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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, die
auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert,
die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse
ein Polypeptid eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das
Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α-
oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens
25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ
ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist. Dieses Verfahren ist bevorzugt
dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der enzymkatalytischen
Reaktion Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole,
Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder
Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt werden.
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Biomoleküle,
die an der Kontrolle von natürlichen Prozessen der Biomineralisation
im nanoskaligen Bereich beteiligt sind, haben in den letzten Jahren
zunehmendes Interesse in der Nano(bio)technologie gefunden.
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Beispiele
für „Nanotechnologie in der Natur” sind
die aus Calciumcarbonat-Kristallen (Aragonit) bestehenden Perlen
oder die aus Calcit-Kristallen aufgebauten Schalen der Abalone-Muscheln,
die durch den Einbau spezifischer Proteine neue, vorteilhafte Materialeigenschaften
erlangen, oder das optische Mikrolinsensystem des Seesterns Ophiocoma
wendtii. Insbesondere besitzen einige marine oder aquatische Organismen wie
die Diatomeen und die Kieselschwämme die Fähigkeit,
Skelettstrukturen aus biogenem Silica aufzubauen.
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Siliciumdioxid
(SiO2) kommt in kristalliner und in amorpher
Form vor. Amorphes SiO2 („Biosilica”)
ist das Material, aus dem die durch Biomineralisation gebildeten
Skelettstrukturen vieler ein- und vielzelliger Organismen bestehen,
wie die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen) und die Nadeln (Spicula)
von Kieselschwämmen.
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Kieselschwämme
besitzen die einzigartige Fähigkeit, Silica (”Biosilica”)
unter milden Bedingungen – bei Raumtemperatur – über
einen enzymatischen Mechanismus zu bilden (Shimizu et al.
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6234–6238).
Chemische Methoden zur Herstellung von Silica erfordern dagegen
die Anwendung hoher Temperaturen, Drucke und aggressiver Chemikalien.
Das von den Schwämmen produzierte Biosilica dient zum Aufbau
ihrer nadelförmigen Skelettelemente („Spicula”)
(Müller et al. (2005) FERS J. 272, 3838–3852; Müller
et al. (2006) Micron 37, 107–120).
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Die
beteiligten Enzyme (Silicateine; siehe
1A)
wurden aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula und einer
Reihe weiterer Schwämme kloniert (
Krasko et al.
(2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887) und ihre
technische Verwendung beschrieben; bei dem zuerst beschriebenen
Enzym handelt es sich um Silicatein-α (auch lediglich Silicatein
genannt) (
PCT/US99/30601 .
Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins
and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct
the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and
their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes,
and mixed poly(silicon/metallo)oxane materials under environmentally
benign conditions. Inventors/Applicants: Morse DE, Stucky GD, Deming,
TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y;
DE 10037270 A1 . Silicatein-vermittelte Synthese
von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches
Patentamt 2000. Anmelder und Erfinder: Müller WEG, Lorenz
B, Krasko A, Schröder HC;
PCT/EP01/08423 sowie
Europäisches Patent Nr.
EP
1320624 und
US-Patent
US 7,169,589 B2 . Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates
and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants: Müller
WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC).
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Mit
Hilfe dieser Enzyme ist es möglich, Glas-ähnliche
Materialien im Nano-Maßstab bei Raumtemperatur herzustellen
(Schröder et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 12001–12009; Schröder
et al. (2007) Naturwissenschaften 94, 339–359).
Die Silicateine können in Escherichia coli exprimiert werden.
Die erhaltenen rekombinanten Proteine sind in der Lage, aus Siliziumalkoxiden
oder Kieselsäure/Orthosilicat Polysilicate bei Raumtemperatur,
neutralem pH und in wässrigen Puffersystemen zu bilden.
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In
Demospongien (marine Schwämme und Süßwasserschwämme)
konnten verschiedene Isoformen von Silicatein identifiziert werden
(
Müller et al. (2007) Gene 395, 62–71).
