DE102004021230A1

DE102004021230A1 - Enzym-und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung

Info

Publication number: DE102004021230A1
Application number: DE102004021230A
Authority: DE
Inventors: Heiko Dr. Schwertner; Werner E.G. Prof. Dr. Müller; Heinz C. Prof. Dr. Dr. Schröder
Original assignee: Individual
Current assignee: Nanotecmarin 55128 Mainz De GmbH
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2005-11-24
Also published as: US20080293096A1; CA2565118A1; EP1740707A1; WO2005106003A1; JP2007535319A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Silicia, Kondensationsprodukte der Kieselsäure) und anderen polymeren Metall(IV)-Verbindungen aus nicht-organischen Siliciumverbindungen bzw. Metall(IV)-Verbindungen sowie Aminosilanen und Silazane, wobei (1) ein Template (Kollagen oder anderes Molekül, das mit Orthokieselsäure oder polymeren Kieselsäuren sowie deren Salzen oder anderen Metall(IV)-Verbindungen in Wechselwirkung tritt) und (2) eine Silicase/Carboanhydrase oder ein Silicatein oder verwandtes Polypeptid zur Synthese eingesetzt wird, und dessen technische Verwendung.

Description

Siliciumverbindungen sind von außerordentlicher wirtschaftlicher Bedeutung. Sie werden u. a. benutzt in der Glas-, Faserglas- und Porzellan-Industrie, bei der Zement-Produktion, zur Herstellung von Keramiken, in der Lack-, Kautschuk-, Kunststoff- und Papier-Industrie, in der Waschmittel-Industrie, bei der Farben-, Seifen- und Kosmetika-Produktion sowie in der Medizin/Zahnmedizin, z. B. bei der Dental-Manufaktur/Reparatur. Bestimmte Silicate besitzen Molekularsieb- und Ionenaustauscher-Eigenschaften sowie katalytische Eigenschaften (siehe u. a.: CD Römpp Chemie Lexikon – Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995).

Die Orthokieselsäure (H₄SiO₄) ist eine sehr schwache Säure. Verdünnte Lösungen sind lediglich bei kleinen pH-Werten (pH 2–3) einige Zeit beständig. Bei einer Erhöhung oder Erniedrigung des pH kommt es zur intermolekularen Wasserabspaltung (Kondensation), wobei als erstes Kondensationsprodukt die Dikieselsäure (Pyrokieselsäure; H₆Si₂O₇) auftritt. Als weitere Kondensationsprodukte entstehen zunächst – bei einer kleineren Gliederzahl (n = 3, 4 oder 6) – zyklische Kieselsäuren sowie auch käfigartige Kieselsäuren und Polykieselsäuren. Diese Metakieselsäuren besitzen die Bruttozusammensetzung (H₂SiO₃)_n. Das Endprodukt der Kondensation ist ein polymeres Siliciumdioxid (SiO₂)_x, das amorph ist, da bei der Kondensation kettenverlängernde und verzweigende Prozesse ungeordnet nebeneinander ablaufen. Bei allen Kieselsäuren befinden sich die Siliciumatome im Mittelpunkt von regelmäßigen Tetraedern, deren Ecken jeweils vier Sauerstoffatome bilden. Bei den Polykieselsäuren bzw. im amorphen Siliciumdioxid gehören die Sauerstoffatome gleichzeitig den benachbarten, miteinander unregelmäßig verknüpften Tetraedern an.

Biosilica

Auch das Skelett der Kieselalgen (Diatomeen) und der Kieselschwämme besteht aus amorphem SiO₂ („Biosilica"). Die SiO₂-Synthese bei diesen Organismen ist durch hohe (strukturelle) Spezifität und Regulierbarkeit ausgezeichnet, was die Synthese definierter Strukturen im mikroskopischen und submikroskopischen Bereich (Nanostrukturen) ermöglicht. Darüber hinaus besitzen Kieselschwämme die Fähigkeit, ihre Silicatgerüste unter milden Bedingungen, d. h. bei relativ niedriger Temperatur und niedrigem Druck, zu bilden. Dies beruht auf der Tatsache, dass an ihrer Synthese spezifische Enzyme beteiligt sind. Im Gegensatz hierzu sind zur chemischen Synthese der Silicate meist drastische Bedingungen wie hoher Druck und hohe Temperatur erforderlich. Deshalb ist die Herstellung vieler Siliciumverbindungen auf herkömmlichen Wege kostenintensiv und auch wenig umweltfreundlich.

Zwei Enzyme, die bei silicatbildenden Organismen an der Synthese des SiO₂-Skeletts beteiligt ist, und ihre technische Verwendung wurden beschrieben. Bei dem ersten Enzym handelt es sich um Silicatein, das in drei Formen, Silicatein-α, -β und -γ, vorkommt (PCT/US99/30601. Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/metallo)oxane materials under environmentally benign conditions. Inventors/Applicants: Morse DE, Stucky GD, Deming, TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y; DE 10037270 A1 . Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches Patentamt 2000. Anmeldet und Erfinder: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC). Silicatein-α wurde aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula kloniert (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S. domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267: 4878–4887). Silicatein-β, das ebenfalls aus S. domuncula kloniert wurde, zeichnet sich durch einige vorteilhafte Eigenschaften im Vergleich zu Silicatein-α hinsichtlich seiner Vergleich zu Silicatein-α hinsichtlich seiner katalytischen Fähigkeiten und deren technische/medizinische Anwendbarkeit aus ( DE 103 52 433.9. Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. Deutsches Patentamt 2003. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Schwertner H, Schnöder HC).

Beide, Silicateine, Silicatein-α und Silicatein-β, sind nach dem Stand der Technik lediglich in der Lage, aus organischen Siliciumverbindungen (Alkoxysilanen) amorphes Siliciumdioxid (Polykieselsäuren und Polysilicate) zu bilden (Cha JN, Shimizu K, Zhou Y, Christianssen SC, Chmelka BF, Stucky GD, Morse DE (1999) Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 96:361–365; sowie oben zitierte Patente).

Bei dem zweiten Enzym handelt es sich um eine Silicase ( DE 102 46 186.4. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. Deutsches Patentamt 2002. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Krasko A, Schröder HC; PCT/EP03/10983. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. European Patent Office 2003. Applicant: Johannes Gutenberg-Universität Mainz. Inventors: Müller WEG, Krasko A, Schröder HC; Schröder HC, Krasko A, Le Pennec G, Adell T, Wiens M, Hassanein H, Müller IM, Müller WEG (2003) Silicase, an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula. Prog Mol Subcell Biol 33:250–268). Die Silicase, und zwar insbesondere das Enzym aus dem Meeresschwamm S. domuncula, ist in der Lage, sowohl amorphes als auch kristallines Siliciumdioxid aufzulösen. Hierbei kommt es zur Freisetzung von Kieselsäure. Daneben besitzt die Silicase die Fähigkeit, in Analogie zu der Carboanhydrase Kalkmaterial aufzulösen.

Bisher wurde nicht offenbart, dass dieses Enzym in Gegenwart eines geeigneten Template (z. B. Kollagen) auch in der Lage ist, eine Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Silica) aus nicht-organischen kurzkettigen Metasilicaten sowie aus eine eine oder mehrere Si-N-Bindungen enthaltenden Aminosilanen oder Silazanen zu bewirken.

