DE69619808T2 - Chimäre msp und daf proteine mit einem telloberflächenlokalisierendem domän - Google Patents
Chimäre msp und daf proteine mit einem telloberflächenlokalisierendem domänInfo
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf Fusionsproteine, die Sequenzen von Komplementinhibitoren-Membran-Cofaktor-Protein (hier als "MCP" bezeichnet) und Zerfalls-beschleunigender Faktor (hier als "DAF" bezeichnet) enthalten, wobei die Fusionsproteine auch mindestens eine Zelloberflächenlokalisierungsdomäne enthalten.
- Das Komplement ist ein bedeutender Abwehrmechanismus, um infektiöse Mittel abzuwehren. Das Komplement lenkt Mikroorganismen und andere Antigene zu Komplement- Rezeptor-tragenden Zellen, rekrutiert phagocytäre Zellen in dem Bereich, wo die Komplementaktivierung und der Abbau der Zielmembran stattfindet.
- Das Komplement besteht aus einer Kaskade von über 30 Proteinen und wird während einer Entzündung angeschaltet. Es sind die Komplementkomponenten C3a, C4a und C5a, die die Freisetzung von Entzündungsmediatoren aus Mastzellen auslösen, eine glatte Muskelkontraktion induzieren, die Blutgefäßpermeabilität erhöhen und Neutrophile rekrutieren. In einigen Fällen ist die Entzündung und die begleitende Aktivierung des Komplements schädigend für Wirtsgewebe. Sepsis, Erwachsenen-Atemnot-Syndrom (Adult Respiratory Distress Syndrome, hier als "ARDS" bezeichnet), Reperfusionsverletzung und Verbrennungen gehören zu den klinisch signifikanten Bedingungen, bei denen eine Vervielfachung der Komplementaktivierung zu Gewebeschäden führt.
- Das Komplement wird zum Teil durch sechs Proteine reguliert, die eine eng verwandte Primärsequenzstruktur aufweisen, einschließlich des Membran-Cofaktor-Proteins (Membrane Cofactor Protein, hier als "MCP" bezeichnet) und eines Zerfalls-beschleunigender Faktor (Decay Accelerating Factor, hier als "DAF" bezeichnet). Die MCP- und DAF-codierenden Gene und vier Gene von komplementregulierenden Proteinen wurden am langen Arm des menschlichen Chromosoms 1, Bande 1q32, lokalisiert. Alle sechs dieser Proteine haben ein gemeinsames strukturelles Motiv mit einer ungefähr 60 Aminosäuren-Konsensuseinheit oder einer kurzen Konsensuswiederholung (hier als "SCR" bezeichnet) und kommen in vier angrenzenden Kopien in MCP und DAF vor. Obwohl die SCRs nicht vollständig identisch in der Sequenz sind, haben sie invariante Cysteine an vier Positionen und bis zu 18 hoch-konservierte Stellen, die über den Rest der Sequenz verteilt sind.
- MCP (auch bekannt als "CD46") kommt auf der Zelloberfläche einer Reihe von Zelltypen vor, einschließlich peripherer Blutzellen (ohne Erythrozyten), epithelialer, endothelialer und Fibroblasten-Zelllinien, Trophoblasten und Sperma. MCP hat vier SCR-Sequenzen und eine mit Serin/Threonin angereicherte Region, in der vielfach O-gebundene Glykosylierung stattfindet. MCP hat auch eine Transmembran und cytoplasmatische Domäne. MCP bindet an C3b und C4b, die sich auf der Zelloberfläche befinden, um so das Protein für den Abbau durch Faktor I, einer plasmatischen Protease, zu binden und dadurch eine C3- oder C4-Konvertaseaktivität zu zerstören. Somit sagt man bei MCP auch, dass es eine "Cofaktor-Aktivität" hat. Da MCP auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, schützt es nur solche Zellen, bei denen es gegenwärtig ist und man sagt daher, dass es auf eine innere Art und Weise funktioniert. Die Sequenz einer cDNA, die für das menschliche MCP codiert, wurde von Lublin et al., J. Exp. Med., (1988) 168: 181- 194 beschrieben.
- DAF befindet sich auf der Zelloberfläche bei einer Reihe von Zelltypen, einschließlich peripherer Blutzellen (einschließlich Erythrozyten), epitheliale, endotheliale und Fibroblasten- Zelllinien, Trophoblasten und Sperma. DAF reguliert die Komplementfunktion über die "Zerfalls-beschleunigende Aktivität". Demnach bindet DAF an C4b/C2a und an C3b/Bb und destabilisiert die Assoziation von C2a oder Bb (die Proteasekomponente), um somit die C3- Konvertaseaktivität zu zerstören. Für DAF wurde auch berichtet, dass er mit der Bildung von C4b/C2a- und C3b/Bb-Komplexen interferiert. Gleich wie bei MCP reguliert DAF das Komplement in einer inneren Art und Weise und schützt daher nur solche Zellen, auf denen DAF lokalisiert ist.
- Die Sequenz der cDNA, die für humanes DAF codiert, wurde von Medof et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 2007 und durch Caras et al., Nature, (1987) 325: 545-549 beschrieben. Gleich wie MCP, hat DAF vier SCR-Sequenzen und eine mit Serin/Threonin angereicherte Region, in der zahlreiche O-gebundene Glykosylierung stattfinden. DAF hat eine Zelloberflächen-Lokalisierungsdomäne an seinem carboxyterminalen Ende, an dem ein Glykophosphatidylinositol-Anteil (hier als "GPI" bezeichnet) covalent gebunden ist. Das GPI verbindet DAF mit den Zelloberflächen und ermöglicht sogar eine Wiederbindung von DAF an die Zelloberflächen, nachdem die Zellmembranen mit Detergens solubilisiert wurden. Caras et al. berichten von der Entdeckung von zwei mRNAs, die für DAF codieren. Eine Art codiert DAF mit der Zelloberflächen-Lokalisierungsdomäne. Die zweite Art trägt 10% der DAF-mRNA bei und scheint eine sekretierte Form von DAF zu codieren, bei der die Zelloberflächen- Lokalisierungsdomäne, an die der GPI-Anker gebunden ist, fehlt.
