DE102010000168A1

DE102010000168A1 - Biokatalysator für die Hydroxylierung und /oder Epoxidierung

Info

Publication number: DE102010000168A1
Application number: DE102010000168A
Authority: DE
Inventors: Yogan 66123 Khatri; Rita Prof. Dr. 66129 Bernhardt; Frank Dr. Akad. Rat. 66125 Hannemann; Vlada Prov.-Doz. 70569 Urlacher; Marco Dipl.-Biol. 56414 Girhard
Original assignee: UNIVERSITAET DES SAARLANDES CAMPUS SAARBRUECKEN GEBAEUDE A1 1; Universitaet des Saarlandes
Current assignee: UNIVERSITAET DES SAARLANDES CAMPUS SAARBRUECKEN GEBAEUDE A1 1; Universitaet des Saarlandes
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-28
Also published as: DE102010000168A9

Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden, sowie ein Verfahren zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden.

Description

Die Erfindung betrifft ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden, sowie ein Verfahren zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden.
Terpenoide bilden eine heterogene Klasse von Naturstoffen, die von flüchtigen, niedermolekularen bis zu hochmolekularen, polymeren Verbindungen reicht. Unter ihnen findet man unter anderem azyklische, mono-, bi-, tri- und tetrazyklische und kondensierte Systeme, sowie Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Epoxide und heterozyklische Verbindungen. Ihr Bauprinzip wird am besten durch die Biosynthese verstanden. So sind die Terpenoide dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem oder mehreren Isoprenoideinheiten zusammengesetzt sind. Ein allgemeines Charakteristikum der Terpene, einer Untergruppe der Terpenoide, ist die Tatsache, dass die Anzahl ihrer Kohlenstoffatome durch fünf teilbar ist. Es werden jedoch auch solche Verbindungen zu den Terpenoiden gezählt, die von dieser Regel abweichen und bei denen die Anzahl der Kohlenstoffatome dadurch, dass im Ablauf der Biosynthese Kohlenstoffatome aus- oder eingeschleust wurden, keinem Vielfachen von 5 entspricht.
Die Menge der Verbindungen der Gruppe der Terpenoide spiegelt auch den Umfang der verschiedenen chemischen und biologischen Wirkungen dieser Stoffgruppe wieder. Viele dieser Terpenoidverbindungen besitzen eine antimikrobielle und sogar eine zytostatische Wirksamkeit. Sie werden z. B. zur Konservierung für kosmetische Präparate und auch als Therapeutika verwendet. Andere Terpene wirken als hormonelle Wachstumsregulatoren in Pflanzen und Tieren oder stellen wichtige Mediatoren in der Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Tieren dar. Aber auch die meisten ätherischen Öle basieren auf Terpenoiden, womit ihnen auch eine wichtige Rolle in der pharmazeutischen Industrie sowie auch in der Lebensmittelindustrie zukommt. Die Hauptbestandteile von ätherischen Ölen stellen die Mono- und Sesquiterpene, die von Pflanzen in großen Mengen produziert werden. Es sind über 900 Monoterpene bekannt. Demgegenüber stehen etwa 3000 verschiedene natürliche Sesquiterpene. Von letzteren sind jedoch nur etwa 20 als Geruchs- oder Aromastoffe von Relevanz.
Unter Monoterpenen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden solche Verbindungen verstanden, die aus zwei Isoprenoideinheiten aufgebaut sind und deren Kohlenstoffgerüst aufgrund ihrer Biosynthese aus zehn Kohlenstoffatomen besteht. Es werden aber auch solche Verbindungen als Monoterpene im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, deren Kohlenstoffgerüst auf Grund weiterer Biosyntheseschritte in der Anzahl der Kohlenstoffatome von zehn abweicht.
Als Sesquiterpene im Sinne der vorliegenden Erfindung werden solche Verbindungen angesehen, die aus drei Isoprenoideinheiten aufgebaut sind und deren Kohlenstoffgerüst aus fünfzehn Kohlenstoffatomen besteht. Es werden aber natürlich auch solche Verbindungen als Sesquiterpene im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen, deren Anzahl an Kohlenstoffatomen im Kohlenstoffgerüst auf Grund weiterer Biosyntheseschritte von fünfzehn abweicht.
Sämtliche natürliche Monoterpene werden durch Monoterpensynthasen aus Geranylpyrophosphat synthetisiert; dies geschieht über eine Reihe von komplexen organisch-chemischen Reaktionen, die dann zu der großen strukturellen Vielfalt der Monoterpene führen. Monoterpene haben eine, für Kohlenwasserstoffe, hohe Bioverfügbarkeit und in Tierexperimenten konnte eine antikanzerogene Wirkung festgestellt werden. Aber auch völlig verschiedene Wirkungen von Monoterpenen sind bekannt; so erlangte zum Beispiel Cantharidin, der Inhaltsstoff des Ölkäfers „Spanische Fliege”, als Potenzmittel gewisse Berühmtheit.
Für Sesquiterpene gibt es keine allgemeinen Biosyntheseweg, doch zumindest die cystosolischen Sesquiterpene, also solch deren Biosynthese im Cytosol statt findet, gehen vom Farnesylpyrophosphat als Grundgerüst aus.
