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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Schwamm aus Keratin und dessen
Verwendung für pharmazeutische Zwecke, ein Verfahren zu
dessen Herstellung sowie die Verwendung des Keratinschwamms und
zur Herstellung von Produkten für die medizinische Verwendung,
beispielsweise zur Verwendung bei der Wundversorgung oder als Trägergerüst
für neu zu bildendes Gewebe, z. B. für ein Implantat.
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Der
erfindungsgemäße Keratinschwamm ist in wässrigen
Zusammensetzungen quellfähig und kann daher auch als Wundtamponade
Verwendung finden. Weiterhin ist der erfindungsgemäße
Keratinschwamm nicht zytotoxisch und kann über den gesamten
Querschnitt von tierischen Zellen besiedelt werden, sodass sich der
Keratinschwamm zur Implantation in den tierischen oder menschlichen
Körper eignet, beispielsweise als Implantat zur Aufüllung
von Defektstellen, optional mit immunkompatiblen Zellen, vorzugsweise
mit autologen Zellen besiedelt.
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Stand der Technik
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Die
WO 99/26570 beschreibt
offenzellige Schäume aus Keratin, beispielsweise durch
Versprühen oder Gefriertrocknen einer Keratinlösung.
Die Keratinlösung wird unter reduzierenden Bedingungen
erzeugt, sodass Disulfidbrücken zu Thiolgruppen reduziert
werden. Nach der Bildung eines Films oder Schaums aus der reduzierten
Keratinlösung, die noch ein Reduktionsmittel enthält,
wird nach Trocknung eine Oxidation des Keratins durchgeführt,
was eine Vernetzung ergibt.
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Tanaga
et al. (Materials Science and Engineering C24, 441–446
(2004)) beschreiben die Erzeugung eines Films aus reduzierter
Keratinlösung, die mit chemischen Vernetzungsmitteln versetzt
ist. Die Keratinlösung wird nach Yamauchi et al.
(Journal of Biomedical Materials Research 439–444 (1996)) bzw. Yamauchi
et al. (Journal Biomaterials Science Polymer Vol 9, Nr. 3, 259–270
(1998)) durch Solubilisieren von Wolle unter reduzierenden
Bedingungen hergestellt und wie von Yamauchi et al. vorbeschrieben,
einschließlich des Reduktionsmittels getrocknet, beispielsweise
durch Gefriertrocknen.
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Reichl
(5th World Meeting of Pharmaceutics, Biopharmaceutics and
Pharmaceutical Technology Genf, 27–30 März 2006)
beschreibt die Beschichtung eines Trägers mit einer reduzierten
Keratinlösung durch Ausfällung mit Trichloressigsäure.
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Die
WO 01/19305 beschreibt
die Herstellung von quellfähigem oxidiertem Keratin, in
welchem Disulfidbrücken mit einem Peroxid behandelt wurden,
um die Bildung von Disulfidbrücken im fertigen Gel zu verhindern.
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Die
EP 0 628 573 A1 beschreibt
die Herstellung von Filmen und Fasern aus Keratin aus einer Keratinlösung,
die in Gegenwart eines Reduktionsmittels hergestellt wird und anschließend
in Gegenwart von Thioglycolsäure oxidiert wird, um ein
gemischtes Disulfid, ein Carboxymethyldisulfid zu bilden. Das erhaltene
Protein ist wasserlöslich.
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Die
EP 1 470 824 A1 beschreibt
in einem Beispiel die Extraktion von Keratin aus Hautbiopsin und
Hydrolyse von Haar in Gegenwart eines Reduktionsmittels, und anschließende
Pelletierung, Resuspendierung des pelletierten Materials und dessen
Dialyse zur Verwendung als Antigen.
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Aufgabe der Erfindung
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Gegenüber
bekannten Keratinschwämmen ist es Aufgabe der Erfindung,
einen alternativen Keratinschwamm und ein alternatives Verfahren
zu dessen Herstellung bereitzustellen. Insbesondere ist es Aufgabe der
Erfindung, einen für pharmazeutische Zwecke, d. h. für
die medizinische Verwendung geeigneten Keratinschwamm bereitzustellen,
der quellfähig ist, und z. B. als Absorber für
Exudatwasser verwendet werden kann.