Kollagen

Kollagen ist neben Elastin, polyanionischen Proteoglykanen und Struktur-Glykoproteinen Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix der Gewebe und Organe. Kollagenfibrillen besitzen eine außerordentlich große Zugfestigkeit. Dadurch sind sie insbesondere in der Lage, dem Binde- und Stützgewebe mechanische Stabilität zu verleihen. Weiterhin ist die Bildung von Kollagenfibrillen ein wichtiger Prozess bei der Wundheilung.

Bei Vertebraten bilden die Kollagene eine große Proteinfamilie: 19 Kollagentypen wurden beschrieben, die von mindestens 33 verschiedenen Genen kodiert werden (Prockop und Kivirikko (1995) Annu Rev Biochem 64:403–434). Unter den Mitgliedern der Kollagen-Familie befinden sich sowohl fibrilläre als auch nichtfibrilläre Proteine. Die fibrillären Kollagentypen I, II, III, V und XI sind in der Lage, Fibrillen mit einem Bandenmuster zu bilden. Die sogenannten nichtfibrillären Kollagene kommen zusammen mit den fibrillären Kollagenen (fibrillenassoziierte Kollagene) oder in den Basalmembranen (Typ IV; Basalmembran-Kollagene) vor. Weiterhin gehören zu dieser Gruppe die kurzkettigen Kollagene. Einige Kollagene – wie die Typen XV und XVIII – sind nur aufgrund ihrer cDNA bekannt.

Das gemeinsame Strukturmerkmal aller Kollagene ist die Tripelhelix, die aus drei umeinander gewundenen Polypeptidketten (α-Ketten) besteht, welche die sich wiederholende Sequenz G-x-y besitzen; x ist meist Prolin und y häufig Hydroxyprolin. Dieses Triplet bedingt die charakteristische helicale Konformation der Kollagen-α-Helix und deren Eigenschaft, mit ähnlichen Polypeptidketten unter Ausbildung der Tripelhelix zu assemblieren (Brodsky und Ramshaw (1997) Matrix Biol 15:545–554). Meist ist die Tripelhelix aus den Polypeptidketten unterschiedlicher Kollagentypen (α1, α2, α3) zusammengesetzt. Die resultierende Struktur besitzt aufgrund der Position von Glycin (einer kleinen Aminosäure) nahe der Achse der Helix, der stabilisierenden Wirkung von Prolin und der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen eine hohe Stabilität (Bella et al. (1994) Science 266:75–81).

Das Typ I Kollagen bildet die Hauptmenge des Kollagens im Organismus. Bei dem Typ II Kollagen handelt es sich um das Fibrillen-bildende Kollagen des Knorpels. Bei diesen Kollagentypen sind jeweils drei α-Ketten zusammengelagert. Die Länge der so gebildeten Tropokollagenmoleküle beträgt 280 nm. In den Kollagen-Fibrillen wird eine versetzte Anordnung dieser Bausteine gefunden. Durch die gestaffelte Anordnung dieser Moleküle kommt es alle 68 nm zum Auftreten von Querstreifen innerhalb der Kollagenfasern.

Bei den sogenannten Minoritäten-Kollagenen wird die Tripelhelix nur noch in einigen Abschnitten des Moleküls gefunden; andere Abschnitte weisen globuläre Domänen auf. Zu ihnen gehören die Kollagentypen IV bis XIX. Die Typ V- und Typ XI-Minoritätenkollagene bilden allerdings auch Fibrillenstrukturen aus. Das Typ IV-Kollagen ist für die Ausbildung räumlicher Gitterwerke spezialisiert und kommt in den Basalmembranen vor. Das im interstitiellen Bindegewebe vorkommende Typ VI-Kollagen besitzt nur eine relativ kurze Tripelhelix; die beiden globulären Domänen an den Enden dieses hantelförmigen Kollagentyps treten mit dem Typ I-Kollagen sowie Membran-ständigen Integrinen in Wechselwirkung. Das Typ VII-Kollagen dient der Verankerung der Basalmembran unter Plattenepithelien. Die Typ VIII- und Typ X-Kollagene sind kurzkettige Kollagene; die Typ VIII-Kollagene assoziieren zu einem hexagonalen Netzwerk. Das Typ IX-Kollagen gehört zu den Fibrillen-assoziierten Kollagenen und kommt zusammen mit Typ II-Kollagen in den kalzifizierenden Bereichen des enchondralen Knorpels vor.

Klonierung und Sequenzierung von Kollagen aus Schwämmen

Kollagen ist auch ein Hauptprotein der extrazellulären Matrix der Schwämme und fungiert als Matrix für die Spicula-Bildung (Bildung der Schwamm-Nadeln) (Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878–4887). Kollagenfibrillen bei Schwämmen sind denjenigen bei Vertebraten sehr ähnlich (Gross et al. (1956) J Histochem Cytochem 4:227–246; Garrone et al. (1975) J Ultrastruct Res 52:261–275; Garrone (1978) Phylogenesis of connective tissue. Karger, Basel). Elektronenmikroskopische Untersuchungen des Kollagens aus dem Meeresschwamm Geodia cydonium zeigen 20 bis 25 nm dicke Kollagenfibrillen mit einer Periodizität von 19,5 nm (Diehl-Seifert et al. (1985) J Cell Sci 79:271–285; Gramzow et al. (1988) J Histochem Cytochem 36:205–212). Das von uns aus dem Meeresschwamm S. domuncula klonierte Kollagen (Schröder et al. (2000) FASEB J 14:2022–2031) besteht aus (i) einer nichtkollagenen N-terminalen Domäne, (ii) einer kollagenen internen Domäne und (iii) einer nicht-kollagenen C-terminalen Domäne. Die interne Domäne ist bei S. domuncula ungewöhnlich kurz mit lediglich 24 G-x-y Kollagentripletts. Im Gegensatz dazu besitzt das Kollagen des Süßwasserschwammes Ephydatia muelleri zwei interne Domänen mit 79 G-x-y Tripletts (Exposito et al. (1991) J Biol Chem 266:21923–21928). Die Organisation der Gene, die für die fibrillären Schwamm-Kollagene kodieren, ähnelt somit sehr derjenigen der Vertebraten-Kollagen-Gene.

Die Expression von Kollagen in Schwammzellen (benutzt wurden Primmorphe, eine spezielle Form von aus Schwamm-Einzelzellen gebildeten 3D-Zellaggregaten; DE 19824384 . Herstellung von Primmorphe aus dissoziierten Zellen von Schwämmen, Korallen und weiteren Invertebraten: Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland. Erfinder und Anmelden: Müller WEG, Brummer F; Müller et al. (1999) Mar Ecol Prog Ser 178:205–219) wird durch Myotrophin stimuliert (Schröder et al. (2000) FASEB J 14:2022–2031; Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878–4887). Myotrophin ist ein wachstumsförderndes Protein, das von den Erfindern ebenfalls aus S. domuncula cloniert wurde.