Aus dem durchaus heterogenen Spektrum an Wirkweisen und Effekten der Mono- und Sesquiterpen, insbesondere auch aufgrund ihrer Eigenschaft als Geruchs- und Aromastoffe, ergibt sich ein mannigfaltige Anwendungspotential dieser Stoffgruppen. Gleichzeitig begründet dies auch des Interesse der Industrie, das natürliche Spektrum dieser Verbindungen durch gezielte Modifikation zu erweitern und/oder die Wirkweisen einzelner Verbindungen gerichtet zu beeinflussen.
Bei diesen Veränderungen spielt nicht nur die Regioselektivität sondern auch die Stereoselektivität der Modifikation eine entscheidende Rolle. Die unterschiedliche Wirkung verschiedener Enantiomere, also von Stereoisomeren chemischer Verbindungen, die in ihrem Aufbau jedoch nicht in ihrer Chiralität übereinstimmen, hat in der Vergangenheit traurige Bestätigung gefunden. Dies unterstreicht die Bedeutung von gezielten chemischen Modifikationen im Bereich der chemischen und pharmazeutischen Industrie.
Unter regioselektiven Modifikationen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden selektive, das heißt positionsspezifische Modifikation bestimmter Atome eines Moleküls verstanden; die Reaktion wird entsprechend als regioselektiv bezeichnet.
Unter stereoselektiven Modifikationen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden solche Modifikationen verstanden, die in einem bestimmten Stereoisomer als Reaktionsprodukt resultieren; die Reaktion wird entsprechend als stereoselektiv bezeichnet. Stereoisomere Verbindungen haben grundsätzlich die gleiche Struktur – und damit auch die gleiche Struktur- und Summenformel – unterscheiden sich aber durch die räumliche Anordnung der Atome.
Insbesondere bei der Hydroxylierung einzelner Kohlenstoffatome sowie die Epoxidierung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen bestimmter Moleküle gibt es bislang keine zuverlässige und reproduzierbare Verfahren, mit denen regioselektiv oder stereoselektiv veränderte Moleküle insbesondere Terpenoide hergestellt werden können.
Unter dem Begriff Hydroxylierung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Einführung einer oder mehrerer funktioneller Gruppen, bestehend aus einem Wasserstoff- und einem Sauerstoffatom in eine organisch-chemischen Verbindung verstanden. Die Hydroxylierung nicht aktivierter Kohlenstoffatome ist in diesem Kontext von besonderer Bedeutung. Hierbei werden unter aktivierten Kohlenstoffatomen im Sinne der vorliegenden Erfindung solche verstanden, die durch Verschiebung der Valenzelektronen, wie zum Beispiel durch elektronenziehende oder -schiebende Seitengruppen, leichter chemische Reaktionen eingehen.
Unter dem Begriff Epoxidierung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Darstellung von Epoxiden durch das Einfügen eine Sauerstoffatoms durch elektrophile Addition an eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung verstanden.
Im Stand der Technik sind Verfahren zur Modifikation nicht aktivierter Kohlenstoffatome sowie von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen bekannt. Anwendung finden hierbei Radikalreaktion sowie der Einsatz chemischer Katalysatoren.
Bei beiden genannten Verfahren handelt es sich jedoch um unselektive Verfahren, bei denen alle möglichen Reaktionspartner mehr oder weniger stochastisch chemisch modifiziert werden. Demnach erfährt nur ein geringer Anteil der Verbindungen, insbesondere hinsichtlich des Ortes und der resultierenden räumlichen Anordnung, eine gezielte chemische Modifikation, während der Rest der Verbindungen andere Modifikationen erfährt oder unverändert bleibt. Entsprechend aufwändige Reinigungs- und Selektionsverfahren müssen als Folge eingesetzt werden, um das Erwünschte aus der Mischung von Reaktionsprodukten in Reinform zu isolieren. Der entscheidende Nachteil solcher Radikalreaktion ist somit die fehlende Spezifität beziehungsweise die fehlende Regioselektivität.
Darüber hinaus werden bei Katalysator-getriebenen Reaktionen häufig toxische Verbindungen als Katalysatoren eingesetzt, deren Entsorgung teuer beziehungsweise deren Aufarbeitung sehr aufwendig und damit auch kostspielig ist.
Eine ebenfalls im Stand der Technik bekannte Alternative dazu, auch um eine regioselektive Modifikation der Verbindung zu gewährleisten, stellt die de novo-Synthese der gewünschten Verbindung dar. Allerdings ist eine entsprechende chemische Totalsynthese sehr aufwendig, da unter Umständen sehr viele Syntheseschritte durchgeführt werden müssen. Dies führt zu erheblichen Kosten, zum einen aufgrund des erhöhten Arbeitsaufwandes aber auch aufgrund der Vielzahl für die Synthese notwendigen Substanzen und Einrichtungen.
Selbst wenn mit all den bekannten Verfahren eingeführt entsprechende chemische Modifikationen werden können, so bleibt diesen Verfahren dennoch der Nachteil, dass keine stereoselektive Modifikation der chemischen Verbindung gewährleistet werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereit zu stellen, das die im Stand der Technik bekannten Nachteile in Bezug auf Regioselektivität zu verringert und eine verbesserte Stereoselektivität der Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden erreicht.