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Allgemeine Beschreibung der
Erfindung
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Die
Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe durch Bereitstellung
eines Keratinschwamms, der aus einer Keratinlösung hergestellt
ist, die unter reduzierenden Bedingungen aus natürlichem
Keratin, vorzugsweise menschlichem Haarkeratin hergestellt ist,
und aus der reduzierende Verbindungen entfernt sind, beispielsweise
durch Dialyse gegen ein wässriges Medium ohne reduzierende
Inhaltsstoffe. Der erfindungsgemäße Keratinschwamm
besteht vorzugsweise aus Keratin, das ohne chemische Derivatisierung
in wässriger Lösung solubilisiert, optional anteilig
alkalisch hydrolysiert ist, und ohne Anwesenheit von Reduktions-
und/oder Oxidationsmittel aus wässriger Lösung
in Gegenwart einer Polyhydroxyverbindung gefriergetrocknet und anschließend
auf ca. 100–150°C an der Luft erwärmt
wurde.
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In
bevorzugter Ausführungsform umfasst der Keratinschwamm
eine Mischung einer ersten Keratinlösung, die unter reduzierenden
Bedingungen aus natürlichem Keratin hergestellt ist, und
aus der reduzierende Verbindungen, beispielsweise durch Dialyse
gegen ein wässriges Medium ohne reduzierende Inhaltsstoffe
bei neutralem bis leicht saurem pH-Wert entfernt wurden, und einem
Anteil einer zweiten Keratinlösung, die ebenfalls vorzugsweise
aus natürlichem Keratin durch Hydrolyse unter reduzierenden
Bedingungen hergestellt ist, aus der Reduktionsmittel entfernt sind,
beispielsweise durch Dialyse, die durch alkalische Behandlung teilweise
hydrolysiert ist, vorzugsweise durch Dialyse der Keratinlösung
gegen eine alkalische wässrige Zusammensetzung, gefolgt
von anschließender Entfernung der alkalischen Zusammensetzung,
beispielsweise durch Ultrafiltration, Waschen und/oder Dialyse,
vorzugsweise gegen Wasser bei neutralem pH-Wert.
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Vorzugsweise
besteht der erfindungsgemäße Keratinschwamm aus
reduzierter Keratin, das aus einer Lösung reduzierten Keratins
ohne Anwesenheit von Reduktionsmitteln gebildet ist, mit anschließender
Oxidation allein durch Kontakt mit Sauerstoff, beispielsweise in
Mischung mit Stickstoff, z. B. Luft, wobei bevorzugt die Keratinlösung
einen Anteil reduzierten Keratins, ebenfalls in Abwesenheit von
Reduktionsmittel enthält, der teilweise hydrolysiert ist.
Besonders bevorzugt besteht der erfindungsgemäße
Keratinschwamm aus einem Gerüst aus diesem Keratin oder
der Mischung des Keratins mit teilweise hydrolysiertem Keratin,
besonders bevorzugt mit einem Zusatz eines Weichmachers, der insbesondere
ausgewählt ist unter Polyhydroxyverbindungen, insbesondere
Glycerin und Propyplenglycol. Die der Gehalt an Polyhydroxyverbindung,
vorzugsweise gemessen vor der Wärmebehandlung, beträgt
insbesondere 0,5 bis 3 Gew.-% pro 15 bis 30 mg Keratin, gemessen
als Gesamtprotein nach Bradford, vorzugsweise 1 bis 2 Gew.-% Polyhydroxyverbindung
pro 20 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford.
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Die
erfindungsgemäßen Keratinschwämme können
durch herkömmliche Verfahren zur Bildung einer porösen
Struktur aus einer Lösung des Keratins hergestellt werden,
vorzugsweise durch Gefriertrocknen einer wässrigen Lösung
des Keratins, bevorzugt der Mischung des Keratins mit teilweise
alkalisch hydrolysiertem Keratin.
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Die
erfindungsgemäßen Keratinschwmme zeichnen sich
durch eine hohe Formstabilität für lange Zeit innerhalb
des tierischen Körpers aus und sind im Wesentlichen nach
Implantation in einen tierischen Körper biologisch nicht
abbaubar.
