DE10037270A1 - Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silikaten und Siloxanen und ihre Verwendung - Google Patents
Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silikaten und Siloxanen und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Silicatein ist ein Enzym silikatbildender Organismen zur Synthese ihres Silikatgerüstes. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinantem oder aus natürlichen Quellen isoliertem Silicatein sowie von Silicatein-Fusionsproteinen zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und Silikate), Siloxanen sowie Modifikationen dieser Verbindungen und deren technische Verwendung.
Description
Silicium ist das zweithäufigste Element der Erdkruste (über 80% der Erdkruste
bestehen aus Silikaten) und kommt in verschiedenartigsten Verbindungen vor.
Siliciumverbindungen stellen nicht nur die artenreichste Klasse der Mineralien dar,
sondern sind auch in wirtschaftlicher Hinsicht außerordentlich wichtig. Sie werden in
großem Umfang und in vielfältiger Form eingesetzt. Glas, Porzellan, Email,
Tonwaren, Zement und Wasserglas sind technisch wichtige, aus Silikaten
bestehende Materialien. Die katalytischen Eigenschaften einiger Silikate werden
synthetisch genutzt. Ihr vielseitiger Einsatz wird noch erweitert, wenn andere
Elemente, insbesondere Aluminium, einige sonst vom Silicium eingenommene
Gitterstellen besetzen. Zu diesen Alumosilicaten gehören z. B. die Feldspäte und die
Zeolithe; die Bedeutung der letzteren liegt besonders in ihren Molekularsieb- und
Ionenaustauscher-Eigenschaften begründet. Al- u. Ca-Silikate haben als Füllstoffe in
der Lack-, Kautschuk-, Kunststoff und Papier-Industrie, Mg-Silikat (Talk) als
Absorber- und Füllstoff in der Kosmetik und Pharmazie und Alkali-Aluminium-Silikate
als Ersatz für Phosphate in Waschmitteln Bedeutung erlangt. Auch für das Abbinden
von Portlandzement spielen Silikate eine wichtige Rolle. Da manche Silikate an
ihren Oberflächen freie OH-Gruppen (analog den Silanolen) besitzen, lassen sich
dort reaktive Gruppen anbinden; man nutzt diese Eigenschaft in der
Festphasen-Technik zur Immobilisierung.
Siliciumdioxid (SiO2) ist ein Festkörper mit einem hohen Schmelzpunkt, der sowohl
in kristallisierter als auch in amorpher Form vorkommt. In allen diesen
Erscheinungsformen ist jedes Silicium-Atom tetraedrisch von vier Sauerstoff-Atomen
umgeben (Koordinationszahl: 4). Kristallisiert tritt Siliciumdioxid in verschiedenen
Modifikationen auf (Quarz, Tridymit, Cristobalit u. a.). Die häufigste Form des
kristallinen SiO2 ist der Quarz. Amorphe Siliciumdioxid-Mineralien sind u. a. Achat,
Opal und Feuerstein. Quarzglas, das durch Schmelzen von Quarz und langsames
Abkühlen der Schmelze erhalten wird, zeigt keine Kristallflächen mehr. Verwendet
wird es u. a. zur Herstellung von Quarzlampen (wegen seiner Durchlässigkeit für
ultraviolette Strahlen) und hitzebeständiger Apparate. Aus amorphem SiO2 bestehen
auch die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen).
Auch in den Kieselsäuren und Silicaten besitzt Silicium die Koordinationszahl 4. Das
tetraedrisch gebaute [SiO4]4--Ion neigt zur Polymerisation durch Verknüpfung von
SiO4-Einheiten. Dabei sind jeweils zwei Si-Atome über ein O-Atom miteinander
verbunden.
Durch Wasserabspaltung (Kondensation) entsteht dabei aus der Orthokieselsäure
zunächst die Orthodikieselsäure (Pyrokieselsäure; H6Si2O7). Die weitere
Kondensation führt über die Polykieselsäuren zu den Metakieselsäuren [(H2SiO3)n].
Bei kleinerer Zahl der SiO4-Einheiten (n = 3, 4 oder 6) können sich dabei auch
ringförmige Moleküle bilden.
Die Polykieselsäuren besitzen einen amorphen (ungeordneten) Aufbau.
Die Salze der Orthodikieselsäuren (Orthosilicate) mit der Zusammensetzung
Me2SiO4 enthalten einzelne [SiO4]4--Anionen. Die wasserlöslichen Alkalisilicate,
welche beispielsweise durch Schmelzen von Quarz mit Soda, Lauge oder
Kaliumcarbonat gewonnen werden können, enthalten neben [SiO4]4-- auch [Si2O7]6--
und [Si3O10]-8-Anionen (und größere Anionen). Solche "Wasserglas"-Lösungen, aus
denen die gelösten Teilchen durch Dialyse an einer Membran abgetrennt werden
können, dienen u. a. zum Verkitten von Glas und Porzellan, zum Imprägnieren von
Papier, als Flammschutzmittel für Holz sowie zur Lebensmittel-Konservierung.
Nach Ansäuerung einer solchen Alkalisilicatlösung kondensieren die aus den
[SiO4]4-- und [Si2O7]6--Gruppen (und größere Gruppen) durch Protonenaufnahme
gebildeten Säuremoleküle untereinander zu Polykieselsäuren (siehe oben), wobei
die Lösung gelartig wird. Die erhaltenen Polymere bestehen zunächst aus Ketten
oder Netzen. Bei weiterem Fortschreiten der Kondensation entstehen
dreidimensionale Strukturen, welche der Zusammensetzung SiO2 entsprechen.
Es ergibt sich folgende Einteilung:
- 1. Silicate mit diskreten Anionen:
- a) Insel-Silicate: Es handelt sich um Ortho-Silicate mit dem Anion [SiO4]2-. Beispiel: Phenakit, Olivin, Zirkon.
- b) Gruppen-Silicate: Die SiO4-Tetraeder sind zu kurzkettigen Einheiten verknüpft. Beispiele: Di-Silicate mit dem Anion [Si2O7]6- und Tri-Silicate.
- c) Ring-Silicate: Die SiO4-Tetraeder sind ringförmig angeordnet. Beispiele: Benitoid (3-er-Ring), Axinit (4-er-Ring), Beryll (6-er-Ring).
- 2. Ketten-Silicate und Band-Silicate. Kettensilicate bestehen aus kettenartig miteinander verbundenen SiO4-Tetraedern; sie sind Polymere des Anions [SiO3]2-. Durch Verknüpfung mehrerer SiO4-Ketten können bandförmige Moleküle entstehen. Beispiele: Hornblenden, Asbeste.