In Meeresschwämmen wie S. domuncula kommen zwei Silicatein-Isoformen
vor: Silicatein-α und Silicatein-β (
Krasko
et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 4878–4887;
Schröder
et al. (2004) Cell Tissue Res. 316, 271–280;
Müller
et al. (2007) Gene 395, 62–71; Patentanmeldung
Silicatein-β:
DE 103
52 433.9 . Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau
von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. Deutsches
Patentamt 2003. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität
Mainz; Erfinder: Müller WEG, Schwertner H, Schröder
HC), in Süßwasserschwämmen wie Lubomirskia
baicalensis sogar vier Silicatein-Isoformen (
Wiens et al.
(2006) Dev. Genes Evol. 216, 229–242; Patentanmeldung:
DE102006001759.5 ).
Diese konnten kloniert und rekombinant dargestellt werden.
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Die
Silicateine gehören zur Cathepsin-Familie der Proteasen;
die größte Ähnlichkeit besteht mit Cathepsin
L. Die Silicateine unterscheiden sich jedoch von diesen Enzymen
durch den Ersatz des Cysteinrestes im aktiven Zentrum durch einen
Serinrest (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887),
der wahrscheinlich essentiell für den katalytischen Mechanismus
des Enzyms ist (2). Weiterhin besitzen sie ein Cluster
aus Hydroxyaminosäuren (Serin-Cluster), das an der Oberfläche
des Moleküls lokalisiert ist und als Templat bei der Präzipitation
von Biosilica dient.
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Ebenfalls
gelang es, aus S. domuncula ein Enzym („Silicase”)
zu klonieren, das in der Lage ist, amorphes Siliciumdioxid aufzulösen
(
Schröder HC, Krasko A, Le Pennec G, Adell T, Wiens
M, Hassanein H, Müller IM, Müller WEG (2003) Silicase,
an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution
to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites
domuncula. Progr Molec Subcell Biol 33: 250–268;
Deutsches Patent
DE10246186 .
Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und
Verwendung des reversiblen Enzyms. Deutsches Patentamt 2002. Anmelder:
Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller
WEG, Krasko A, Schröder HC) (
1B). Das Silica-anabole
Enzym Silicatein sowie das Silica-katabole Enzym Silicase (
1B)
sind von außerordentlichem Interesse für eine
Vielzahl von Anwendungen in der Nanobiotechnologie.
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Das
rekombinante Silicatein (His-tagged Silicatein) behält
seine katalytische Aktivität auch nach Immobilisierung
an Oberflächen (Tahir et al. (2004) Chem. Commun.
2848–2849). Silicatein kann an die Oberfläche
von Gold nach Funktionalisierung mit Nitrilotriessigsäure(NTA)-Alkanthiol
immobilisiert werden. Das rekombinante Protein bindet dabei über
sein Histidin-Tag an den Chelatbildner NTA-Alkanthiol durch Bildung
eines Ni2 +-Komplexes,
an dem beide Moleküle beteiligt sind. Die Bildung von Biosilica
durch das immobilisierte Protein konnte mit Hilfe verschiedener
Techniken wie Raster-Kraft-Mikroskopie („Scanning Force
Microscopy”; SFM) und Rasterelektronenmikroskopie („Scanning
Electron Microscopy”; SEM) nachgewiesen werden (Tahir et
al. (2004) Chem. Commun. 2848–2849).
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Silicatein
ist auch zur Katalyse der Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid
(TiO
2) und Zirkoniumdioxid (ZrO
2)
aus wasserstabilen Präkursoren in der Lage (
Tahir
et al. (2005) Chem. Commun. 28: 5533–5535). Es
wurde auch ein Verfahren zur Immobilisierung von His-Tag-Silicatein
an TiO
2-Nanodrähte beschrieben
(
Angew. Chem. Int. Ed. 45, 4803–4809, 2006;
Patentanmeldung:
DE102006001759.5 ).