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Die
erfindungsgemäßen Keratinschwämme sind
in wässrigen Zusammensetzungen quellfähig, wobei die
Quellfähigkeit mit zunehmendem Gehalt an alkalisch hydrolysiertem
Keratin zunimmt, sodass die Quellfähigkeit durch den Anteil
des alkalisch hydrolysierten Keratins am gesamten Keratin einstellbar
ist.
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Die
erfindungsgemäßen Keratinschwämme werden
durch ihr ganzes Volumen von Zellen besiedelt, die innerhalb der
offenen Porenstruktur anhaften. Entsprechend eignen sich die erfindungsgemäßen
Schwämme zur Verwendung als Gerüstsubstanz zur
in vitro Kultivierung tierischer Zellen in dreidimensionaler Struktur und
insbesondere zur Verwendung als Implantat zur Auffüllung
von Defektstellen, beispielsweise von Gewebe, insbesondere von Weichgewebe
des tierischen Körpers, einschließlich des Menschen.
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Das
erfindungsgemäße Herstellungsverfahren umfasst
eine Härtung des Keratins, das in Wasser hydrolysiert ist,
optional anteilig zusätzlich alkalisch hydrolysiert ist,
und durch Gefriertrocknung aus wässriger Zusammensetzung,
aus der reduzierende Mittel und/oder oxidierende Mittel entfernt
und daher nicht enthalten sind, in Gegenwart einer Polyhydroxyverbindung
durch Wärmebehandlung, beispielsweise bei 100°C
bis 160°C, vorzugsweise bis 100 bis 110°C für
0,5 bis 1,5 h. Die Kombination der Abwesenheit reduzierender Mittel
von der wässrigen Zusammensetzung solubilisierten Keratins
mit der Anwesenheit einer Polyhydroxyverbindung und die Wärmebehandlung
führen zu einem Keratinschwamm mit struktureller Stabilität,
Elastizität, Wasseraufnahmefähigkeit und Beständigkeit
gegen Abbau im tierischen Körper. Optional kann der Keratinschwamm
einer Sterilisation durch γ-Bestrahlung unterworfen werden.
Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme
weisen keine für die Zellkultur schädlichen Stoffe
auf, beispielsweise keine zytotoxischen Stoffe und keine Viren.
So zeigten Tests zur Kultivierung von tierischen Zellen auf dem
Schwamm keine Kontamination der Schwämme mit zellschädlichen
Agenzien und die Abwesenheit von Viren. Daher ermöglicht
das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren, beispielsweise
ausgehend von menschlichen Haaren bei der Herstellung von Keratinlösung,
die Herstellung einer porösen Implantatstruktur, die frei
von Viren und frei von Zytotoxinen ist.
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Die
besondere Eignung der erfindungsgemäßen Keratinschwämme
zur Zellkultur und zur Verwendung bei der Herstellung von Implantaten
für medizinische Zwecke, insbesondere als Gerüstsubstanz
zur Ausfüllung von Defektstellen von Weichgewebe, wird
darauf zurückgeführt, dass erfindungsgemäße
Keratinschwämme Partikel von Keratin etwa gleicher Größe
aufweisen, z. B. monomodal um etwa 50–250 nm, die eine
Besiedelung durch Zellen fördern.
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In
Vergleichsversuchen lässt sich zeigen, dass die erfindungsgemäßen
Keratinschwmme eine hohe Strukturstabilität und eine bessere
Beständigkeit gegen den Abbau nach Implantation in den
tierischen Körper haben und/oder schneller und gleichmäßiger
von tierischen Zellen besiedelt werden, sodass sie bei der Verwendung
zur Herstellung eines Implantats ein Implantat ergeben, das schneller
zur Ausbildung natürlichen Gewebes innerhalb der Implantatstruktur
führt.
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So
zeigen z. B. Keratinschwämme, die ohne Polyhydroxyverbindung
unter ansonsten gleichen Bedingungen hergestellt wurden, eine hohe
Brüchigkeit, bzw. niedrige Strukturstabilität,
und eine wesentlich geringere Wasserfestigkeit als erfindungsgemäße
Keratinschwämme.