Gegenstand der Erfindung

Überraschenderweise konnte nun von den Erfindern gezeigt werden, dass die Silicase und andere Carboanhydrasen sowie Silicateine in der Lage sind, in Gegenwart geeigneter Template wie Kollagen auch nicht-organische Siliciumverbindungen, insbesondere Metasilicate, sowie ein oder mehrere Si-N-Bindungen enthaltende Aminosilane oder Silazane in Silica umzusetzen. Bisher war nur bekannt, dass Silicateine die Hydrolyse organischer Siliciumverbindungen mit einer oder mehreren Si-O-Bindungen (Alkoxysilane) katalysieren (mit nachfolgender Kondensation der freigesetzten Silanole unter Bildung von amorphem Siliciumdioxid; siehe Zhou et al. (1999) Angew. Chem. [Int. Ed.] 38:780–782; PCT/US99130601; DE 10037270 A1 ; 10037270 A1; PCT/EP01/08423). Von den Carboanhydrasen-Domänen enthaltende Enzymen war bekannt, dass sie zwar in der Lage sind, anorganische Polysilicate (Polykieselsäuren) sowie amorphes und auch kristallines Siliciumdioxid unter Freisetzung von Kieselsäure zu spalten (Schröder et al. (2003) Prog Mol Subcell Biol 33:250–268; DE 102 46 186.4 ; PCT/EP03/10983), nicht dagegen zur Katalyse einer Template-gesteuerten Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Silica) aus Orthosilicaten und Metasilicaten.

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit allgemein ein Verfahren zur in vitro oder in vivo Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Silica, Kondensationsprodukte der Kieselsäure) und anderen Metall(IV)-Verbindungen zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids eingesetzt wird, das entweder dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid eine tierische, pflanzliche, bakterielle oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfasst, die mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, oder dadurch, dass das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α-Domäne oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 3 bzw. in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Sequenz aufweist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Templates, das ein Polypeptid von Kollagen aus S. domuncula gemäß SEQ ID Nr. 7 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Sequenz besitzt oder Teile davon enthält oder daraus besteht.

Das erfindungsgemäße Template (Kollagen oder anderes Polypeptid) kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es synthetisch hergestellt worden ist oder dass es in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder -lysat vorliegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex vivo oder ex vitro gewonnen werden, werden, zum Beispiel einer rekombinanten bakteriellen Zelle oder einem Meeresschwamm.

Das erfindungsgemäße Template (Kollagen oder anderes Polypeptid) kann nach herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden und somit im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorliegen.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Synthese Verbindungen wie Kieselsäuren (Orthokieselsäure und Metakieselsäure) oder deren Salze (Orthosilicate und Metasilicate) oder andere Metall(IV)-Verbindungen als Reaktanten (Substrate) eingesetzt werden.

Bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Synthese Verbindungen wie Alkyl- und Dialkylaminosilane, Bis(alkylamino)silane bzw. Bis(dialkylamino)silane, Tris(alkylamino)silane bzw. Tris(dialkylamino)silane, Tetrakis(alkylamino)silane bzw. Tetrakis(dialkylamino)silane sowie Alkyl- oder Aryl-substitutierte Derivate dieser Verbindungen (allgemein: Aminosilane) eingesetzt werden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein oder mehrere Si-N-Bindungen enthalten.

Bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Synthese Di-, Tri-, Tetra- und Polysilazane sowie Alkyl- oder Aryl-substitutierte Derivate dieser Verbindungen (allgemein: Silazane), einschließlich der cyclischen Verbindungen (Cyclotrisilazane, Cyclotetrasilazane und weitere Derivate), eingesetzt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Verfahrens zur Modifikation von Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Materialien.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Synthese definierter zwei- und dreidimensialer Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid (Silica, Kondensationsprodukte der Kieselsäure) und anderen polymeren Metall(IV)-Verbindungen verwendet werden.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine chemische Verbindung oder Silica (amorphes Siliciumdoxid)-enthaltende Struktur oder Oberfläche, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde.

SEQ ID Nr. 2 zeigt die Nucleotidsequenz der Schwamm-Silicase-cDNA und SEQ ID Nr. 1 zeigt das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid der Schwamm-Silicase (SIA_SUBDO). Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Schwamm-Silicase besitzt eine große Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen der Carboanhydrase-Familie. Die Eukaryonten-Typ-Carboanhydrase-Domäne (PFAM00194 [www.ncbi.nlm.nig.gov]) wird bei der Schwamm-Silicase im Aminosäure-Bereich von aa₈₇ bis aa₃₃₅ gefunden. Die meisten der charakteristischen Aminosäuren, welche die Eukaryonten-Typ-Carboanhydrase-Signatur bilden (Fujikawa-Adachi et al. (1999) Biochim Biophys Acta 1431:518–524; Okamoto et al. (2001) Biochim Biophys Acta 1518:311–316), sind auch in der Schwamm-Silicase vorhanden.

Die Carboanhydrasen bilden eine Familie von Zinkmetall-Enzymen (Sly und Hu (1995) Annu Rev Biochem 64:375–401). Die drei Zink-bindenden konservierten Histidinreste werden in der Silicase bei den Aminosäuren aa₁₈₁, aa₁₈₃ und aa₂₀₆ gefunden (siehe SEQ ID Nr. 1).

Neben der Schwamm-Silicase können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch (z. T. kommerziell erhältliche) Carboanhydrasen aus anderen Organismen verwendet werden.