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Silica
ist ein wichtiger Bestandteil von Materialien („bioaktive
Gläser”), die als Gerüst beim Tissue
Engineering benutzt werden. Es wurde beschrieben, dass die Mineralisierung
(Bildung von Calciumphosphat) von humanen Osteobiastenzelllinien
(SaOS-2-Zellen) stark ansteigt, wenn sie auf Kulturplatten wachsen,
die mit enzymatisch, über Silicatein gebildetem Biosilica
beschichtet worden waren (
Schröder et al. (2005)
J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 75B: 387–392;
DE102004021229.5 ).
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Ein
Vorteil der enzymatisch (Silicatein) vermittelten Beschichtung liegt
in den Eigenschaften von Silicatein selbst. Das Enzym besitzt sowohl
anabole (Silica-Polymerase) als auch katabole Aktivität
(Silica-Esterase). Deshalb ermöglicht es die Herstellung
einer flexiblen Silica-Hülle, die – über
die Esterase-Aktivität von exprimierten Silicateins – umgebaut
oder perforiert werden kann.
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Der
wahrscheinliche der Silica-Esterase-Aktivität von Silicatein
zugrunde liegende Mechanismus ist in 2A gezeigt.
Angenommen wird, dass die Hydrolyse von Oligo/Polysilicat-Substraten
auf einem nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe des Serinrestes
im aktiven Zentrum des Silicateins an einem der Siliziumatome des
polymeren Substrats basiert. Dabei wird die Sauerstoffbindung in
dem polymeren Silicat gespalten. Diese Reaktion wird durch die Ausbildung
einer Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Imidazol-Stickstoff
des Histidins und der Hydroxylgruppe des Serins im aktiven Zentrum
erleichtert, was zu einem Anstieg der Nukleophilie des Serin-Sauerstoffs
führt. Die transiente kovalente Bindung zwischen Enzym
und Substrat wird dann durch Wasser unter Freisetzung von Kieselsäure
hydrolysiert. 2B zeigt den wahrscheinlichen
Mechanismus der Silica-Polymerase-Aktivität von Silicatein.
Der Histidinrest im aktiven Zentrum des Enzyms fungiert als Säure-Base-Katalysator.
Die Übertragung eines Protons von der Orthokieselsäure
zu dem Imidazol-Stickstoff führt zur Bildung einer reaktiven
Silicat-Spezies, die in der Lage ist, ein zweites Orthosilicat-Molekül
anzugreifen. Das gebildete negative geladene, pentavalente Intermediat
wird dann in Dikieselsäure (oder höhere Oligomere) überführt
unter Freisetzung von Wasser, das durch Übertragung eines
Protons vom protonierten Imidazolring des Histidinrestes gebildet
wird.
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Beschrieben
wurde auch ein „osteoinduktives” biomimetisches
Nanokomposit-Füllmaterial, das auf enzymatisch (über
Silicatein) synthetisiertem Biosilica basiert. Dieses Biosilica-Silicatein-Füllmaterial
fördert die Rekrutierung von Osteoblasten und den natürlichen
Biomineralisationsprozess (Apatit-Bildung). Als organische Komponente
enthält es entweder Silicatein alleine oder in Kombination
mit Schmelzprotein („Amelogenin”) oder Seidenfibroin
(adhäsives Protein) (USPTO-Patentantrag
US 60/839,601 : Biosilica-adhesive
protein nanocomposite materials: synthesis and application in dentistry,
Erfinder: W. K. Geurtsen, W. E. G. Müller und H. C. Schröder;
sowie
PCT/EP2007/007363 :
Biosilica-adhesive protein nanocomposite materials: synthesis and
application in dentistry. Erfinder: W. K. Geurtsen, W. E. G. Müller
and H. C. Schröder).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung
einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta,
die auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert,
die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse
ein Polypeptid eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das
Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α- oder
Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25%
Sequenzähnlichkeit, insbesondere 25% Sequenzidentität,
weiter bevorzugt 50%, 75%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität
zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der
enzymkatalytischen Reaktion Verbindungen wie Kieselsäuren,
Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder
Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure
eingesetzt werden.