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Zum
Vergleich können beispielsweise auch Keratinschwämme
herangezogen werden, die unter ansonsten gleichen Bedingungen aus
einer Keratinlösung hergestellt sind, die jedoch noch Reduktionsmittel
enthält, oder ein Oxidationsmittel, beispielsweise ein
Peroxid.
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Nachfolgend
wird die bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung Keratinschwämmen
aus Keratinlösung beschrieben, die zur Ausbildung von Nanopartikeln
aus Keratin in etwa monomodaler Größenverteilung führt.
Die Keratinlösung, die zur Herstellung des Keratinschwamms
durch Entzug des Lösungsmittels, insbesondere Wasser, eingesetzt
wird, enthält keine reduzierenden Verbindungen, keine oxidierenden
Verbindungen und hat vorzugsweise einen etwa neutralen pH. Besonders
bevorzugt ist die zur Herstellung von Keratinschwämmen
eingesetzte Keratinlösung eine wässrige Zusammensetzung,
die reduziertes Keratin, bevorzugt davon einen Anteil alkalisch
hydrolysierten reduzierten Keratins in Wasser aufweist.
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Vorzugsweise
werden beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Keratinlösung,
d. h. die Lösung aus reduziertem Keratin oder eine Mischung
einer Lösung aus reduziertem Keratin mit reduziertem Keratin,
das teilweise alkalisch hydrolysiert ist, gegen reines Wasser dialysiert,
vorzugsweise bei pH 6,5–7,5.
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Besonders
bevorzugt werden Aggregate aus der wässrigen Keratinlösung
entfernt, z. B. durch Ultrazentrifugation bei 10.000 × g,
optional durch Filtration.
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Bevorzugt
ist das zur Herstellung der Lösung eingesetzte Keratin α-Keratin;
insbesondere bevorzugt wird die Keratinlösung aus Haaren
hergestellt, beispielsweise menschlichen Haaren. Zur Solubilisierung
von Keratin aus Haaren wird vorzugsweise eine wässrige
Zusammensetzung einsetzt, die in wässriger Lösung
aus Thioharnstoff, Harnstoff und Mercaptoethanol besteht, wobei
das Mercaptoethanol durch eine andere reduzierende Verbindung ersetzt
sein kann.
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Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Keratinschwämme
liegt darin, dass diese zumindest teilweise optisch transparent
sind, und eine einfache optische Kontrolle der Besiedlung mit Zellen,
insbesondere nach Anfärbung der Zellen erlauben, z. B.
per Mikroskopie in den oberflächennahen Bereichen des Schwamms.
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Die
Analyse der Größenverteilung von solubilisiertem
Keratin in den erfindungsgemäß für die
Herstellung der Keratinschwämme eingesetzten Lösungen,
die auch als nanopartikuläre Suspension von Keratin, wässrige
Zusammensetzung von Keratin oder solubilisiertes Keratin bezeichnet
werden können zeigt, dass das erfindungsgemäße
Verfahren zum Lösen bzw. Solubilisieren des Keratins aus
Haaren eine sehr enge, monomodale Größenverteilung
um etwa 50 bis 250 nm erzeugt. Mittels Photonenkorrelationsspektroskopie
mit dynamischer Laserlichtstreuung kann ein Polydispersitätsindex
analysiert werden, der signifikant kleiner als der für
Keratinlösungen nach dem Stand der Technik ist. Entsprechend
werden aus der erfindungsgemäß verwendeten Keratinlösung
zur Herstellung der von Keratinsschwämmen Keratinschwämme
erzeugt, die eine monomodale Größenverteilung
von Keratinpartikeln aufweisen, deren Hauptwert im Bereich von 20
bis 5.000 nm, vorzugsweise 100 bis 1.000 nm, bevorzugter 100 bis
200 nm liegt.
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Weiterhin
hat sich beim Vergleich der erfindungsgemäßen
Keratinschwämme mit anderen porösen keratinhaltigen
Materialien gezeigt, dass zumindest für einige Zelltypen
und immortalisierte Zelllinien so wie Primärzellen eine
erhöhte Aussaateffizienz und/oder ein besseres Wachstum
auf den erfindungsgemäßen Keratinschwämmen
erhalten wird. Gegenwärtig wird angenommen, dass die signifikant
besseren Kultivierungsergebnisse auf die besondere Struktur der
Keratinschwämme mit ihrer nanopartikulären Struktur
zurückgehen.
