DE102013107885A1

DE102013107885A1 - Biokatalysator zur Produktion von 25-OH-Vitamin D3 und anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten mittels rekombinanter Bacillus megaterium Stämme

Info

Publication number: DE102013107885A1
Application number: DE102013107885.0A
Authority: DE
Inventors: Elisa Brill; Frank Hannemann; Josef Zapp; Rita Bernhardt; Adrian Gerber
Original assignee: Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Endotherm De GmbH
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-01-29

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor zur Exprimierung eines Proteins, das zur regioselektiven Herstellung von Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten beiträgt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor zur Exprimierung eines Proteins, das zur regioselektiven Herstellung von Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten beiträgt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Nahrungsmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln oder Medizinprodukten. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein Protein, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Präparation, enthaltend 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate erhältlich aus einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Vitamin D ist ein fettlösliches Vitamin und wird vor allem von höheren Organismen durch Biosynthese aus Cholesterin gebildet. Vitamin D3 wird durch UV-Strahlen und thermischer Reaktion in der Haut hergestellt. In einem Haupt-Vitamin-D-Biosyntheseweg im Menschen, wird zunächst aus 7-Dehydrocholesterin zu Vitamin D3 (Cholecalciferol) synthetisiert. Vitamin D3 als solches hat keine großen Wirkungen auf den Organismus. Die Modifizierung zur aktiven Form erfolgt durch Hydroxylierung des Vitamin D3 durch ein Cytochrom P450-Enzym. Cytochrom P450 (CYPs, P450s) sind eine Superfamilie von Häm enthaltenden externen Monooxygenasen, die in allen biologischen Reichen gefunden werden können (http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html). Die Cytochrome P450 fungieren meist als terminale Monooxygenasen, indem sie molekularen Sauerstoff aktivieren und ein Sauerstoffatom in das Substrat integrieren, während das andere Sauerstoffatom zu Wasser reduziert wird.
Beim Menschen kann eine erste Hydroxylierung des Vitamin D3 an Position 25 zum 25-OH-Vitamin D3 durch ein in den Mitochondrien befindliches Cytochrom P450 (CYP27A1) in der Leber erhalten werden. Eine weitere Hydroxylierung zum 1α, 25-(OH)2-Vitamin D3 kann in der Nebennierenrinde stattfinden (Schuster I et al., 2011, Biochim. Biophys. Acta,1814(1):186–99). Aktives Vitamin D3 spielt aufgrund seiner Vielzahl von physiologischen Aktivitäten wie z.B. seiner Beteiligung an der Calcium-Homöostase, Wachstumskontrolle, Differenzierung und Immunantwort eine wichtige Rolle im Organismus. Das 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate sind daher als Medizinprodukt, Nahrungsmittel oder Nahrungsergänzungsmittel für eine Vielzahl von Krankheiten die auf Vitamin D Mangel zurückgehen interessant. Daher ist die Schaffung eines effizienten Verfahrens zur Herstellung der aktiven Form von Vitamin D3 erstrebenswert.
Die Cytochrome P450, die diese erste Hydroxylierung des Vitamin D3 zu 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls zu anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten bewerkstelligen, sind durch eine sehr hohe Diversität bezüglich der von ihnen katalysierten Reaktionen und der umgesetzten Substrate charakterisiert (Bernhardt 2006). Wegen dieser Vielseitigkeit sind diese Cytochrome in verschiedene biologische Prozesse wie der Assimilierung von Kohlenstoffquellen, der Karzinogenese, der Biosynthese von Steroidhormonen oder dem Metabolismus von Arznei- und Fremdstoffen involviert (Bernhardt 1996; Werck-Reichhart und Feyereisen 2000; Urlacher und Eiben 2006; Bernhardt und Waterman 2007). Cytochrome P450 haben das Potential eine Vielzahl von Substanzen zu produzieren, deren chemische Synthese zum Beispiel sowohl schwierig als auch teuer ist.
Die chemische Totalsynthese von 25-OH-Vitamin D3 ist sehr aufwendig, da viele Syntheseschritte durchgeführt werden müssen, was zu erheblichen Kosten führen kann. So umfasst z.B. die Synthese von 25-OH-Vitamin D3 und 1α, 25-(OH)₂-Hydroxylierung ausgehend vom Cholesterol zwanzig Schritte, welche zudem eine geringe Ausbeute (ca. 1%) aufweisen (Kametani T, Furuyama H, 1987. Med. Res. Rev. 7(2):147–171).
Die regioselektive Oxidation ist daher eine Schlüsselaufgabe für die Herstellung von aktivem Vitamin D3 wie 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten. Die Hydroxylierung nicht-aktivierter C-Atome kann nur durch Radikalreaktionen erreicht werden, die nicht selektiv genug sind, um eine Alkoholfunktion an der gewünschten Position im Molekül einzuführen. Ein Problem ist, dass die meisten Cytochrome P450 nicht in der Lage sind, mit dem externen primären Elektronendonor NAD(P)H direkt zu interagieren, sondern auf ein oder zwei Hilfsproteine angewiesen sind, um Elektronen von NAD(P)H auf das Cytochrom P450 zu übertragen.
Bezüglich der Proteinkomponenten, die an der Elektronentransfer Reaktion beteiligt sind, können die Cytochrom P450 Systeme in verschiedene Klassen eingeteilt werden (Hannemann et al. 2007). Eine der beiden Hauptklassen stellt der mitochondriale/bakterielle Typ der Cytochrom P450 Systeme dar (Klasse I), wo die Elektronen von NAD(P)H durch eine FAD-enthaltende Ferredoxin Reduktase und ein Ferredoxin auf das Cytochrom P450 übertragen werden. Klasse I P450 Systeme umfassen die meisten bakteriellen Cytochrome P450, welche wegen ihrer Löslichkeit einfach zu reinigen und zu handhaben sind.
Die bakteriellen P450 CYP105A1 aus Streptomyces griseolus und CYP107 aus Pseudonocardia autographica sind in der Lage 25-OH-Vitamin D3 und 1α, 25-(OH)₂-Vitamin D3 herzustellen (Sawada N et al., 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 320(1): 156–164; Hayashi K et al., 2010, FEBS J. 277(9):3999–4009; Fujii Y et al.,2009, Biochem. Biophys. Res. Commun. 385(2):170–175). Ein Vorteil wäre ein schnell-wachsendes Zellsystem, das große Mengen an 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten herstellen könnte.
Kleser beschreibt in seiner Dissertation ein rekombinantes Ganzzellsystem bei dem CYP105A1 (R84A/R73V) aus Streptomyces griseolus mit Arh1 (Adrenodoxin Reduktase Homolog 1) und Etp^fd (516–618) aus Schizosaccharomyces pombe in B. megaterium MS941 exprimiert werden. Die Ausbeute an 25-OH-Vitamin D3 liegt bei 0,5 mg/Liter/Kultur/24 Stunden (hrs) (Kleser, M. Dissertation Universität des Saarlandes, 2011, Etablierung einer Biotransformation zur stereoselektiven Hydroxylierung der Sulfonylharnstoffe Glimepirid und Gilbenclamid sowie von Vitamin D3 mit CYP105A1).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines effizienten Herstellungssystems zur Gewinnung von 25-OH-Vitamin und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.
In der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass CYP109E1 und CYP109A2 aus B. megaterium DSM319 effizient regioselektiv Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten und darüber hinaus eine Herstellung in einem Schritt ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst die Aufgabe durch die Bereitstellung eines Expressionsvektors zur Exprimierung eines Proteins, das zur regioselektiven Herstellung von Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten beiträgt, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

i. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt;
ii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert;
iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist;
iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist;
v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

a. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen;
b. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren;
c. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist;
d. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen;
e. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.

Zudem betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Protein bereit, das von der hierin beschriebenen Nukleinsäure kodiert wird.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors, enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure, die die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, 3 und 4; SEQ ID NO: 1, 3 und 5; SEQ ID NO: 1, 3 und 6; SEQ ID NO: 1, 3 und 7, SEQ ID NO: 2, 3 und 4; SEQ ID NO: 2, 3 und 5; SEQ ID NO: 2, 3 und 6 oder SEQ ID NO: 2, 3 und 7 enthält.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors liegt die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 oder 2 stromaufwärts (5‘) in Bezug auf die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 3 im Expressionsvektor vor.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist die Nukleinsäure mit einer optimierten ribosomalen Bindestelle unmittelbar vor die kodierende Sequenz in den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kloniert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist der Expressionsvektor ein induzierbarer Expressionsvektor.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist der Expressionsvektor durch einen Zucker, bevorzugt durch Xylose, induzierbar.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1 Vektor.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1, pSMF2.1CYP109A2, pSMF2.1CYP109E1ArhFld, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx2, pSMF2.1CYP109E1ArhhFdx3, pSMF2.1CYP109E1AFdx4, pSMF2.1CYP109A2ArhFld, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx2, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx3 oder ein pSMF2.1CYP109A2ArhFdx4.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend

i. Exprimieren des erfindungsgemäßen Expressionsvektors in einer Wirtszelle;
ii. Kultivieren der Wirtszelle;
iii. Zusetzen des Substrats Vitamin D3 zu der Kultur;
iv. Gewinnen des entstandenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter 25-OH-Vitamin D3 Derivate.

In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren zusätzlich die Herstellung eines Zellextraktes. Dieser wird vorzugsweise vor Schritt iii) oder iv) hergestellt.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle in dem Verfahren eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle in dem Verfahren eine gram-negative oder gram-positive Zelle.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-negative Zelle eine Zelle der Gattung Escherichia oder Pseudomonas.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-negative Zelle E. coli, P. putila oder P. fluorescens. Einer weiteren Ausführungsform zufolge ist die gram-positive Zelle eine Zelle der Gattung Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus oder Lactococcus.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive Wirtszelle in dem Verfahren eine Zelle aus B. subtilis oder B. megaterium.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive Wirtszelle in dem Verfahren eine Zelle aus B. megaterium.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive Wirtszelle in dem Verfahren eine Zelle aus B. megaterium DM319 oder MS941.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die eukaryotische Wirtszelle eine Hefezelle oder Pilzzelle.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Hefezelle eine Hefezelle der Gattung Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces ist, bevorzugt ist die Hefezelle eine Zelle aus Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces cerevisiae.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Pilzzelle in dem Verfahren eine Pilzzelle der Gattung Ustilago, Aspergillus, Trichoderma oder Neurospora ist.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Pilzzelle in dem Verfahren eine Pilzzelle aus Ustilago maydis, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus itaconius oder Aspergillus flavus.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate in iv) aus der Wirtszelle und/oder dem extrazellulären Raum und/oder dem Medium gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Gewinnung des 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate in iv) die Wirtszelle lysiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Expression des Proteins in i) des Verfahrens induziert, wenn der OD_578nm der Kultur einen Wert von 0,4 erreicht.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in iii) des Verfahrens in einer β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert, die Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zugesetzt.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in iii) des Verfahrens in einer 45 %igen β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert, die 4 mM Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zu 50 ml Medium zugesetzt, wobei die Endkonzentration des β-Hydroxypropyl-Cyclodextrins 2,25 % und die des Saponins 0,2 % beträgt.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in iii) des Verfahrens in einem Schritt zu 25-OH-Vitamin D3 umgesetzt.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins mindestens 5 mg, bevorzugt 10 mg, weiterhin bevorzugt 15 mg, besonders bevorzugt 20 mg, insbesondere bevorzugt 25 mg, weiterhin bevorzugt 30 mg, besonders bevorzugt 40 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins mindestens 26 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in dem Verfahren pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 1 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen werden. Vorzugsweise werden mindestens etwa 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, oder 10 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in dem Verfahren pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 5 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in dem Verfahren gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate in iv) weiter aufbereitet.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Gewinn des 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate in iv) durch folgende Schritte:

1. Stoppen der Reaktion durch Zusetzen von Ethylacetat;
2. Trennen der in den Kulturen enthaltenen wässrigen und organischen Phasen;
3. Isolieren der organischen Phase und Gewinn von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst diese zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle umfassend ein Protein, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst diese zusätzlich Proteine, die von zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren kodiert werden, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen Ausführungsformen zu Wirtszellen, treffen auch auf die vorbeschriebenen Wirtszellen als solche zu.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.
Ein weiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Medizinprodukten.
Ein weiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Untersuchung des 25-OH Vitamin D3 Status und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Diagnostik.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszelle oder eines Zellextraktes davon oder eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren oder einem oder mehrerer Proteine, die von einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Nukleinsäuren kodiert wird, zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Präparation, enthaltend 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate erhältlich aus einem erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Präparation enthält die Präparation pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des vom erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 1 mg oder mehr 25-OH-Vitamin D3.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Präparation, wobei die Präparation eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Schema zur Hydroxylierung von Vitamin D3.
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Adsorptionsspektrum von Fld mit und ohne Arh (A). Adsorptionsspektrum von Fdx2, Fdx3 und Fdx4 (B). UV-Vis-Absorptionsspektren von gereinigten Proteinen: A Fld wurde Semichinon Form (durchgezogene Linie) gereinigt und konnte zu der Hydrochinon-Form (gestrichelte Linie) reduziert und oxidiert werden, um die Chinonform (gepunktete Linie) zu erhalten. (B) Die drei [3 Fe-4S] oder [4Fe-4S]-Cluster Ferredoxine Fdx2 (gepunktete Linie), Fdx3 (durchgezogene Linie) und Fdx4 (gestrichelte Linie), breite Maxima bei 390 nm bis 400 nm charakteristisch für diese Art von Ferredoxin.
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Chromatogramm der Biotransformation von 200 µM Vitamin D3 durch einen Bacillus megaterium Stamm, der CYP109E1 überexprimiert, nach 24h im Vergleich zum Zeitpunkt t0, unmittelbar nach der Substratzugabe ( ). Das Produkt bei 33 min überlagert mit dem Standard 25-OH-Vitamin D3 ( ).
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Chromatogramm der Biotransformation von 200 µM Vitamin D3 durch einen Bacillus megaterium Stamm, der CYP 109-2 überexprimiert, nach 24h im Vergleich zum Zeitpunkt t0, unmittelbar nach der Substratzugabe ( ). Das Produkt bei 33 min überlagert mit dem Standard 25-OH-Vitamin D3 ( ).

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Tabelle mit Überblick über die molaren Extinktionskoeffizienten, die Expressionsausbeute der heterolog in E.coli exprimierten Proteine aus B. megaterium. q = Quinon; sq = Semiquinon; h = Hydrochinon von Fld. Sequenzen Tabelle 1: Sequenzen

SEQ ID NO	Was	Woher	Art	Sequenz-protokoll
SEQ ID NO: 1	CYP109E1	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2	CYP109A2	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 3	Arh1_A18 Ferredoxin- Reduktase (Arh)	S. pombe	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4	Fld (Flavodoxin)	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5	Fdx2 (Ferredoxin 2)	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6	Fdx3 (Ferredoxin 3)	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 7	Fdx4 (Ferredoxin 4)	B. megaterium DSM319	Nukleinsäure	SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8	CYP109E1	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 9	CYP109A2	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 10	Arh1_A18 Ferredoxin- Reduktase (Arh)	S. pombe	Protein	SEQ ID NO: 10
SEQ ID NO: 11	Fld(Flavodoxin)	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12	Fdx2(Ferredoxin 2)	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 12
SEQ ID NO: 13	Fdx3 (Ferredoxin 3)	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14	Fdx4 (Ferredoxin 4)	B. megaterium DSM319	Protein	SEQ ID NO: 14

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthalten die in Tabelle 1 aufgelisteten Sequenzen einen His-Tag. Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, besitzen die in Tabelle 1 aufgelisteten Sequenzen einen Sequenzüberhang, um z.B. eine Klonierung zu ermöglichen.
Im Folgenden sind die erfindungsgemäßen Sequenzen im Einzelnen aufgeführt: Die eigentlichen Gene beginnen jeweils mit ATG und enden mit TAA. Die für die Klonierung in das Ganzzellsystem zusätzlich eingefügten Sequenzen sind unterstrichen. Das His-Tag der Ferredoxine ist kursiv dargestellt. SEQ ID NO:1 CYP109E1 (CYP109-1)
SEQ ID NO:2 CYP109A2 (CYP109-2)
SEQ ID NO:3 Arh1_A18 Ferredoxin-Reduktase (Arh)

SEQ ID NO:4 Fld (Flavodoxin)
SEQ ID NO:5 Fdx2 (Ferredoxin 2)

SEQ ID NO:6 Fdx3 (Ferredoxin 3)
SEQ ID NO:7 Fdx4 (Ferredoxin 4)
SEQ ID NO:8 CYP109E1 (CYP109-1)
SEQ ID NO:9 CYP109A2 (CYP109-2)
SEQ ID NO:10 Arh1_A18 Ferredoxin-Reduktase (Arh)
SEQ ID NO:11 Fld (Flavodoxin)
SEQ ID NO:12 Fdx2 (Ferredoxin 2)
SEQ ID NO:13 Fdx3 (Ferredoxin 3)
SEQ ID NO:14 Fdx4 (Ferredoxin 4)
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Begriff „25-OH-Vitamin D3“ oder „25-OH Vitamin D3“, wie hierin gleichbedeutend verwendet bezieht sich auf Vitamin D3, dass an Position 25 eine Alkoholgruppe trägt.
Der Begriff „25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate“, wie hierin verwendet, ist das Produkt des durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierten Proteins hydroxylierten Vitamin D3s. Zu Vitamin D3 wird in der vorliegenden Erfindung ein Sauerstoffatom an ein Kohlenstoffatom an Position 25 und gegebenenfalls 3 weiteren Positionen aufgenommen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, wird durch das Protein, das von der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 kodiert wird, Vitamin D3 an Position 25 und 3 weiteren Stellen hydroxyliert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Nukleinsäure, wird durch das Protein, das von der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, Vitamin D3 ausschließlich an Position 25 hydroxyliert.
Der Begriff „regioselektiv“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine chemische Reaktion bei der bestimmte Regionen eines Moleküls bevorzugt oder ausschließlich angegriffen werden. In der vorliegenden Erfindung wird Vitamin D3 bevorzugt am C Atom 25 angegriffen (siehe ).
„Hydroxylierung“ oder „hydroxyliert“ bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf die Anfügung eines Sauerstoffatoms an das C-Atom 25 des Vitamin D3 (siehe ) und gegebenenfalls an 3 weiteren Positionen des Vitamin D3. Vorzugsweise verläuft die Anfügung regioselektiv. Das entstandene Produkt kann wie anhand der Beispiele beschrieben analysiert werden.
Der Begriff „Nukleinsäure“, wie hierin verwendet meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure liegt die Nukleinsäure als DNA vor.
Die Begriffe "Genexpression", "Expression" und "exprimieren" werden hierin austauschbar verwendet und meinen das Realisieren der Information, die in einem Nukleinsäuremolekül gespeichert ist.
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäureresten. Die Ausdrücke beziehen sich auf Aminosäurepolymere, die natürlich vorkommenden Aminosäuren als auch Aminosäuren, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist. Die Aminosäure-Polymere können eine beliebige Länge aufweisen.
In der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform besitzt die Nukleinsäure entweder SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure besitzt die Nukleinsäure eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 definiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure besitzt die Nukleinsäure eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 definiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure ein Protein entweder gemäß SEQ ID NO: 8 oder gemäß SEQ ID NO: 9.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 9 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist.
Der Begriff „Teil des von der Nukleinsäure kodierten Proteins kodiert“, wie hierin verwendet meint einen kodierenden Abschnitt auf der Nukleinsäure, der für einen Teil/Abschnitt eines Proteins kodiert.
Der Begriff „Teil eines Proteins der hydroxylierende Aktivität aufweist “, wie hierin verwendet meint einen Teil/Abschnitt eines Proteins, der ausreicht eine hydroxylierende Aktivität zu verwirklichen. Der Begriff „hydroxylierende Aktivität“ wie hierin verwendet meint die Bildung einer Alkohol-Funktion z.B. durch Anfügung eines Sauerstoffatoms an Position C25 des Vitamin D3 und gegebenenfalls 3 weiteren Positionen. Ob ein Teil eines Proteins hydroxylierende Aktivität besitzt kann man z.B. wie in den Ausführungsbeispielen dargelegt prüfen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
"Prozent Identität" oder "% Identität" oder „% identisch“, in Bezug auf eine Nukleinsäure-Sequenz, bezieht sich auf den Anteil der identischen Nukleotide zwischen mindestens zwei Nukleotidsequenzen, wobei die Identität mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) beurteilt wird. Siehe Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247–250. Die BLAST-Maschine ist für die Öffentlichkeit vom National Center für Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD zugänglich.

Um zwei Nukleotidsequenzen auf Identität zu prüfen, benutzt man das Programm zum Vergleich mehrerer Nukleotidsequenzen („blastn“). Das "blastn"-Programm optimiert für sehr ähnliche Sequenzen benutzt folgende Parameter: Tabelle 2: Blast Parameter

Maximale Anzahl von verglichenen Sequenzen die angezeigt werden (Max target sequences)	100
Kurze Anfragen (Short queries)	Ja
Erwartete Anzahl von zufälligen Übereinstimmungen in einem Zufallsmodel-Grenze (Expect threshold)	10
Die Länge einer Nukleinsäure die ein Vergleich initiert (Word size)	28
Maximale Vergleiche in einer Anfrage (Max matches in a query range)	Keine Grenze (0)
Übereinstimmungs-/Nicht-Übereinstimmungs-Auswertung (für Sequenzen die zu 95% konserviert sind) (Match/Mismatch Scores)	1/–2
Übereinstimmungs-/Nicht-Übereinstimmungs-Auswertung (für Sequenzen die zu 75 % konserviert sind) (Match/Mismatch Scores)	1/–1
Kosten einen Spalt zwischen den Basenpaaren in einem Sequenzvergleich einzuführen und zu vergrößern (Gap Costs)	linear
Filter (Filter)	Regionen mit niedriger Komplexität (low complexity regions)
Maske/Abdeckung (Mask)	Maske nur für die Nachschlagetabelle (mask for lookup table only)