Die Fähigkeit bestimmter Enzyme der Familie der P450 Cytochrome zur Hydroxylierung definierter Positionen in einzelnen Verbindungen, auch solcher aus der Gruppe der Terpenoide, ist bekannt. Auch die Epoxidierung bestimmter Terpenoide durch Cytochrom P450, wie zum Beispiel im Bereich des Stoffwechsels von Wachstumsregulatoren bei Insekten, ist bekannt.
Ebenso ist die Verwendung bestimmter Hydroxylasen zur enzymatischen Umsetzung, sowie auch z. B. die Verwendung von Cytochrom P450 für verschiedene Molekülgruppen, zum Beispiel Steroide bekannt.
In der Regel werden bei solchen Verwendungen, die häufig als „Biokatalysatoren” bezeichneten Enzyme in gereinigter Form, also in vitro, verwendet. Es ist aber zu berücksichtigen, dass hierbei neben den eigentlichen Biokatalysatoren auch die für die Reaktion notwendigen Reaktionspartner, wie im Fall der genannten Hydroxylase entsprechende Elektronentransferpartner, sowie Co-Faktoren (wie z. B. NADPH) und Regenerationssysteme (wie Glucose-6-Phosphat, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) zugesetzt werden müssen. Somit ist neben der Expression und der anschließenden Aufreinigung des Enzyms auch die Aufreinigung oder Synthese besagter Reaktionspartner, Co-Faktoren und Regenrationssysteme von Nöten; dadurch wird die enzymatische Umsetzung in vitro aufwendiger und in der Regel auch teurer.
Um dies zu umgehen, werden im Stand der Technik auch sogenannte Ganz-Zell-Biokatalysatoren beschrieben. Hierbei werden das Enzym und die benötigten Reaktionspartner von Mikroorganismen (MO), wie z. B. Bakterien, produziert und dann die eigentliche katalytische Reaktion auch von diesen MOs, bzw. von den Enzyme in diesen MOs durchgeführt. Diese lebenden Systeme können im Vergleich zu in vitro-Systemen größere Mengen des Substrates umsetzen. Eine vergleichbare Produktionsraten in vitro ist daher nur unter Verwendung eines immensen Enzymeinsatzes zu erreichen sind.
Der Einsatz von Ganz-Zell-Biokatalysatoren setzt allerdings voraus, dass alle für die Reaktion benötigten Komponenten bekannt sind und auch genetisch verfügbar sind, so dass sie in den als Ganz-Zell-Biokatalysator dienenden Organismus eingebracht und von diesem produziert werden können. Unter Umständen können hierfür auch funktionell ähnliche, bekannte und verfügbare Substanzen eingesetzt werden. Eine solche heterologe Kombination führt in der Regel zu Einbußen in Bezug auf Effektivität und Qualität der Reaktion, da die beteiligten Komponenten schlechter aufeinander abgestimmt sind.
So ist z. B. auch ein auf Escherichia coli basierendes System zur Hydroxylierung von Steroiden, nämlich Progesteron und 11-Deoxycortisol bekannt (Virus et al., Function and engineering of the 15beta-hydroxylase CYP106A2. Biochem Soc Trans (2006) vol. 34 (Pt 6) pp. 1215–8). Hierbei wird Cytochrom P450 CYP106A2 in E. coli exprimiert, die nötigen Elektronentransferpartner werden durch bovine Redoxproteine substituiert.
Solche Ansätze zur enzymatischen Umsetzung, nämlich der in vitro-Ansatz sowie der in vivo-Ansatz, bestimmter Verbindungen haben den gemeinsamen Nachteil, dass ausreichende Menge eines funktionellen Biokatalysators vorliegen müssen. In dem ersten Fall werden ausreichende Mengen des Enzyms für die Aufreinigung benötigt werden. Im zweiten Fall müssen ausreichende Mengen des Enzyms in den MOs vorhanden sein, um eine effektive Umsetzung zu gewährleisten. Oft scheitert eine im experimentellen Maßstab vielversprechende enzymatische Umsetzung bei dem Versuch sie in ein effizientes Verfahren umzusetzen.
Es besteht also nach wie vor ein Bedarf an Systemen und Verfahren zur effektiven, wirtschaftlichen, präzisen regiospezifischen und verbesserten stereospezifischen, enzymatischen Hydroxylierung und/oder Epoxidierung chemischer Verbindungen, insbesondere auch der Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Kohlenstoffatome in ausgewählten Verbindungen, für deren Umsetzung kein Pendant in der Natur bekannt ist. Oder allgemein gesprochen von ausgewählten nicht-aktivierten Kohlenstoffatomen beziehungsweise ausgewählten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen.
Entsprechend der formulierten Aufgabe stellt die Erfindung ein Verfahren zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden gemäß Anspruch 1 bereit.