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Der
besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, dass es gelingt, eine dichte und fest haftende Versiegelung
der Zahnoberfläche mit einer Biosilica-Nanoschicht zu erzielen.
Hierbei kommt es auch zum Verschluss feinster Fissuren, dadurch
bedingt, dass sich die enzymatisch gebildeten Biosilica-Nanopartikel
auf Grund ihres geringen Durchmessers diesen Fissuren flexible anpassen
können.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird allgemein ein Verfahren
zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden
Zahnpasta beschrieben, das auf einer enzymkatalysierten Bildung
von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica)
bestehen, wobei das Polypeptid an die Oberfläche von Polylactid-Nanosphären
gebunden wird. Polylactide (PLA) sind bioabbaubare Polymere.
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Zur
Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären kann
ein bifunktioneller Linker verwendet werden, wobei der bifunktionelle
Linker aus einem Polymer besteht, das Nitrilotriessigsäure-Gruppen
enthält, wobei diese Gruppen an das mit einem Histidin-Tag
verknüpften Polypeptid, das eine tierische, bakterielle, pflanzliche
oder Pilz Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne
umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit, insbesondere
25% Sequenzidentität, weiter bevorzugt 50%, 75%, 80%, 90%
oder 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ
ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist, über Nickel-Komplexierung
gebunden werden.
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Alternativ
kann die Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären über
physikalisch-chemische Wechselwirkung erfolgen.
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Bisher
war nicht bekannt und nicht aus dem Stand der Technik zu erkennen,
dass es möglich ist, durch eine enzymkatalytische Reaktion
die Versiegung der Oberfläche von Zahnhartgewebe (Enamel)
erreichen.
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Bei
dem enzymgemäßen Verfahren werden die zur Versiegelung
benötigten Komponenten als Bestandteil einer Zahnpasta
hinzugefügt.
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Es
wird weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden
Zahnpasta eingesetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid,
das zur enzymkatalysierten Bildung von aus amorphem Siliciumdioxid
(Silica) bestehenden Nanopartikeln (Nanosphären) benötigt,
in Polylactid-Nanosphären eingeschlossen wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Polylactid-Nanosphären
mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen
enzymatisch-aktiven Polypeptids vor Anwendung der Zahnpasta silizifiziert,
entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche
der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns,
wobei als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion Kieselsäure, Monoalkoxysilantriole,
Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder
Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Silizifizierung
der Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche
gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids
bei Anwendung der Zahnpasta, entweder durch Bildung einer Silica-Schale
auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch
Bildung eines Silica-Kerns, auch dadurch erfolgen, dass das Substrat
der enzymkatalytischen Reaktion bei der Anwendung als zweite Komponente
einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta bereitgestellt wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zur Silizifizierung
der Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche
gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids,
entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche
der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns,
bei Anwendung der Zahnpasta auch dadurch erfolgen, dass als Substrat
der enzymkatalytischen Reaktion die im Speichel oder der Nahrung
natürlich vorhandenen Kieselsäure- und Silicat-Moleküle
dienen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden
Zahnpasta beschrieben, wobei das zur Enzymkatalyse verwendete Polypeptid
an die Oberfläche des Zahnhartgewebes (Enamels) gebunden
wird, dadurch dass das Polypeptid eine Oligo-Glutamat-Sequenz aufweist.
Bei dem eine Oligo-Glutamat-Sequenz aufweisenden Polypeptid kann
es sich um ein rekombinant hergestelltes Fusionsprotein handeln.
Als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion können Verbindungen
wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole,
Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der
Kieselsäure eingesetzt werden.
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Hierbei
kann die Silizifizierung bei Anwendung der Zahnpasta auch dadurch
erfolgen, dass das Substrat der enzymkatalytischen Reaktion bei
der Anwendung als zweite Komponente einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta
bereitgestellt wird.