- 3. Schicht-Silicate (Blatt-Silicate): Schichtsilicaten enthalten ebene Schichten aus SiO4-Tetraedern. Diese werden durch dazwischen gelagerte Kationen zusammengehalten. Sie sind Polymere des Anions [Si4O10]4-. Beispiele: Talk, Kaolinit.
- 4. Gerüstsilicate: In den Gerüstsilicaten sind die tetraedrischen SiO4-Gruppen zu dreidimensionalen Gittern verbunden. Beispiele: verschiedene Modifikationen von Siliciumdioxid wie Feldspäte.
Der zu den Polykieselsäuren bzw. Polysilikaten führende Kondensationsvorgang
läßt sich durch teilweises Ersetzen der OH-Gruppen der Kieselsäure durch
einbindige Organylreste, welche sich nicht am Kondensationsvorgang beteiligen,
steuern (Herstellung verschiedener Silicone).
Synthetische Kieselsäuren sind amorph, ungiftig und führen im Gegensatz zu den
kristallinen SiO2-Modifikationen nicht zur Entstehung einer Silicose.
Allgemeine Literatur:
Hinz, Silicat-Lexikon (2 Bd.), Berlin: Akademie Verl. 1985
Liebau, Structural Chemistry of Silicates, Berlin: Springer 1985
Petzold und Hinz, Einführung in die Grundlagen der Silicatchemie, Stuttgart: Enke 1979
CD Römpp Chemie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995.
Hinz, Silicat-Lexikon (2 Bd.), Berlin: Akademie Verl. 1985
Liebau, Structural Chemistry of Silicates, Berlin: Springer 1985
Petzold und Hinz, Einführung in die Grundlagen der Silicatchemie, Stuttgart: Enke 1979
CD Römpp Chemie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995.
Die nach dem Stand der Technik angewandten Methoden zur Darstellung von
Silanolen und Siloxanen bestehen darin, daß man auf organische Siliciumderivate,
wie zum Beispiel Trimethylsiliciumchlorid [(CH3)3SiCl] Wasser einwirken läßt, wobei
zunächst Silanole wie zum Beispiel Trimethylsilanol gebildet werden:
(CH3)3SiCl + H2O → (CH3)3Si-OH + HCl
Aus diesen entstehen durch Wasserabspaltung Siloxane wie zum Beispiel
Hexamethyldisiloxan [(CH3)3Si-O-Si(CH3)3]:
2 (CH3)3SiOH → (CH3)3Si-O-Si(CH3)3 + H2O
Weiterhin lassen sich durch Reaktion von Dimethyl- oder Monomethylsiliciumchlorid
mit Wasser hochmolekulare Verbindungen mit ring- oder kettenartigen Strukturen
oder dreidimensional vernetzten Makromolekülen ("Silicone") herstellen (über die
Zwischenprodukte Dimethylsilandiol bzw. Methylsilantriol):
(CH3)2SiCl2 + 2 H2O → (CH3)2Si(OH)2 + 2 HCl
n (CH3)2Si(OH)2 → (CH3)2SiOn + n H2O
Die zur Darstellung weiterer Silicone benutzten Ausgangsverbindungen R3SiOH
(Silanole), R2Si(OH)2 (Silandiole) und RSi(OH)3 (Silantriole) werden gewöhnlich
durch Hydrolyse der entsprechenden Halogenverbindungen R3SiCl, R2SiCl2 und
RSiCl3 hergestellt (R = Ethyl-, Propyl-, Phenyl-Gruppen u. a.).
Siloxane (Silicone) lassen sich demnach einteilen in:
- a) Lineare Polysiloxane mit dem Bautyp R3SiO[R2SiO]nSiR3.
- b) Verzweigte Polysiloxane, die an den Verzweigungsstellen trifunktionelle oder tetrafunktionelle Siloxan-Einheiten enthalten.
- c) Cyclische Polysiloxane, die ringförmig aus difunktionellen Siloxan-Einheiten aufgebaut sind.
- d) Vernetzte Polymere, wobei ketten- oder ringförmige Moleküle zu zwei- oder dreidimensionalen Netzwerken verknüpft sind.
Die Viskosität der hochmolekularen, aus kettenförmigen Makromolekülen
bestehenden Silicone (Siliconöle) nimmt mit wachsender Kettenlänge zu. Silicone
spielen eine bedeutsame Rolle als technische Werkstoffe. In geringem Maß
vernetzte Ketten zeigen Kautschuk-Elastizität (Siliconkautschuk; Verwendung:
Dichtungen u. a.), stark vernetzte Silicone sind harzartige (Siliconharze).
Aufgrund ihrer, durch den organischen Anteil bedingten hydrophoben
(wasserabstoßenden) Eigenschaften finden Silicone zum Imprägnieren (von
Textilien, Papier u. a.) Verwendung.
Einige der oben genannten Siliciumverbindungen sind nur kostenintensiv
herzustellen bzw. kommen nur in geringen Mengen als Bodenschätze vor und sind
deshalb nur unter beträchtlichem Aufwand zu isolieren. Der Prozess der chemischen
Synthese der Silikate bedarf dabei drastischer Bedingungen wie hohem Druck und
hoher Temperatur.
Organismen (insbesondere Schwämme und Algen) sind im Gegensatz dazu
befähigt, mit Hilfe spezifischer Enzyme Silikatgerüste unter natürlichen
Bedingungen, d. h. bei niedriger Temperatur und niedrigem Druck, zu bilden. Die
Vorteile dieses Syntheseweges sind: hohe Spezifität, koordinierte Bildung,
Regulierbarkeit und Möglichkeit der Synthese von Nanostrukturen.
Die Isolierung und Reinigung eines silikatbildenden Enzyms (Silicatein) wurde vor
kurzem erstmals beschrieben: Shimizu, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
6234-6238 (1998).
Hierbei ergibt sich jedoch das Problem, daß die Isolierung und Reinigung des
Enzyms (Silicateins) zeitaufwendig ist und dabei nur relativ geringe Ausbeuten zu
erzielen sind.
Ein möglicher Lösungsansatz ist die Synthese des rekombinanten Proteins
(rekombinantes Silicatein) mit Hilfe der bekannten cDNA- oder Gen-Sequenz. Dies
erlaubt die effektive enzymatische Synthese von Silikaten.
Bei der Herstellung des rekombinanten Silicateins aus dem Meeresschwamm
Suberites domuncula ergab sich jedoch das Problem, daß bei Anwendung der dem
Stand der Technik entsprechenden Methoden nur sehr geringe Ausbeuten erzielt
werden konnten und das Protein nur geringe enzymatische Aktivität zeigte. Die
vorliegende Erfindung beschreibt, daß durch gezielte Veränderung der
Expressionsbedingungen rekombinantes Silicatein in hohen Ausbeuten und mit
hoher spezifischer Aktivität hergestellt werden kann.
