet, P., Pilcher, K.E. & Chisholm, R.L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protocols 2, 1307–1316 (2007) [0108]
www.dictybase.org. Protocols for Dictyostelium discoideum development [0108]
http://dictybase.org/techniques/media/dicty_development.html (2010) [0108]
Wheeler et al. Science 1981, 212, 1397–1398 [0117]

Claims

Verfahren zur Identifikation von biomineralisierenden Systemen umfassend folgende Schritte: a) Einbringen mindestens eines rekombinanten Polynukleotids in mindestens eine Wirtszelle aus der Klasse der Schleimpilze (Eumycetozoa), wobei das rekombinante Polynukleotid; a1) mindestens ein Protein und/oder Polypeptid kodiert, und a2) zur Expression des kodierten Proteins und/oder Polypeptides in der Wirtszelle geeignet ist, b) Expression des durch das rekombinante Polynukleotid kodierten Proteins; c) Untersuchung einer biomineralisierenden Wirkung des exprimierten Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Polynukleotid mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, welche eine Aminosäurensequenz zur Steuerung der Lokalisierung und/oder Zeitpunkt der Expression des Proteins und/oder Polypeptids kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Polynukleotid ein Fusionsprotein bestehend aus dem Protein und/oder Polypeptid und einer Signalsequenz zur Steuerung der Lokalisierung und/oder Zeitpunkt der Expression des Proteins und/oder Polypeptids kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erste rekombinante Polynukleotid ein Protein und/oder Polypeptid aus Tabelle 2, bevorzugt aus Tabelle 3 kodiert.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Zelle der Gattung Dictyostelium, insbesondere der Art Dictyostelium discoideum, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die biomineralisierende Wirkung durch in Kontaktbringen der Wirtszelle mit einer Lösung mindestens eines Salzes umfasst.
Organisch-anorganisches Kompositmaterial erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 6.
Rekombinante Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fusionsprotein bestehend aus mindestens einem biomineralisierend wirkendem Protein und/oder Polypeptid und mindestens einer Aminosäuresequenz zur Beeinflussung der Sekretion des Fusionsproteins kodiert und einen zugehörigen Promotor enthält.
Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte biomineralisierend wirkende Protein und/oder Polypeptid mindestens 80 % Sequenzhomologie zu einem Protein und/oder Polypeptid aus der Tabelle 2 aufweist.
Rekombinantes Protein und/oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Fusionsprotein aus mindestens einem biomineralisierend wirkenden Protein und/oder Polypeptid und einer Aminosäurensequenz zur Beeinflussung der Sekretion des Fusionsproteins umfasst und das biomineralisierend wirkende Protein und/oder Polypeptid mindestens 80 % Sequenzhomologie zu einem Protein und/oder Polypeptid aus der Tabelle 2 aufweist.
Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie eine rekombinante Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 oder 9 enthält.