Die Erfindung soll nun im folgenden durch die beigefügten Beispiele genauer beschrieben werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. In den beigefügten Sequenzen und Figuren zeigen:
SEQ ID No. 1: Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäß verwendeten Silicase aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
SEQ ID No. 2: Die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäß verwendeten Silicase aus S. domuncula.
SEQ ID No. 3: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Silicateins-α aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
SEQ ID No. 4: Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Silicateins-α aus S. domuncula.
SEQ ID No. 5: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Silicateins-β aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
SEQ ID No. 6: Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Silicateins-β aus S. domuncula.
SEQ ID No. 7: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Kollagens 3 aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
SEQ ID No. 8: Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäß verwendeten Kollagens 3 aus S. domuncula.
1: A. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von isoliertem Kollagen von Geodia cydonium. (A-a) Bündel von Kollagenfibrillen. (A-b) Negativ gefärbte Fibrillen. B. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Schwamm-SiO₂-Skelettelementen. Oben von links nach rechts: Tylostyle (Suberites domuncula), Spheraster (Geodia cydonium), Sterraster (Geodia cydonium). Unten von links nach rechts: Sterraster (Geodia cydonium) in zunehmender Vergrößerung.
2: Nucleotidsequenz des Carboanhydrase (Silicase)-Klons (S. domuncula) sowie Forward Primer (Positiv-1 und Positiv-2) und Reverse Primer (Negativ-1) zur Amplifizierung der für die lange und die kurze Silicase-Form kodierenden cDNA zur Klonierung in den Expressionsvektor pGEX-4T-2 und Aminosäuresequenz der rekombinanten Proteine (lange und kurze Form der Silicase). Protein-Information über die Proteine ist:
Protein-Information über CAexpresL.prt (lange Form):
Molekulargewicht: 43130,74 Dalton + 25000 Da GST ~~> 68 kDa
379 Aminosäuren
46 Stark basische(+) Aminosäuren (K, R)
46 Stark saure (–) Aminosäuren (D, E)
120 Hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, F, W, V)
103 Polare Aminosäuren (N, C, Q, S, T, Y)
7,666 Isoelektrischer Punkt
2,871 Ladung bei pH 7,0
Protein-Information über CAexpresS.PRO(1,2
4) (kurze Form):
Molekulargewicht: 32271,28 Dalton + 25000 Dalton GST ~~> 57 kDa
284 Aminosäuren
35 Stark basische (+) Aminosäuren (K, R)
39 Stark saure (–) Aminosäuren (D, E)
91 Hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, F, W, V)
70 Polare Aminosäuren (N, C, Q, S, T, Y)
6.701 Isoelektrischer Punkt
–1,795 Ladung bei pH 7,0
3: Nucleotidsequenz des Carboanhydrase (Silicase)-Klons (S. domuncula) sowie Forward Primer (Positiv-1 und Positiv-2) und Reverse Primer (Negativ-1) zur Amplifizierung der für die lange und die kurze Silicase-Form kodierenden cDNA zur Klonierung in den Expressionsvektor pBAD/gIII A und Aminosäuresequenz der rekombinanten Proteine (lange und kurze Form der Silicase). Protein-Information über die Proteine ist:
Lange Form: Molekulargewicht: 48430,78 Dalton
424 Aminosäuren
49 Stark basische (+) Aminosäuren (K, R)
53 Stark saure (–) Aminosäuren (D, E)
137 Hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, F, W, V)
111 Polare Aminosäuren (N, C, Q, S, T, Y)
7,005 Isoelektrischer Punkt
0,045 Ladung bei pH 7,0 Kurze Form: Molekulargewicht: 33 702,52 Dalton
330 Aminosäuren
0,045 Ladung bei pH 6,52
4: Expression von nichtfibrillärem Kollagen 3 von S. domuncula im pBAD/gIII-Expressionsvektor. Von oben nach unten werden gezeigt: Nucleotidsequenz des Kollagen 3-Klons mit Bindestellen des „Forward primer" und des „Reverse primer"; insertierte Sequenz des nichtfibrillären Kollagens 3 von S. domuncula im Expressionsvektor pBAD/gIII (die Restriktionsstellen von Ncol und HindIII sind unterstrichen); die benutzten Primer für die Expression in pBAD/gIII („Forward Primer" Col3_f und „Reverse Primer" Col 3_r; die Restriktionsstellen von Ncol und HindIII sind markiert); aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des rekombinanten Proteins.
5: Schwammkollagene. A. Vergleich der deduzierten Aminosäuresequenzen der cDNA des S. domuncula Kollagens (COL1_SUBDO) mit denjenigen des Kollagens aus E. muelleri (COL4_EPHMU). Konservierte Aminosäurereste (ähnlich oder verwandt im Hinblick auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften) in den Sequenzen werden in weiß auf schwarz gezeigt. NC1: nicht-kollagene N-terminale Domäne. COL: kollagene interne Domäne. NC2: nicht-kollagene C-terminale Domäne. B. Vergleich des S. domuncula-Kollagens mit dem Kollagen von E. muelleri. NC1: nicht-kollagene Nterminale Domäne. COL: kollagene interne Domäne. NC2: nicht-kollagene Cterminale Domäne. Zahlen: Anzahl der Aminosäuren.
6: A. Herstellung von rekombinantem Silicatein-α. B. Herstellung von rekombinanter Silicase.
7: In dem hier gezeigten Experiment wurden 100 μM Na-Metasilicat in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 μg/ml rekombinantem Silicatein-α oder Rinderserumalbumin (BSA) in Puffer (50 mM Tris-HCI pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde – wie in der Figur angegeben – 4 μg/ml rekombinantes Schwamm-Kollagen, 10 μg/ml Carboanhydrase (aus Rinder-Erythrozyten) und/oder 10 mM Catechol hinzugefügt und für weitere 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen angegebenen Konzentrationen handelt es sich um die Endkonzentration nach Zusatz jeweils aller Komponenten zu den Ansätzen. Zum Nachweis des gebildeten amorphen Siliciumdioxids wurden die Reaktionsansätze in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert (12 000 × g; 15 min; 4°C), mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend wurden die Sedimente mit 1 M NaOH hydrolysiert und das freigesetzte Silicat unter Anwendung eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens (kolorimetrischer "Silicon Test" der Firma Merck) quantitativ gemessen.
Der Versuch zeigt, dass maximale Mengen an amorphem Silica in Gegenwart von Kollagen, Silicatein-α und Carboanhydrase (0,098–0,117 OD-Einheiten) sowie in Gegenwart von Kollagen und Silicatein-α (0,138 OD-Einheiten) synthetisiert werden. Geringere Mengen an unlöslichem SiO₂ wurden in Abwesenheit der Carboanhydrase (0,057 OD-Einheiten) und in Abwesenheit von Silicatein-α (0,037 und 0,048 OD-Einheiten) bestimmt. In Abwesenheit von Kollagen wurden sowohl mit als auch ohne Silicatein oder Carboanhydrase oder beiden Enzymen nur sehr geringe Mengen an unlöslichem SiO₂ (0,014–0,019 bzw. 0,022 bzw. 0–0,018 bzw. 0,008 OD-Einheiten) gemessen. Ebenfalls wurde auch in Gegenwart von Kollagen alleine nur wenig unlösliches SiO₂ gebildet (0,008 und 0,032 OD-Einheiten). In Gegenwart von BSA anstelle von Silicatein und Kollagen wurden sowohl mit als auch ohne Carboanhydrase nur sehr geringe SiO₂-Mengen gemessen (0.015 OD-Einheiten). Der Zusatz von Catechol führte zu einer Erniedrigung der Menge an unlöslichem SiO₂.
8: In dem hier gezeigten Experiment wurde 100 μM Na-Metasilicat in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 bis 400 μg/ml rekombinantem Silicatein-α oder Rinderserumalbumin (BSA; 20 μg/ml) in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde – wie in der Figur angegeben – 4 μg/ml rekombinantes Schwamm-Kollagen, 10 μg/ml Carboanhydrase (Rinder-Erythrozyten) und/oder 10 mM Catechol hinzugefügt und für weitere 5 h bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen angegebenen Konzentrationen handelt es sich um die Endkonzentration nach Zusatz jeweils aller Komponenten zu den Ansätzen. Zum Nachweis des gebildeten amorphen Siliciumdioxids wurden die Reaktionsansätze wie in 5 beschrieben weiter behandelt und die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ bestimmt. Es wurde gefunden, dass die Menge an unlöslichem SiO₂ mit zunehmender Konzentration an Carboanhydrase ansteigt (von 0,002 bis 0,050 OD-Einheiten). Eine Präinkubation mit Silicatein-α (10 min) führte zu keiner weiteren Erhöhung, sondern unter den angewandten Bedingungen zu einer Abnahme der SiO₂-Bildung (0,015 und 0,030). In Gegenwart von BSA anstelle von Silicatein und Kollagen wurden nur sehr geringe SiO₂-Mengen gemessen (0.020 OD-Einheiten OD-Einheiten). Ohne Zusatz von Catechol waren die Mengen an gebildetem unlöslichem SiO₂ größer.
9: In dem hier gezeigten Experiment wurden 100 μM Na-Metasilicat und 4 μg/ml rekombinantes Schwamm-Kollagen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (2 bis 20 μg/ml) an Carboanhydrase (aus Rinder-Erythrozyten) in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol) in Gegenwart von 10 mM Catechol für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Hierbei stieg die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ stark an (von 0,015 bis 0,060 OD-Einheiten). Ebenso stieg die Menge an gebildetem SiO₂ mit zunehmender Menge an Kollagen (1,2 bis 10 μg/ml) stark an (von 0,022–0,023 auf 0,068–0,070 OD-Einheiten). Eine Erhöhung der Na-Metasilicat-Konzentration führte zu keiner weiteren Steigerung, sondern zu einer Abnahme der SiO₂-Bildung (bis zu 0,027 OD-Einheiten). In Gegenwart von Rinderserumalbumin (BSA; 20 μg/ml) anstelle von Kollagen wurde nur sehr wenig SiO₂ gebildet (0,008 OD-Einheiten); in Gegenwart der Carboanhydrase alleine lag die SiO₂-Bildung dagegen bei 0,019–0,029 OD-Einheiten. Ohne Zusatz von Catechol war die SiO₂-Bildung etwas geringer. Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um die Endkonzentration nach Zusatz jeweils aller Komponenten zu den Ansätzen. Zum Nachweis des gebildeten amorphen Siliciumdioxids wurden die amorphen Siliciumdioxids wurden die Reaktionsansätze wie in 5 beschrieben weiter behandelt und die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ bestimmt.
10: In dem hier gezeigten Experiment wurden 100 μM Si-Catecholat-Komplex in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 μg/ml rekombinantem Silicatein-α in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde – wie in der Figur angegeben – entweder rekombinantes Schwamm-Kollagen (1 bis 4 μg/ml) oder gereinigtes Rinder-Kollagen (2 bis 10 μg/ml) sowie 10 μg/ml Carboanhydrase (aus Rinder-Erothrozyten) hinzugefügt und für weitere 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um die Endkonzentration nach Zusatz jeweils aller Komponenten zu den Ansätzen. Zum Nachweis des gebildeten amorphen Siliciumdioxids wurden die Reaktionsansätze wie in 5 beschrieben weiter behandelt und die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Zusatz steigender Mengen an fibrillärem Kollagen (Rind) – im Gegensatz zu rekombinantem, nicht-fibrillärem Schwamm-Kollagen – die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ zunächst ansteigt, aber dann wieder abfällt. Ebenso wie bei der Benutzung von Na-Metasilicat (siehe 7) stieg die Menge an gebildetem SiO₂ mit zunehmender Menge an Schwamm-Kollagen (1 bis 4 μg/ml) stark an (von 0,002 auf 0,010 OD-Einheiten). Ähnlich wie bei den mit Na-Metasilicat erhaltenen Ergebnissen (siehe 5) war die SiO₂-Bildung in Gegenwart von Catechol geringer, was durch eine Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung Si-Catecholat-Komplex erklärt werden kann. In Gegenwart der Carboanhydrase alleine wurde kein unlösliches SiO₂ gebildet (nicht gezeigt in der Abbildung). Eine Erhöhung der Konzentration von rekombinantem Silicatein-α auf 40 und 400 μg/ml führte zu einer Abnahme der SiO₂-Bildung (nicht gezeigt in der Abbildung).
11: Gezeigt ist der Nachweis der gebildeten Silica-Produkte mit Hilfe eines „High Performance Field Emission Electron Probe Microanalyzer (EPMA)". Die Inkubation wurde in Abwesenheit (= Kontrolle) oder in Gegenwart von 50 μg/ml Carboanhydrase (aus Rinder-Erythrozyten; Firma Calbiochem) und 30 μg/ml Kollagen in Puffer (50 mM mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM (3-Mercaptoethanol) mit 1 mM Na-Metasilicat bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Inkubationszeit für betrug 4 h. Gezeigt sind die Ergebnisse der Element-Analyse für Si in einem Ansatz mit Carboanhydrase und Kollagen (A) und einer Kontrolle (Abwesenheit von Carboanhydrase und Kollagen; B).
Herstellung und Nachweis der für das Verfahren benötigten Komponenten
Herstellung der Silicase
Die Reinigung der Silicase aus natürlichen Quellen wie Geweben oder Zellen sowie die rekombinante Herstellung des Enzyms wurden beschrieben und sind Stand der Technik ( DE 102 46 186.4. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. Deutsches Patentamt 2002. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Krasko A, Schröder HC; PCT/EP03/10983. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. European Patent Office 2003. Applicant: Johannes Gutenberg-Universität Mainz. Inventors: Müller WEG, Krasko A, Schröder HC).
Die für die Silicase aus dem Meeresschwamm S. domuncula codierende cDNA SDSIA) sowie das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid (SIA_SUBDO) besitzen folgende Eigenschaften. Länge der cDNA: 1395 Nucleotide (nt); offenes Leseraster: von nt₁₂₂–nt₁₂₄ bis nt₁₂₅₉–nt₁₂₆₁ (Stoppcodon); Länge des Polypeptids: 379 Aminosäuren; relative Molekülmasse (M_r) des Polypeptids: 43131; isoelektrischer Punkt (pl): 6,5.
Für die hier beschriebenen Experimente wurde die rekombinante S. domuncula Silicase als Glutathion S-Transferase (GST)-Fusionsprotein hergestellt. Sowohl ein langes als auch ein verkürztes Fragment der für die S. domuncula Silicase codierende cDNA (genannt: SDSIA) wurden in ein pGEX-4T-2-Plasmid kloniert, welches das GST-Gen enthielt (2). Gezeigt sind im Folgenden die Ergebnisse für die gereinigte kurze Form der Silicase mit einer Größe von 32 kDa; analoge Ergebnisse wer- Ergebnisse werden für die lange Form (M_r 43 kDa), die jedoch weniger effizient ist, erhalten.
Eine weitere Alternative ist die Herstellung der rekombinanten Silicase in E. coli unter Benutzung des Oligo-Histidin-Expressionsvektors pBAD/gIIIA (Invitrogen), bei dem auf Grund der Gen III-Signalsequenz das rekombinante Protein in den periplasmatischen Raum sezerniert wird (3). Die für die Silicase kodierende cDNA-Sequenz (kurze Form) wird mittels PCR unter Verwendung folgender Primer amplifiziert: Forward primer: ATACTC GAG TCG AAA TGC CAC CGT CAC TTC TCC ACA TCA und Reverse primer: ATATCT AGA AA CCA ATA TAT CTT CCT GAC CAG CTC TCT; und in pBAD/gIIIA einkloniert (Restriktionsnucleasen zur Insertion in den Expressionsvektor: Xhol und Xbal). Nach Transformation von E. coli XL1-Blue wird die Expression des Fusionsproteins mit L-Arabinose induziert.
Ebenso kann auch ein Insert benutzt werden, welches das gesamte abgeleitete Silicase-Protein (lange Form) umfasst.
Herstellung von Silicatein
Die Reinigung des Silicatein-α und des Silicatein-β aus natürlichen Quellen wie Geweben oder Zellen sowie die rekombinante Herstellung der Enzyme wurden beschrieben und sind Stand der Technik ( DE 10037270 A1 . Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches Patentamt 2000. Anmelden und Erfinder: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC; DE 103 52 433.9 . Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. Deutsches Patentamt 2003. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Schwertner H, Schröder HC).