Die Aufgabe wird dabei durch die Verwendung von einem isolierten oder rekombinanten Polypeptid als Biokatalysator gelöst, wobei bevorzugte Ausgestaltungsformen, welche Abwandlungen des Verfahrens zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden betreffen, ebenso wie solche, die Ausführungsformen der Verwendung des Polypeptids betreffen, Gegenstand entsprechender Unteransprüche sind.
Zur Lösung der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe wurde für die chemische Modifikation der Terpenoide ein Polypeptid als Biokatalysator verwendet, welches einem Cytochrom P450 aus Sorangium cellulosum entspricht.
Bei Sorangium cellulosum handelt es sich um ein gram-negative Bodenbakterium der Ordnung der Myxobakterien. Sorangium cellulosum produziert eine Vielzahl von Wirkstoffen, die in der Medizin, der pharmazeutischen Industrie, aber auch in der Agrochemie Verwendung finden können. Von besonderer Bedeutung sind hierbei die Epothilone, denen Mediziner enormes Potenzial als Krebsmedikamente zutrauen. Epothilone sind 16-gliedrige Macrolactone, die 1987 erstmals aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum isoliert wurden. Bei den Epothilonen handelt es sich um relativ komplexe Verbindungen mit einer Vielzahl verschiedener funktioneller Gruppen. So weisen die verschiedenen Epothilone unter anderem Epoxid-, Keto- sowie Thiazolseitenketten auf. Dies zeigt, dass Sorangium cellulosum aufgrund seiner enzymatischen Ausstattung in der Lage eine Vielzahl komplexer Syntheseschritte und chemischer Modifikationen durchzuführen.
Generell weisen Enzyme jedoch eine sehr hohe Substratspezifität auf. Dies bedeutet, dass diese Biokatalysatoren, anders als chemische Katalysatoren, die entsprechenden Modifikationen oder Reaktionen nur an bestimmten Substraten durchführen. Diese Spezifität liegt in dem katalytischen Zentrum, also dem Bereich eines Enzymmoleküls, der für die Bindung des Substrats und die Katalyse zum Produkt verantwortlich ist, begründet. Diese Regionen zeichnen sich durch eine hohe Selektivität für die Substrate aus (Schlüssel-Schloss-Prinzip) und bilden einen aktiven Übergangskomplex mit dem Substrat. Besonders wichtig hierbei ist die Ausbildungen von Wasserstoff-Brücken-Bindungen.
Trotz der äußerst vielschichtigen Synthesewege in Sorangium cellulosum sind keine Terpenoide als Inhaltsstoffe bei diesem Organismus bekannt. Dennoch konnte in der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt werden, dass ein Enzym aus diesem Organismus in der Lage ist chemische Modifikationen an Terpenoiden zu katalysieren, so dass die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe überraschender Weise durch die Verwendung eines Enzyms, nämlich dem Protein CYP109D1 aus Sorangium cellulosum gelöst werden konnte.
Gemäß der Erfindung weist das Verfahren zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden wenigstens die folgenden Schritte auf:
In einem vorzugsweise ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz ausweist, die zumindest zu 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz des Proteins CYP109D1 von Sorangium cellulosum (Seq ID No. 1), zu einem geeignetem Reaktionsmedium gegeben.
Unter „Identität” im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Übereinstimmung bezogen auf die Sequenz, also die Abfolge der einzelnen Aminosäure- bzw. Nukleinsäurebausteine verstanden.
Als geeignetes Reaktionsmedium werden im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl für enzymatische Reaktionen geeignete Puffersysteme sowie für die Verwendung von Ganz-Zell-Biokatalysatoren geeignete Zellkulturmedien verstanden, die dem Fachmann bekannt sind.
Als „Biokatalysator” werden im Rahmen der Erfindung polymere Biomoleküle, insbesondere Enzyme, verstanden, welche chemische Modifikation, insbesondere die Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Kohlenstoffatomen katalysieren.
In einem optionalen, vorzugsweise zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Elektronentransferpartner zugegeben.
Unter „Elektronentransferpartnern” im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Kombinationen von Elektronendonatoren und Elektronenakzeptoren verstanden, welche bei der Hydroxylierung durch den Biokatalysator als Reaktionspartner fungieren. Ein Beispiel hierfür sind adrenale Redoxproteine, wie das Paar bestehend aus Adrenodoxin und Adrenodoxinreduktase. Andere Kombinationen von Elektronendonatoren und Elektronenakzeptoren, gewonnen aus anderen Cytochrom P450 exprimierenden Organismen oder Zellen, sind ebenso einsetzbar.
In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu hydroxylierende Terpenoide der Reaktionsmischung zugegeben. Nach dieser Zugabe erfolgt die Inkubation der Mischung.
Unter „Inkubation” wird das Wirkenlassen des Enzyms auf das Substrat bei in der Regel definierter Temperatur sowie über eine in der Regel definierte Zeitspanne, häufig bis zur vollständigen Umsetzung der Ausgangsstoffe verstanden. Vorzugsweise wird die Inkubation bei Temperaturen von ca. 15C°, 20C°, 25C°, 30C°, 32C° und/oder 36°C durchgeführt. Weiter vorzugsweise wird die Inkubation für 1–3 Stunden, 3–8 Stunden, 5–12 Stunden, 6–18 Stunden oder 12–24 Stunden durchgeführt.