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 60 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 70 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 80 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 90 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 95 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 100 % identisch zu einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann es sich zum Beispiel um eine Variante des Proteins handeln, das hydroxylierende Aktivität aufweist (Referenzprotein). Eine "Variante" dieses Referenzproteins bezieht sich auf ein Protein, das eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, Deletionen oder Insertionen in Bezug auf das Referenzprotein besitzt. "Prozent Identität" oder "% Identität", mit Bezug auf Polypeptidsequenzen, bezieht sich auf den Prozentsatz identischer Aminosäuren zwischen mindestens zwei Polypeptidsequenzen ausgerichtet über Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Maschine. Siehe Tatusova et al. (1990) FEMS Microbiol Lett. 174:247–250. Die BLAST-Maschine ist für die Öffentlichkeit über das National Center für Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD zugänglich. Es werden zwei Polypeptidsequenzen mit dem "blastp" (protein-protein blast) Programm verglichen. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Proteinsequenzen mit mindestens 50–100 % Identität mit den Polypeptidsequenzen wie hierin offenbart oder Fragmente und funktional äquivalente Polypeptide davon. In einer Ausführungsform weisen die Polypeptide mindestens 60, vorzugsweise 70, weiterhin bevorzugt 80 oder besonders bevorzugt 85 % Identität mit den erfindungsgemäßen Proteinen auf. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung weisen die Polypeptide mindestens 90 % Identität mit den erfindungsgemäßen Proteinen auf. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung weisen die Polypeptide mindestens 95 % Identität mit den erfindungsgemäßen Proteinen auf. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung weisen die Polypeptide mindestens 97 % Identität mit den erfindungsgemäßen Proteinen auf. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung weisen die Polypeptide mindestens 99 % oder 100 % Identität mit den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen auf.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Unter Hybridisierung eines Nukleinsäure-Moleküls versteht die vorliegende Erfindung, wenn zwei komplementäre Nukleinsäuremoleküle eine Bindung mit Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. „Komplementär“ bedeutet in der vorliegenden Erfindung, dass z.B. ein einzelner DNA-Strang die Basen-Abfolge (Sequenz) des gegenüberliegenden Stranges eindeutig bestimmt, denn jede Base eines DNA-Nucleotids kann nur mit einem festgelegten Partner über Wasserstoffbrückenbindungen eine stabile Beziehung eingehen (Adenin-Thymin und Guanin-Cytosin).
Der hier verwendete Begriff "hybridisieren" bedeutet hybridisieren unter üblichen Bedingungen, wie sie in Sambrook et al. (1989) beschrieben sind, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC (saline-sodium citrate buffer, Puffer z.B. erhältlich bei z.B. AppliChem) bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Wenig stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 37 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 1 × SSC bei Raumtemperatur. "Stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten:
Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS (sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA und 1 % BSA (bovine serum albumin) für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Der Begriff „Teil eines Proteins der Funktion als Redoxpartner aufweist “, wie hierin verwendet meint einen Teil/Abschnitt eines Proteins, der ausreicht eine Funktion als Redoxpartner zu verwirklichen.
Der Begriff „Funktion als Redoxpartner“, wie hierin verwendet meint die Eigenschaft die Elektronen von NAD(P)H z.B. durch eine FAD-enthaltene Ferredoxin Reduktase und ein Ferredoxin auf ein Zielmolekül zu übertragen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn das Zielmolekül CYP109E1 und/oder CYP109A2 ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn das Zielmolekül CYP109E1 ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn das Zielmolekül CYP109A2 ist (siehe auch Tabelle 1).
Ob ein Teil eines Proteins eine Funktion als Redoxpartner aufweist kann man z.B. wie in den Ausführungsbeispielen dargelegt indirekt an der Hydroxylierung von Vitamin D3 prüfen.
Der Begriff „Expressionsvektor“, wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst. Der Expressionsvektor ist beispielsweise ein rekombinanter Expressionsvektor.
Der Expressionsvektor kann hergestellt werden, indem ein Plasmid, ein Phage, ein YAC (Yeast artificial chromosome), ein BACs (Bacterial artificial chromosome) ein PAC (P1 artificial chromosome), ein Virus oder ein Cosmid als nicht beschränkende Beispiele verwendet werden. Des Weiteren kann der Expressionsvektor mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt werden. Die Art des Vektors ist nicht im Besonderen beschränkt, solange er in einer Wirtszelle exprimiert wird. Genauer werden solche Vektoren hergestellt durch den Einbau einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in ein Plasmid, ein Phage, ein YAC (Yeast artificial chromosome), ein BACs (Bacterial artificial chromosome) ein PAC ein Virus oder ein Cosmid zusammen mit einer Promotorsequenz, die auf geeignete Weise ausgewählt wurde, um eine Genexpression zu gewährleisten.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1, 3 und 4.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1, 3 und 5.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1, 3 und 6.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1, 3 und 7.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2, 3 und 4.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2, 3 und 5.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2, 3 und 6.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2, 3 und 7.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für das Proteine der SEQ ID NO: 8 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für das Protein der SEQ ID NO: 9 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 8, 10 und 11 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 8, 10 und 12 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 8, 10 und 13 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 8, 10 und 14 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 9, 10 und 11 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 9, 10 und 12 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 9, 10 und 13 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält der Expressionsvektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für die Proteine der SEQ ID NO: 9, 10 und 14 kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors liegt die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 oder 2 stromaufwärts (5‘) der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 3 im Expressionsvektor vor.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ist eine optimierte ribosomale Bindestelle unmittelbar vor die erfindungsgemäße Nukleinsäure kloniert.
Der Begriff „vor“ im Zusammenhang mit einer Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Position stromaufwärts (5‘) auf der Nukleinsäure.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor oder rekombinanter Expressionsvektor umfasst Expressionskontrollregionen (zum Beispiel Promotor, Terminator und/oder Replikationsursprung), die abhängig von der Art der angestrebten Wirtszelle variieren können. Prinzipiell kann der Promotor auch ein induzierbarer oder reprimierbarer Promotor sein, der durch Umweltfaktoren wie z.B. Licht, Temperatur oder bestimmte chemische Verbindungen aktiviert oder reprimiert wird.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Promoter ein induzierbarer Promoter.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Promoter durch einen Zucker induzierbar.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Promoter durch Xylose bevorzugt durch 0,5 % (w/v) Xylose induzierbar.
Als Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, soweit er in einer Wirtszelle exprimiert werden kann. Insbesondere können für Bakterienexpressionsvektoren Promotoren wie z.B. trp-Promotor (Ptrp), lac-Promotor (P lac), PL-Promotor, PR-Promotor, PSE-Promotor und dergleichen, SPO1-Promotor, SPO2-Promotor, penP Promotor, trc Promoter, tac Promoter oder T7 Promotor verwendet werden. Alternativ kann der Promoter künstlich konstruiert und verändert werden wie z.B. ein Promotor, bei dem zwei Ptrp (s) in Reihe geschaltet sind (Ptrpx2), tac-Promotor und lacT7 Promotor.
Als Promotor kann ebenso jeder Promotor soweit er in Hefe exprimiert werden kann, verwendet werden. Als Hefepromotoren werden zum Beispiel ein ADO1(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PHO5(saure Phosphatase)-Promotor, PGK1(Phosphoglycerat-Kinase-)Promotor, GAPDH(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase)-Promotor, GAL1(Galaktosekinase)-Promotor, GAL10(UDP Galaktose-4-Epimerase)-Promotor, MFα1(α Pheromon)-Promotor, CUP1 (Metallothionein)-Promotor und dergleichen verwendet. Ein pna2/tpi hybrid Promoter, gpdA Promoter, TAKA-A amylase Promoter, glaA Promoter, niiA Promoter, cbhI Promoter, ctr4 Promoter, thiA Promoter oder trpC-Promotor wird zum Beispiel als Promotor für filamentöse Pilze verwendet.
Einige Beispiele für Expressionsvektoren in die die erfindungsgemäße Nukleinsäure kloniert werden kann sind: Gateway^® pDEST^TM14 Vector; Gateway^® pDEST^TM17 Vector; Gateway^® pDEST^TM24 Vector pRSET A, B, & C pTrcHis2 A, B, & C Vector, pAO815 Vector, pPICZ A, B, & C und dergleichen (alle beziehbar bei Invitrogen), VariFlex, ZAP Express EcoR I/CIAP-Treated Vector und weitere (erhältlich bei Stratagene), pQE-80L, pQE-81L, and pQE-82L Vectors, pQE-TriSystem Vectors (erhältlich bei Addgene) und dergleichen, Pgrac100 Expression Vectors, pHT01, pHT43 (MoBiTec); PichiaPink^TM Expression (Life Technologies), YES^TM Vector collection (Invitrogen), IP-Free^© Yeast Expression Vectors (DNA2.0), pUXV3, pU2X1 (addgene), sowie weitere Expressionsvektoren die frei erhältlich sind z.B. pHS19, pHS15 und dergleichen. Bevorzugte Expressionsvektor, die verwendet werden können sind pCR4-TOPO Vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA); pET17b oder pSMF2.1.
Ein Expressionsvektor kann auch vom Fachmann mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt und/oder optimiert werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pET17b Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pCR4-TOPO Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1 Vektor. Dies bedeutet, dass eine Sequenz, die für CYP109E1 kodiert (siehe z.B. Tabelle 1) in einem pSMF2.1 Vektor vorliegt.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Vektor ein pSMF2.1CYP109A2 Expressionsvektor. Dies bedeutet, dass eine Sequenz, die für CYP109A2 kodiert (siehe z.B. Tabelle 1) in einem pSMF2.1 Vektor vorliegt.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1ArhFld Vektor. Dies bedeutet, dass eine Sequenz, die für CYP109E1, Arh und Fld kodiert (siehe Tabelle 1) in einem pSMF2.1 Vektor vorliegt. In diesem Sinne sind auch die folgenden Ausführungsformen zu verstehen.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1ArhFdx2 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1ArhFdx3 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1ArhFdx4 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109A2ArhFld Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109A2ArhFdx2 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109A2ArhFdx3 Vektor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109A2ArhFdx4 Vektor.
Es kann davon ausgegangen werden, dass die in Tabelle 1 genannten Gene, auch einzeln in verschiedenen Vektoren vorliegen können. Z.B. könnte in so einem Fall eine Wirtszelle mit verschiedenen Vektoren gleichzeitig transfektiert oder transformiert werden. Die erzielten Ausbeuten sollten erwartungsgemäß ähnlich einem erfindungsgemäßen Verfahren sein.
Das Protein das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure vom Expressionsvektor exprimiert wird, kann als Fusionsprotein exprimiert werden. Als Fusionspartner können Proteine gewählt werden, die von der ausgesuchten Wirtszelle z.B. hoch exprimiert werden und/oder sich gut aufreinigen lassen. Als Fusionspartner können unter anderem folgende in Frage kommen: Polyhistidin, Polyarginin, Polyaspartat, Polycystein, Polyphenylalanin, Myc, Flag, Glutathion-S-Transferase, Protein A, Maltose bindendes Protein, Glactose bindendes Protein oder Chloramphenicol-Acetyltransferase. Zwischen der Nukleinsäure und dem Fusionspartner kann auch eine sogenannte „linker region“ liegen, die z.B. für eine Protease-Erkennungssequenz kodiert, um das Protein des Interesses vom Fusionsprotein trennen zu können. Das Protein kann weiterhin direkt exprimiert werden, wobei die Nukleinsäure direkt hinter die Kontrollregion des Expressionsvektors inseriert wird. Zur Erleichterung der anschließenden Reinigung oder zu anderen Zwecken kann bei der Konstruktion des Vektors N-oder C-terminal an die inserierte Nukleinsäure die Sequenz für eine kurze Peptidsequenz („tag“) angehängt werden, die eine affinitätschromatographische Reinigung des „tagged“-Proteins erlaubt.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann gemäß gewöhnlicher Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Restriktionsenzymen und/oder Ligasen. Die Transformation der Wirte mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor kann ebenfalls gemäß herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden.
Als ein Verfahren zum Einführen eines rekombinanten Vektors, kann jedes Verfahren verwendet werden, solange es ein Verfahren zur Einführung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors in die erfindungsgemäße Wirtszelle ist. Beispiele sind ein Verfahren der Elektroporation (Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)), eine Calciumphosphat-Methode (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 69, 2110 (1972) oder eine Lipofektion (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, 7413 (1987)).
In der vorliegenden Erfindung kann z.B. der B. megaterium Stamm MS941, eine Mutante des B. megaterium Stammes DSM319 (Wittchen und Meinhardt, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:871–877), für Ganzzellumsätze verwendet werden. B. megaterium MS941 wird z.B. mit Hilfe der Polyethylenglykol vermittelten Protoplastentransformation mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert (Barg et al., 2005, vol 18. Microbial processes and products, 1st edn. Humana Press, Inc, Totowa:205–223).
Verschiedene Marker können verwendet werden, um zu überprüfen, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Wirtszelle eingebaut worden ist, oder ob das Protein, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird, erfolgreich in der Wirtszelle exprimiert wird. Der Marker wird mit einem Träger wie beispielsweise einem Expressionsvektor zusammen mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure eingebaut und in die Wirtszelle eingeführt. Die erfolgreiche Aufnahme der Nukleinsäure kann durch Überprüfen der Expression des Markers in der Wirtszelle, die den Expressionsvektor eingebaut hat und/oder exprimiert, bestätigt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Protein in Form eines Fusionsproteins in der Wirtszelle exprimiert werden. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Protein als Fusionsprotein mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP), das von Aequorea victoria stammt, exprimiert werden. In diesem Fall würde GFP als Marker verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend das Exprimieren des erfindungsgemäßen Expressionsvektors in einer Wirtszelle.
Die „Wirtszelle“ ist nicht im Besonderen eingeschränkt und verschiedene, üblicherweise erhältliche Zellen können verwendet werden. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle. Bei der eukaryotischen Zelle ist eine Hefezelle oder Pilzzelle bevorzugt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, ist die Wirtszelle eine gram-negative oder gram-positive Zelle. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-negative Zelle eine Zelle der Gattung Escherichia oder Pseudomonas. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-negative Zelle E. coli, P. putila oder P. fluorescens.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive Zelle eine Zelle der Gattung Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus oder Lactococcus. Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive Zelle eine Zelle aus B. subtilis oder B. megaterium
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive eine Zelle aus B. megaterium DM319
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die gram-positive eine Zelle aus B. megaterium MS941.
Bacillus megaterium (B. megaterium) ist ein Gram-positives, Sporen bildendes, hauptsächlich aerobes Bakterium. Seine Fähigkeit, auf verschiedenen Kohlenstoffquellen zu wachsen, macht diesen Organismus zu einem idealen industriellen Produktionswirt (Vary et al. 2007), welcher bisher vorwiegend für die Proteinproduktion eingesetzt wurde. Zu den von B. megaterium hergestellten Produkten gehören industrielle Enzyme wie Penicillin Acyclase oder verschiedene Amylasen, Vitamine und diagnostische Enzyme (Vary et al. 2007). Bacillus megaterium ist vorteilhaft, da es ist nicht pathogen ist und die Plasmide in der Zelle stabil hält. Weiterhin produziert es keine alkalischen Proteasen, so dass es idealerweise dazu geeignet ist, homologe und heterologe extrazelluläre Proteine zu produzieren (Sussman et al. 1988; Meinhardt et al. 1989; Malten et al. 2005; Richhardt et al. 2010).
Weitere mögliche prokaryotische Wirtszellen umfassen: Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Hefezelle eine Hefezelle der Gattung Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Hefezelle aus Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces cerevisiae.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Pilzzelle eine Pilzzelle der Gattung Ustilago, Aspergillus, Trichoderma oder Neurospora. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Pilzzelle eine Zelle aus Ustilago maydis, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus itaconius oder Aspergillus flavus.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle.
Grundsätzlich wird das Medium in dem die Wirtszelle kultiviert wird auf die Bedürfnisse der Wirtszelle abgestimmt. Neben Wasser kann das Medium kulturspezifische Nährstoffe und -salze enthalten. Diese Nährstoffe können Kohlenhydrate, Proteine und/oder Fettsäuren sein. Nährsalze wie z.B. Ammonium, Kalium, Natrium, Magnesium, Phosphat und Sulfat können auch enthalten sein. Weitere mögliche Bestandteile sind: Puffersubstanzen, Indikatoren, Farbstoffe, Hemmstoffe (z.B. Antibiotika), selektive Agentien (z.B. Chloramphenicol), Wachstumshilfstoffe wie z.B. Hormone, Vitamine oder ähnliches, Biomaterialien und Verdickungsmittel.
Gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Wirtszelle in einem Komplexmedium kultiviert wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 5 ml und 1000 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 500 Liter.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 40 ml und 500 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 300 Liter.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 40 ml und 250 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 100 Liter.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 40 ml und 100 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 500 Liter.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 40 ml und 50 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 25 Liter.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge zwischen 40 ml und 1 Liter vor, beispielsweise in einer Menge von 1 Liter.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge von 1 Liter vor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge von 750 ml vor.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Komplexmedium in einer Menge von 250 ml vor.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht das Komplexmedium aus Hefextrakt, Soyton, KH₂PO₄ und K₂HPO₄. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Komplexmedium zusätzlich Tetracyclin.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht das Komplexmedium aus 24 g/l Hefextrakt, 12 g/l Soyton, 2.31 g/l KH₂PO₄ und 12.5 g/l K₂HPO₄. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Komplexmedium zusätzlich 10 µg/ml Tetracyclin.
Der pH der Kultur ist beliebig unter Berücksichtigung eines optimalen pH für die vorliegende Wirtszelle. Ebenso kann die Kultur unter aeroben und/oder anaeroben Bedingungen kultiviert werden, je nachdem was die Wirtszelle benötigt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Kulturen in einem geeigneten Gefäß kultiviert, das auch für die entsprechende Medienmengen geeignet ist. Als nicht beschränkende Beispiele können die Kulturen z.B. in einem Schikanekolben oder einem Bioreaktor kultiviert werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine einzelne B. megaterium Kolonie in einem 300 ml Schikanekolben in 50 ml Komplexmedium angeimpft und über Nacht inkubiert. 50 ml Komplexmedium, das mit 10 µg/ml Tetracyclin supplementiert wird, wird mit 500 µl der Übernachtkultur angeimpft und weiter kultiviert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Volumen der Kultur auf 750 ml erhöht.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 0 °C bis 70 °C, beispielsweise bei 45 °C statt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 10 °C bis 60 °C, beispielsweise bei 40 °C statt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 °C bis 50 °C, beispielsweise bei 35 °C statt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 25 °C bis 40 °C, beispielsweise bei 32 °C statt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung bei einer Temperatur von 30 °C statt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung unter Schütteln statt. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 1 und 1500 rpm (revolutions per minute) bewegt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 10 und 1300 rpm bewegt. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 20 und 1100 rpm bewegt. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 30 und 1000 rpm bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 40 und 800 rpm bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 50 und 600 rpm bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 60 und 400 rpm bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 70 und 300 rpm bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultur zwischen 80 und 200 rpm bewegt wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Kultivierung unter Schütteln bei 180 rpm statt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Proteinexpression durch die Zugabe eines Induktors wie 0,5% (w/v) Xylose induziert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Proteinexpression durch die Zugabe eines Induktors vorzugsweise 0,5% (w/v) Xylose induziert, sobald die OD_578nm einen Wert von 0,4 erreicht.
Ein sogenannter „Induktor“ oder „induziert“ wie in der vorliegenden Erfindung verwendet bezieht sich auf einen Umweltfaktor, der die Expression des von dem Expressionsvektor kodierten Proteins, auslöst/anstößt. Mögliche Induktoren sind Licht, Temperatur, Zucker, Arabinose oder Rhamnose aber auch andere passende Induktoren, die z.B. auf die oben genannten Promotoren wirken können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend das Zusetzen des Substrats Vitamin D3 zu der Kultur. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in einem Zeitraum zwischen sofort und 76 Stunden nach der Induktion zugegeben, beispielsweise nach 48 Stunden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in einem Zeitraum zwischen 1 Stunde und 48 Stunden nach der Induktion zugegeben, beispielsweise nach 40 Stunden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in einem Zeitraum zwischen 2 Stunden und 36 Stunden nach der Induktion zugegeben, beispielsweise nach 30 Stunden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in einem Zeitraum zwischen 3 Stunden und 24 Stunden nach der Induktion zugegeben, beispielsweise nach 24 Stunden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 24 Stunden nach der Induktion zugegeben.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 vor der Zugabe so verändert, dass die chemische Stabilität oder Löslichkeit des Substrats in Wasser erhöht wird, oder die Hemmung des Substrats durch ein Enzym oder Mikroorganismus verringert wird. Beispiele für ein solches Mittel sind Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin, α, β oder γ-Cyclodextrin oder Derivate davon oder Methyl-β-Cyclodextrin (Me-β-CD). Vorzugsweise wird Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin zugegeben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man durch Steigerung der Membranpermeabilität der Wirtszelle die Produktbildung für das Substrat erhöhen. Einige Substanzen die hierfür verwendet werden können sind z.B. Methanol, Aceton, Tween, Triton X, Rhamnolipid oder Saponin, vorzugsweise wird Saponin verwendet.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Vitamin D3 vor der Zugabe solubilisiert. Beispielsweise wird das Substrat Vitamin D3 mit einer β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert, die Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zugesetzt.
Vorzugsweise wird das Substrat mit einer 45 %igen β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert, die 4 mM Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zu 50 ml Medium zugesetzt wird, wobei die Endkonzentration des β-Hydroxypropyl-Cyclodextrins 2,25 % und die des Saponins 0,2 % beträgt.
Gemäß einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 in einem Schritt zu 25-OH-Vitamin D3 hydroxyliert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 5 Minuten bis zu 76 Stunden umgesetzt bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Der Begriff „umgesetzt“ bedeutet in der vorliegenden Erfindung, dass das Substrat Vitamin D3 während dieser Zeit in Kontakt mit einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder mit einem erfindungsgemäßen Zellextrakt verbleibt. Es handelt sich um die Zeit zwischen Zugabe des Substrates und dem Gewinn des Produktes 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate. Optimaler Weise verringert sich mit der Zeit der Anteil an Vitamin D3, wenn man es mit der Menge an Vitamin D3 bei Zugabe vergleicht, da es immer mehr zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate umgewandelt wird. Bei einem induzierbaren Expressionsvektor bemisst sich die Zeit von der Induktion (dem Beginn der Expression des erfindungsgemäßen Expressionsvektors) bis zum Gewinn des Produktes 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 30 Minuten bis zu 76 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 1 Stunde bis zu 36 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 1 Stunde bis zu 30 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 2 Stunden bis zu 26 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für einen Zeitraum von 3 Stunden bis zu 24 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Substrat Vitamin D3 für 24 Stunden umgesetzt, bevor 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend das Gewinnen des entstandenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate.
Ein Verfahren zum Gewinn/Aufreinigen/Isolieren des vorliegenden 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate kann durch ein herkömmliches Verfahren, das in der Technik gut bekannt ist, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Verfahren zum Gewinn/Aufreinigen ähnlich wie in Sadler et al. (Methods in Enzymology, 83, 458) beschrieben, verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewonnene oder gebildete 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate aus der Wirtszelle und/oder dem extrazellulären Raum und/oder dem Medium gewonnen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewonnene oder gebildete 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate aus der Wirtszelle und dem extrazellulären Raum und dem Medium gewonnen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate aus dem Medium gewonnen. Das in einer Wirtszelle und/oder dem extrazellulären Raum und/oder dem Medium vorliegende 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate können mit einem geeigneten Puffer gewaschen, oder mit Beschallung lysiert, einer Französischen Presse, einem Homogenisator, einem Zerkleinerer oder dergleichen lysiert werden. Das 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate können auch als zellfreie Lösung durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen werden.
Ein Puffer, der zum Gewinn/Aufreinigen des 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate verwendet werden kann, kann eine geeignete Menge eines Tensids enthalten, beispielsweise Natriumlaurylsulfat (SDS), N-Lauroylsarcosin-Natrium (Sarcosil) oder dergleichen.
Der Gewinn/Aufreinigung/Isolierung des erhaltenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate kann durch die Kombination oder einzelner der an sich bekannten verschiedenen Gewinn/Aufeinigungs-Verfahren durchgeführt werden. Beispiele dieser bekannten Verfahren sind Lösungsmittel-Extraktionsverfahren, Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder dergleichen, ein Dialyse-Verfahren, eine Ausfällung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, ein Ultrafiltrationsverfahren, eine Gelfiltration, verschiedene chromatographische Verfahren, wie Diethylaminoethyl(DEAE)-Sepharose-Chromatographie, Anionenchromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines Harzes, unter Verwendung von Kationen-Lysin wie S-Sepharose FF und ähnlichem, hydrophobe Chromatographie unter Verwendung von Butyl-Sepharose oder dergleichen, Affinitätschromatographie, verschiedener Elektrophoresen wie SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung und dergleichen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Gewinnung des 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate die Wirtszelle lysiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate weiter aufbereitet.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren zusätzlich das Lysieren der Wirtszelle. Bevorzugt findet die Lyse der Wirtszelle vor Schritt iii. oder iv. des erfindungsgemäßen Verfahrens statt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Wirtszelle vor, nach oder beim Exprimieren des erfindungsgemäßen Expressionsvektors lysiert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Wirtszelle vor, nach oder beim Kultivieren lysiert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Wirtszelle vor, nach oder beim Zusetzen des Substrates zur Kultur lysiert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Wirtszelle vor, nach oder beim Gewinn des entstandenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate lysiert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Gewinnung des 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate in iv. die Wirtszelle lysiert.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 5 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 10 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 15 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 20 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 25 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 26 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 30 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens etwa 40 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression von CYP109E1 mindestens 77 mg Vitamin D3 umgesetzt, wobei mindestens 34 % auf 25-OH-Vitamin D3 entfallen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 1 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 2 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 3 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 4 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 5 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 10 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 15 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 20 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des CYP109A2 mindestens etwa 25 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Gewinn des 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate durch folgende Schritte:

Bevorzugt werden die Kulturen nach einer angemessenen Umsatzzeit zentrifugiert und der Überstand ein- oder zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden z.B. an einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-114 von Büchi) eingedampft und bei –20 °C gelagert. Die Aufreinigung und Isolierung/der Gewinn der Produkte aus dem Extrakt erfolgt z.B. mittels semi-präparativer HPLC-Trennung unter Verwendung einer reversed-phase ec MN Nucleodur C₁₈ (5 µm, 8.0 × 250 mm) Säule (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA).
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses zusätzlich das Herstellen eines Zellextraktes. Der Begriff „Zellextrakt“ wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, meint, dass die Wirtszelle lysiert wurde und kann alle Bestandteile der Zelle beinhalten. Eine Möglichkeit, ein Zellextrakt herzustellen ist, dass man zuerst die Zellen in einem geeigneten Puffer wie z.B. das Medium in dem die Zellen enthalten sind zentrifugiert und anschließend das Pellet in einem geeigneten Puffer resuspensiert. Durch mehrmaliges Einfrieren/Auftauen z.B. bei –196 °C/37 °C können die Zellen lysiert werden. Alternativ kann auch eine alkalische Lyse oder mechanische Lyse benutzt werden. Wahlweise können die Zelltrümmer durch erneute Zentrifugation sedimentiert und der Überstand als das Zellextrakt weiterbenutzt werden. Bevorzugter Weise geht durch die Behandlung der Wirtszelle keine Enzymaktivität verloren. Dies kann man in einem Aktivitätstest im Vergleich zu unbehandeltem Enzym feststellen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung des Zellextraktes vor Schritt iii oder iv. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung des Zellextraktes vor der Zugabe des Substrates.
Es kann davon ausgegangen werden, dass mit einem Zellextrakt ähnliche Ausbeuten an 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate, wie mit einem erfindungsgemäßen Verfahren, erreicht werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung des Zellextraktes vor dem Gewinn des entstandenen 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate.
Dem Zellextrakt und der Wirtszell-Kultur können vor, zeitgleich oder nach der Zugabe des Substrates Vitamin D3 verschiedene Proteine zugegeben werden. Dem Zellextrakt und der Wirtszell-Kultur können z.B. ein NAD(P)H regenerierendes System zugegeben werden. Vorzugsweise enthält dieses regenerierende System MgCL₂, Glukose-6-Phosphat und Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase, weiterhin bevorzugt 1 mM MgCL₂, 5 mM Glukose-6-Phosphat und 1 U Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase. Dem Zellextrakt und der Wirtszell-Kultur kann weiterhin NADPH zugegeben werden. Dem Zellextrakt kann außerdem ein Ferredoxin beispielsweise aus Spinacia oleracea, Clostridium pasteurianum, Spirulina sp oder Porphyra umbilicalis und/oder z.B. eine Ferredoxin-Reduktase aus Spinacia oleracea (alle erhältlich bei Sigma-Aldrich) zugegeben werden. Auch ein Flavodoxin kann zu dem Zellextrakt hinzugegeben werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Proteine, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden zum Zellextrakt oder der Wirtszell-Kultur gegeben.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst diese zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Protein, dass von einer Nukleinsäure kodiert wird ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst diese zusätzlich Proteine, wobei diese Proteine von mindestens zwei Nukleinsäuren kodiert werden, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.
Der Begriff „Nahrungsmittel“ wie in der vorliegenden Erfindung benutzt, bezeichnet Lebensmittel, die vorwiegend der Ernährung des Menschen oder eines Tieres dienen, Makronährstoffe (Proteine, Kohlenhydrate und Lipide) enthalten. Danach zählen zu den Lebensmitteln alle Stoffe und Erzeugnisse, die dazu bestimmt sind oder von denen nach vernünftigem Ermessen erwartet werden kann, dass sie in verarbeitetem, teilweise verarbeitetem oder unverarbeitetem Zustand von Menschen oder Tieren aufgenommen werden können.
Zur Ergänzung der Nahrung gibt es Produkte mit ernährungsphysiologisch relevanten Inhaltsstoffen in meist konzentrierter Form die als „Nahrungsergänzungsmittel“ bezeichnet werden. Der Begriff „Nahrungsergänzungsmittel“ wie in der vorliegenden Erfindung benutzt, sind Produkte zur erhöhten Versorgung des menschlichen oder tierischen Stoffwechsels mit bestimmten Nähr- oder Wirkstoffen.
Der Begriff Nahrungsergänzungsmittel, wie in der vorliegenden Erfindung genutzt ist ein Nahrungsmittel, das