Durch die Herstellung eines spezifischen polyklonalen Antikörpers und
anschließende Koppelung an eine feste Phase kann eine schnelle und effektive
affinitätschromatographische Reinigung des Enzyms durchgeführt werden.
Durch Einsatz von Fusionsproteinen und Verwendung verschiedener
Ausgangssubstrate ergeben sich zahlreiche Variationsmöglichkeiten und technische
Anwendungen.
Das Silicatein-Protein von Schwämmen enthält charakteristische Sequenz-
Segmente, von denen einige genannt seien: Bereich um die Serin-reichen
Aminosäure-Cluster (bei S. domuncula: Aminosäuren 267-277); Bereich um das
Cystein, der ersten Aminosäure der katalytischen Triade (bei S. domuncula:
Aminosäure 138), die bei Silicatein fehlt und bei den verwandten Enzymen, den
Cathepsinen, vorhanden ist; Bereich um den Übergang zwischen dem Propeptid und
dem prozessierten Peptid (bei S. domuncula: Aminosäuren 112/113).
Aus cDNA-Bibliotheken, z. B. in ZapExpress und in Escherichia coli XL1-Blue MRF',
kann dann mit geeigneten degenerierten Primern (beispielsweise: der reverse
Primer 5'-GAA/GCAG7CCGIGAIGAA/GTCA/GTAG/CAC-3' zusammen mit dem
5'-Vektor-spezifischen Primer [Bereich um die Aminosäuren 267-277] - oder der
Vorwärtsprimer am gleichen Protein-Segment zusammen mit dem 3'-Vektor-spezifischen
Primer) das Gen für Silicatein mittels der Technik der Polymerasen-Ketten
Reaktion identifiziert werden; hierzu wird ein entsprechender
vektorspezifische Primer eingesetzt. Das erhaltene Syntheseprodukt wird zum
Screenen in der betreffenden cDNA-Bibliothek benutzt. Danach wird der/die
identifizierte(n) Clon(e) in einen Vektor (beispielsweise pGem-T) subcloniert und
anschließend sequenziert. Abb. 1 zeigt als Beispiel die cDNA für Silicatein aus
Suberites domuncula.
Die Herstellung von rekombinantem Silicatein erfolgt bevorzugt in E. coli XL1-Blue.
Aber auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich und wurde
erfolgreich durchgeführt. Hierzu wird die cDNA in einen entsprechenden Vektor, z. B.
pQE-30, eincloniert. Auch andere Expressionsvektoren haben sich als geeignet
erwiesen. Nach Transformation von E. coli wird die Expression von Silicatein durch
Induktion mit üblicherweise IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) (Ausubel,
F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidmann, J. G. & Struhl, K.
(1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York)
durchgeführt. Die Expression von Silicatein sowie die Aufreinigung des
rekombinanten Proteins über z. B. das Histidin-Tag, das an dem rekombinanten
Protein vorliegt, kann an entsprechenden Affinitätssäulen, z. B. einer Ni-NTA-Matrix
durchgeführt werden (Skorokhod, A., Schäcke, H., Diehl-Seifert, B., Steffen, R.,
Hofmeister A., and Müller W. E. G. Cell. Mol. Biol. 43: 509-519; 1997).
Die Expression der kompletten Silicatein-Sequenz in E. coli gelingt jedoch nur mit
sehr geringen Ausbeuten. Folgende Veränderungen der Expressionsbedingungen
führten unerwarteterweise zu drastischen Verbesserungen der Ausbeute:
- 1. Durch Verkürzung der Sequenz, die für das N-terminale Ende des Proteins codiert, wurde eine über 100-fache Erhöhung der Expression (im Vergleich zur Expression des Gesamt-cDNA) erreicht. Bevorzugt wird der Start in die Region des Propeptides gesetzt. Aber auch eine Verkürzung im Bereich des "reifen" Protein vor der ersten potentiellen Disulfid-Brücke (üblicherweise an der Aminosäure 135) führt zu der gewünschten starken Expression (Abb. 2).
- 2. Auch durch eine verkürzte cDNA, die für das C-terminale Ende des Proteins codiert, wird im Vergleich zur Expression der kompletten cDNA eine über 20-fache erhöhte Expression von Silicatein gefunden (Abb. 2). Erfolgreich hat sich die Verkürzung des Genes am 3'-Ende im Bereich der Sequenz nach der letzten potentiellen Disulfid-Brücke (üblicherweise an der Aminosäure 319) erwiesen. Dort wird ein Stop-Codon insertiert.
- 3. Eine über 40-fache Erhöhung der Expression in E. coli wird dadurch erreicht, daß beim Aufbrechen der Zellen ein Protease-Inhibitor-Cocktail hinzugegeben wird. Als vorteilhaft hat sich die Verwendung folgendes Protease-Inhibitor-Cocktails erwiesen: Antipain (10 µg), Bestatin (5 µg/ml), Chymostatin (10 µg/ml), Leupeptin (1 µg/ml), Pepstatin (1 µg/ml), Aprotinin (1 µg/ml). Dieser Schritt war deshalb so überraschend, da die Vorschrift, die üblicherweise zur Isolierung der rekombinanten Proteine angewandt wird, wie bei dem BugBuster Extraktions-Kit (Fa. Novagen), dies nicht vorsieht.
- 4. Nach dem Aufbrechen der E. coli-Bakterien ist die erhaltene Lösung sehr viskos. Eine Isolierung des rekombinanten Proteins wird effizient dadurch erreicht, daß Enzyme zur Verdauung der Nukleinsäuren hinzugegeben werden. Hierzu eignet sich die Nuclease "Benzonase".
- 5. Üblicherweise wird bei einer Expression von Silicatein in E. coli das rekombinante Protein in den "inclusion bodies" gefunden. Deshalb muß das rekombinante Protein in die "native" Form überführt werden. Hierzu erwies sich das folgende Verfahren als vorteilhaft: Die E. coli-Bakterien werden mit der Lösung des BugBuster Extraktions-Kits aufgeschlossen; nach Waschen werden die "inclusion bodies" durch Zentrifugation gewonnen. Die "inclusion bodies" werden mehrmals mit dem sog. IB Wash Buffer aus dem "Protein Refolding-Kit (Fa. Novagen)" gewaschen. Die Vorschrift, die z. B. dem "Protein Refolding-Kit" zugrunde liegt, wird angewandt, um das rekombinante Silicatein in die "native" Form zu überführen. Bei der Anwendung dieses und anderer vergleichbarer Verfahren wird jedoch das rekombinante Silicatein abgebaut. Überraschenderweise kann dieser Prozeß durch Weglassen des Enzyms Lysozym verhindert werden. Üblicherweise ist dieser Lysozym-Schritt fester Bestandteil eines Protokolls zur Gewinnung rekombinanter Proteine aus E. coli. Er dient dazu, assoziierte Bakterienmembranen von den rekombinanten Proteinen zu entfernen. Die Endreinigung des rekombinanten Silicateins kann über Affinitätsmatrizes, wie Ni-NTA Matrizes, erfolgen.