- Diese Zelloberflächen-Lokalisierungsdomäne scheint für die optimale Funktion von DAF von Bedeutung zu sein. Patienten mit paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie fehlen die GPI-verankerten Proteine und diese Defizienz kommt dadurch zustande, dass deren Blutzellen für die Lyse durch Komplement anfänglich sind. Darüber hinaus haben Moran et al., J. Immunol., (1992) 149: 1736-1743 gezeigt, dass das rekombinante DAF mit voller Länge und das rekombinante DAF, bei dem die Zelloberflächen-Lokalisierungsdomäne (seDAF) fehlt, beide Zellen gegen das Komplement schützen, aber dass der mDAF 50mal mehr Wirkung zeigte als das seDAF. Der mDAF muss jedoch in die Zelloberflächenmembranen eingelagert sein, um die höhere Aktivität zu haben und es scheint, dass Serumlipoproteine mit dieser Einlagerung interferieren. Diese Entdeckung bringt Moran und andere zu der Schlussfolgerung, dass der seDAF das bevorzugte Molekül für klinische Anwendungen sein wird.
- Lublin und Coyne, J. Exp. Med. (1991) 174: 35-44 verglichen die Aktivität von DAF, MCP und Varianten von DAF und MCP, bei denen die Zelloberflächenmembranen- Lokalisierungsdomänen von DAF und MCP (der GPI-Anker von DAF und die Transmembran(TM)-Domäne von MCP) ausgetauscht worden sind. Interessanterweise zeigen DAF und die DAF/MCP-TM-Variante ungefähr die gleiche Komplement-Hemmaktivität. Gleicherweise zeigen das MCP und die MCP/DAF-GPI-Ankervariante ungefähr die gleiche Komplement-Hemmaktivität in vitro.
- Hybridkomplement-Regulationsproteine, die DAF und MCP in einem einzigen Polypeptid enthalten, sind offenbart worden. Siehe z.B. Iwata et al., J. Immunol., (1994) 152: 3436-3444. Iwata et al. offenbart, dass die MCP-DAF-Hybride bei der Inhibition der C3-Ablagerung über den alternativen Weg effektiver sind als DAF, MCP oder DAF und MCP. Das MCP-DAF- Hybrid war bei der Inhibition der C3-Ablagerung über den klassichen Weg auch effektiver als MCP allein.
- Die vorliegende Erfindung stellt chimäre Proteine zur Verfügung, in welchen MCP, DAF und MCP-DAF-Hybride mit Zelloberflächen-Lokalisierungsdomänen hergestellt werden, welche Moleküle an die Zelloberflächen lenken und dadurch die Konzentration dieser Moleküle an den Zelloberflächen erhöhen, damit sie so die Komplement-vermittelte Zelllyse hemmen können. Es wird anerkannt, dass solche Moleküle für die Prävention und Behandlung von Krankheitszuständen, in denen das Komplement bei der Verursachung des Krankheitszustandes eine Rolle spielt, nützlich sind.
- Fig. 1 ist eine DNA-Sequenz, die eine codierende Region eines MCP-DAF- Hybridmoleküls enthält.
- Die chimären Proteine der Erfindung umfassen:
- a) ein Hybrid, umfassend einen Membran-Cofaktor-Protein(MCP)-Teil, gebunden an einen Zerfalls-beschleunigender-Faktor(DAF)-Teil, wobei jeder Teil eine Komplementhemmwirkung besitzt, und
- b) ein Gewebsfaktor-Stoffwechselweg-Inhibitor(TFPI)-Peptid, wobei das Peptid die Fähigkeit, Glykosaminoglykan zu binden, besitzt und an das aminoterminale Ende des carboxyterminalen Endes des Hybrids gebunden ist.
- Die hier benutzte Bezeichnung "MCP" bedeutet ein Protein, das Komplement- Hemmaktivität des reifen MCP besitzt, so wie es in Lublin et al., Fig. 1 auf Seite 182 offenbart ist. (Assays zur Bestimmung der Komplement-Hemmaktivität von Proteinen, die eine MCP- Sequenz enthalten, siehe unten in Beispiel 5).
- Für den Fachmann ist es naheliegend, dass die vollständige Aminosequenz, wie sie von Lublin et al. offenbart wurde, nicht für die Komplement-Hemmaktivität notwendig ist. Danach können Teile der reifen MCP-Sequenz deletiert werden und das Protein behält trotzdem seine Komplement-Hemmaktivität. Beispiele für Teile von MCP, die deletiert werden konnten, schließen den cytoplasmatischen Schwanz und die Transmembrandomäne ein. Natürlich vorkommende allele Varianten, die Aminosäuresubstitutionen enthalten und die Komplement- Hemmaktivität behalten, sind genauso wie die artifiziell hergestellten Mutanten von MCP (das ist MCP mit 1 bis 5 Aminosäuresubstitutionen) in diese Definition mit eingeschlossen. Natürlich vorkommende und artifiziell hergestellte Varianten von MCP, wie solche, die in Liszewski et al., Ann. Rev. Immunol., (1991) 4: 431-455 und in WO 91/18097 beschrieben wurden, sind auch in der Definition von MCP mit eingeschlossen. Die Offenbarungen von Liszewski et al. und von WO 91/18097 sind hier als Referenz mit einbezogen. Ein in den Molekülen der Erfindung verwendbarer Teil von MCP ist:
- Der hier verwendete DAF bedeutet ein Protein, das Komplement-Hemmaktivität des reifen DAF besitzt, so wie es in Caras et al. in Fig. 1a auf Seite 546 offenbart ist.