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Es
hat sich herausgestellt, dass ein mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellter Keratinschwamm, der aus einer Mischung einer
wässrigen Keratinlösung, die durch Hydrolyse von
Haaren in denaturierender wässriger Lösung mit
einem Gehalt an Reduktionsmittel, das zur Hydrierung von Disulfidbrücken des
Keratins dient, anschließender Entfernung des Reduktionsmittels
aus der Lösung, wobei die Lösung kein Oxidationsmittel
enthält, hergestellt ist, mit einem Anteil der so hergestellten
wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel
und kein Oxidationsmittel enthält, der partiell alkalisch
hydrolysiert ist, durch Trocknen der Mischung mit einem Gehalt an
Polyhydroxyverbindung, vorzugsweise zu 1 bis 3 Gew.-% pro 20 mg
Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford, zu einer porösen
Struktur umgesetzt ist, und anschließend auf ca. 100 bis
150°C, bevorzugt 100 bis 110°C, für mindestens
1 h, bevorzugt 2,5 h ohne Zusatz weiterer Verbindungen an Luft erwärmt
ist, vorteilhafte Eigenschaften aufweist. Die vorteilhaften Eigenschaften
des so erhaltenen Keratinschwamms zeigen sich insbesondere bei Verwendung
des Herstellungsverfahrens für medizinische Produkte, beispielsweise
für Implantate. Zu den vorteilhaften Eigenschaften zählen
neben der Stabilität gegen einen Abbau nach Implantation
im tierischen Körper, d. h. der hohen Widerstandsfähigkeit
gegen Resorption, die Elastizitäts- und Stabilitätseigenschaften
und die gute Besiedelung durch Zellen, die die Keratinschwämme zur
Verwendung als Implantat, z. B. zum Auffüllen von Defektstellen
im tierischen Körper, einschließlich des Menschen,
geeignet machen. Zu den vorteilhaften Eigenschaften zählen
neben der Elastizität und der strukturellen Beständigkeit
im Körper insbesondere die Quellfähigkeit, z.
B. zur Aufnahme von Wundexudat.
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Bei
elektronenmikroskopischer Analyse können Nanostrukturen
im erfindungsgemäßen Keratinschwamm sichtbar gemacht
werden, die vorliegend auch als Nanopartikel bezeichnet werden.
Es wird angenommen, dass die mechanischen Eigenschaften und auch
die Eignung des erfindungsgemäßen Keratinschwamms
zur Besiedelung durch tierische Zellen durch diese nanopartikuläre
Struktur begründet sind. Der Keratinschwamm enthält
bereits nach der Trocknung und vor der Wärmebehandlung
im Wesentlichen keine freien Thiol-Gruppen. Es wird angenommen,
dass Thiolgruppen bereits im Dialysat aufgrund der Abwesenheit von
Reduktionsmittel vollständig oxidiert sind.
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Der
erfindungsgemäße Keratinschwamm weist daher eine
nanopartikulären Mikrostruktur mit im Wesentlichen monomodaler
Größenverteilung der Nanopartikel auf, und enthält
keine dem Keratin zugesetzten Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel.
Das Keratin ist durch Trocknung einer wässrigen Keratinlösung hergestellt,
die keine zugesetzten Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel
enthält und in wässriger Lösung solubilisiertes
Keratin, insbesondere aus Haaren, enthält, wobei vorzugsweise
ein Anteil des solubilisierten Keratins teilweise alkalisch hydrolysiert
ist. Besonders bevorzugt ist der Keratinschwamm aus Keratinlösung
hergestellt, die aus solubilisiertem Keratin in Wasser besteht,
d. h. ohne Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel. Erfindungsgemäß enthält
der erfindungsgemäße Keratinschwamm einen Weichmacher,
insbesondere ausgewählt aus Glycerin und Propylenglycol
enthalten, der z. B. der wässrigen Keratinlösung
vor deren Gefriertrocknung und vor der anschließenden Wärmebehandlung
zugesetzt ist.