Nach Anwendung dieser einzusetzenden Verfahrensänderungen wird
überraschenderweise eine hohe Expression in E. coli erreicht (mehr als 100-fach);
jetzt werden Ausbeuten von etwa 10 mg/100 ml Bakterien-Kulturmedium an
rekombinantem Silicatein erreicht (Abb. 3).
Entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise kann die Isolierung,
Clonierung und Expression der cDNA für Silicatein aus weiteren Siliciumdioxid
produzierenden Organismen durchgeführt werden, beispielsweise aus Diatomeen (z. B.
Cylindrotheca fusiformis). Die Gewinnung von Diatomeen in axenischen Kulturen
ist Stand der Technik (Kröger, N., Bergsdorf, C., and Sumper M. Europ. J. Biochem.
239: 259-264; 1996).
Silicatein ist dasjenige Enzym, das amorphes Silikat, z. B. in Schwämmen,
synthetisiert. Deshalb kann das Silicatein auch aus den Organismen selbst
gewonnen werden. Hierzu werden, z. B. aus dem Schwamm Suberites domuncula
die Spiculae (bestehend aus amorphem Silikat) durch Dissoziation des Gewebes in
Ca++- und Mg++-freiem Seewasser gewonnen. Die Spiculae werden durch
Sedimentation gewonnen. Das amorphe Silikat der Spiculae wird im alkalischen
Milieu, z. B. in verdünnter Natronlauge, entfernt. Die organischen Fibrillen der
Spiculae, die das Silicatein enthalten, werden durch Abzentrifugation (z. B.
20,000 × g; 1 Stunde; 4°C) gewonnen. Das Protein wird durch hohe Salzkonzentration,
wie z. B. 1 M NaCl, aber auch durch den "Protein Refolding-Kit" in Lösung gebracht.
Anschließend wird das Silicatein an einer Affinitätsmatrix gereinigt. Die
Affinitätsmatrix wird hergestellt, indem ein Silicatein-spezifischer Antikörper an eine
feste Phase (CNBr-aktivierte Sepharose oder andere geeignete Träger)
immobilisiert wird, gereinigt. Als Antikörper werden monoklonale oder polyklonale
Antikörper gegen das Silicatein eingesetzt, die nach Standard-Methoden hergestellt
werden (Osterman, L. A. Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. 2;
Springer-Verlag [Berlin] 1984). Die Kopplung des Antikörpers an die Säulenmatrix
wird nach den Angaben des Herstellers (Pharmacia) durchgeführt. Die Elution des
reinen Silicateins erfolgt mittels pH-Änderung oder Änderung der Ionenstärke. Auch
andere Affinitätsmatrizes wie polymere Silikate oder copolymere Silikate/Germanate
wurden mit Erfolg eingesetzt. Die Elution des Silicateins von diesen Matrizes
geschieht bei einem pH um den isoelektischen Punkt von Silicatein (im Falle des S.
domuncula-Silicateins bei einem pH von etwa 6).
Entsprechende Isolierungen von Silicatein aus weiteren Siliciumdioxid
produzierenden Organismen, wie Diatomeen (z. B. Cylindrotheca fusiformis), wurden
nach der oben dargestellten Verfahren mit Erfolg durchgeführt.
Neu an der Erfindung ist außerdem, daß das Silicatein-Gen durch geeignete
Silikatkonzentrationen im Medium (gewöhnlicherweise 60 µM) und durch Myotrophin
(1 µg/ml) induziert werden kann (Abb. 4A, B).
Die Messung der enzymatischen Aktivität des rekombinanten Silicateins wird
üblicherweise wie folgt durchgeführt. Das rekombinante Silicatein wird über Nacht
gegen einen für die Reaktion geeigneten Puffer, wie 25 mM Tris-HCl, pH 6,8
dialysiert [andere Puffer innerhalb eines pH-Bereiches von 4,5 bis 10,5 sind
ebenfalls geeignet].
Üblicherweise werden 1-60 µg rekombinantes Silicatein in 1 ml eines geeigneten
Puffers, wie 25 mM Tris-HCl (pH 6,8) gelöst und mit 1 ml einer üblicherweise 1-4,5 mM
Tetraethoxysilan-Lösung versetzt. Die enzymatische Reaktion kann bei
Raumtemperatur - aber auch bei Temperaturen zwischen 5°C und etwa 65°C -
durchgeführt werden. Die durchschnittliche Inkubationszeit ist 60 min. Während
dieser Zeitspanne werden üblicherweise 300 nmol amorphes Silikat (als Molybdat-reaktives,
lösliches Silikat) pro 100 µg Silicatein synthetisiert. Zum Nachweis der
Silikat-Produkte wird das Material in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert
(12 000 × g; 15 min; +4°C), mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend wird das
Sediment mit z. B. 1 M NaOH hydrolysiert. In der entstandenen Lösung wird unter
Anwendung eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem
Silicon-Assays (Merck), Silikat quantitativ gemessen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Silicatein neben dem Substrat
Tetraethoxysilan auch noch weitere Silan-Alkoxide polymerisiert.
Neu in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß folgende Verbindungen zur
Silicatein-vermittelten Synthese verwendet werden können: Tetraalkoxysilane,
Trialkoxysilanole, Dialkoxysilandiole, Monoalkoxysilantriole, Alkyl- oder
Aryl-Trialkoxysilane, Alkyl- oder Aryl-Dialkoxysilanole oder Alkyl- oder
Aryl-Monoalkoxysilandiole oder die entsprechenden (Alkyl- oder Aryl-substituierten)
Alkoxyverbindungen von Gallium (IV), Zinn (IV) oder Blei (IV). Auch Mischungen
dieser Substrate werden durch das Enzym erkannt und polymerisiert. Somit können
auch Mischpolymere hergestellt werden.
Zur Erhöhung der Aktivität des Enzyms Silicatein werden die Substrate, wie
Tetraethoxysilan, in Dimethylsulfoxid in einer Stammlösung von üblicherweise
500 mM gelöst und anschließend in die gewünschte Endkonzentration herunter
verdünnt.