- Es ist für den Fachmann naheliegend, dass die vollständige Aminosäuresequenz, so wie sie von Caras et al. offenbart wurde, nicht für die Komplement-Hemmaktivität notwendig ist. Danach können Teile der reifen DAF-Sequenz deletiert werden und das Protein behält trotzdem seine Komplement-Hemmaktivität. Beispiele, in denen Teile von DAF deletiert werden konnten, schließen die GPI-Ankerdomäne mit ein. Natürlich vorkommende allele Varianten, die Aminosäuresubstitutionen enthalten und die Komplement-Hemmaktivität behalten, sind genauso wie die artifiziell hergestellten mutierten Proteine von DAF (das ist DAF mit 1 bis 5 Aminosäuresubstitutionen) in dieser Definition mit eingeschlossen. Beispiele von mutierten Proteinen können EP 0 244 267 entnommen werden. Natürlich vorkommende Varianten, z.B. die sekretierten Varianten, wie sie von Caras et al. beschrieben wurden, sind in dieser Definition von DAF mit eingeschlossen. Ein in den Molekülen dieser Erfindung verwendbarer Teil von DAF ist:
- MCP-DAF-Hybride, wie sie hier benutzt werden, bedeuten Polypeptide, die MCP und DAF enthalten, so wie sie in diesem Abschnitt definiert wurden. Z.B. können MCP-DAF- Hybride die vollständige Sequenz beider Moleküle enthalten oder sie können nur die SCR- Regionen von jedem MCP und DAF enthalten. Ein Beispiel für ein MCP-DAF-Hybrid ist das Molekül, das durch Iwata et al., a.a.O., offenbart wurde und bei dem die ersten 250 Aminosäuren von MCP covalent an DAF gebunden sind. Sequenzen, welche die MCP- und DAF-Teile voneinander trennen, können auch enthalten sein. Das MCP-DAF-Hybridmolekül kann auch die folgende Aminosäuresequenz haben:
- Die chimären Proteine der Erfindung schließen Proteine mit Sequenzen, welche die Komplementfunktion hemmen, und Sequenzen, welche an die Glykosaminglykane, die sich auf der Zelloberfläche befinden, speziell Heparin, mit ein. Sequenzen, welche die Komplementfunktion hemmen, sind MCP, DAF und MCP-DAF-Hybride. Diese Peptidsequenzen besitzen bevorzugt die Fähigkeit, Glykosaminglykan zu binden.
- Peptidsequenzen, welche die Fähigkeit haben, Glykosaminglykan zu binden, können von Proteinen stammen, welche Heparin binden, einschließlich des Gewebsfaktor-Stoffwechselweg- Inhibitors (hier als "TFPI" bezeichnet) (auch bekannt als LACI, TFI und EPI).
- Im Falle von TFPI kann der geeignete Teil Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met (SEQ ID NO: 15) sein.
- Der Fachmann wird die verschiedenen Deletionen und Substitutionen anerkennen und Insertionen können von den oben aufgelisteten Sequenzen gemacht werden, ohne hierbei grundlegend die Fähigkeit der Sequenzen, an Heparin zu binden, zu beeinträchtigen. Solche Modifikationen der oben aufgelisteten Sequenzen sollen so verstanden werden, dass sie in den Schutzumfang der Erfindung fallen.
- Der Fachmann auf dem Gebiet der DNA-Clonierung und der im Besitz der DNA ist, die für MCP, DAF und eine Zelloberflächen-Lokalisierungsdomäne codiert, wird fähig sein, geeignete DNA-Moleküle für die Herstellung von solchen chimären Proteinen unter Verwendung der bekannten Clonierungsverfahren (z.B. Restriktionsenzymverdauung von MCP, DAF oder Zelloberflächen-Lokalisierungsdomänen-codierender DNA, Exonukleaseverdauung, Ligation und andere geeignete Verfahren), die im Folgenden genannt sind, zu präparieren: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA CLONING, Bd. I und II, D.N. Glover Hrsg. (IRL Press, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, M.J. Gait Hrsg. (IRL Press, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. (IRL Press, 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION, B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. (IRL Press, 1984); ANIMAL CELL CULTURE; R.I. Freshney Hrsg. (IRL Press, 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES, K. Mosbach (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, Wiley (1984); die Reihen, METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, Inc.; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, J.H. Miller und M.P. Calos Hrsg. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); METHODS IN ENZYMOLOGY, Bd. 154 und 155, Wu und Grossmann, Hrsg., bzw. Wu, Hrsg. (Academic Press, 1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, R.J. Mayer und J.H. Walker, Hrsg. (Academic Press London, Harcourt Brace U.S., 1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 2. Ausg. (Springer-Verlag, N.Y. (1987)) und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Bd. I-IV, D.M. Weir et al., (Blackwell Scientific Publications, 1986); Kitts et al., Biotechniques, (1993), 14: 810-817; Munemitsu et al., Mol. Cell. Biol., (1990) 10: 5977-5982. Alternativ kann die vollständige Sequenz oder Teile der Nukleinsäuresequenz, die für die oben beschriebenen Proteine codieren, durch synthetische Methoden (z.B. Verwendung von DNA-Synthesemaschinen) hergestellt werden. Schließlich ist die Verwendung von PCR-Techniken, speziell der überlappenden PCR, wie sie in PCR-PROTOKOLLEN: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis, Gelfand, Sninsky und White (Hrsg.) (Academic Press, 1990) beschrieben sind, eine bevorzugte Methode, um Nukleinsäuremoleküle, die für die beschriebenen chimären Proteine codieren, herzustellen.