Den abschließenden Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Extraktion des Hydroxylierungs-respektive Epoxidierungsproduktes dar. Unter „Extraktion” wird im Sinne der Erfindung die Isolation bzw. Aufreinigung der Reaktionsendprodukte nach dem Fachmann bekannten Methoden verstanden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird das Polypeptid zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, welche zumindest zu 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Nukleinsäuresequenz Seq ID No. 2.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das rekombinante Polypeptid zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden heterolog in einem Wirtsorganismus oder in Sorangium cellulosum exprimiert.
Als Wirtsorganismus im Sinne der vorliegenden Erfindung werden sämtliche Organismen aber auch Zellkulturlinien verstanden, in welchen unter Verwendung entsprechender Vektoren die kodierende Sequenz für das Polypeptid entsprechend der vorliegenden Erfindung eingebracht werden kann und welche dadurch befähigt sind, das entsprechende Enzym zu exprimieren.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Verfahrens wird das isolierte Polypeptid als aufgereinigtes Enzym oder als Zellderivatpräparation für die Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden verwendet.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Verfahrens wird das Polypeptid für die Aufreinigung und anschließende Verwendung zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden heterolog in einem Wirtsorganismus exprimiert.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Verfahrens wird das Polypeptid zusätzlich mit wenigstens einem Chaperonkomplex in dem Wirtsorganismus oder Sorangium cellulosum exprimiert.
Chaperone sind Proteine, die neu synthetisierten Proteinen „helfen”, sich korrekt zu falten. Neu synthetisierte Proteine müssen zunächst ihre spezifische, native, funktionelle Konformation finden. Diese ist grundsätzlich in der Primärstruktur angelegt, und kleinere Proteine können sich auch spontan in der richtigen Weise falten. Vor allem bei größeren, komplexeren Proteinen sind aber oft Hilfsmittel zur korrekten Faltung nötig, da solche Proteine zur Bildung von unerwünschten, funktionsuntüchtigen Aggregationen neigen. Chaperone interagieren spezifisch mit aggregationsanfälligen Proteinen und treten somit direkt in Konkurrenz zu Aggregationsreaktionen. Die Chaperone beschleunigen dabei die korrekte Faltung und Assoziation der Proteine, ohne selbst Teil der Struktur zu werden. Durch die Zugabe oder auch Coexpression von Chaperonen kann die Ausbeute an funktionellen Proteinen deutlich gesteigert werden.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Verfahrens wird der Chaperon-Komplex ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Unter funktionellen Homologen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden solche Komplexe verstanden, die in den entsprechenden Ursprungsorganismen eine entsprechende Funktion einnehmen, jedoch eine andere Aminosäuresequenz und damit einen anderen strukturellen Aufbau aufweisen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden die zu hydroxylierenden und/oder epoxidierenden Terpenoide ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Monoterpenen und/oder Sesquiterpenen, gemäß weiterer Ausführungsformen werden die zu hydroxylierenden und/oder epoxidierenden Terpenoide aus einer Gruppe bestehend aus Geraniol, Nerol, α-Jonon und/oder β-Jonon ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird dieses zur Herstellung wenigstens eines Mono- und/oder Sesquiterpens verwendet, wobei das herzustellende Mono- und/oder Sesquiterpens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3-epoxy-Geraniol, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-epoxy-Nerol, 6,7-epoxy-Nerol, 2-hydroxy-α-Jonon und 4-hydroxy-β-Jonon.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung Terpenoiden wird ferner durch einen Ganz-Zell-Biokatalysator gelöst, welcher ein Wirtsorganismus oder Sorangium cellulosum ist, der ein Polypeptid exprimiert, welches eine Aminosäuresequenz ausweist, die zumindest zu 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz des Proteins CYP109D1 von Sorangium cellulosum (Seq ID No. 1).
Unter „Ganz-Zell-Biokatalysator” im Sinne der vorliegenden Erfindung, werden Systeme verstanden, bei denen das Substrat durch Enzyme oder anderweitige biologische Systeme einer Zelle, insbesondere von Mikroorganismen, umgewandelt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Ganz-Zell-Biokatalysators wird in dem Wirtsorgansimus oder in Sorangium cellulosum wenigstens ein Elekronentransferpartner heterolog oder homolog exprimiert.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Ganz-Zell-Biokatalysators wird das Polypeptid zusätzlich mit wenigstens einem Chaperonkomplex in dem Wirtsorganismus oder in Sorangium cellulosum exprimiert.
Gemäß weiterer Ausführungsformen des Ganz-Zell-Biokatalysators wird der Chaperonkomplex ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz des Proteins CVP109D1 Sorangium cellulosum (Seq ID No. 1) zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform der Verwendung des Polypeptids, wird die Aminosäuresequenz des Polypeptids durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, welche zumindest zu 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Nukleinsäuresequenz Seq ID No. 2.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Verwendung des Polypeptids in einem Ganz-Zell-Biokatalysator wird das Polypeptid in einem Ganz-Zell-Biokatalysator verwendet, indem ein Wirtsorganismus das Polypeptid heterolog oder Sorangium cellulosum das Polypeptid exprimiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Verwendung des Polypeptids in einem Ganz-Zell-Biokatalysator wird der wenigstens eine neben dem Polypeptid von dem Wirtsorganimus oder Sorangium cellulosum exprimierte Chaperonkomplex ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung die hydroxylierten und/oder epoxidierten Terpenoide, welche nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung herstellbar und/oder hergestellt sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Strukturformeln von a) Geraniol, b) Nerol, c) α-Jonon und d) β-Jonon.