Fusionsproteine mit Silicatein werden wie folgt gewonnen. Ein geeigneter
Expressionsvektor (beispielsweise pQE-30) wird eingesetzt. Die Silicatein-cDNA -
mit z. B. einer BamHI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und z. B. einer
SalI-Restriktionsstelle am 3'-Terminus - wird hergestellt. Das Stop-Codon in der
Silicatein-cDNA wird entfernt. Hierzu wird die PCR-Technik eingesetzt und Primer,
welche die betreffenden Restrikionsstellen besitzen, zum Amplifizieren benutzt. Die
cDNA für das zweite Protein wird entsprechend gewonnen, wobei am 5'-Terminus
die gleiche Schnittstelle wie am 3'-Terminus der Silicatein-cDNA (im Beispiel SalI)
und am 3'-Terminus eine von den anderen verschiedene (z. B. eine HindIII-Stelle)
vorliegt. Falls sich in den betreffenden cDNAs interne Restriktionsstellen befinden,
können alternative Restriktionsenzyme eingesetzt werden. Darüber hinaus können
auch Linker zwischen die beiden cDNAs eingesetzt werden (Abb. 5A).
Diese beiden cDNAs werden nach den üblichen Verfahren ligiert, gereinigt und in
den pQE-30 Vektor (Quiagen) einligiert. Die Ligation erfolgt im Anschluß an das
Histidin-Tag (etwa 6 Histidin-Codons). Die Expression und Reinigung des
Fusionsproteins kann wie oben beschrieben erfolgen (Abschnitt 2.1.2).
Alternativ zu dem Verfahren, das unter 4.1. beschrieben wurde, kann zwischen der
cDNA für das Silicatein und der cDNA für das bioaktive Protein eine
Protease-Spaltstelle (wie z. B. eine Enterokinase-Stelle) eincloniert werden. In diesem Falle
kann ein Codon für ein neues Start-Methionin vor den codierenden Bereich des
Genes für das bioaktive Protein insertiert werden. Nach Expression und Reinigung
wird das (Fusions)-Protein proteolytisch gespalten. Jetzt liegen beide Proteine
separat vor (Abb. 5B).
Alternative können beide Proteine auf einem Konstrukt - aber separat - exprimiert
werden. Hierzu wird in einem Expressions-Vektor das Silicateingen dem His-Tag
nachgeschaltet. Am Ende der Silicatein-cDNA wir ein Stop-Codon insertiert.
Zwischen der cDNA für das Silicatein und der cDNA für ein bioaktives Protein wird
eine Ribosomen-Bindungsstelle mit Codon für ein Start-Methionin eincloniert.
Wiederum wird ein His-Tag der cDNA für das bioaktive Protein vorgeschaltet.
Ebenfalls erhält dieses Gen ein Stop-Codon (Abb. 5C).
Die His-Tags können deletiert werden, wenn die Proteine zur Funktionsanalyse in
den betreffenden Wirtszellen benutzt werden.
Für die Expression, wie unter 4.1 bis 4.3 beschrieben, können sowohl bakterielle als
auch eukaryotische Zellen benutzt werden.
Die Expression, wie unter 4.1 bis 4.3 beschrieben, kann auch für drei und mehr
offene Leserahmen eingesetzt werden.
Die biologische Reaktion von Organismen (oder biologischen Extrakten/Produkten)
auf (exponierte und/oder implantierte) Biomaterialien wird großenteils durch deren
Oberflächenstruktur und -chemie bestimmt. Deshalb besteht ein Bedarf an
Methoden zur Oberflächenmodifikation derartiger Biomaterialien. Ziel dabei ist stets,
die vorteilhaften chemisch-physikalischen Eigenschaften der Biomoleküle zu
erhalten. Deshalb sollte nur die äußerste Oberfläche modifiziert werden, da dadurch
deren biologische Wechselwirkungen beeinflußt werden.
Oberflächenmodifizierte Biomaterialien (wie beispielsweise durch Silicon- und
Siloxan-enthaltende Block-Copolymere, "Silanisierung") finden Verwendung zur
Beeinflussung von Zelladhäsion und Wachstum, zur Modifizierung der Blut-
Kompatibilität oder zur Kontrolle der Protein-Adsorption (Herabsetzung der
Adsorption von Kontaktlinsen, Vorbehandlung von ELISA-Platten). Die Sialinisierung
zur Modifizierung von Materialoberflächen kann dabei insbesondere zur
Modifizierung hydroxylierter oder Amin-reicher Oberflächen benutzt werden, wie
beispielsweise Oberflächen von Glas, Silicium, Germanium, Aluminium, Quarz und
vielen Metalloxiden, die reich an Hydroxylgruppen sind. Eine Literatur-Übersicht
findet sich in: B. D. Ratner et al. (Hrsg.) Biomaterials Science - An Introduction to
Materials in Medicine. Academic Press, San Diego, 1996.
Dabei ergibt sich jedoch das Problem, daß bei den zur Herstellung dieser
Modifizierungen angewandten Bedingungen oft schädliche (destruierende) Effekte
auf die benutzten Biomaterialien auftreten.
Eine im Vergleich zu den angewandten physikalisch/chemischen Verfahren "milde"
Methode stellen die allein auf biochemischen Reaktionen beruhenden
Modifikationen von Biomaterialien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
(Verwendung von rekombinantem/gereinigtem Silicatein) dar (Silicatein-vermittelte
enzymatische Synthese von amorphem SiO2-, Siloxan- oder
Siloxan-Block-Copolymere-enhaltende Oberflächen).
Die modifizierte Zone auf der Material-Oberfläche sollte in den meisten Fällen so
dünn wie möglich sein, da modifizierte Oberflächenschichten, die zu dick sind, die
mechanischen und funktionellen Eigenschaften des Materials verändern können.
Dies kann durch Variation der Reaktionszeit und der Substrat-Konzentration bei der
Silicatein-vermittelten enzymatischen Reaktion auf einfache Weise erreicht werden.
Mittels der Silicatein-vermittelten enzymatischen Reaktion lassen sich eine Vielzahl
unterschiedlicher Biomaterialien, die entweder eine Protein (Silicatein)-bindende
Oberfläche von Natur aus besitzen bzw. die durch eine vorhergehende Modifikation
proteinbindend gemacht wurden, verwenden, und zwar Biomaterialien einschließlich
Polymere, Metalle, Keramiken und Gläser.
Silane können zwei Arten von Oberflächen-Strukturen bilden. Sehr dünne
(Monolayer) Schichten, falls nur Spuren von Oberflächen-adsorbiertem Wasser
vorhanden sind, oder, falls mehr Wasser vorhanden ist, dickere Silan-Schichten, die
sowohl aus Si-O Gruppen, die an die Oberfläche gebunden sind, als auch Silan-Einheiten,
die ein dreidimensionales, polymeres Netzwerk ausbilden, bestehen.
Derartige Modifikationen können beispielsweise durch Behandlung von
hydroxylierten Oberflächen mit n-Propyl-trimethoxysilan hergestellt werden.
Allgemeine Literatur: Pleuddemann, E. P. (1980) Chemistry of silane coupling
agents. In Silylated Surfaces (D. E. Leyden, Hrsg.) Gordon & Breach, New York,
pp. 31-53.