1. dazu bestimmt ist, die allgemeine Ernährung zu ergänzen,
2. ein Konzentrat von Nährstoffen oder sonstigen Stoffen mit ernährungsspezifischer oder physiologischer Wirkung allein oder in Zusammensetzung darstellt und
3. in dosierter Form, insbesondere in Form von Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pillen, Brausetabletten und anderen ähnlichen Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsformen von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme in abgemessenen kleinen Mengen in den Verkehr gebracht wird.

Typische nicht beschränkende Inhaltsstoffe für Nahrungsergänzungsmittel sind z.B. Mineralstoffe, Vitamine und Antioxidantien, Anthocyane, Coenzym Q10, Kreatin, L-Carnitin, Phytoöstrogene, Coenzym Q10, Carnitin, Inositol, Cholin Amygdalin (Lätril), Chlorophyll und Flavonoide.
Beispiele für Nahrungsmittel, denen nahrungsergänzungsmittelhaltiges 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate zugesetzt werden können, oder die nahrungsergänzungsmittelhaltiges 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate enthalten, sind Getränke, Fruchtriegel, Kekse und Milchprodukte, beispielsweise Joghurts, Quark, Molkezubereitungen, Buttermilch und Kefir; können Trockenfutter und Feuchtfutter oder in eine Teigmasse gerührt oder wie Streusel auf ein Produkt aufgebracht werden.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Medizinprodukten.
Der Begriff „Medizinprodukt“ wie in der vorliegenden Erfindung verwendet bezieht sich auf alle einzeln oder miteinander verbunden verwendeten Instrumente, Apparate, Vorrichtungen, Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen.
Diese sind dazu bestimmt im oder am menschlichen oder tierischen Körper weder pharmakologisch noch immunologisch den Metabolismus zu erreichen, deren Wirkungsweise aber eben solche Mittel unterstützten kann. Als nicht begrenzende Beispiele sind zu nennen: Pflaster, Kompressen, Spritzen (nur Spritzenkörper), Kanülen, Stoma-Artikel, chirurgische Instrumente, Katheter, Implantate, Infusionspumpen, aber auch Kapseln oder Tabletten.
Ein Medizinprodukt kann auch ein In-vitro-Diagnostikum, das als Reagenz, Reagenzprodukt, Kalibriermaterial, Kontrollmaterial, Kit, Instrument, Apparat, Gerät oder System einzeln oder in Verbindung miteinander nach Zweckbestimmung zur In-vitro-Untersuchung von aus dem menschlichen oder tierischem Körper stammenden Proben einschließlich Blut- und Gewebespenden bestimmt ist und ausschließlich oder hauptsächlich dazu dient, Informationen zu liefern