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Dabei
hat sich gezeigt, dass erfindungsgemäße Keratinschwmme
auch im gequollenen Zustand, d. h. in Gegenwart wässriger
Zusammensetzungen, eine strukturelle Stabilität beibehalten,
so dass z. B. aufgenommene Flüssigkeit auch unter Druckbelastung
im Wesentlichen nicht freigesetzt wird. So geben gequollene Schwämme
unter Druckbelastung einen geringen Teil aufgenommener Flüssigkeit
ab, z. B. den nur kapillar gebundenen Anteil der Flüssigkeit,
und behalten den überwiegenden Anteil der aufgenommenen
Flüssigkeit. Im gequollenen Zustand sind erfindungsgemäße
Keratinschwämme z. B. fest und gelartig, so dass gebundene Flüssigkeit
auch bei Druckbelastung im Wesentlichen nicht freigesetzt wird.
Das elastische Rückstellvermögen bleibt im Wesentlichen
auch im gequollenen Zustand erhalten. Mit zunehmendem Anteil alkalisch
hydrolysierten Keratins nimmt das elastische Rückstellvermögen
ab.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die
Figuren beschrieben, in denen
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1 das
Messergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie der Keratinlösung
nach Vergleichsbeispiel 1 zeigt (Y-Achse zeigt Intensität
in Prozent),
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2 das Messergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie
der Keratinlösung nach Beispiel 1 zeigt (Y-Achse zeigt
Intensität in Prozent),
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3 eine
rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen
Keratinschwamms mit ca. 10% hydrolysierten Keratins zeigt,
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4 eine
vergrößerte rasterelektronenmikroskopische Aufnahme
eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms von 3 zeigt,
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5 eine
vergrößerte rasterelektronenmikroskopische Aufnahme
eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms von 3 zeigt,
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6 eine
rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen
Keratinschwamms mit ca. 20% hydrolysierten Keratins zeigt und
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7 eine
rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen
Keratinschwamms mit ca. 30% hydrolysierten Keratins zeigt.
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Vergleichsbeispiel: Herstellung eines
Schwamms aus einer Keratinlösung mit einem Gehalt an reduzierenden Verbindungen
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Als
Vergleich wurde ein Keratinschwamm aus einer Keratinlösung
durch Gefriertrocknen hergestellt, die entsprechend Yamauchi
et al. (J. Biomater. Sci. Polym. Ed 9: 259–270 (1998)) erzeugt
wurde, jedoch ohne einen Gehalt an SDS in der Keratinlösung.
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Im
einzelnen wurde menschliches Haar (20 g) nach Waschen in 0,5% SDS-Lösung,
Trocknen und Entfetten Übernacht in n-Hexan nach Entfernen
des Hexans in 360 mL 7 M Harnstoff mit 32 mL 2-Mercaptoethanol in
einer geschlossenen Glasflasche bei 50°C für 24
h geschüttelt und anschließend filtriert. Das
Filtrat wurde dreimal gegen 12 L destilliertes Wasser mit 0,2 Gew.-%
2-Mercaptoethanol über Nacht dialysiert. Es wurde eine
trübe Lösung von ca. 480 mL erhalten.
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Die
Analyse der Partikelgrößenverteilung mit Photonenkorrelationsspektroskopie
ist in 1 gezeigt und ergab eine multimodale Größenverteilung
mit einem Z-Average-Wert um eine Partikelgröße
von ca. 125 nm und auf Grund einer stark multimodalen Verteilung
einen Polydispersitätsindex von 0,41. Die Verteilungskurve
zeigt drei Spitzenwerte bei ca. 115 nm, 700 nm und 4770 nm.
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Die
Lösung wurde entweder unmittelbar zur Herstellung von Schwämmen
eingesetzt, oder nach Entfernen von Aggregaten durch Ultrazentrifugation.
Die Lösung wurde bei –20°C eingefroren
und anschließend gefriergetrocknet.
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Die
Analyse zeigte eine geringere Aussaateffizienz bzw. ein geringeres
Anwachsen von tierischen Zellen in Kultur, eine geringere mechanische
Strukturfestigkeit des trockenen und des in Wasser hydratisierten Schwamms,
sowie eine geringe Quellfähigkeit in Verbindung mit einer
geringen Volumenzunahme, z. B. bei der Aufnahme von Wundexudat.