Mittels der Silicatein-vermittelten enzymatischen Reaktion lassen sich - unter
milden, die Biomaterialien schonenden Bedingungen - ebenfalls verschiedene Arten
von Oberflächen-Strukturen auf einer Vielzahl unterschiedlicher Biomaterialien
bilden, deren Synthese jedoch, da enzymatisch vermittelt, gezielt abläuft.
Insbesondere ergibt sich auch eine Verwendung der rekombinanten oder des aus
verschiedenen Quellen gereinigten Silicateins bei der Herstellung von Oberflächen-
Modifikationen von Biomaterialien mit Silikon-artigen Eigenschaften (wie
Silikon-Brust-Implantate) sowie medizinischer Implantate und Endoprothesen, ebenfalls
auch bei Kontaktlinsen.
Durch die gesteuerte Synthese von SiO2- oder Siloxan-Hüllen mittels des
rekombinanten oder des aus verschiedenen Quellen gereinigten Silicateins ergibt
sich eine Verwendung zum Einkapseln von Biomolekülen (einschließlich Proteinen
und Nucleinsäuren) sowie bioaktiven Molekülen (einschließlich Hormonen,
Pharmaka und Cytokinen), mit dem Ziel, deren biologischen Eigenschaften (wie
Protease- und Nuclease-Resistenz, Temperatur-Stabilität) oder deren Freisetzung
(kontrolliertes "Drug-delivery", ebenfalls auch Ermöglichung eines topischen
"Drug-delivery") zu verändern oder zu verbessern.
- a) Erhöhung der Proteaseresistenz (und Temperatur-Stabilität) von Proteinen. Vorgehensweise: Umgebung des Proteins mit einem Silicatein-Mantel (beispielsweise durch Crosslinking), der eine SiO2-Hülle synthetisiert.
- b) Erhöhung der Nucleaseresistenz (und Temperatur-Stabilität) von Nucleinsäuren Vorgehensweise: Umgebung der Nucleinsäure mit einem Silicatein-Mantel (beispielsweise durch Crosslinking), der eine SiO2-Hülle synthetisiert.
Auf die oben geschilderte Weise ist auch die Herstellung von Depot-Formen für
Arzneimittel (einschließlich für Peptid/Proteohormone und Cytokine) möglich. Dazu
werden die Arzneimittel (einschließlich Peptid/Proteohormone und Cytokine)
zunächst modifiziert durch
- a) Crosslinking mit Silicatein oder (falls es sich um Proteine handelt)
- b) Herstellung von Fusionsproteinen mit Silicatein.
Danach erfolgt die Silicatein-vermittelte Synthese des Kapselmaterials.
WO 9614832 A1 19960523 (US 9514261 19951106) offenbart eine Methode zur
Herstellung von synthetischen Liposomen aus Polyphosphaten zur Steigerung der
Aufnahme von Arzneimitteln ("Drug-delivery"). Durch Aufbau einer derartigen
Liposomen stabilisierenden Hülle mittels Silicatein läßt sich die Effizienz der
Methode steigern.
Weiterhin ergibt sich eine Verwendung des rekombinanten oder des aus
verschiedenen Quellen gereinigten Silicateins bei der Herstellung neuer
Biomaterialien (oder Komposit-Materialien) wie Knochenersatzmaterialien oder
Zahnersatzmaterialien durch Co-Synthese von Polysilikaten, Siliconen oder
Mischpolymeren (hergestellt mittels des rekombinanten/gereinigten Silicateins) und
Polyphosphaten (hergestellt mittels rekombinanter Polyphosphat-Kinase).
Die gesteuerte Synthese von SiO2 oder Siloxan-Hüllen mittels des rekombinanten
oder des aus verschiedenen Quellen gereinigten Silicateins kann auch zur
Einkapselung von Zellen bei Transplantationen verwendet werden (Verbesserung
der Biokompatibilität).
Dies kann durch "Coaten" der Zellen mit Silicatein oder durch Expression von
Silicatein-Fusionsproteinen auf der Zell-Oberfläche durchgeführt werden.
Das rekombinante sowie das aus verschiedenen Quellen gereinigte Silicatein kann
auch zur Oberflächen-Modifikation von (Silicium oder Germanium)-Halbleitern oder
(Silicium oder Germanium)-Biosensor-Chips verwendet werden. Hierdurch kann eine
Verbindung mit Zellen oder anderen aus organischem Material bestehenden
Strukturen hergestellt werden. Diese "Matrizes" können zur Messung der
elektrischen Eigenschaften von Zellen benutzt werden. Derartige
Silicatein-modifizierte Halbleiter (oder Silicium-Mikrochips) können auch als
Biosensoren Verwendung finden.
Das rekombinante sowie das aus verschiedenen Quellen gereinigte Silicatein ist in
der Lage, amorphes SiO2 zu bilden. Zu den amorphen bzw. feinkristallinen
Modifikationen des SiO2 (Opale) zählen Achat, Jaspis, Onyx u. a. Aufgrund der
Möglichkeit, mit Hilfe des rekombinanten oder des aus verschiedenen Quellen
gereinigten Silicateins unter kontrollierten Bedingungen amorphes SiO2 zu
synthetisieren, wobei gezielt Fremdmoleküle/atome eingefügt werden können, ergibt
sich folglich die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung
der obengenannten und anderer Edelsteine/Halbedelsteine.
Mit Hilfe des rekombinanten oder des aus verschiedenen Quellen gereinigten
Silicateins ist es auch möglich, unter kontrollierten Bedingungen dünne SiO- und
SiO2-Schichten auf Halbleiter-Unterlagen aufzubringen (zur Herstellung von
integrierten Schaltkreisen).
Silicium ist bekannt als Spurenelement, das offenbar für die Ausbildung von
Bindegewebe und Knochen (Mineralisation) benötigt wird. Die Herstellung von
Silicium-organischen Verbindungen als Grundlage für sogenannte Sila-Pharmaka
(Pharmaka, bei denen C durch Si ersetzt ist, mit potentiellen Wirkungsänderungen
auf den Organismus) ist von medizinischem Interesse [siehe: Chem. unserer Zeit 14,
197-207 (1980), sowie: Bioactive Organo-Silicon Compounds (Topics Curr. Chem.
84), Berlin, Springer 1979]; die Synthese derartiger Verbindungen unter milden
(enzymatischen) Bedingungen ist mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
(Verwendung des rekombinanten oder des aus verschiedenen Quellen gereinigten
Silicateins) möglich.