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Ebenfalls
kann hierbei die Versiegelung des Zahnhartgewebe (Enamel) mit Hilfe
des an deren Oberfläche gebundenen enzymkatalytisch aktiven
Polypeptids auch dadurch erfolgen, dass als Substrat der enzymkatalytischen
Reaktion die im Speichel oder der Nahrung natürlich vorhandenen
Kieselsäure- und Silicat-Moleküle dienen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kieselsäure-enthaltende
Versiegelung von Zahnhartgewebe (Enamel), die nach einem Verfahren
der voranstehenden Ansprüche erhalten wurde.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid (Silicatein-α-
oder Silicatein-β aus Suberites domuncula gemäß SEQ
ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 oder ein dazu homologes Polypeptid, das
in der Aminosäuresequenz der Silicatein-α- oder
Silicatein-β-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit,
insbesondere 25% Sequenzidentität, weiter bevorzugt 50%,
75%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID
Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz besitzt) kann, neben der
natürlichen Form, ferner dadurch gekennzeichnet sein, dass
es synthetisch hergestellt worden ist oder dass das Polypeptid in
einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder -lysat
vorliegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex
vivo oder ex vitro gewonnen werden, zum Beispiel einer rekombinanten
bakteriellen Zelle oder einem Meeresschwamm.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid kann nach herkömmlichen
im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden und somit
im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorliegen.
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Die
Eigenschaften der für das Silicatein-α-Polypeptid
und das Silicatein-β-Polypeptid aus S. domuncula codierende
cDNAs sowie die aus der Nucleotidsequenz abgeleiteten Polypeptide
wurden beschrieben (
PCT/US99/30601 ;
DE 10037270 A1 ;
PCT/EP01/08423 ;
DE 103 52 433.9 ).
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Im
nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den beigefügten
Abbildungen und den Sequenzprotokollen aufgeführt. Es zeigen:
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SEQ
ID No. 1: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen
Silicatein-α-Polypeptids aus S. domuncula.
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SEQ
ID No. 2: Die Nukleinsäuresequenz der cDNA des erfindungsgemäßen
Silicatein-α- Polypeptids aus S. domuncula.
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SEQ
ID No. 3: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen
Silicateins-β aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
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SEQ
ID No. 4: Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen
Silicateins-β aus S. domuncula.
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In
den Figuren zeigt:
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1:
Computer-Modelle der Silica-metabolen Enzyme. (A) Silica-Synthese-Enzym:
Silicatein. Die drei Aminosäuren des aktiven Zentrums („catalytic
centre”; cc) sind rot markiert. Die Aminosäuren
des Serin-Clusters sind grün markiert. (B) Silica-Abbau-Enzym:
Silicase. Die drei Histidin-Reste (Bindung von Zn2+) im
aktiven Zentrum des Enzyms sind rot markiert.
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2:
Silica-Esterase-Aktivität (A) und Silica-Polymerase-Aktivität
(B) von Silicatein.
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3:
Ergebnisse für die Probe Nr. 2 (50 nm Silica-Nanosphären).
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4:
Amplifikation der für das Hydroxylapatit-bindende Silicatein-α-Protein
codierenden cDNA.
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5:
Ligation des Amplikons mit dem bakteriellen Expressionsvektor pTRC-His2
(Invitrogen) über T/A Klonierung.
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2.2. Herstellung der Silicatein-Polypeptide
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Die
Silicatein-Polypeptide können aus Geweben oder Zellen gereinigt
oder rekombinant hergestellt werden.
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2.2.1. Reinigung der Silicatein-Polypeptide
aus natürlichen Quellen
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Die
Reinigung des Silicatein-α und Silicatein-β kann
aus isolierten Spicula von Schwämmen durchgeführt
werden.
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2.2.2. Herstellung der rekombinanten Silicatein-Polypeptide
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Die
cDNAs für Silicatein-α und -β werden
von einer cDNA-Bibliothek des Schwammes Suberites domuncula, die
beispielsweise in einem pBK-CMV-Vektor (Stratagene) hergestellt
wird, isoliert. Die den reifen Proteinen entsprechenden offenen
Leseraster (ORF) werden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Benutzung
geeigneter Primer erhalten.