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Beispiel: Herstellung von Keratinschwämmen
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Zur
Herstellung einer erfindungsgemäß einzusetzenden
wässrigen Keratinlösung wurden 20 g menschlicher
Haare mit 0,5% SDS-Lösung gewaschen, getrocknet und durch
Inkubation mit n-Hexan über Nacht entfettet. Nach Entfernen
des Hexans wurden 400 mL einer 25 mM Tris-Lösung (pH 8,5)
2 M Thioharnstoff, 5 M Harnstoff und 5% Mercaptoethanol in Wasser
zugeben. Nach Verschließen des Gefäßes
mit Parafilm wurde für 72 h bei 50°C gerührt.
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Ungelöste
Bestandteile wurden durch Zentrifugieren bei ca. 4.500 × g
(Laborzentrifuge), 10 min, 5.000 upm) entfernt. Der Überstand
wurde zusätzlich durch einen Filter mit einer Porengröße
von 2,5 μm filtriert. Das Filtrat konnte ohne wesentliche
Veränderungen der Eigenschaften bei 4°C aufbewahrt
oder in Aliquots eingefroren werden.
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Zur
Entfernung von Reduktionsmitteln wurde das Filtrat gegen destilliertes
Wasser dialysiert, z. B. mit einer Spectrapore 1 Membran (Ausschlussgrenze
6.000–8.000 Da), üblicherweise je 100 mL Filtrat
gegen 5 L Wasser über 72 h mit 6-fachem Auswechseln des
Wassers. Das Dialysat wurde in einer Ultrazentrifuge bei 15.000
upm für 10 min zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen.
Der Proteingehalt dieser Keratinlösung betrug etwa 20 mg/mL
(Bradford). Das Zentrifugat kann unmittelbar zur Herstellung von
Keratinschwämmen eingesetzt werden, vorzugsweise durch
Einfrieren der Lösung und anschließendes Gefriertrocknen.
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Für
die bevorzugte Ausführungsform wurde ein Teil der vorstehend
beschriebenen Keratinlösung alkalisch hydrolysiert, beispielsweise
durch Dialyse gegen 0,1 M Natronlauge bei 4°C. Das erhaltene
alkalische Dialysat wurde durch Ultrafiltration (Ausschlussgrenze
5000 Da, Filter erhältlich unter der Bezeichnung Vivaspin)
gereinigt und mit 0,1 mM Natronlauge gewaschen, der verbleibende
pH betrug 10. Der Proteingehalt wurde nach Bradford zu 25 bis 30
mg/mL bestimmt.
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Zur
Herstellung eines Schwamms wurden die in der nachfolgenden Tabelle
dargestellten Mischungen der Keratinlösung mit der alkalisch
hydrolysierten Keratinlösung hergestellt und nach Einfrieren
gefriergetrocknet. Als Weichmacher waren der Keratinlösung
jeweils 1 Gew.-% Glycerin pro mL Keratinlösung zugegeben. Tabelle: Quellvermögen und Wasseraufnahme
| Anteil
alkalisch hydrolysierten Keratins (Vol.-% ) | Volumenzunahme
(Faktor) | Gewichtszunahme
(Faktor) |
| 0 | 1 | ca.
1,3 |
| 25 | 2 | 2,6 |
| 50 | 2,3 | 3,3 |
| 75 | 2,75 | 4,9 |
| 100 | 3,25 | 7,1 |
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Die
Gewichtszunahme wurde als Abtropfgewicht nach Eintauchen in Wasser
gemessen. Für die Schwammbildung wurde etwa 1 mL der Mischung
von Keratinlösungen in zylindrischen Röhrchen
bei –20°C eingefroren, gefriergetrocknet und anschließend
bei 110°C für ca. 2,5 Stunden erwärmt.
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Weiter
in der Tabelle angegeben sind die Werte für die Volumenzunahme
und die Gewichtszunahme der Schwämme bei Lager in Wasser
(20°C, 30 min) Die Ergebnisse zeigen, dass mit höheren
Anteil alkalisch hydrolysierten Keratins das Quellvermögen
zunimmt.