Weitere Verwendungen von Silicium-Verbindungen, die mit Hilfe des
erfindungsgemäßen Verfahrens unter milden (enzymatischen) Bedingungen
synthetisiert werden (Verwendung des rekombinanten oder des aus verschiedenen
Quellen gereinigten Silicateins) in Medizin und Kosmetik sind: Verwendung derartig
synthetisierter Silicium-Verbindungen als Bestandteil oder Grundlage von Salben,
sowie als Bestandteil von Zahnpasten [zur Verwendung in der Kosmetik, siehe:
Parfüm. Kosmet. 67, 232-239, 326-336, 384-389(1986); 68, 195-203 (1987)].
Silicium-Verbindungen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter
milden (enzymatischen) Bedingungen synthetisiert wurden (Verwendung des
rekombinanten oder des aus verschiedenen Quellen gereinigten Silicateins) lassen
sich auch für weitere Zwecke verwenden: Gleitmittel (Kunststoffverarbeitung),
Schmiermittel (Kunststoffgetriebe), Schaumdämpfungsmittel, Formtrennmittel,
(Hydrophobieren von Glas, Keramik, Textilien, Leder) und Dielektrika (z. B. in
Transformatoren).
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens synthetisierten Verbindungen
schließen die in der Technik verwendeten Siloxan-Harze wie (mehr oder minder
vernetzte) Polymethyl- oder Polymethylphenysiloxane mit ein.
Die durch Kondensation der im Verlauf der Silicatein-vermittelten Katalyse
gebildeten Silantriole RSi(OH)3 führen zur Synthese von Blattstruktur-artigen
Polymeren der Bruttozusammensetzung R2Si2O3. Der Vernetzungsgrad und die
Ausdehnung dieser Polymere kann dabei durch kontrollierte Beimischung von
Silandiolen und Silanolen variiert werden. Somit lassen sich enzymatisch
maßgeschneiderte Siliconstrukturen mit charakteristischen, regulierbaren
Eigenschaften erzeugen.
Das Siloxan-Gerüst kann dabei mit verschiedenartigen Kohlenwasserstoff-Resten
verknüpft sein. Dadurch lassen sich seine Eigenschaften modifizieren.
Aufgrund ihrer Wärmebeständigkeit und Hydrophobizität können die durch
Silicatein-vermittelte Katalyse synthetisierten (erfahrungsgemäß nicht gesundheits
schädlichen) Silicone auch in der kosmetischen Hautpflege und plastischen
Chirurgie Verwendung finden.
Allgemeine Literatur: Brinker et al., Polydimethylsiloxane in der Lebens- und
Genußmittelindustie, München: Dow Corning 1981.
Durch Transfektion von Zellen mit einem Silicatein-Gen/cDNA-enthaltendem
Plasmid lassen sich deren Eigenschaften verändern, was eine Verwendung bei der
Herstellung von Knochenersatzmaterialien (auch durch Co-"Polymerisation" von
Silicatein-synthetisiertem SiO2 und Polyphosphaten, hergestellt durch Transfektion
mit einem Polyphosphat-Kinase-cDNA-enthaltendem Plasmid) ergibt.
Mittels des rekombinantem Silicateins, der rekombinanten Silicatein-Fusionsproteine
oder des gereinigtem Silicateins ist es möglich, spezifische zwei- und
dreidimensionale, sieb-, netz-, käfig- oder andersartig geformte Strukturen aus
amorphem Siliciumdioxid, Siloxanen oder anderen Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-,
Zinn (IV)- oder Blei (IV)-]-Verbindungen im Nano-Maßstab zu synthetisieren, wobei
mit diesen Enzymen assoziierte Makromoleküle (synthetische Polymere oder
Biopolymere) als "Leitschienen" für der Synthese benutzt werden. Derartige
Synthesen sind auch unter Verwendung von in Marikultur oder in Aquarien
gehaltenen Schwämmen oder anderen Silikatein-produzierenden Organismen sowie
mit gentechnologisch veränderten, ursprünglich nicht zur Silikat-Synthese
befähigten Organismen möglich. Die gebildeten Strukturen können in der
Nanotechnologie angewandt werden (beispielsweise als "Miniatursiebe" für
Trennprozesse im Nanomaßstab).
Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den auf den Seiten 28-33
abgebildeten Grafiken aufgeführt:
cDNA mit abgeleiteter Aminosäure-Sequenz für das Suberites domuncula-Silicatein.
Aminosäure-Sequenz von Silicatein aus dem Schwamm Suberites domuncula.
Einige Stellen am Protein, die nach Verkürzung der cDNA zu einer starken
Erhöhung der Expression des rekombinanten Proteins geführt haben, sind
eingezeichnet [-]. Darüber hinaus sind die Aminosäuren der katalytischen
Triade (CT) sowie die Cystein-Einheiten, die zu potentiellen Disulfidbrücken führen,
markiert (•).
Herstellung des rekombinanten Silicatein-Proteins in E. coli. Nach dem
angegebenen Verfahren wurde aus dem Rohextrakt das reine Silicatein gewonnen.
Spur a: Proteinextrakt aus nicht-induzierte Zellen [-IPTG]; Spur b und Spur c:
Proteinextrakt aus induzierte Zellen [+IPTG], 2,5 Stunden (Spur b) und 8 Stunden
(Spur c) nach Zugabe von IPTG. Spur d: Löslicher Proteinextrakt des Bakterien-
Lysats nach Expression für 8 Stunden. Spur e: Proteinextrakt der "inclusion bodies".
Spur f: Gereinigtes Silicatein aus den "inclusion bodies" nach Reinigung des
Proteins an einer Ni-NTA Matrix. Das Molekulargewicht des rekombinanten
Silicateins ist etwa 33 kDa. Am linken Rand sind die Molekulargewichtsmarker
angegeben.
(A) Konzentration an Transkripten für Silicatein in Primmorphen von S. domuncula.
Primmorphe, die nach 5-tägiger Inkubation aus Einzelzellen gebildet worden waren,
wurden für 0 (Kontrollen; Kon) bis 5 Tage entweder in Abwesenheit von exogenem
Silikat (minus Silikat) oder in Anwesenheit von 60 µM Na-Silikat (plus Silikat)
inkubiert. Anschließend wurde die RNA extrahiert und 5 µg der Gesamt-RNA nach
ihrer Größe aufgetrennt; nach dem Blot-Transfer wurde die Hybridisierung mit der
Silicatein-Sonde von S. domuncula (SUBDOSILICA) durchgeführt. (B) Effekt von
rekombinantem Myotrophin auf die Expression von Silicatein in Primmorphen.
Primmorphe wurden für 0 (Kontrollen) bis zu 5 Tagen in Abwesenheit (minus
Myotrophin) oder Gegenwart von 1 µg/ml Myotrophin (plus Myotrophin) inkubiert.
Dann wurde das Northern-Blotting mit der SUBDOSILICA-Sonde zur Bestimmung
des Ausmaßes der Expression von Silicatein durchgeführt.