2 zeigt das Gaschromatographie (GC)-Chromatogramm der Cytochrom P450 CYP109D1-abhängigen α-Jonon-Umwandlung unter Verwendung des isolierten, aufgereinigten Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung (durchgezogene Linie), sowie die Negativkontrolle ohne Zugabe des Enzyms (gestrichelte Linie).
3 zeigt das GC-Chromatogramm der Cytochrom P450 CYP109D1-abgängigen Umsetzung der β-Jonon unter Verwendung des isolierten, aufgereinigten Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung (durchgezogene Linie), sowie die Negativkontrolle ohne Zugabe des Enzyms (gestrichelte Linie).
Die Auswahl des Polypeptides im erfindungsgemäßen Verfahren zur Katalyse der Hydroxylierung von Terpenoide gewährleistet auf Grund der hohen Spezifität des Enzyms eine sowohl regio- als auch stereospezifische Umsetzung der zu modifizierenden Kohlenstoffatome von Terpenoiden. Insbesondere sind aufgrund der katalytischen Eigenschaften des Enzyms auch solche Atome für die Umsetzung akzessibel, die aufgrund ihrer chemischen Eigenschaft für chemische Reaktion nicht oder nur schlecht zugänglich sind, wie zum Beispiel nicht-aktivierte Kohlenstoffatome und/oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht darüber hinaus auch, dass die gewünschten Reaktionen, im Gegensatz zu klassischen chemischen Modifikationen, bei niedrigen Temperaturen und unter physiologischen Rahmenbedingungen (bezogen unter anderem auf den pH-Bereich und die Osmolarität der Reaktionsmediums) durchgeführt werden können. Dies gewährleistet eine schonende Umsetzung des Substrates und führt, zusätzlich zur genannten Spezifität der Enzyme, zur einer geringen Zahl an Nebenprodukten.
Des Weiteren können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hydroxylierungen und/oder Epoxidierungen direkt, das heißt in einem Schritt durchgeführt werden.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Ganz-Zell-Biokatalysators werden die für die Reaktion benötigten Komponenten wie Enzyme, Elektronentransferpartner, Co-Faktoren und die entsprechenden Regenrationssysteme von den MOs produziert, was ein in sich abgestimmtes Zusammenspiel dieser Komponenten gewährleistet, und somit maximale Umsatzraten ermöglicht. Auf diese Weise ermöglicht die Verwendung des erfindungsgemäßen Ganz-Zell-Biokatalysators eine vollständigere Umsetzung des Substrates.
All dies stellt eine entscheidende Erleichterung und auch Kostenersparnis im Vergleich zu der sonst unter Umständen nötigen Neu-Synthese dar. Aber auch im Vergleich zur Modifikation bestehender Verbindungen, da hier gegebenenfalls zusätzliche Reaktionsschritte zur Aktivierung der an der Reaktion beteiligten Atome von Nöten ist.
Die Erfindung bietet also eine sowohl effiziente, das heißt in einem Reaktionsschritt durchführbare, als auch präzise, das heißt sowohl regiospezifische als auch stereospezifische Methode zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Nerol zu 2,3-epoxy-Nerol sowie zu 6,7-epoxy-Nerol epoxidiert wird und α-Jonon zu 2-hydroxy-α-Jonon hydroxiliert wird.
Die Erfindung stellt damit zum ersten Mal Cytochrom P450 CYP109D1 als regiospezifische Hydroxylase und Epoxidase bereit.
Wie bereits erwähnt, zeichnen sich P450 Cytochrome durch eine sehr hohe Substratspezifität aus. Um dem Verlangen der Chemie, insbesondere der pharmazeutischen Chemie nach geeigneten Synthesemethoden oder Umsetzungsmethoden für bestimmte Verbindungen nachzukommen, werden regelmäßig gezielt Reaktionspartner beziehungsweise Reaktionsbeschleuniger, also Katalysatoren, für eben dieses Substrat beziehungsweise diesen Reaktionsschritt gesucht. Das bedeutet zum Beispiel, dass die betreffenden Verbindungen von verschiedenen, in ihrer Funktion definierten, eventuell aufgrund von Strukturvorhersagen ausgewählter Enzyme umgesetzt werden, in der Hoffnung einen geeigneten Katalysator für die gewünschte Reaktion zu finden. Häufig wird hierbei der Einfachheit halber unter den bekannten Biokatalysatoren, also solchen Enzymen, deren katalytische Eigenschaft bekannt ist gesucht und versucht die gewünschte Reaktion mit den somit bekannten Mitteln umzusetzen – dies unter Umständen unter Einbußen in Bezug auf die Spezifität oder die Umsatzrate der Reaktion. Die Suche und Charakterisierung neuer Biokatalysator ist jedoch ungleich aufwändiger, so dass diese Limitation oder Einbußen unter Umständen in Kauf genommen werden.