- Die oben beschriebenen Proteine können durch geeignete Expressionssysteme einschließlich, aber ohne Beschränkung auf die folgenden Expressionssysteme hergestellt werden: Säugetier-Gewebekultur, Insektenzellkultur, bakterielle Zellkultur und Hefezellkultur. Es soll hierbei so verstanden werden, dass sich die Proteine der Erfindung als Vorläufermoleküle innerhalb der Zellen befinden, die innerhalb der Zellen geschnitten werden können, um so das gewünschte Proteine zu erhalten. Alternativ können die Vorläuferproteine den Zellen entnommen werden und weiter verarbeitet werden, um so das gewünschte Protein zu erhalten. Säugetier-Expressionssysteme sind auf dem Gebiet bekannt. Sambrook et al., "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Säugetierzelllinien als Wirte für die Expression sind auf dem Gebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, mit ein.
- Die Proteine der Erfindung können auch in Insektenzellen hergestellt werden unter Verwendung eines Vektors, der Baculovirussequenzen enthält. Materialien und Methoden für das Baculovirus/Insektenzell-Expressionssystem sind kommerziell in Kitform von, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Kit) erhältlich. Diese Techniken sind allgemein den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und vollständig in Summers and Smith, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987) (hier als "Summers and Smith") beschrieben. In letzter Zeit am meisten verwendeter Transfervektor, um fremde Gene in AcNPV einzuführen, ist pAc373. Viele andere Vektoren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wurden ebenfalls entworfen. Diese schließen z.B. pVL985 (der das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT verändert, und der eine BamHI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts des ATT einführt; siehe Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31), mit ein. Methoden, um heterologe DNA an der gewünschten Stelle im Baculovirus einzufügen, sind auf dem Gebiet bekannt. (Siehe Summers und Smith; a.a.O; Ju et al., (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol., (1983) 3: 2156; und Luckow und Summers (1989), a.a.O). Z.B. kann die Insertion in ein Gen, wie z.B. das Polyhedringen, durch homologe doppelte Crossover-Rekombination erfolgen; die Insertion kann auch über eine konstruierte Restriktionsenzymstelle im gewünschten Baculovirusgen erfolgen. Miller et al., Bioessays (1989) 4: 91. Die DNA-Sequenz, die an der Stelle des Polyhedringens im Expressionsvektor cloniert wurde, wird sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende durch Polyhedrin-spezifische Sequenzen flankiert und befindet sich stromabwärts des Polyhedrinpromotors.
- Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Infektion in mehreren Insektenzellen entwickelt. Z.B. wurden rekombinante Baculoviren für unter anderem: Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT Pub. Nr. WO 89/046699; Carbonell et al., J. Virol. (1985) 56: 153; Wright, Nature (1986) 321: 718; Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156 entwickelt; und siehe allgemeiner Fraser, et al., Cell. Dev. Biol., (1989) 25: 225. Zellen und Zell-Kulturmedien sind sowohl für eine direkte als auch für eine Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressionssystem kommerziell erhältlich; die Zellkulturtechnologie ist den Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Siehe z.B. Summers and Smith, a.a.O. Die modifizierten Insektenzellen könnten dann in einem geeigneten Nährmedium, das eine stabile Erhaltung der/des Plasmide(s) in dem modifizierten Insektenwirt ermöglicht, kultiviert werden. Ein solches Nährmedium ist in EP 380 495 beschrieben.
- Zahlreiche bakterielle Expressionstechniken sind auf dem Gebiet bekannt. Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli". In MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
- Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, wurden für die Transformation in viele Bakterien entwickelt. Z.B. wurden Expressionsvektoren entwickelt, unter anderem für die folgenden Bakterien: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1982) 79: 5582; EP 036 259 und 063 953; PCT WO 84/04541), E. coli (Shimatake et al., Nature, (1981) 292: 128; Amann et al., Gene (1985) 40: 183; Studier et al., J. Mol. Biol., (1986) 189: 113; EP Publ. Nrn. 036 776, 136 829 und 136 907), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., (1988) 54: 655); Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., (1988) 54: 655), Streptomyces lividans (U.S. Patent Nr. 4 745 056).
- Die DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, kann zum Export oder zur Sekretion des reifen Proteins in dem periplasmatischen Raum von Bakterien, unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet üblich sind, mit einem Signalpeptid verbunden sein. Darüber hinaus kann die Transkription und Translation in einem bakteriellen Expressionssystem weiter optimiert werden, indem der Platz zwischen der DNA, die exprimiert werden soll, und den Sequenzen, die für den Promotor und die Ribosomenbindestelle codieren, variiert wird.
- Hefeexpressionssysteme sind auch auf dem Gebiet bekannt. Fusionsproteine stellen auch ein Mittel für die Expression von Proteinen der Erfindung in Hefesystemen zur Verfügung. Normalerweise wird eine DNA-Sequenz, die für den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende einer heterologen codierenden Sequenz fusioniert. Nach der Expression erhält man mit diesem Konstrukt eine Fusion der zwei Aminosäuresequenzen. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann oder kann keine Schnittstelle codieren. Siehe z.B. EP 196 056. Ein solches Fusionsprotein ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Solch ein Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die eine Stelle für ein bearbeitendes Enzym enthält, welche es einer Ubiquitin-spezifischen Bearbeitungs-Protease erlaubt, das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuschneiden. Durch diese Methode ist es daher möglich, ein fremdes Protein mit einem authentischen Aminoterminus aus der Hefezelle zu isolieren. Die Herstellung von Ubiquitin-Fusionsproteinen ist in der gleichzeitig anhängenden Anmeldung des U.S. Patentes Serial Nrn. 07/806 813 und 07/957 627 beschrieben. Eine Übersicht dieser Methode ist in Barr et al., in RECOMBINANT SYSTEMS IN PROTEIN EXPRESSION (Elsevier Science Publishers B.V., 1991), Seiten 37 bis 46 beschrieben.