Co-Expression von Silicatein und einem Gen, das für eine bioaktive Substanz
codiert (Schema). A. Herstellung des Fusionsproteins Silicatein-bioaktives Protein.
Die beiden cDNAs [Silicatein und bioaktives Protein] wurden über eine
Restriktionsstelle (z. B. SalI) ligiert und anschließend in die Restriktionsstellen
BamHI und HindIII des pQE-30-Vektors eincloniert. Am 5'-Terminus befindet sich
das Histidin-Tag. B. Getrennte Protein-Expression. Die beiden cDNAs werden in
einem geeigneten Vektor über eine Protease-Spaltstelle eincloniert. Nach
Expression und Reinigung wird das Fusionsprotein durch Protease-Verdau getrennt
erhalten. C. Getrennte Protein-Expression (als Kassetten-Expression). Die beiden
cDNAs werden auf dem gleichen Konstrukt separat exprimiert und über die His-Tags
gereinigt.
Claims (15)
1. Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und
Silikate), Siloxanen oder anderen Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)-
oder Blei (IV)-]-Verbindungen (einschließlich sogenannter Sila-Pharmaka)
sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen mit Hilfe von rekombinantem
Silicatein, das durch Expression in Bakterien oder anderen Organismen oder
Zellen unter Verwendung der Silicatein-cDNA- oder der Silicatein-Gen-Sequenz
aus marinen Schwämmen oder anderer silikatbildenden Organismen
hergestellt wurde.
2. Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und
Silikate), Siloxanen oder anderen Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)-
oder Blei (IV)-]-Verbindungen (einschließlich sogenannter Sila-Pharmaka)
sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen mit Hilfe von Silicatein, das
aus marinen Schwämmen oder anderen silikatbildenden Organismen mit Hilfe
eines affinitätschromatographischen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet
ist, das ein spezifischer Antikörper oder ein spezifisch Silicatein-bindendes
Protein an einer festen Phase immobilisiert wird.
3. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Silicatein-Konstrukten in Form
von (a) Fusionsproteinen (chimäre Proteine), (b) getrennte Protein-Expression
(Protease-Spaltstelle) oder (c) getrennte Protein-Expression (Kassetten-Expression),
wobei eine mit einer cDNA, die für ein anderes Protein codiert,
ligierte Silicatein-cDNA-Sequenz verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß zur Synthese Tetraalkoxysilane, Trialkoxysilanole, Dialkoxysilandiole,
Monoalkoxysilantriole, Alkyl- oder Aryl-Trialkoxysilane, Alkyl- oder
Aryl-Dialkoxysilanole oder Alkyl- oder Aryl-Monoalkoxysilandiole oder die
entsprechenden (Alkyl- oder Aryl-substituierten) Alkoxyverbindungen von
Gallium (IV), Zinn (IV) oder Blei (IV) als Substrate eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß durch Verwendung definierter Mischungen der in Anspruch 4
genannten Verbindungen Mischpolymere definierter Zusammensetzung
hergestellt werden.
6. Verfahren zur Immobilisierung von rekombinantem oder aus natürlichen
Quellen gereinigtem Silicatein oder Silicatein-Fusionsproteinen auf
Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren
oder anderen Materialien und Verwendung zur Synthese von amorphem
Siliciumdioxid (Kieselsäuren und Silikate), Siloxanen oder anderen Silicium
(IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)- oder Blei (IV)-]-Verbindungen einschließlich
Mischpolymeren.
7. Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine als Anker-Molekül
fungierende und eine funktionelle Gruppe enthaltene Substanz kovalent oder
nicht-kovalent an eine Festphase gebunden wird und anschließend in einer
enzymatischen Reaktion mit Hilfe von rekombinantem oder aus natürlichen
Quellen gereinigtem Silicatein oder Silicatein-Fusionsproteinen mit Oligo- und
Polysilikaten und anderen Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)- oder Blei
(IV)-]-Verbindungen modifiziert wird.
8. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5 zur
Oberflächen-Modifikation von technischen Materialien sowie von
Biomaterialien mit dem Ziel der Veränderung von deren Oberflächen-
Eigenschaften einschließlich Protein-Bindungsvermögen, Hydrophobizität der
Oberflächen-Kontakt-Zone, Spezifität, Beständigkeit und Biokompatibiltät.
9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5 zum
Einkapseln von Biomolekülen, Pharmaka oder anderen bioaktiven Substanzen
in Silicatein-synthetisierte Siliciumdioxid (SiO2)-Hüllen oder Hüllen aus
Silicatein-synthetisierten Siloxanen oder anderen Silicium (IV)-Verbindungen
[oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)- oder Blei (IV)-Verbindungen], um deren
biologische und pharmakologische Eigenschaften oder deren Freisetzung
(kontrolliertes "Drug-delivery") zu verändern.
10. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5 zum
Einkapseln von Zellen oder Geweben bei Transplantationen.
11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5 zur
Oberflächen (Kontaktzonen)-Behandlung von (Silicium oder Germanium)-
Halbleiter-Materialien oder (Silicium- oder Germanium)-Biosensor-Chips.
12. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5 zur
Synthese von Silicium-haltigen Mineralien, Edelsteinen und Halbedelsteinen.
13. Veränderung der Eigenschaften von Zellen oder Organismen durch
Transfektion mit einem Silicatein-Gen/cDNA-enthaltenden Plasmid.
14. Verwendung von rekombinantem Silicatein, rekombinanten Silicatein-Fusionsproteinen
oder aus marinen Schwämmen oder anderen silikatbildenden
Organismen gereinigtem Silicatein oder von Silikat-produzierenden
Organismen oder von gentechnologisch veränderten Silikat-produzierenden
Organismen zur Synthese spezifischer zwei- und dreidimensionaler
Nano-Strukturen (sieb-, netz-, käfig- oder andersartig geformter Strukturen) aus
amorphem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und Silikate), Siloxanen oder anderen
Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)- oder Blei (IV)-]-Verbindungen zur
Anwendung in der Nanotechnologie.
15. Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und
Silikate), Siloxanen oder anderen Silicium (IV)- [oder Gallium (IV)-, Zinn (IV)-
oder Blei (IV)-]-Verbindungen mit Hilfe von solchen Organismen und Zellen, die
natürlicherweise kein Silikat produzieren und gentechnologisch dahingehend
verändert wurden, daß sie zu deren Synthese befähigt sind.
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Owner name: NANOTECMARIN GMBH, 55128 MAINZ, DE |
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Inventor name: LORENZ, BERND,DR., 39108 MAGDEBURG, DE Inventor name: SCHROEDER, HEINZ.,PROF.DR.DR., 65189 WIESBADEN, DE Inventor name: MUELLER, WERNER E.G. PROF.DR., 65203 WIESBADEN, DE Inventor name: KRASKO, ANTOLI,DR., 55116 MAINZ, DE |
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