Für die hier beschriebenen Experimente erfolgte die Herstellung des rekombinanten Silicatein-α in E. coli unter Benutzung des Oligo-Histidin-Expressionsvektors pBAD/gIIIA (Invitrogen), bei dem auf Grund der Gen III-Signalsequenz das rekombi rekombinante Protein in den periplasmatischen Raum sezerniert wird. Die für das Silicatein-α kodierende cDNA-Sequenz (kurze Form) wurde mittels PCR unter Verwendung folgender Primer amplifiziert: Forward primer: TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC und Reverse primer: TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC; und in pBAD/gIIIA einkloniert (Restriktionsnucleasen zur Insertion in den Expressionsvektor: Ncol und Xbal). Nach Transformation von E. coli XL1-Blue wurde die Expression des Fusionsproteins mit L-Arabinose induziert.
Das rekombinante Schwamm-Silicatein-Polypeptid (kurze Form) besitzt ein Molekulargewicht von ~28,5 kDa (~26 kDa Silicatein plus 2 kDa Vektor) und einen isolelektrischen Punkt von pl 6,16.
Ebenso kann auch ein Insert benutzt werden, welches das gesamte abgeleitete Silicatein-α-Protein (lange Form) umfasst.
Herstellung von Schwammkollagen
Sowohl natives Kollagen (aus Vertebraten wie beispielsweise Rinderkollagen sowie aus Invertebraten (wie beispielsweise aus marinen Demospongien) als auch rekombinantes Kollagen (insbesondere aus dem marinen Schwamm S. domuncula) kann als Template benutzt werden. Im folgenden werden einige Verfahren zu ihrer Darstellung beschrieben.
Isolierung von nativem Schwamm-Kollagen
Ein einfaches Verfahren zur Isolierung von Kollagen aus verschiedenen marinen Schwämmen wurde beschrieben ( DE 100 10 113 A1 . Verfahren zur Isolierung von Schwammkollagen sowie Herstellung von nanopartikulärem Kollagen. Anmelden: W. Schatton. Erfinder: Kreuter J, Müller WEG, Schatton W, Swatschek D, Schatton M; Swatschek et al. (2002) Eur J Pharm Biopharm 53:107–113). Das Schwammkollagen wird dabei mit hoher Ausbeute (> 30%) erhalten.
Herstellung von rekombinantem Schwamm-Kollagen
Der zur Herstellung des rekombinanten Kollagens verwendete Klon codiert für ein nichtfibrilläres Kollagen (Kollagen 3) aus dem Meeresschwamm Suberites domuncula; dieses Kollagen besitzt den Vorteil, dass es (1) ein relativ niedriges Molekulargewicht hat und (2) posttranslational nicht weiter modifiziert wird.
Die für das Schwamm-Kollagen 3 kodierende cDNA-Sequenz kann mittels PCR unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert und in einen geeigneten Expressionsvektor subkloniert werden. Mit Erfolg wurde die Expression unter anderem mit den bakteriellen Oligo-Histidin-Expressionsvektoren pBAD/gIIIA (Invitrogen) und pQTK_1 (Qiagen) durchgeführt. Als Primer für die PCR (bei anschließender Verwendung von pBAD/gIIIA) können dienen; Forward primer: TAT cc atg gTG GCA ATA TCA GGT CAG GCT ATA GGA CCT C und Reverse primer: TAT AA GC TT CGC TTT GTG CAG ACA ACA CAG TTC AGT TC; Restriktionsnucleasen zur Insertion in den Expressionsvektor: Ncol und HindIII. Nach Transformation von Escherichia coli-Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid (Expressionsvektor) wird die Expression des Fusionsproteins mit L-Arabinose (bei pBAD/gIIIA) bzw. mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG; bei pQTK_1) induziert. Der Expressionsvektor pBAD/gIIIA besitzt den Vorteil, dass auf Grund der Gen III-Signalsequenz das rekombinante Protein in den periplasmatischen Raum sezerniert wird. Die Signalsequenz wird nach der Membran-Passage entfernt. Bei Verwendung von pQTK_1 werden die Bakterien mit PBS/8 M Harnstoff extrahiert. Nach Ultrabeschallung wird die Suspension zentrifugiert. Die Reinigung des Fusionsproteins aus dem Überstand erfolgt durch Metall-Chelat-Affinitätschromatographie unter Benutzung einer Ni-NTA-Agarose-Matrix (Qiagen), wie von Hochuli et al. (J Chromatogr 411:177–184; 1987) beschrieben. Der Extrakt wird auf die Säule gegeben; anschließend wird mit PBS/Harnstoff gewaschen und das Fusionsprotein von der Säule mit 150 mM Imidazol in PBS/Harnstoff eluiert.
Die Charakterisierung der Kollagen-Präparationen erfolgt über SDS-PAGE, Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung, des isoelektrischen Punkts sowie durch Elektronenmikroskopie.
Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt: Die Bestimmung der Molekulargewichte kann durch SDS-PAGE erfolgen. Das Molekulargewicht des Proteins, das nach Expression der unter Benutzung der oben genannten Primer amplifizierten cDNA erhalten wird, beträgt ~28,5 kDa.
Der isoelektrische Punkt (IEP) kann durch Titration in wässriger Lösung bestimmt werden. Der IEP von Schwammkollagen liegt meist bei pH 6,5 – 8,5 (zum Vergleich, IEP von Rinderkollagen: pH 7,0 ± 0,09). Das aus der SEQ ID No. 8 gezeigten cDNA abgeleitete Peptid (siehe SEQ ID No. 7) besitzt einen vorhergesagten isoelektrischen Punkt von 8,185. Die Ladung bei pH 7,0 ist 4,946.
Aminosäurezusammensetzung: Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung kann mit Hilfe eines automatischen Aminosäureanalysators durchgeführt werden.
Elektronenmikroskopie. Die elektronenmikroskopische Charakterisierung des isolierten Schwammkollagens kann durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erfolgen. Dazu wird die gefriergetrocknete Kollagenprobe mit einer 2%igen Phosphorwolframsäure negativ kontrastiert (Harris, Negative staining and cryoelectron microscopy. Royal Microscopical Society Microscopy Handbook No 35. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, UK).
Nachweis der Silicase-Aktivität
Die Methode zum Nachweis der Silicase-Aktivität von (kommerziellen) Carboanhydrasen-Präparationen (z. B. aus Rinder-Erythrozyten; Firma Calbiochem) bzw. der rekombinanten Schwamm-Silicase wurde beschrieben ( DE 102 46 186 .4; PCT/EP03/10983).
Nachweis der Silicatein-Aktivität
Die Methode zum Nachweis der Silicatein-Aktivität (Silicatein-α und Silicatein-β) wurde beschrieben (PCT/US99/30601; DE 10037270 A1 ; PCT/EP01/08423; DE 103 52 433.9 ).
Die Kieselsäure kann z. B. mit Hilfe eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem kolorimetrischen "Silicon Test" (Merck; 1.14794), quantitativ bestimmt werden. Die Menge an Kieselsäure kann anhand einer Kalibrierungskurve mit einem Siliciumstandard (Merck 1.09947) aus den Extinktionswerten bei 810 nm berechnet werden.
Beschreibung des Verfahrens der Silica-Synthese
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Kieselsäure in Form eines Metasilicats (Natriumsalz oder Salz eines anderen Alkali-, Erdalkali- oder Metallions), Silicium-Komplexes (der mit freier Orthokieselsäure bzw. Orthosilicat im Gleichgewicht steht; beispielsweise Silicium-Catecholat [Dikaliumtricatecholatosilicium] oder in Form von Orthokieselsäure bzw. eines Orthosilicats in einem geeigneten Puffer (beispielsweise 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol oder anderer Puffer; die Gegenwart von Zn ist vorteilhaft bei der Inkubation mit Silicase oder Carboanhydrasen, die Zn-Enzyme darstellen) über einen für die gewünschte Menge des gebildeten Silica-Produktes (amorphes Siliciumdioxid) angepassten Zeitraum mit einem Template und einem Enzym inkubiert. Die Inkubation kann bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden. Als vorteilhaft hat sich Raumtemperatur (22°C) erwiesen, aber auch höhere (z. B. 37°C) oder niedrigere Temperaturen (z. B. 15°C) wurden mit Erfolg angewandt.
Das Metasilicat kann hierzu entweder in dem benutzten Puffer gelöst werden oder zuvor (eventuell als höher konzentrierte Stock-Lösung) in einer alkalischen Lösung (wie 0,01 N NaOH). Im letzteren Fall muss die erhaltene Metasilicat-Lösung neutralisiert werden (vorteilhafter pH: 7,2).
Bei dem Template handelt es sich um ein oder mehrere unterschiedliche Moleküle, Molekülaggregate oder Oberflächen, die funktionelle Gruppen besitzen, die mit Orthokieselsäure, oligomeren oder polymeren Kieselsäuren sowie deren Salzen (Orthosilicate, Metasilicate) in Wechselwirkung treten.
Als vorteilhaft hat sich herausgestellt, wenn es sich bei den Hydroxylgruppenenthaltenden Molekülen um Kollagen oder um ein Silicatein handelt (siehe 7–10).
Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, wenn es sich bei dem Kollagen um ein Kollagen aus einem Schwamm handelt, insbesondere um ein Kollagen gemäß SEQ ID Nr. 7 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Sequenz besitzt, oder Teile davon. Bei dem in SEQ ID Nr. 7 angegebenen Kollagen handelt es sich um ein nicht-fibrilläres Kollagen (Kollagen 3) aus dem Meeresschwamm S. domuncula. Dieses Kollagen erwies sich effizienter als fibrilläres Rinder-Kollagen (siehe 10).
Als besonders vorteilhaft hat sich weiterhin herausgestellt, wenn es sich bei dem Silicatein um ein Silicatein aus einem Schwamm gemäß SEQ ID Nr. 3 oder ein dazu homologes Polypeptid handelt, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz besitzt, oder Teile davon (siehe 7–10).
Neben Silicatein-α (SEQ ID Nr. 3) kann auch Silicatein-β (SEQ ID Nr. 5) oder ein dazu homologes Polypeptid handelt, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Sequenz besitzt, oder Teile davon verwendet werden.
Auch eine Mischung von einem oder mehreren Templaten (beispielsweise Kollagen und Silicatein) kann verwendet werden (siehe 7–10).
Das Kollagen aus einem Schwamm gemäß SEQ ID Nr. 7 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Sequenz besitzt, oder Teile oder Teile davon, kann sowohl in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt werden.
Bei dem Enzym handelt es sich um ein Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Metallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon (siehe 7–10).
Das Polypeptid einer Silicase aus S. domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, kann sowohl in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt werden.
Vorteilhaft ist auch die Verwendung kommerzieller Carboanhydrasen, wie der Carboanhydrase von Rinder-Erythrozyten (siehe 7–10).
Der Zusatz von Catechol, das freie Kieselsäure komplexiert, führt zu einer Erniedrigung der Menge an unlöslichem SiO₂ (siehe 7 und 10).
Maximale Mengen an amorphem Silica werden in Gegenwart von Kollagen, Silicatein und Carboanhydrase sowie in Gegenwart von Kollagen und Silicatein synthetisiert (siehe 7). Geringere Mengen an unlöslichem SiO₂ werden in Gegenwart von Kollagen und Carboanhydrase erhalten (siehe 7). Eine Präinkubation mit Silicatein kann in Abhängigkeit von den angewandten Bedingungen (Inkubationszeit) auch zu einer Abnahme der SiO₂-Bildung führen (siehe 8). In Abwesenheit von Kollagen werden mit Silicatein oder Carboanhydrase oder beiden Enzymen nur sehr geringe Mengen an unlöslichem SiO₂ gebildet (siehe 7). Ebenfalls wird in Gegenwart von Kollagen alleine nur wenig unlösliches SiO₂ gebildet (siehe 7). Kontrollexperimente mit BSA anstelle von Silicatein und Kollagen als Template zeigen nur eine sehr geringe Bildung von unlöslichem SiO₂ (siehe 7–9).
Die Menge an gebildetem unlöslichem SiO₂ steigt mit zunehmender Konzentration an Carboanhydrase an (siehe 8 und 9).
Weiterhin hängt die Menge an gebildetem SiO₂ von der Konzentration des verwendeten Templates ab; eine Zunahme wird mit steigender Konzentration beispielsweise von Silicatein-α (siehe 8) oder von Kollagen gefunden (siehe 9).
Eine Erhöhung der Na-Metasilicat-Konzentration führte zu keiner weiteren Steigerung, sondern zu einer Abnahme der SiO₂-Bildung (siehe 9).
Neben Metasilicaten können auch Silicium-Komplexe (beispielsweise der Silicium-Catechol-Komplex) verwendet werden; auch hier steigt die Menge an gebildetem SiO₂ mit zunehmender Menge an Kollagen an (siehe 10). Bei der Verwendung des Silicium-Catechol-Komplexes anstelle von Metasilicat sind die Ausbeuten an gebildetem unlöslichen SiO₂ jedoch geringer (vgl. 7–9 und 10).
Auch die Verwendung anderer Silicium-Komplexe wie der Silicium-Komplexe mit Gallussäure oder Tropolon (Tristropolonatosiliciumchlorid) ist möglich.
Die Inkubation mit Silicatein und Carboanhydrase kann gleichzeitig (siehe 9) oder aufeinanderfolgend (siehe 7, 8 und 10) durchgeführt werden.
Neben Kollagen können eine Reihe weiterer Biomaterialien und Komposit-Materialien als Template für die Silica-Bildung dienen, wie fibrilläres Chitin, das nach einem beschriebenen Verfahren gewonnen wird ( DE 102 10 571.5. Zusammensetzung und Verfahren zur Herstellung von modifiziertes fibrilläres Chitin und potenzierende Zusatzstoffe enthaltenden, biologisch hochaktiven Präparaten und ihre Anwendung als Protektions- und Nahrungsergänzungsmittel während der prä- und postnatalen Entwicklung und adulter Lebensphasen bei Mensch und Tier. Anmelder und Erfinder: Müller WEG, Schröder HC, Lorenz B, Senyuk OF, Gorowoj LF).
Das Verfahren eignet sich auch zur Synthese anderer polymerer Metall(IV)-Verbindungen aus rein anorganischen Metall(IV)-Verbindungen, wobei ebenfalls (1) ein Template (Molekül, Molekülaggregat oder Oberfläche) und (2) ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese eingesetzt wird, das entweder dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid eine tierische, pflanzliche, bakterielle oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, oder dadurch, dass das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α-Domäne oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 3 bzw. in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Sequenz aufweist.
Nachweis des gebildeten Siliciumdioxids
Zum Nachweis der Produkte (gebildetes amorphes Siliciumdioxid) kann das Material (bzw. der Reaktionsansatz) in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert (12 000 × g; 15 min; 4°C), mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet werden. Anschließend kann das Sediment mit 1 M NaOH hydrolysiert. In der entstandenen Lösung wird das freigesetzte Silicat unter Anwendung eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem kolorimetrischen "Silicon Test" der Firma Merck, quantitativ gemessen werden.
Der Nachweis des gebildeten Silica-Produktes (Element-Analyse) kann auch mit Hilfe eines „High Performance Field Emission Electron Probe Microanalyzer (EPMA)" erfolgen. Benutzt wurde für das in 11 gezeigte Experiment ein JXA-8900RL Electron Probe Microanalyzer (JEOL, Inc., Peabody, MA, USA). Dieses Gerät kombiniert hochauflösende Rasterlektronenmikroskopie (REM) mit Hochqualitäts-Röntgenstrahlenanalyse.
Die Ansätze für die Analyse mittels des „High Performance Field Emission Electron Probe Microanalyzer" enthielten 1 mM Na-Metasilicat in 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM ZnSO₄ und 0,1 mM β-Mercaptoethanol. Die Inkubation wurde in Abwesenheit (= Kontrollen) oder in Gegenwart von 50 μg/ml Carboanhydrase (aus Rinder-Erythrozyten; Firma Calbiochem) und 30 μg/ml Kollagen für 4 h bei Raumtemperatur durchgeführt.
Auf die Träger wurden jeweils 100 μl der Proben (Ansätze nach Inkubation) aufgebracht. Die Träger mit den Präparaten wurde einer Kohlenstoffbedampfung (Emitech K959) unter Vakuum (10^-4 mbar) unterworfen. Neben Si wurden Ca, Na und Cl bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, dass eine deutliche Bildung von Siliciumaggregaten in den Ansätzen mit Carboanhydrase und Kollagen nachweisbar war, nicht dagegen in den Kontrollen (Abwesenheit von Carboanhydrase und Kollagen) (siehe 11).
Es ergaben sich keine Übereinstimmungen in den Lokalisierungen der Signale für Si, Ca, Na und Cl.
Verwendungen des Verfahrens
Für das beschriebene Verfahren zur enzymatischen Synthese von amorphem Silica aus anorganischen (nicht-organischen) Siliciumverbindungen ergeben sich eine Reihe unterschiedlicher industriell-technischer Verwendungen, und zwar:

1.) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Biomaterialien, die entweder aus den genannten Template-Materialien (Hydroxylgruppen-enthaltende Moleküle) selbst bestehen oder mit ihnen beschichtet sind. Dies können auch Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Materialien sein. Eine Literatur-Übersicht über Oberflächen-modifizierte Biomaterialien findet sich in: Ratner BD et al (Hrsg) Biomaterials Science – An Introduction to Materials in Medicine. Academic Press, San Diego, 1996. Die bei herkömmlichen physikalisch/chemischen Methoden zur Herstellung dieser Modifikationen angewandten Bedingungen haben oft einen schädlichen (destruierenden) Effekt auf die Biomaterialien. Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt im Vergleich zu den herkömmliche Verfahren "milde" Bedingungen, welche die Biomaterialien schonen, da es allein auf biochemisch/enzymatischen Reaktionen beruht. Insbesondere ergibt sich eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bei der Herstellung von Oberflä von Oberflächen-Modifikationen (Coating) von Kollagen, das als Gewebe-, Knochen- oder Zahnersatzmaterial dient, und von Kollagen-Vliesen ("Tissue Engineering"). Die Oberflächen-Modifikationen dient hierbei der Erhöhung der Stabilität und der Porosität sowie die Verbesserung der Resorbierbarkeit.