1. über physiologische oder pathologische Zustände oder
2. zur Überwachung therapeutischer Maßnahmen.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Untersuchung des 25-OH Vitamin D3 Status und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Diagnostik.
Eine Methode um 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate nachzuweisen ist eine Auswertung eines Probenmaterials z.B. einer Blutprobe, die von der zu testenden Person oder des zu testenden Tieres erhalten wurde, mittels eines 25-OH Vitamin D ELISA (z.B. von Immundiagnostik). Oder eine Auswertung der Proben mittels Referenzmethoden wie HPLC oder LC-MS/MS. Bevorzugt handelt es sich um eine in vitro Methode. Bei dem zu testenden Tier handelt es sich vorzugsweise um Hund, Katze, Maus, Ratte, Pferd, Schlange, Schwein, Rind, Schaf, Kaninchen, Hase, und dergleichen.
Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszelle oder des erfindungsgemäßen Zellextraktes oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, oder eines Proteins, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird, zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Präparation, enthaltend 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate erhältlich aus einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Der Begriff „Präparation“ bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf eine Aufreinigung/Isolierung/Gewinnung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, eine Isolierung/Gewinnung von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, von einem Protein, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird oder eine Aufreinigung/Isolierung/Gewinnung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors aus der Wirtszelle, aus dem die Wirtszelle enthaltenen Medium und/oder aus dem gewonnenen Zellextrakt.
Außerdem können auch nur ein oder mehrere Fragmente/Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder dem Protein, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird in der Präparation enthalten sein. Dies kann man z.B. mittels PCR und entsprechend hergestellten Primern prüfen.
Gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation wird das Protein, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird aus der Wirtszelle, aus dem die Wirtszelle enthaltenen Medium und/oder aus dem gewonnenen Zellextrakt aufgereinigt/gewonnen/isoliert.
Gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation wird 25-OH Vitamin D3 aus der Wirtszelle, aus dem die Wirtszelle enthaltenen Medium und/oder aus dem gewonnenen Zellextrakt aufgereinigt/gewonnen/isoliert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation werden andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate als 25-OH-Vitamin D3 aus der Wirtszelle, aus dem die Wirtszelle enthaltenen Medium und/oder aus dem gewonnenen Zellextrakt aufgereinigt/gewonnen/isoliert.
Gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation wird der erfindungsgemäße Expressionsvektor aus der Wirtszelle und/oder aus dem gewonnenen Zellextrakt aufgereinigt/gewonnen/isoliert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation, enthält die Präparation pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des vom erfindungsgemäßen Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 1 mg oder mehr 25-OH-Vitamin D3.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation, wobei die Präparation eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die folgenden Ausführungsformen, die im Folgenden als Punkte aufgelistet sind:

1. Expressionsvektor zur Exprimierung eines Proteins, das zur regioselektiven Herstellung von Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten beiträgt, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend: i. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; ii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
2. Expressionsvektor nach Ausführungsform 1 dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: a. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; b. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; c. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; d. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; e. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
3. Expressionsvektor nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei der Expressionsvektor eine Nukleinsäure enthält, die die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1, 3 und 4; SEQ ID NO: 1, 3 und 5; SEQ ID NO: 1, 3 und 6; SEQ ID NO: 1, 3 und 7, SEQ ID NO: 2, 3 und 4; SEQ ID NO: 2, 3 und 5; SEQ ID NO: 2, 3 und 6 oder SEQ ID NO: 2, 3 und 7 enthält.
4. Expressionsvektor nach einer der Ausführungsformen 1–3, wobei die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 oder 2 stromaufwärts (5‘) in Bezug auf die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 3 liegt.
5. Expressionsvektor nach einer der Ausführungsformen 1–4, wobei die Nukleinsäure mit einer optimierten ribosomalen Bindestelle unmittelbar vor die kodierende Sequenz kloniert ist.
6. Expressionsvektor nach einer der Ausführungsformen 1–5, wobei der Expressionsvektor ein induzierbarer Expressionsvektor ist.
7. Expressionsvektor nach einer der Ausführungsformen 1–6, wobei der induzierbare Expressionsvektor durch einen Zucker, bevorzugt Xylose, induzierbar ist.
8. Expressionsvektor nach einer der Ausführungsformen 1–7, wobei der Expressionsvektor ein pSMF2.1 Vektor ist.
9. Expressionsvektor nach Ausführungsform 8, wobei der Expressionsvektor ein pSMF2.1CYP109E1, pSMF2.1CYP109A2, pSMF2.1CYP109E1ArhFld, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx2, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx3, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx4, pSMF2.1CYP109A2ArhFld, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx2, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx3 oder ein pSMF2.1CYP109A2ArhFdx4 ist.
10. Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend i. Exprimieren des in den Ausführungsformen 1–9 definierten Expressionsvektors in einer Wirtszelle; ii. Kultivieren der Wirtszelle; iii. Zusetzen des Substrats Vitamin D3 zu der Kultur; iv. Gewinnen des entstandenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter 25-OH-Vitamin D3 Derivate.
11. Verfahren nach Ausführungsform 10, wobei das Verfahren zusätzlich das Herstellen eines Zellextraktes umfasst, vorzugsweise wird der Zellextrakt vor Schritt iii) oder iv) hergestellt.
12. Verfahren nach Ausführungsform 10 oder 11, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist.
13. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die Wirtszelle eine gram-negative oder gram-positive Zelle ist.
14. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die gram-negative Zelle eine Zelle der Gattung Escherichia oder Pseudomonas ist.
15. Verfahren nach Ausführungsform12, wobei die gram-negative Zelle E. coli, P. putila oder P. fluorescens ist.
16. Verfahren nach Ausführungsform12, wobei die gram-positive Zelle eine Zelle der Gattung Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus oder Lactococcus ist.
17. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die gram-positive Zelle eine Zelle aus B. subtilis oder B. megaterium, vorzugsweise B. megaterium, weiterhin bevorzugt aus B. megaterium DM319 oder MS941 ist.
18. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die eukaryotische Zelle eine Hefezelle oder Pilzzelle ist.
19. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die Hefezelle eine Hefezelle der Gattung Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces ist, bevorzugt ist die Hefezelle eine Hefezelle aus Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces cerevisiae.
20. Verfahren nach Ausführungsform 12, wobei die Pilzzelle eine Pilzzelle der Gattung Ustilago, Aspergillus, Trichoderma oder Neurospora ist, bevorzugt ist die Pilzzelle eine Pilzzelle aus Ustilago maydis, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus itaconius oder Aspergillus flavus.
21. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–20, wobei das gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate in iv) aus der Wirtszelle und/oder dem extrazellulären Raum und/oder dem Medium gewonnen wird.
22. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–21, wobei zur Gewinnung des 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate in iv) die Wirtszelle lysiert wird.
23. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–22, wobei die Expression des Proteins in i) induziert wird, wenn der OD_578nm der Kultur einen Wert von 0,4 erreicht.
24. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–23, wobei das Substrat Vitamin D3 in iii) in einer β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert wird, die Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zu Medium zugesetzt wird.
25. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–24, wobei das Substrat Vitamin D3 in iii) in einer 45 %igen β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert wird, die 4 mM Saponin enthält und in einer Endkonzentration von 200 µM zu 50 ml Medium zugesetzt wird, wobei die Endkonzentration des β-Hydroxypropyl-Cyclodextrins 2,25 % und die des Saponins 0,2 % beträgt.
26. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–25, wobei das Substrat Vitamin D3 in iii) in einem Schritt zu 25-OH-Vitamin D3 umgesetzt wird.
27. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–26, wobei pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem in den Ausführungsformen 1–9 definierten Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 5 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen werden.
28. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–27, wobei pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem in den Ansprüchen 1–9 definierten Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 1 mg 25-OH-Vitamin D3 gewonnen werden.
29. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–28, wobei das gewonnene 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate in iv) weiter aufbereitet werden.
30. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 10–29, wobei der Gewinn des 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate in iv) durch folgende Schritte erfolgt: 1. Stoppen der Reaktion durch Zusetzen von Ethylacetat; 2. Trennen der in den Kulturen enthaltenen wässrigen und organischen Phasen; 3. Isolieren der organischen Phase und Gewinn von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate.
31. Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend: i. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; ii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
32. Wirtszelle nach Ausführungsform 31, wobei die Wirtszelle zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: a. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; b. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; c. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; d. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; e. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
33. Wirtszelle umfassend ein Protein, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: i. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; ii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
34. Wirtszelle nach Ausführungsform 33 zusätzlich umfassend Proteine, die von mindestens zwei Nukleinsäuren kodiert werden, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: a. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; b. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; c. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; d. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; e. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
35. Verwendung des in den Ausführungsform 10–30 definierten Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.
36. Verwendung des in den Ausführungsform 10–30 beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Medizinprodukten.
37. Verwendung des in den Ausführungsform 10–30 beschriebenen Verfahrens zur Untersuchung des 25-OH Vitamin D3 Status und gegebenenfalls anderer hydroxylierter Vitamin D3 Derivate zur Diagnostik.
38. Verwendung der Wirtszelle nach einer der Ausführungsformen 31–34 oder eines Zellextraktes davon, oder einer oder mehrerer wie in den Ausführungsformen 1–9 definierten Nukleinsäuren oder eines oder mehrerer Proteine, die von einer oder mehrerer wie in den Ausführungsformen 1–9 definierten Nukleinsäuren kodiert wird, zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.
39. Präparation, enthaltend 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate erhältlich aus einem Verfahren gemäß den Ausführungsformen 10–30.
40. Präparation nach Ausführungsform 39, wobei die Präparation pro Liter Kultur und pro 24-stündiger Expression des von dem in den Ausführungsformen 1–9 definierten Expressionsvektor kodierten Proteins, mindestens etwa 1 mg oder mehr 25-OH-Vitamin D3 enthält.
41. Präparation nach Ausführungsformen 39 oder 40, wobei die Präparation eine wie in Ausführungsform 1 oder 2 definierte Nukleinsäure enthält.