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Die
Herstellung der rekombinanten Proteine (Silicatein-α: SEQ
ID No. 1; Silicatein-β: SEQ ID No. 3) kann in E. coli erfolgen.
Auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich.
Hierzu wird die jeweilige cDNA in einen Expressionsvektor, z. B.
pQE-30, einkloniert. Nach Transformation von E. coli wird die Expression
der Proteine durch mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)
induziert (Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular
Biology. John Wiley and Sons, New York). Die Aufreinigung
der rekombinanten Proteine über das Histidin-Tag wird an
einer Ni-NTA-Matrix durchgeführt.
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Zwischen
Oligohistidin und Silicatein kann eine Sequenz, die der Enterokinase-Spaltstelle
entspricht, eingebracht werden. Das Fusionsprotein wird dann mit
Enterokinase gespalten.
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Alternativ
kann zur Expression der rekombinanten Proteine z. B. das „GST
(Glutathion-S-Transferase) Fusions”-Systems (Firma Amersham)
benutzt werden. Es können zwei Inserte benutzt werden,
um potentielle Effekte von Signalpeptiden während der Expression
zu eliminieren; ein Insert umfasst das gesamte abgeleitete Protein
(lange Form) und das andere Insert lediglich den aktiven Bereich
(kurze Form). Die entsprechenden Klone werden in das Plasmid pGEX-4T-2
eincloniert, welches das GST-Gen von Schistosoma japonicum enthält.
Nach Transformation von E. coli wird die Expression der Proteine
durch IPTG induziert. Die erhaltenen GST-Fusionsproteine werden
durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose
4B gereinigt. Zur Abtrennung der Glutathion-S-transferase werden
die Fusionsproteine mit Thrombin gespalten.
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Eine
weitere Alternative (benutzt für die hier beschriebenen
Experimente) ist die Herstellung des rekombinanten Silicatein-α in
E. coli unter Benutzung des Oligo-Histidin-Expressionsvektors pBAD/gIIIA
(Invitrogen), bei dem auf Grund der Gen III- Signalsequenz das rekombinante
Protein in den periplasmatischen Raum sezerniert wird. Die für
das Silicatein-α kodierende cDNA-Sequenz (SEQ ID No. 2)
wird mittels PCR unter Verwendung folgender Primer amplifiziert
(kurze Form des Silicatein-α): Forward Primer: TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT
GTA GAC TGG AGA ACC und Reverse Primer: TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC
ATC GGT AGC; und in pBAD/gIIIA einkloniert (Restriktionsnucleasen
zur Insertion in den Expressionsvektor: NcoI und XbaI). Nach Transformation
von E. coli XL1-Blue wird die Expression des Fusionsproteins mit
L-Arabinose induziert.
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Ebenso
kann auch ein Insert benutzt werden, welches das gesamte abgeleitete
Silicatein-α-Protein (lange Form) umfasst.
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Auf
analoge Weise kann eine kurze und eine lange Form des Silicatein-β (cDNA:
SEQ ID No. 4; davon abgeleitete Aminosäuresequenz: SEQ
ID No. 3) exprimiert werden.
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2.3. Mikroemulsions-Verfahren zur Herstellung
der Polylactid-Silica-Nanosphären (Synthese der Nanosphären mittels
Silicatein)
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Die
Silicatein-enthaltenden Nanosphären werden wie folgt hergestellt:
5 ml Cyclohexan, Triton X-100, TEOS und Silicatein. Als Kontrollen
werden NH3, BSA und Ansätze ohne
Katalysator benutzt. Üblicherweise werden das Detergens
und TEOS in Cyclohexan gelöst und für 30 min bei
Raumtemperatur zur Bildung der Mikroemulsion gerührt. Danach
wird rekombinantes Silicatein hinzugegeben um die Silica-Polymerisation
in Gang zu setzen. Die Reaktion erfolgt für 3 h bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation werden die Polylactid-Silica-Nanosphären
durch Präzipitation mittels Aceton gesammelt und bei 5000
Upm und Raumtemperatur für 10 min zentrifugiert. Die Nanosphären
werden dann zweimal mit Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen,
um das Detergens und nicht reagierte Silica-Monomere zu entfernen.