Die Vorteile von Schwammkollagen als Biomaterial sind, wie bei anderen Kollagenen, Bioabbaubarkeit sowie eine niedrige Toxizität und Immunogenizität. Das Schwammkollagen besitzt jedoch nicht die Nachteile des bisher vornehmlich aus Tierhäuten und Knochen von Schweinen, Kälbern und Rindern gewonnenen Kollagens, bei dem die Möglichkeit einer Infektion durch pathogene Keime nicht ausgeschlossen werden kann.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt darin, dass zur Lösung der verwendeten Ausgangssubstrate (Kieselsäuren und Metasilicate sowie deren Salze) keine organischen Lösungsmittel verwendet werden müssen, wie es bei organischen Siliciumverbindungen (z. B. TEOS) der Fall ist. Somit wird eine Schädigung der zu modifizierenden Biopolymeren wie von Kollagen vermieden.

2.) Verwendung zur Modifikation oder zur Synthese von Nano-Strukturen aus Silica (amorphem Siliciumdioxid). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, definierte zwei- und dreidimensionale Strukturen aus Silica (oder anderen polymeren Metall(IV)-Verbindungen) im Nano-Maßstab aus rein anorganischen Ausgangssubstraten (Kieselsäure, Metakieselsäure und deren Salze) zu synthetisieren. Die gebildeten Strukturen können in der Nanotechnologie angewandt werden.
3.) Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung dreidimensionaler, mit Silica beschichteter Matrizes aus Kollagenen mit definierten physikalischchemischen Eigenschaften zur Herstellung von Geweben/Organen des menschlichen Organismus mit körpereigenen Zellen, die als Ersatzgewebe zur Behandlung von onkologischer Defekten, posttraumatischer Organ- und Gewebeschäden, Brandverletzungen, Gefäßverschlüssen sowie chirurgischen Wunden dienen können. Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass (1) durch die Silica-Beschichtung Unverträglichkeits- und Abstoßungsreaktionen durch den Empfängerorganismus vermieden werden und (2) keine Schädigung der Matrizes (Kolla keine Schädigung der Matrizes (Kollagen) durch organische Lösungsmittel eintreten kann (die Ausgangssubstrate sind wasserlöslich im Gegensatz zu den nach dem Stand der Technik zu verwendenden organischen Siliciumverbindungen wie TEOS).