Ausführungsbeispiel 1
Bioinformatische Analyse
Bei Durchsuchung des Genoms von B. megaterium DSM319 wurden Gene identifiziert die für potentielles Flavodoxin und verschiedene Ferredoxine kodieren.
Eine Analyse der Protein-Domänen mit der Pfam Datenbank bewies, dass Fdx2, Fdx3 und Fdx4 zu einem [4Fe-4S] oder einem [3Fe-4S] Cluster gehören. Die Gene für Fdx und Fld sind über das gesamte Genom verteilt.
Amplifikation und Klonierung der Gene
Für in vitro Studien wurde das Gen, das Flavodoxin (Fld; BMD_4866), Fdx2 (BMD_2329), Fdx3 (BMD_4349) oder Fdx4 (BMD_0889), mittels Polymerase-Ketten-Reaktion aus genomischer DNA aus B. megaterium MS941 amplifiziert. Die PCR-Primer führten eine NdeI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes und eine HindIII Schnittstelle sowie ein His6-Tag an das 3’ Ende des Fragmentes ein. Für Fld führten die PCR-Primer eine NcoI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes und eine BamHI Schnittstelle sowie ein His6-Tag an das 3’ Ende des Fragmentes ein.
Nach Zwischenklonierung des PCR-Produktes in einen pCR4-TOPO Vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA), wurde das Plasmid mit NdeI/Ncol und KpnI/BamHI verdaut und in den zuvor linearisierten Expressionsvektor pET17b, oder im Falle des Flavodoxin in pET3d, ligiert. Für das B. megaterium Ganzzell-System wurden alle Gene mit einer optimierten ribosomalen Bindestelle unmittelbar vor den kodierenden Sequenzen kloniert. Die Gene, die Flavodoxin, Fdx2, Fdx3 oder Fdx4 kodieren wurden mittels PCR aus dem pET3d Vektor oder dem pET17b Vektor amplifiziert. Die PCR-Primer führten hier bei den Fdx2, Fdx3, Fdx4 eine SacI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes und eine NotI Schnittstelle sowie ein His6-Tag an das 3’ Ende des Fragmentes ein. Beim Flavodoxin führten hier PCR-Primer eine BsrGI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes und eine anSphI Schnittstelle an das 3’ Ende des Fragmentes ein.
Nach einer Zwischenklonierung der resultierenden PCR Produkte in einen pCR4-TOPO Vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA), wurden diese mit SacI and NotI oder BsrGI und SphI geschnitten und in einen vorher linearisierten pSMF2.1 Vektor ligiert (Bleif et al. 2012). Dies führte zum Gewinn der folgenden Vektoren: pSMF2.1Fld, pSMF2.1Fdx2, pSMF2.1Fdx3 und pSMF2.1Fdx4.
Der Kondongebrauch von Arh1 wurde für die Expression in B. megaterium optimiert und über Geneart synthetisiert. Es wurden eine KpnI Schnittstelle und eine optimierte ribosomale Bindestelle unmittelbar vor den kodierenden Sequenzen sowie eine SacI Schnittstelle an das 3’ Ende kloniert. Arh1 wurde aus dem Vektor mittels SacI und KpnI herausgeschnitten und stromaufwärts von Fld oder den Ferredoxinen der oben beschriebenen Plasmide ligiert. Es wurden folgende Plasmide erhalten:
pSMF2.1ArhFld, pSMF2.1ArhFdx2, pSMF2.1ArhFdx3 und pSMF2.1ArhFdx4.
Expression, Aufreinigung und spektrale Charakterisierung der Proteine
Zur Expression der Proteine wurden E.coli C43(DE3) Zellen als Wirtszelle benutzt. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmiden transformiert und über Nacht in 100 µg/ml Ampicillinenthaltenem TB-Medium bei 37°C und 150 rpm kultiviert. Diese Über-Nacht-Kultur wurde benutzt, um 250 ml einer Hauptkultur in einem 2-Liter Schikanekolben anzusetzen. Diese Kultur enthielt 100 µg/ml Ampicillin. Die Kultur wurde bei 37°C und bei 100 rpm kultiviert. Nachdem der OD₆₀₀ einen Wert von 0,5 erreichte wurden die Kulturen durch die Zugabe von 1mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Daraufhin wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 28°C und für 100 rpm kultiviert. Die E.coli Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4500 rpm für 20 Minuten geerntet. Die Zellpellets wurden bei –20°C bis zum weiteren Gebrauch gelagert. Alle Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellpellets wurden in 50 mM Natriumphosphatpuffer aufgenommen (pH 8; 300 mM NaCl, 50µg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid) und mit Sonifikation behandelt. Nach einer weiteren Zentrifugation konnten die His6-getaggten Proteine durch Immobilisierte Metall-Affinitätstschromatographie mit einem TALCON^TM Harz (Clontech), die nach den Herstellerinstruktionen durchgeführt wurde, konzentriert oder aufgereinigt werden. Fraktionen, die die heterolog exprimierten Proteine enthielten wurden gesammelt und durch Ultrazentrifugation konzentriert. Eine weitere Konzentrierung erfolgte durch Größenausschlusschromatographie, wobei eine Superdex 75 (GE Healthcare) Säule und 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) und eine konstante Flussrate von 0,1 ml/min benutzt wurde. Passende Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und bei –20°C gelagert. Die Mutante Arh1_A18G aus Schizosaccharomyces pombe, welche eine stärkere Ausbeute an Holoprotein aufweist und in der vorliegenden Anmeldung nur Arh1 oder Arh genannt wurde, wurde exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben (Ewen et al., 2008, FEMS Yeast Res. 8:432–441).
UV-Vis-Absorption-Spektroskopie
Um die spektralen Eigenschaften der aufgereinigten Proteine zu analysieren wurden UV-Vis-Absorption-Spektra zwischen 250 nm und 700 nm mit einem double-beam-Spektrophotometer (UV-2101PC, Shimadzu, Japan) aufgenommen. Um die Konzentrationen von Fld und den Ferredoxinen zu messen, wurden die molaren Extinktionskoeffizienten und die charakteristischen Maxima durch eine totale Proteinquantifikation des aufgereinigten Proteins durch eine BC-Assay (Uptima/Interchim Montlucon, France) bestimmt.
Ergebnisse
Die Expression von Fld resultierte in einem blauen Zell-Pellet und einem blau-grauen Lysat, was darauf hindeutete, dass das Protein in seiner semichinonen Form vorliegt. Während der Elution von Fld in der Immobilisierten Metall-Affinitätstschromatographie Säule wurde die Farbe grün, und diese Farbe blieb auch bei der nachfolgenden Größenausschlusschromatographie, der Konzentration und Lagerung bestehen. Das reine Protein zeigte Maxima bei 377 nm und 460 nm, eine Schulter bei 482 nm und eine breites Absorptionsbande von 550 bis 650 nm, welches charakteristisch für die semichinone Form ist ( , Tabelle).
Die Zugabe von Kalium-Ferricyanid zu Fld, gefolgt von Konzentration zur Entfernung des Kalium-Ferricyanid aus der Fld-Lösung führte zu einem Verlust der Absorbtion bei 550 nm und 650 nm, was auf eine Oxidation des Flavin-Semichinon zu seiner voll oxidierten Chinon-Form hindeutet. Diese Chinon-Form war zur Bestimmung des Extinktionskoeffizienten von 6718 M^–1cm^–1 am charakteristischen Maximum bei 460 nm nötig. Die Expressionsausbeute der E.coli Kultur war 5733 mmol l^–1. Mischung von Fld mit der Reduktase Arh1 aus S. pombe änderte das Semichinon-Spektrum des Fld nicht und war daher geeignet eine Reduktion des Flavin-Chromophor zu verfolgen. Eine Zugabe von NADPH führte zu einer Verringerung der Adsorption bei 460 nm und einem Anstieg bei 593 nm und 640 nm, was auf eine Reduktion des Flavo-Semiquinon zu seiner Hydrochinonform hindeutet ( , Tabelle).
Fdx2, Fdx3 und Fdx4 waren grün-braun-farben und zeigten ein breites Absorptionsspektrum zwischen 390 nm bis 400 nm, was zeigte, dass sie keine [2Fe-2S] Cluster Ferredoxine, aber [3Fe-4S] oder [4Fe-4S] Cluster Ferredoxine (Sticht und Rösch 1998) sind. Als molarer Extinktionskoeffizient wurden 6671, 7272 und 6471 M^–1cm^–1 für Fdx2, Fdx3, Fdx 4 berechnet. Die Expressionsausbeute der E.coli Kultur waren 3052, 3592, 1392 mmol l^–1 ( , Tabelle)
Ausführungsbeispiel 2
Bioinformatische Analysen
Bei Durchsuchung des Genoms von B. megaterium DSM319 wurden zwei Gene identifiziert, die für zwei potentielle CYP109 (CYP109E1 und CYP109A2) kodieren. Die von den Genen kodierten Proteine weisen das Häm-Binde Motiv, FxxGx(H/R)xCxG auf. Zudem enthalten sie ein konserviertes Threonin in der potenziellen I-Helix und das konservierte EXXR Motivs in der K-Helix (Khatri et al., 2010, Chem. Biol. 17:1295–1305). Die Cytochrome P450 konnten erfolgreich exprimiert werden. Die reinen, oxidierten Proteine wiesen typische Peaks bei 356 nm, 417 nm, 534 nm und 568 nm auf und die reduzierten und CO gebundenen Formen zeigten jeweils einen charakteristischen Peak bei 450 nm.
Amplifikation und Klonierung der Gene
Für in vitro Studien wurden die Gene, die CYP109E1 (BMD_3874) und CYP109A2 (BMD_2035) kodieren, mittels Polymerase-Ketten-Reaktion aus genomischer DNA von B. megaterium DSM319 amplifiziert. Die PCR-Primer führten jeweils eine NdeI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes und eine KpnI Schnittstelle sowie ein His₆-Tag an das 3’ Ende des Fragmentes ein. Nach Zwischenklonierung der PCR-Produkte in den pCR4-TOPO Vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) wurden die Plasmide mit NdeI und KpnI verdaut und jeweils in den zuvor linearisierten Expressionsvektor pET17b ligiert. Die Klonierung der Redoxpartner Fld, Fdx2, Fdx3 und Fdx4 erfolgte wie zuvor beschrieben.
Für das B. megaterium Ganzzell-System wurden alle Gene mit einer optimierten ribosomalen Bindestelle unmittelbar vor den kodierenden Sequenzen kloniert. Die Ganzzellvektoren pSMF2.1ArhFld, pSMF2.1ArhFdx2, pSMF2.1ArhFdx3 und pSMF2.1ArhFdx4, welche die Redoxpartner enthalten, stammten aus Ausführungsbeispiel 1. Die Gene, die für CYP109E1 und CYP109A2 kodieren, wurden mittels PCR aus den in dieser Arbeit konstruierten pET17b Expressionsvektoren amplifiziert, wobei die PCR-Primer eine SpeI Schnittstelle an das 5’ Ende des Fragmentes sowie eine KpnI Schnittstelle für CYP109E1 bzw. eine MluI Schnittstelle für CYP109A2 an das 3’ Ende des Fragmentes einfügten. Die PCR-Produkte wurden in den pCR4-TOPO Vektor zwischenkloniert (Invitrogen, San Diego, CA, USA) und mit SpeI und KpnI bzw. SpeI und MluI verdaut. Die resultierenden Fragmente wurde vor Arh1 in die pSMF2.1 Vektoren, die Arh1 und Fld oder eines der Ferredoxine enthielten, kloniert, wodurch die endgültigen Expressionsvektoren erhalten wurden, welche CYP109E1 bzw. CYP109A2, Arh1 und Fld, Fdx2, Fdx3 oder Fdx4 enthielten: pSMF2.1CYP109E1ArhFld, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx2, pSMF2.1CYP109E1ArhFdx3 und pSMF2.1CYP109E1ArhFdx4 sowie pSMF2.1CYP109A2ArhFld, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx2, pSMF2.1CYP109A2ArhFdx3 und pSMF2.1CYP109A2ArhFdx4. Zwei weitere Vektoren wurden konstruiert, indem nur CYP109E1 bzw. CYP109A2 ohne Redoxpartner in den pSMF2.1 Vektor kloniert wurden (pSMF2.1CYP109E1 bzw. pSMF2.1CYP109A2).
Ausführungsbeispiel 3
Expression in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine
Die Expression und Reinigung von CYP109E1 und CYP109A2 erfolgte folgendermaßen:
Zur Expression der Proteine wurden E.coli C43(DE3) Zellen als Wirtszelle benutzt. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmiden transformiert und über Nacht in 100 µg/ml Ampicillinenthaltenem TB-Medium bei 37°C und 150 rpm kultiviert. Diese Über-Nacht-Kultur wurde benutzt, um 250 ml einer Hauptkultur in einem 2-Liter Schikanekolben anzusetzen. Diese Kultur enthielt 100 µg/ml Ampicillin. Die Kultur wurde bei 37°C und bei 100 rpm kultiviert. Nachdem der OD₆₀₀ einen Wert von 0,5 erreichte wurden die Kulturen durch die Zugabe von 1mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Daraufhin wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 28°C und für 100 rpm kultiviert. Die E.coli Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4500 rpm für 20 Minuten geerntet. Die Zellpellets wurden bei –20°C bis zum weiteren Gebrauch gelagert. Alle Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellpellets wurden in 50 mM Natriumphosphatpuffer aufgenommen (pH 8; 300 mM NaCl, 50µg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid) und mit Sonifikation behandelt.
Die Expression und Reinigung der Redoxpartner Fld, Fdx2, Fdx3 und Fdx4 aus B. megaterium DSM319 erfolgte wie zuvor beschrieben.
Die Mutante Arh1_A18G aus Schizosaccharomyces pombe, welche eine stärkere Ausbeute an Holoprotein aufweist und in der vorliegenden Anmeldung nur Arh1 oder Arh genannt wurde, wurde exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben (Ewen et al., 2008, FEMS Yeast Res. 8:432–441).
a) UV-vis Absorptionsspektroskopie
Die Konzentration von CYP109E1 und CYP109A2 wurde mit Hilfe eines CO-Differenzspektrums und ΔA (450nm–490nm) = 91 mM^–1cm^–1 nach der Methode von Omura und Sato berechnet (Omura und Sato 1964). Die Bestimmung der Konzentrationen des Flavodoxins und der Ferredoxine erfolgte anhand der zuvor ermittelten Extinktionskoeffizienten.
b) In vitro Substratumsätze
Die in vitro Substratumsätze wurden in einem Volumen von 250 µl bei 30 °C für 30 min durchgeführt. Als Puffersystem wurde 20 mM Kaliumphosphat Puffer, 20% Glycerin, pH 7,4 eingesetzt. Ein Reaktionsansatz enthielt Arh1 (1,5 µM), Fdx/Fld (10 µM) und CYP109E1 (0,5 µM), ein NADPH-regenerierendes System (1 mM MgCl₂, 5 mM Glukose-6-Phosphat, 1 U Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase). Das Substrat Vitamin D3 wurde in einer 45%igen β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert und in einer Endkonzentration von 200 µM zugegeben, wobei die Endkonzentration des β-Hydroxypropyl-Cyclodextrins 2,25% betrug. Die Reaktion wurde durch Zugabe von NADPH in einer Endkonzentration von 1 mM gestartet und durch 500 µl Ethylacetat gestoppt. Die Proben wurden bei 10000 Upm 10 min zentrifugiert, um wässrige und organische Phasen zu trennen. Die organische Phase wurde in ein neues Eppendorf Gefäß überführt und die wässrige Phase erneut mit 500 µl Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, das Lösemittel durch einen Vakuum-Zentrifugen-Konzentrator (Univapo 100 H von UniEquip) eingedampft und die Proben direkt mittels high-performance liquid chromatography (HPLC) analysiert oder bei –20 °C gelagert.
c) HPLC Analyse
Die HPLC Analysen wurden an einem 900er-System der Firma Jasco (eine Pu-980 HPLC Pumpe, ein AS-950 Sampler, ein UV-975 UV/visible Detektor und eine LG-980-02 Gradienteneinheit; Jasco, Gross-Umstadt, Germany) durchgeführt. Alle verwendeten Lösemittel waren von HPLC-Reinheit und das verwendete Wasser wurde zuvor mit einer Milli-Q Biocel (Millipore, Bedford, MA, USA) gereinigt. Alle Lösemittelgemische wurden vor Gebrauch entgast. Eine reversed-phase ec MN Nucleodur C₁₈ (3 µm, 4.0 × 125 mm) Säule (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA) wurde für alle Experimente mit einer Flussrate von 1 ml/min, bei einer Temperatur von 40°C und unter Verwendung eines Gradienten eingesetzt: 100 % Lösemittel A (10 % Acetonitril) für 3 min, linearer Gradient in 32 min von 0–100 % Lösemittel B (100 % Acetonitril), 100 % Lösemittel B für 10 min, 100 % Lösemittel A für 7 min. Die Detektion des Substrates Vitamin D3 und der Produkte erfolgte bei 265 nm.
Das CYP109E1 ist in der Lage, Vitamin D3 in vitro zu einem Hauptprodukt und drei Nebenprodukten umzusetzen, wobei Arh1 aus S. pombe sowie Fld, Fdx2, Fdx3 oder Fdx4 aus B. megaterium DSM319 als Redoxpartner eingesetzt wurden. Das CYP109A2 ist in der Lage, Vitamin D3 in vitro zu einem Produkt umzusetzen, wobei Arh1 aus S. pombe sowie Fld, Fdx2, Fdx3 oder Fdx4 aus B. megaterium DSM319 als Redoxpartner eingesetzt wurden.
Ausführungsbeispiel 4
Ganzzellumsätze mit B. megaterium MS941
Der B. megaterium Stamm MS941, eine Mutante des B. megaterium Stammes DSM319 (Wittchen und Meinhardt, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:871–877), wurde für alle Ganzzellumsätze verwendet. B. megaterium MS941 wurde mit Hilfe der Polyethylenglykol vermittelten Protoplastentransformation mit den entsprechenden Expressionsplasmiden transformiert (Barg et al., 2005, vol 18. Microbial processes and products, 1st edn. Humana Press, Inc, Totowa:205–223). Für die Ganzzellumsätze wurde 50 ml Komplexmedium (bestehend aus 24 g/l Hefextrakt, 12 g/l Soyton, 2.31 g/l KH₂PO₄ und 12.5 g/l K₂HPO₄), das 10 µg/ml Tetracyclin enthielt, in einem 300 ml Schikanekolben mit einer einzelnen B. megaterium Kolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C und 180 rpm inkubiert. 50 ml Komplexmedium, das mit 10 µg/ml Tetracyclin supplementiert wurde, wurde mit 500 µl der Übernachtkultur angeimpft und weiter kultiviert. Sobald die OD_578nm einen Wert von 0,4 erreichte, wurde die Proteinexpression durch die Zugabe von 0,5 % (w/v) Xylose induziert. 24 h nach der Induktion wurde das Substrat Vitamin D3 zugegeben. Das Substrat Vitamin D3 wurde in einer 45%igen β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin-Lösung solubilisiert, welche 4 mM Saponin enthielt und in einer Endkonzentration von 200 µM zugegeben, wobei die Endkonzentration des β-Hydroxypropyl-Cyclodextrins 2,25 % und die des Saponins 0,2% betrug. 500 µl Proben der Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen. Die Extraktion der Proben wurde wie oben beschrieben durchgeführt und die Proben bis zur HPLC Analyse bei –20 °C gelagert.
Um ausreichende Mengen der Produkte für eine Strukturaufklärung mittels NMR zu erhalten, wurden B. megaterium MS941 Stämme konstruiert, in welchen das jeweilige Cytochrom P450 (CYP109E1 bzw. CYP109A2) zusammen mit den Redoxpartnern exprimiert wird. Alle konstruierten B. megaterium MS941 Stämme setzten Vitamin D3 dabei zu dem gleichen HPLC Produktmuster um (CYP109E1 , B, CYP109A2 , B) wie in dem in vitro Assay unter Verwendung gereinigter Proteine. Das Hauptprodukt des CYP109E1 abhängigen Vitamin D3 Umsatzes konnte mittels NMR als 25-hydroxy-Vitamin D3 bestimmt werden, wohingegen die Mengen der Nebenprodukte für eine Strukturaufklärung mittels NMR zu gering waren. Auch das Produkt des CYP109A2 abhängigen Vitamin D3 Umsatzes konnte mittels NMR als 25-hydroxy-Vitamin D3 bestimmt werden.
Ohne Optimierung ist ein CYP109E1 überexprimierender Bacillus megaterium Stamm ist in der Lage, 200 µM Vitamin D3 in 24 h fast vollständig umzusetzen ( ). Pro Liter Kultur und pro 24 h werden somit 77 mg Vitamin D3 umgesetzt, wobei 34% (entspricht 26 mg/Liter Kultur/24h) auf 25-hydroxy-Vitamin D3 entfallen. Ohne Optimierung ist ein CYP109A2 überexprimierender Bacillus megaterium Stamm in der Lage, etwa 5 mg 25-OH-Vitamin D3/Liter Kultur/24h zu produzieren ( ). Damit ist die Produktivität zwar geringer als bei CYP109E1, jedoch wird hier nur mit 25-OH-Vitamin D3 nur ein Produkt gebildet, während durch CYP109E1 neben 25-OH-Vitamin D3 mindestens drei weitere Produkte gebildet werden.
Ausführungsbeispiel 5
Large-scale Ganzzellumsätze mit B. megaterium MS941
Um ausreichende Mengen der durch CYP109E1 und CYP109A2 hergestellten Vitamin D3-Produkte zu erhalten, so dass eine Strukturaufklärung der Produkte mittels NMR-Spektroskopie möglich war, wurde der Kultivierungsmaßstab erhöht (Upscale). Das Kulturvolumen der Hauptkultur wurde auf ein Volumen von 750 ml erhöht, wobei eine Aufteilung zu je 250 ml auf einen 2 L Schikanekolben erfolgte. Die Inkubation und Induktion wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Nach einer Expressionszeit von 24 h wurde Vitamin D3 in einer Endkonzentrationen von 200 µM (2,25% β-Hydroxypropyl-Cyclodextrin, 0,2% Saponin) zugegeben. Nach einer Umsatzzeit von 24 h wurden die Kulturen für 20 min bei 4500 g zentrifugiert und der Überstand zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, an einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-114 von Büchi) eingedampft und bei –20 °C gelagert. Die Reinigung und Isolierung der Produkte aus dem Extrakt erfolgte mittels semi-präparativer HPLC-Trennung unter Verwendung einer reversed-phase ec MN Nucleodur C₁₈ (5 µm, 8.0 × 250 mm) Säule (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA).
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Claims