- Alternativ können die fremden Proteine in das Wachstumsmedium von der Zelle ausgeschieden werden, indem chimäre DNA-Moleküle gebildet werden, die für ein Fusionsprotein codieren, das ein Leader-Sequenzfragment umfasst, das die Ausscheidung des fremden Proteins in Hefe ermöglicht. Es können Bearbeitungs-Stellen existieren, die zwischen dem Leader- Fragment und dem fremden Gen codiert sind, welche entweder in vivo oder in vitro geschnitten werden können. Das Leader-Sequenzfragment codiert gewöhnlicherweise für ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht und die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuert.
- DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, stammt von Genen für sekretierte Hefeproteine, beispielsweise dem Hefe-Invertasegen (EP 012 873; JPO 62 096 086), dem α- Faktor-Gen (U.S. Patent Nrn. 4 588 684 und 4 870 008; EP 116 201) und verkürzten Versionen des α-Faktor-Gens, wie sie in EP 324 274 und der co-anhängigen Anmeldung U.S. Patent Serial Nr. 07/864 206 beschrieben wurden. Alternativ gibt es Leader aus einer Nicht-Hefe-Quelle, beispielsweise ein Interferon-Leader, die auch zur Sekretion in Hefe zur Verfügung stehen (EP 060 057). Das α-Faktor-Gen kann auch in Nukleinsäurekonstrukten verwendet werden, die für die Sekretion der Proteine der Erfindung entworfen worden sind.
- Eine andere nutzvolle Klasse von Sekretions-Leadern sind jene, die ein Fragment des Hefe-α-Faktor-Gens benutzen, das sowohl eine "Vor"-Signalsequenz als auch eine "Pro"- Region enthält. Die Arten der α-Faktor-Fragmente, die benutzt werden können, schließen den pre-pro-α-Faktor-Leader mit voller Länge (ungefähr 83 Aminosäurereste) und verkürzte α- Faktor-Leader (gewöhnlicherweise ca. 25 bis ca. 50 Aminosäurereste) (U.S. Patent Nrn. 4 546 083 und 4 870 008; EP 324 274) mit ein. Zusätzliche Leader, die ein α-Faktor-Leader- Fragment verwenden, das für eine Sekretion sorgt, schließen Hybrid-α-Faktor-Leitmittel mit ein, die aus einer Presequenz einer ersten Hefe und einer Proregion aus einem zweiten Hefe-α- Faktor hergestellt wurden (siehe z.B. PCT WO 89/02463).
- Expressionsvektoren, die für die Proteine der Erfindung codieren, werden oft in einem Replikon gehalten, beispielsweise einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmid), um in einem Wirt, beispielsweise Hefen oder Bakterien, stabil erhalten zu bleiben. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme enthalten, die es ermöglichen, dass es z.B. in der Hefe für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Ampflifizierung erhalten bleibt. Beispiele von solchen Hefe-Baktieren-Pendelvektoren schließen YEp24 (Botsten et al., Gene, (1979) 8: 17-24), pCl/1 (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81: 4642-4646) und YRp17 (Stinchcomb et al., J. Mol. Biol., (1982) 158: 157) mit ein. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Die Kopienzahl eines Plasmids mit hoher Kopienzahl wird sich im Allgemeinen zwischen ca. 5 und ca. 200 und üblicherweise zwischen ca. 10 und ca. 150 bewegen. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, wird mindestens ca. 10 und kann mindestens ca. 20 Kopien enthalten. Es kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden, was von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt abhängig ist. Siehe z.B. Brake et al., a.a.O. Für die Herstellung von Proteinen der Erfindung in einer Hefezelle, in der das Protein in der Hefezelle zurückgehalten wird, kann ein Plasmid, wie z.B pAB24, benutzt werden. Sabin et al. Bio/Technology, (1989) 7: 705-709. pAB24 enthält einen GAP/ADH-Hybridpromotor, der zum Einen Teile eines ADH-Promotors enthält, welcher eine hohe Expression der Sequenzen unter seiner Kontrolle ermöglicht, der zum Anderen aber auch GAP-Regulationssequenzen enthält, die es ermöglichen, dass dieselbe Sequenz zu einem gewünschten Stadium während des Wachstums einer Kultur exprimiert wird.
- Alternativ können die Expressionskonstrukte in das Wirtsgenom mit einem Integrationsvektor integriert werden. Integrationsvektoren enthalten gewöhnlicherweise mindestens eine Sequenz, die homolog zu einem Wirtschromosom ist, was die Integration des Vektors ermöglicht, und sie können zwei homologe Sequenzen enthalten, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen sind das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologer DNA des Vektors und dem Wirtschromosom. Orr-Weaver et al., Meth. Enzymol., (1983) 101: 228-245. Ein Integrationsvektor kann an einen spezifischen Lokus in der Hefe geleitet werden, indem geeignete homologe Sequenzen für den Einschluss in den Vektor ausgewählt werden. Siehe Orr-Weaver et al., a.a.O. Es können ein oder mehrere Expressionskonstrukte integriert werden, was möglicherweise die Menge der hergestellten rekombinanten Proteine beeinflusst. Rine et al., Proc. Nah. Acad. Sci. USA, (1983) 80: 6750. Die chromosomalen Sequenzen, die in den Vektor eingeschlossen sind, können entweder als einzelnes Segment im Vektor vorkommen, was die Integration des vollständigen Vektors bewirkt, oder sie können als zwei Segmente vorkommen, die homolog zu benachbarten Segmenten im Chromosom sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was eine stabile Integration von ausschließlich dem Expressionskonstrukt bewirkt.
- Gewöhnlicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte Selektionsmarker enthalten, die eine Auswahl der Hefestämme, die transformiert worden sind, ermöglichen. Selektionsmarker schließen biosynthetische Gene mit ein, die im Hefewirt exprimiert werden können, beispielsweise ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, sowie das G418-Resistenzgen, das den Hefezellen eine Resistenz gegenüber Tunicamycin bzw. G418 verleiht. Zusätzlich kann ein geeigneter Selektionsmarker den Hefen die Fähigkeit verleihen, in der Gegenwart von toxischen Substanzen, wie z.B. Metall, zu wachsen. Z.B. ermöglicht es die Gegenwart von CUP1, dass die Hefen in der Gegenwart von Kupferionen wachsen (Butt et al., Microbiol. Rev. (1987) 51: 351).
- Alternativ können einige der oben beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengestellt werden. Transformationsvektoren umfassen gewöhnlicherweise einen Selektionsmarker, der entweder in einem Replikon gehalten wird, oder wie oben beschrieben in einem Integrationsvektor entwickelt wird.
- Für die Transformation in viele Hefen wurden Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replikons oder Integrationsvektoren, entwickelt. So wurden z.B. Expressionsvektoren unter anderem für die folgenden Hefen entwickelt: Candida albicans (Kurtz, et al., Mol. Cell. Biol., (1986) 6: 142), Candida maltosa (Kunze, et al., J. Basic Microbiol., (1985) 25: 141), Hansenula polymorpha (Gleeson, et al., J. Gen. Microbiol., (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., (1986) 202: 302), Kluyveromyces fragilis (Das, et al., J. Bacteriol., (1984) 158: 1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol., (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology, (1990) 8: 135), Pichia guillerimondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol., (1985) 25: 141), Pichia postoris (Cregg, et al., Mol. Cell. Biol., (1985) 5: 3376; U.S. Patent Nrn. 4 837 148 und 4 929 555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol., (1983) 153: 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, (1981) 300: 706) und Yarrowia lipolytica (Davidow, et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380471 und Gaillardin et al., Curr. Genet., (1985) 10: 49).
- Transformationsverfahren, wie sie hier benutzt werden können, um Hefezellen zu transformieren, schließen die Elektroporation, wie sie in "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Bd. 194 METHODS IN ENZYMOLOGY, C. Guthrie und G.R. Fink, (Academic Press 1991) beschrieben wurde, mit ein. Andere Verfahren schließen die Transformation von Spheroblasten oder die Transformation von mit Alkalikationen behandelten intakten Zellen mit ein. Solche Verfahren sind z.B. in Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., (1986) 6: 142; Kunze et al. J. Basic. Microbiol., (1985) 25: 141 für Candida; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., (1986) 132: 3459, Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., (1986) 202: 302 für Hansenula; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol., (1983) 154: 1165; Van den Berg et al., Bio/Technology, (1990) 8: 135 für Kluyveromyces; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985); Kunze et al. J. Basic Microbiol., (1985) 25: 141; U.S. Patent Nrn. 4 837 148 und 4 929 555 für Pichia; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol., (1983) 153: 163 für Saccharomyces; Beach and Nurse, Nature, (1981) 300: 706 für Schizosaccharomyces; Davidow et al., Curr. Genet., (1985) 10: 39; Gaillardin et al., Curr. Genet., (1985) 10: 49 für Yarrowia beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die besonders vorteilhafte Ausführungsarten darstellen, veranschaulicht. Jedoch sollte bemerkt werden, dass diese Ausführungsarten zur Veranschaulichung gedacht sind, und nicht so auszulegen sind, dass die Erfindung in irgendeiner Art und Weise beschränkt wird.
- Ein chimäres Protein wurde konstruiert, umfassend das Protein (SEQ ID NO: 3), ein MCP-DAF-Hybridmolekül mit der folgenden Aminosäuresequenz, die mit dem Carboxyterminalen Ende des MCP-DAF-Hybridmoleküls verbunden ist: Ala-Lys-Arg-Gly-Leu-Arg- Arg-Arg-Leu-Gly-Arg-Lys-Ala (SEQ ID NO: 4). Das chimäre Protein wurde mit Hilfe der überlappenden PCR konstruiert. Die als PCR-Matrize benutzte DNA ist (SEQ ID NO: 17), die für das MCP-DAF-Hybrid (SEQ ID NO: 3) zusammen mit dem MCP-Signalpeptid codiert. Der folgende Primer wurde als Primer für das 3'-Ende verwendet, um (SEQ ID NO: 4) an das Carboxy-terminale Ende des MCP-DAF-Hybridmoleküls einzuführen:
- Als Primer für das 5'-Ende wird verwendet:
- Der Primer für das 5'-Ende hat eine KpnI- und der Primer für das 3'-Ende hat eine Eco- RI-Erkennungsstelle, um die Clonierung der entstandenden DNA in den vorverdauten pAcC13 zu lenken, einem Plasmid, der Baculovirussequenzen enthält, die die Expression der DNA in Insektenzellen ermöglichen. Ein pAcC13-Vektor, der eine PR-3-Sequenz enthält und für das vorliegende Beispiel verwendbar ist, wurde bei der ATCC wie unten beschrieben hinterlegt. Der Fachmann wird erkennen, dass die Einfügung, wie sie bei dem hinterlegten Plasmid vorhanden ist, durch bekannte Methoden des Fachgebietes entfernt werden kann.