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid und anderen polymeren Metall(IV)-Verbindungen, wobei (1) ein Templat mit (2) nicht-organischen Siliciumverbindungen oder Metall(IV)-Verbindungen und/oder Aminosilanen und Silazanen als Substrat und (3) einem Polypeptid oder einem Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese in Kontakt gebracht werden, wobei das Polypeptid eine tierische, pflanzliche, bakterielle oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, oder das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α-Domäne oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 3 bzw. in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Sequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Synthese ein Templat verwendet wird, das funktionelle Gruppen besitzt, die mit Orthokieselsäure, oligomeren oder polymeren Kieselsäuren sowie deren Salzen oder anderen rein nicht-organischen Metall(IV)-Verbindungen oder Aminosilanen oder Silazanen in Wechselwirkung treten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Synthese Verbindungen wie Orthokieselsäure, oligomere oder polymere Kieselsäuren sowie deren Salzen oder andere Metall(IV)-Verbindungen als Substrat eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Synthese ein oder mehrere Si-N-Bindungen enthaltende Aminosilane oder Silazane als Substrat eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den Templaten um Hydroxylgruppen-enthaltende Moleküle, Molekülaggregate oder Oberflächen handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei den Hydroxylgruppen-enthaltenden Molekülen um Kollagen und/oder Silicatein handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Kollagen um ein Kollagen aus einem Schwamm handelt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Kollagen um ein Kollagen aus einem Schwamm gemäß SEQ ID Nr. 7 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Sequenz besitzt oder Teile davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Silicatein um ein Silicatein aus einem Schwamm gemäß SEQ ID Nr. 3 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 3 oder in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Sequenz besitzt oder Teile davon handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Mischung von einem oder mehreren Templaten verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei ein Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Metallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Kollagen aus einem Schwamm gemäß SEQ ID Nr. 7 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz mindestens 25% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Sequenz besitzt oder Teile davon in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei als Oberflächen Glas, Metalle, Metalloxide, Kunststoffe, Biopolymere oder andere Materialien modifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei definierte zwei- und dreidimensialer Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid oder andere polymeren Metall(IV)-Verbindungen synthetisiert werden.