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Rasterelektronenmikroskopische
Aufnahmen der Keratinschwämme zeigen eine gleichmäßige
offenporige Struktur. Im Einzelnen zeigt 3 darauf
Kantenlänge der Abbildung 1.800 µm) einen Schwamm,
der 10 Vol.-% alkalisch hydrolysierte Keratinlösung enthält, 4 einen
Ausschnitt aus 3, Kantenlänge der Abbildung
450 µm, und 5 einen Ausschnitt der 3 mit
einer Kantenlänge der Abbildung von 9 µm.
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Die 3, 4 und 5 zeigen,
dass die Struktur des Schwamms sehr gleichmäßig
ist, und die Porenwände in sich glatt und geschlossen sind,
wobei in 5 die nanopartikuläre
Oberflächenstruktur deutlich wird.
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6 zeigt
eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Schwamms, der
aus einer Mischung von Keratinlösungen mit einem Anteil
von 20 Vol.-% alkalisch hydrolysierter Keratinlösung hergestellt wurde,
und 7 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme
eines Schwamms, der aus einer Mischung mit 30 Vol.-% alkalisch hydrolysierter Keratinlösung
hergestellt wurde. Die Abbildungen von 6 und 7 haben
jeweils eine Kantenlänge von 1.800 μm.
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Im
Vergleich mit 3 zeigen die 6 und 7,
dass ein höherer Anteil alkalisch hydrolysierter Keratinlösung
größere Poren im Keratinschwamm erzeugt, wobei
jedoch die in sich geschlossene Oberfläche der Porenwände
erhalten bleibt.
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Die
Kultivierung von Zellen kann in vitro mit dem erfindungsgemäßen
Schwamm durch Inkubation des Schwamms in Zellkulturmedium unter
Zellkulturbedingungen mit zugesetzten tierischen Zellen erfolgen.
Vorliegend wurden ca. 100.000 humane stromale Keratozyten mit einem
erfindungsgemäß hergestellten Schwamm (10 Vol.-%
alkalisch hydrolysiertes Keratin) für drei Tage in Standardmedium
inkubiert. Zur Kontrolle wurde ein Keratinschwamm gleich behandelt,
jedoch ohne dass Zellen zugesetzt wurden.
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Im
Anschluss an die Kultivierung wurde eine Lebendfärbung
mit MTT (gelbes Tetrazoliumsalz) durchgeführt, das durch
die mitrochondriale Aktivität lebensfähiger Zellen
zu blauem Formazan umgesetzt wird.
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8 zeigt
eine photografische Aufnahme, nämlich links im Bild die
Kontrolle ohne Zellen, und rechts im Bild den mit Zellen inkubierten
Schwamm nach Umsetzung von MTT. Es wird deutlich, dass die Lebendfärbung
durch das gesamte Volumen des erfindungsgemäßen
Schwamms erfolgt, was eine vollständige Besiedlung des
Keratinschwamms durch sein gesamtes Volumen anzeigt.
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Entsprechend
wird der erfindungsgemäße Schwamm auch bei Verwendung
als Implantat durch sein Gesamtvolumen von Zellen besiedelt, vorzugsweise
schneller und/oder gleichmäßiger als Schwämme,
die aus Keratinlösung hergestellt wurden, die ein Reduktions-
oder ein Oxidationsmittel enthielt, oder die ohne Erwärmung
der getrockneten Struktur hergestellt wurden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 99/26570 [0003]
- - WO 01/19305 [0006]
- - EP 0628573 A1 [0007]
- - EP 1470824 A1 [0008]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Tanaga et
al. (Materials Science and Engineering C24, 441–446 (2004)) [0004]
- - Yamauchi et al. (Journal of Biomedical Materials Research
439–444 (1996)) [0004]
- - Yamauchi et al. (Journal Biomaterials Science Polymer Vol
9, Nr. 3, 259–270 (1998)) [0004]
- - 5th World Meeting of Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical
Technology Genf, 27–30 März 2006 [0005]
- - Yamauchi et al. (J. Biomater. Sci. Polym. Ed 9: 259–270
(1998)) [0041]