Die Erfindung befriedigt daher den bestehenden Bedarf an neuen Biokatalysatoren, beziehungsweise nach Proteinen, deren biokatalytische Eigenschaft bislang nicht bekannt war, um die Anforderungen der Industrie nachzukommen. Vor diesem Hintergrund, gewinnt das erfindungsgemäße Polypeptid eine weitreichende Bedeutung, denn es stellt einen neuen Biokatalysator bereit, welcher die gezielte Veränderung von Terpenoiden ermöglicht.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand bevorzugter Ausführungsbeispiele erläutert wobei darauf hingewiesen wird, dass durch diese Beispiele Abwandlungen bzw. Ergänzungen, die sich für den Fachmann unmittelbar ergeben mit umfasst sind. Darüber hinaus stellen diese bevorzugten Ausführungsbeispiele keine Beschränkungen der Erfindung dar, so dass Abwandlungen oder Ergänzungen auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Beispiel 1
Für die erfindungsgemäße Hydroxylierung von Terpenoiden wurde die kodierende Sequenz für das Cytochrom P450 CYP109D1 in entsprechende Mikroorganismen nach allgemein bekannten Methoden kloniert, die Proteine entsprechend exprimiert und anschließend isoliert und aufgereinigt. Die Proteinkonzentrationen wurden an Hand des Extensionskoeffizienten des Proteins photometrisch bestimmt. Die erfindungsgemäße katalytische Hydroxylierung und/oder Epoxidierung wurden mit 200 μM Substrat in einem finalem Volumen von 500 μl bei 30°Celsius für 30 min. durchgeführt. Als Reaktionsmedium wurde ein 10 mM Kalium-Puffer bei pH 7,4 verwendet. Das Reaktionsgemisch enthielt 20% Glycerin sowie ein NADPH-regenerierendes System bestehend aus 5 mM Glcose-6-Phosphat, 1 Einheit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 1 mM Magnesiumchlorid. Das Verhältnis von Biokatalysator und der Elektronentransferpartner Adrenodoxinreduktase und Adrenodoxin war 1:10:1.
Nach der Inkubation zur Umsetzung der Reaktion wurde die Reaktion gestoppt, und die Reaktionsprodukte extrahiert.
Entsprechend der allgemeinen Beschreibung in diesem Beispiel konnte die enzymatische Modifikation, nämlich die Epoxidierung von zwei Monoterpenen (Geraniol und Nerol) sowie die Hydroxylierung von zwei Sesquiterpenen (α-Jonon und β-Jonon) gezeigt werden. Die Qualität der Umsetzung sowie die Identifikation der resultierenden Produkte erfolgte hierbei durch Gaschromatographie in Verbindung mit Massenspektroskopie. Geraniol wurde hierbei in 2,3-epoxy-Geraniol, in 6,7-epoxy-Geraniol sowie in 2,3-, 6,7-epoxy-Geraniol umgewandelt. Nerol wird zu 2,3-epoxy-Nerol sowie zu 6,7-epoxy-Nerol epoxidiert. Die beiden Sesquiterpenen wurden ausschließlich zu 2-hydroxy-α-Jonon respektive 4-hydroxy-β-Jonon umgesetzt.
Beispiel 2
In einem weiteren Beispiel der erfindungsgemäßen Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden wurde zusätzlich zu der kodierenden Sequenz für das Cytochrom P450 CYP109D1 auch der Chaperon-Komplex GroES/GroEL in entsprechende Mikroorganismen kloniert. Anschließend wurden die Proteine exprimiert, isoliert und aufgereinigt. Die Proteinkonzentrationen wurden an Hand der jeweiligen Extensionskoeffizienten für die verschiedenen Proteine photometrisch bestimmt. Durch die Koexpression mit dem Chaperon-Komplex konnte die Produktionsrate des Cytochroms deutlich gesteigert werden. Nach der Inkubation zur Umsetzung der Reaktion wurde die Reaktion gestoppt und die Reaktionsprodukte extrahiert.
Die extrahierten Substanzen der katalytischen Umsetzung basierend auf dem aufgereinigten Cytochrom P450 CYP109D1 wurden durch Gaschromatographie (GC) in Verbindung mit Massenspektroskopie (MS) untersucht. Die Ergebnisse der Umsetzung von α-Jonon beziehungsweise β-Jonon sind in den 2 und 3 anhand der Ergebnisse gaschromatographischen Analyse gezeigt.
Beispiel 3
Für die erfindungsgemäße Hydroxylierung von Terpenoiden unter Verwendung des Ganz-Zell-Biokatalysators wurde eine Kolonie des jeweiligen Ganz-Zell-Biokatalysators, also entweder der das Cytochrom P450 CYP109D1 exprimierende Wirtsorganismus oder das das Cytochrom P450 CYP109D1 exprimierende Sornagium cellulosum in 200 ml eines entsprechendes Komplex-Mediums angezogen. Gegebenfalls, also bei Verwendung des Wirtsorganimus, wurden entsprechende Mengen eines geeigneten Antibiotikums als Selektionsfaktor zugegeben. Die Kulturen wurden bei 30°C für 72 Stunden angezogen. Nach dieser Anzuchtphase wurde das zu hydroxylierende Substrat den Kulturen zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von weiteren 24 oder 48 Stunden wurden die Reaktionsprodukte extrahiert und gaschromatographisch analysiert. Die Umsatzraten konnten dabei im Vergleich zur in vitro-Umsetzung um 25% gesteigert werden.