- Alternativ kann eine kürzere Heparin-Bindesequenz, Ala-Arg-Arg-Gly-Lys-Leu (SEQ ID NO: 5) an das Carboxy-terminale Ende des MCP-DAF-Hybrids (SEQ ID NO: 3) hinzugefügt werden. In diesem Fall würde der Primer wie folgt sein:
- Wie zuvor hat das 3'-Ende des Primers eine EcoRI-Erkennungsstelle, um die Clonierung der entstandenen DNA in den pAcC13 zu lenken.
- Der Heparin-bindende Schwanz von TFPI kann auch in der Konstruktion der chimären Proteine der Erfindung verwendet werden. In diesem Fall ist der Heparin-bindende Schwanz Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile-Ala-Tyr-Glu-Glu-Ile-Phe-Val-Lys- Asn-Met (SEQ ID NO: 15) an das Carboxy-terminale Ende des MCP-DAF-Hybrids (SEQ ID NO: 3) gebunden. Wie in Beispiel 1 wird die DNA, die für das MCP-DAF-Hybrid zusammen mit dem MCP-Signalpeptid (SEQ ID NO: 17) codiert, als Matrize für die überlappende PCR verwendet und der Primer für das 5'-Ende ist wieder (SEQ ID NO: 19). Der Primer für das 3'- Ende hat die Nukleotidsequenz:
- Der Primer für das 3'-Ende hat eine EcoRI-Erkennungsstelle, die es ermöglicht, die entstehenden PCR-Produkte direkt in den pAcC13 zu clonieren, um ihn in Insektenzellen zu transformieren und zu exprimieren. Alternativ kann die PCR in zwei Runden laufengelassen werden unter Verwendung des folgenden 5'-Primers:
- und des folgenden Primers für das 3-Ende:
- Um die EcoRI-Erkennungsstelle einzuführen, wurde eine zweite PCR-Runde durchgeführt, wobei der gleiche Primer für das 5'-Ende und ein Primer für das 3'-Ende mit der folgenden Sequenz verwendet wurde:
- Menschliches Serum wird in Gelatine-Veronal-Puffer (GVB) (Sigma, St. Louis, MO Katalog #G-6514) verdünnt, so dass ausreichende Mengen an Komplement gewonnen werden, um eine maximale Hämolyse von 70% zu bewirken. Die Verdünnungen reichen von 1 : 10 bis 1 : 120. IgM-sensibilisierte Schaf-rote-Blutzellen(SRBC)-Suspension (Diamedix CH50 Test Kit #789-001) wird in ein Zentrifugationsgefäß transferiert und bei 500 · g für 1 Minute (2 bis 8ºC) zentrifugiert. 2 ml des flüssigen Überstandes werden entfernt und das SRBC in dem verbleibenden 1 ml resuspendiert. Diese Präparation wird dann in einem Eiswasserbad aufbewahrt.
- Das Nachfolgende wird dann zu Doppelvertiefungen einer V-Grund-Mikrotiterplatte hinzugefügt:
- Die Versuche enthalten:
- 100 ul SRBC-Suspension; 50 ul GVB; 50 ul von jeder Serumverdünnung
- Die Negativkontrolle enthält:
- 100 ul SRBC-Suspension; 100 ul GVB
- Die maximale Lysekontrolle enthält:
- 100 ul SRBC-Suspension, die wie oben herunter zentrifugiert wurde und in 200 ul Wasser resuspendiert wurde.
- Die Platte wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden dann einer Zentrifugation bei 500 · g für 1 Minute (2 bis 8ºC) ausgesetzt und 100 ul des entstehenden flüssigen Überstandes werden abgezogen. Die Absorption von jeder Probe wird dann bei 405 nm gemessen. Die Prozente der maximalen Lyse wurden für jede Serumverdünnung entsprechend der Formel:
- {[O.D. Probe-O.D.-Negativkontrolle]/[O.D.-Maximum-O.D.-Negativkontrolle] } · 100 berechnet.
- Die Serumverdünnung, bei der ungefähr 70% der maximalen Lyse erreicht werden, ist die Verdünnung, bei der die nachfolgenden Tests mit den Molekülen der Erfindung durchgeführt werden sollten. Diese Verdünnung wird nur für die spezifische Charge des getesteten Humanserums angewendet und muss für jede neue Charge von Serum wiederholt werden.
- Standardlösungen, welche die Moleküle der Erfindung enthalten, können in GVB bei einer Konzentration von 0,8 uM für die Verdünnung präpariert werden. (Diese Konzentration kann nach unten angepasst werden, abhängig von der Aktivität des bestimmten Moleküls). Standards, die MCP oder MCP-DAF verwenden, können unter Verwendung von 80 uM MCP oder 0,8 uM MCP-DAF zubereitet werden. Es wurden vier 1 : 2-Reihen-Verdünnungen von der Standardlösung präpariert. Die Tests werden dann durch das Hinzufügen der folgenden Bestandteile zu den Doppelvertiefungen einer V-Grund-Mikrotiterplatte durchgeführt:
- Versuche
- 100 ul SRBC-Suspension; 50 ul Standardlösung oder Verdünnung; 50 ul der Serumverdünnung
- Negativkontrolle:
- 100 ul SRBC-Suspension; 50 ul Standardlösung; 50 ul GVB
- Positivkontrolle
- 100 ul SRBC-Suspension, die wie oben herunter zentrifugiert wurde und in 200 ul Wasser resuspendiert wurde.
- Die Platte wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden dann einer Zentrifugation bei 500 · g für 1 Minute (2 bis 8ºC) ausgesetzt, und 100 ul des entstehenden flüssigen Überstandes werden abgezogen. Die Extinktion wird dann für jede Probe bei 405 nm gemessen. Die Prozente der Positivkontrolle der SRBC-Lyse werden für jede Verdünnung entsprechend der Formel:
- {[O.D. Probe-O.D.-Negativkontrolle]/[O.D.-Positivkontrolle-O.D.-Negativkontrolle]} · 100 berechnet. Die Hemmung in % ist 100% - (% Positivkontrolle).