Die Proben werden mittels Transmissionelektronenmikroskopie (TEM)
analysiert.
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Verschiedene
Verhältnisse zwischen Detergens (Triton X-100), TEOS und
rekombinantem Silicatein können wie in der folgenden Tabelle
beschrieben benutzt werden. Tabelle 1. Zusammensetzung der möglichen
Kombinationen zur Herstellung der Polylactid-Silica-Nanosphären
| | Zusammensetzung |
| Probe | Hexan
(mL) | Triton
X-100 (μL) | TEOS
(μL) | Silicatein
(0.04 mg/mL in PBS) (μL) |
| 1 | 5 | 450 | 40 | 50 |
| 2 | 5 | 600 | 40 | 50 |
| 3 | 5 | 750 | 40 | 50 |
| 4 | 5 | 600 | 25 | 50 |
| 5 | 5 | 600 | 50 | 50 |
| 6 | 5 | 600 | 75 | 50 |
| 7 | 5 | 600 | 40 | 10 |
| 8 | 5 | 600 | 40 | 50 |
| 9 | 5 | 600 | 40 | 100 |
| Kontrolle | 5 | 600 | 40 | - |
| BSA | 5 | 600 | 40 | - |
| NH3 | 5 | 600 | 40 | - |
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Die
für die Probe Nr. 2 (50 nm Silica-Nanosphären)
erhaltenen Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
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Anstatt
von TEOS kann auch Natriummetasilicat eingesetzt werden. Die Polylactid-Silica-Nanosphären
können in HF und SDS/WB gelöst werden.
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2.4. Herstellung des rekombinanten Hydroxylapatit-bindenden
Silicatein-α-Proteins
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Den
Erfindern gelang die Herstellung eines rekombinanten Silicateins,
welches durch die Präsenz eines 6 × His-Tags nicht
nur durch Ni-NTA Metal-Affinity Chromatographie aufgereinigt, sondern
auch durch die Präsenz eines 8 × Glu Tags Hydroxyapatit-bindende
Eigenschaften besitzt und somit z. B. als Additiv in Zahnreinigungsprodukten
eingesetzt werden kann.
-
Die
Vorgehensweise zur Herstellung des Hydroxylapatit-bindenden Silicatein-α-Proteins
ist wie folgt:
- (1) Einsatz von Oligonukleotiden
zur Herstellung eines modifizierten Silicatein-α Amplikons:
Primer-Design.
Als Forward Primer kann beispielsweise dienen: Unterstrichen: HA-bindender
Glu-Tag
Rot-markiert: Beginn des reifen Silicatein-Proteins
Als
Reverse Primer kann beispielsweise dienen: Fett-markiert: das letzte,
für reifes Silicatein-α kodierende Codon
- (2) PCR: Die Amplifikation ist bei allen Annealing-Temperaturen
(56–60°C) erfolgreich (4)
- (3) Ligation des Amplikons mit dem bakteriellen Expressionsvektor
pTRC-His2 (Invitrogen) über T/A Klonierung (5).
- (4) Klonierung des Konstrukts in E. coli BL21 Zellen (Invitrogen)
- (5) Isolierung von 10 Kolonien, welche das korrekte Konstrukt
integriert haben
-
Das
finale rekombinante Protein hat folgendes Aussehen:
-
Tags
sind unterstrichen, Vektorsequenzen kursiv.
-
Die
einzelnen Klone werden mit 1 mM IPTG (2–8 h) zur Synthese
des rekombinanten Proteins stimuliert.