Expressionsvektor zur Exprimierung eines Proteins, das zur regioselektiven Herstellung von Vitamin D3 zu 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten beiträgt, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend: iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: f. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; g. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; h. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; i. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; j. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten, umfassend ii. Exprimieren des in den Ansprüchen 1–2 definierten Expressionsvektors in einer Wirtszelle; v. Kultivieren der Wirtszelle; vi. Zusetzen des Substrats Vitamin D3 zu der Kultur; vii. Gewinnen des entstandenen 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls anderer hydroxylierter 25-OH-Vitamin D3 Derivate.
Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe umfassend: iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle zusätzlich mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: f. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; g. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; h. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; i. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; j. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
Wirtszelle umfassend ein Protein, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8 und/oder 9 kodiert; iii. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil des von der Nukleinsäure in i) oder ii) kodierten Proteins kodiert, wobei dieser Teil hydroxylierende Aktivität aufweist; iv. eine Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu der Nukleinsäure in i)–iii) ist und ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist; v. eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäure gemäß i)–iv) hybridisiert und welche ein Protein kodiert, das hydroxylierende Aktivität aufweist.
Wirtszelle nach Anspruch 6 zusätzlich umfassend Proteine, die von mindestens zwei Nukleinsäuren kodiert werden, wobei Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: f. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besitzen; g. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine gemäß SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 kodieren; h. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Teil der von den Nukleinsäuren in a) oder b) kodierten Proteine kodieren, wobei dieser Teil eine Funktion als Redoxpartner aufweist; i. Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet, dass sie zu mindestens 50 % identisch zu den Nukleinsäuren in a)–c) sind und Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen; j. Nukleinsäuren deren komplementäre Stränge unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren gemäß a)–d) hybridisieren und welche Proteine kodieren, die eine Funktion als Redoxpartner aufweisen.
Verwendung des in dem Anspruch 3 definierten Verfahrens zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten zur Verarbeitung in Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.
Verwendung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 4–7 oder eines Zellextraktes davon, oder einer oder mehrerer wie in den Ansprüchen 1–2 definierten Nukleinsäuren oder eines oder mehrerer Proteine, die von einer oder mehrerer wie in den Ansprüchen 1–2 definierten Nukleinsäuren kodiert wird, zur Herstellung von 25-OH Vitamin D3 und gegebenenfalls anderen hydroxylierten Vitamin D3 Derivaten.
Präparation, enthaltend 25-OH-Vitamin D3 und gegebenenfalls andere hydroxylierte Vitamin D3 Derivate erhältlich aus einem Verfahren gemäß Anspruch 3.