- Standards werden hergestellt, indem die Moleküle der Erfindung in 20 ul Testpuffer (3 mM Natriumphosphat, pH 7,2; 25 mM Natriumchlorid; 0,5% NP-40) bis zu einer Konzentration von ungefähr 6,0 nM verdünnt werden. Es werden dann fünf 1 : 2-Reihen-Verdünnungen hergestellt. Für jeden Test werden 6 ul der seriellen Verdünnungen zu 2 ul der Faktor-I-Lösung und 8 ul iC3-Lösung gegeben. Die Faktor-I-Stammlösung wird hergestellt, indem 1 mg Faktor I (Quidel, Katalog #A411) in 1 ml Testpuffer verwendet wird. Unmittelbar vor der Benutzung werden 4 ul der Faktor-I-Stammlösung zu 50 ul Testpuffer hinzugefügt, um die Faktor-I- Lösung herzustellen. Die iC3-Lösung wird hergestellt, indem 0,5 mg gereinigtes C3 (Quidel, Katalog #A401) in 1 ml Testpuffer verwendet wird. Eine gleiche Menge von 4.0M Kaliumbromid wird hinzugefügt und die iC3-Lösung wird für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, wobei das Gemisch vor Licht geschützt wird.
- Negativkontrollen werden unter Verwendung von: 8 ul iC3-Lösung, 6 ul Testpuffer und 2 ul Faktor-I-Lösung hergestellt. Die Proben werden dann für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt, indem SDS-Probenpuffer (20% Saccharose; 2% Natriumdodecylsulfat; 100 mM Tris, pH 6,8; 20 mM Dithiothreitol; 0,01% Bromphenolblau) zu jedem Reaktionsgefäß gegeben wird. Die Proben werden dann in einem 100º-Wasserbad für 5 Minuten gekocht und zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehengelassen. Die Proben werden dann einer Elektrophorese auf einem 10% Acrylamidgel unterworfen. Das Gel wird für 1 Stunde in 50% Methanol; 10% Essigsäure; 0,05% Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Das Gel kann dann über Nacht in 15% Methanol und 10% Essigsäure entfärbt werden. Das Gel wird getrocknet und die Spuren des Gels können unter Verwendung eines Densitometers abgetastet werden. Die C3α- Kette hat ein natives Molekulargewicht von 120 kD und wird in 75 kD- und 45 kD-Fragmente geschnitten. Es wird die Fläche unter den drei Peaks, die dem jeweiligen Komplementbestandteil entsprechen, bestimmt und der prozentuale Anteil an der Gesamtfläche wird für jeden Peak berechnet. Der prozentuale Anteil der geschnittenen α-Kette wird wie folgt berechnet:
- % geschnitten = 100% (% Gesamtfläche, entspricht dem nativen MW)
- Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt:
- Die oben genannten Materialien wurden durch die Chiron Corporation, ein Bevollmächtigter für die vorliegende Erfindung, bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nr. ist von der ATCC unter der Telefonnummer (301)881-2600 erhältlich.
- Diese Hinterlegungen werden den Fachleuten als Annehmlichkeit bereitgestellt und sind kein Zugeständnis dafür, dass eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Nukleinsäuresequenz einer dieser Hinterlegungen sowie die von ihr codierten Aminosäuresequenzen der Polypeptide sind hierbei unter Bezugnahme mit eingeschlossen und sollten im Falle eines Fehlers in der hier beschriebenen Sequenz als Bezug dienen. Eine Lizenz ist für die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf des hinterlegten Materials erforderlich und keine derartige Lizenz wird hiermit erteilt. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (15)
1. Chimäres Protein, umfassend a) ein Hybrid, umfassend ein
Membran-Cofaktor-Protein (MCP)-Teil, verknüpft an ein
zerfallsbeschleunigender Faktor (DAF)-Teil, wobei jeder Teil
eine Komplementhemmwirkung besitzt, und b) ein
Gewebsfaktorstoffwechselweginhibitor (TFPI)-Peptid, wobei das Peptid die
Fähigkeit Glycosaminoglycan zu binden besitzt und an das
aminoterminale Ende des carboxylterminalen Endes des Hybrids
gebunden ist.
2. Chimäres Protein nach Anspruch 1, umfassend weiter ein
Peptid, das die MCF- und DAF-Teile des Hybrids trennt.
3. Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei der MCP-Teil an
das aminoterminale Ende des DAF-Teils gebunden ist.
4. Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das TFPI-Peptid
an das carboxylterminale Ende des Hybrids gebunden ist.
5. Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das TFPI-Peptid
SEQ ID Nr. 15 ist.
6. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein
chimäres Protein wie in Anspruch 1 beansprucht codiert.
7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, die das chimäre Protein
wie in Anspruch 2 beansprucht codiert.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 6, die das chimäre Protein
wie in Anspruch 3 beansprucht codiert.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 6, die das chimäre Protein
wie in Anspruch 4 beansprucht codiert.
10. Nukleinsäure nach Anspruch 6, die das chimäre Protein
wie in Anspruch 5 beansprucht codiert.
11. Transformierte Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure,
wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die das
chimäre Protein wie in Anspruch 1 beansprucht codiert.
12. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die
Nukleotidsequenz das chimäre Protein wie in Anspruch 2
beansprucht codiert.
13. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die
Nukleotidsequenz das chimäre Protein wie in Anspruch 3
beansprucht codiert.
14. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die
Nukleotidsequenz das chimäre Protein wie in Anspruch 4
beansprucht codiert.
15. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die
Nukleotidsequenz das chimäre Protein wie in Anspruch 5
beansprucht codiert.
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Owner name: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS,INC.(N.D.GES, US |