-
2.5. Bestimmung der Silicatein-Aktivität
-
Zur
Bestimmung der Enzymaktivität der (rekombinanten) Silicateine
kann ein Assay angewandt werden, der auf der Messung von polymerisiertem
und präzipitiertem Silica nach Hydrolyse und nachfolgender
Polymerisation von Tetraethoxysilan (TEOS) basiert. Hierbei wird
das Enzym üblicherweise in 1 ml eines MOPS-Puffers (pH
6,8) gelöst und mit 1 ml einer 1–4,5 mM Tetraethoxysilan-Lösung
versetzt. Die enzymatische Reaktion wird für verschieden
lange Zeiten üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
Zum Nachweis der Silica-Produkte wird das Material abzentrifugiert,
mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend
wird das Sediment mit 1 M NaOH hydrolysiert. In der entstandenen
Lösung wird unter Anwendung eines Molybdat-gestützten
Nachweisverfahrens (Silicon-Assay von Fa. Merck) das freigesetzte
Silicat quantitativ gemessen.
-
2.6. Bestimmung der Silica-Bildung
-
Die
funktionelle Aktivität der Silicateingenprodukte und die
Silicatein-vermittelte Bildung und physikalisch-chemischen Charakteristika
der porösen (Bio)silica-Nanoschichten (Versiegelungen)
werden mit Hilfe verschiedener Methoden analysiert (SEM, SDS-PAGE,
Molybdat-Assay der Silica-Bildung in Gegenwart von exogenem Na-Silicat
oder Tetraethoxysilan, Zymographie etc.).
-
Die
Bildung von Biosilica wird durch Färbung der sich bildenden
Silica-Partikel mit dem Fluorochrom Rhodamine 123 (Einbau des Fluorochroms
in die sich bildenden Partikel) oder mit Hilfe des β-Silicomolybdato-Farbsystems
(Silicat-Nachweisreagens ”Aquaquant kit”) bestimmt
(Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 361–365; Krasko
et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887).
Weiterhin können die Proben mittels EDX („Energy
Dispersive X-ray”)-Analyse analysiert werden.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 99/30601 [0006, 0034]
- - DE 10037270 A1 [0006, 0034]
- - EP 01/08423 [0006, 0034]
- - EP 1320624 [0006]
- - US 7169589 B2 [0006]
- - DE 10352433 [0008, 0034]
- - DE 102006001759 [0008, 0012]
- - DE 10246186 [0010]
- - DE 102004021229 [0013]
- - US 60/839601 [0016]
- - EP 2007/007363 [0016]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Shimizu et
al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6234–6238 [0005]
- - Müller et al. (2005) FERS J. 272, 3838–3852 [0005]
- - Müller et al. (2006) Micron 37, 107–120 [0005]
- - Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887 [0006]
- - Schröder et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 12001–12009 [0007]
- - Schröder et al. (2007) Naturwissenschaften 94, 339–359 [0007]
- - Müller et al. (2007) Gene 395, 62–71 [0008]
- - Krasko et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 4878–4887 [0008]
- - Schröder et al. (2004) Cell Tissue Res. 316, 271–280 [0008]
- - Müller et al. (2007) Gene 395, 62–71 [0008]
- - Wiens et al. (2006) Dev. Genes Evol. 216, 229–242 [0008]
- - Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887 [0009]
- - Schröder HC, Krasko A, Le Pennec G, Adell T, Wiens
M, Hassanein H, Müller IM, Müller WEG (2003) Silicase,
an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution
to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites
domuncula. Progr Molec Subcell Biol 33: 250–268 [0010]
- - Tahir et al. (2004) Chem. Commun. 2848–2849 [0011]
- - Tahir et al. (2004) Chem. Commun. 2848–2849 [0011]
- - Tahir et al. (2005) Chem. Commun. 28: 5533–5535 [0012]
- - Angew. Chem. Int. Ed. 45, 4803–4809, 2006 [0012]
- - Schröder et al. (2005) J. Biomed. Mater. Res. Part
B: Appl. Biomater. 75B: 387–392 [0013]
- - Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology.
John Wiley and Sons, New York [0049]
- - Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 361–365 [0066]
- - Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887 [0066]
Fett-markiert: das letzte, für reifes Silicatein-α kodierende Codon