Beispiel 4
Für die erfindungsgemäße Hydroxylierung von Terpenoiden unter Verwendung des Ganz-Zell-Biokatalysators wurde eine Kolonie des jeweiligen Ganz-Zell-Biokatalysators, also entweder der das Cytochrom P450 CYP109D1 sowie den Chaperon-Komplex GroES/GroEL exprimierende Wirtsorganismus oder der das Cytochrom P450 CYP109D1 exprimierende Sornagium cellulosum in 200 ml eines entsprechendes Komplex-Mediums angezogen. Gegebenfalls, also bei Verwendung des Wirtsorganimus, wurden entsprechende Mengen eines geeigneten Antibiotikums als Selektionsfaktor zugegeben. Die Kulturen wurden bei 30°C für 72 Stunden angezogen. Nach dieser Anzuchtphase wurde das zu hydroxylierende Substrat den Kulturen zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von weiteren 24 oder 48 Stunden wurden die Reaktionsprodukte extrahiert und gaschromatographisch analysiert. Die Umsatzraten konnten dabei im Vergleich zur in vitro-Umsetzung um wenigstens 35% gesteigert werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Virus et al., Function and engineering of the 15beta-hydroxylase CYP106A2. Biochem Soc Trans (2006) vol. 34 (Pt 6) pp. 1215–8 [0026]

Claims

Verfahren zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden enthaltend die nachfolgenden Schritte: • Zugabe eines isolierten oder in einem Wirtsorganismus rekombinant exprimierten Polypeptids, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz Seq ID No.1, zu einem geeigneten Reaktionsmedium; • Optionale Zugabe von wenigstens einem Elektronentransferpartner; • Zugabe des zu hydroxylierenden Terpenoids zu dem Reaktionsgemisch; • Inkubation der Mischung, und • Extraktion des Hydroxylierungs- und/oder Epoxidierungsproduktes.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids in einer Nukleinsäuresequenz kodiert ist, die zumindest zu 80% identisch ist mit der Nukleinsäuresequenz Seq ID No. 2.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Polypeptid heterolog in einem Wirtsorganismus exprimiert wird oder in Sorangium cellulosum exprimiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Polypeptid ein aufgereinigtes Enzym ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich wenigstens ein Chaperonkomplex in dem Wirtsorganismus oder in dem Sorangium cellulosum exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Chaperonkomplex ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das zu hydroxylierende und/oder epoxidierende Terpenoid ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Monoterpenen und/oder Sesquiterpenen.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das zu hydroxylierende und/oder epoxidierende Terpenoid ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Geraniol, Nerol, α-Jonon und/oder β-Jonon.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung wenigstens eines der Mono- oder Sesquiterpene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2,3-epoxy-Geraniol, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-epoxy-Nerol, 6,7-epoxy-Nerol, 2-hydroxy-α-Jonon und 4-hydroxy-β-Jonon.
Ganz-Zell-Biokatalysator, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wirtsorganismus oder Sorangium cellulosum ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz Seq ID No.1, exprimiert.
Ganz-Zell-Biokatalysator gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich wenigstens ein heterologer Elektronentransferpartner exprimiert wird.
Ganz-Zell-Biokatalysator gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich wenigstens ein Chaperonkomplex exprimiert wird.
Ganz-Zell-Biokatalysator gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Chaperonkomplex ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Verwendung eines Polypeptids, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz Seq ID No.1, zur Hydroxylierung und/oder Epoxidierung von Terpenoiden.
Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids in einer Nukleinsäuresequenz kodiert ist, die zumindest zu 80% identisch ist mit der Nukleinsäuresequenz Seq ID No. 2.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 und 15 in einem Ganz-Zell-Biokatalysator, dadurch gekennzeichnet, dass der Ganz-Zell-Biokatalysator ein das Polypeptid heterolog exprimierender Wirtsorganismus oder Sorangium cellulosum ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass neben dem Polypeptid zusätzlich wenigstens ein Chaperonkomplex von dem Wirtsorganismus oder Sorangium cellulosum exprimiert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Chaperonkomplex ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend den GroEL/ES-Komplex, den Hsp60/Hsp10-Komplex sowie funktionelle Homologe dieser Komplexe.
Hydroxyliertes und/oder epoxidiertes Monoterpen oder Sesquiterpen herstellbar mit dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
Mono- oder Sesquiterpene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2,3-epoxy-Geraniol, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-, 6,7-epoxy-Geraniol, 2,3-epoxy-Nerol, 6,7-epoxy-Nerol, 2-hydroxy-α-Jonon und 4-hydroxy-β-Jonon hergestellt mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.