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Die
Erfindung betrifft neue Insulinanaloga mit basalem Zeit-/Wirkungsprofil,
ihre Herstellung und Verwendung.
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Über
die letzten Jahre hat die Zahl der Erkrankungen an Diabetes in einem
geradezu epidemischen Ausmaß zugenommen. Aufgrund der Erkrankung
kann es zu einer gravierenden Verkürzung der Lebenserwartung
kommen. Menschen mit Diabetes müssen ihrem Körper
oft Insulin von außen zuführen. Es ist sinnvoll, die
Behandlung mit Insulin zu optimieren. Mittlerweile gibt es unterschiedliche
Insuline mit spezifischen pharmakologischen Eigenschaften zur Behandlung.
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Praktischerweise
werden die unterschiedlichen Insuline nach ihrer Wirkdauer unterschieden
in kurzwirksame Insuline, schnellwirkende Insuline, langwirksame
Insuline und Mischinsuline. Synonym verwendete Bezeichnungen für
langwirksame Insuline sind Verzögerungsinsulin, Depotinsulin
oder auch Basalinsulin. Die Wirkstoffe vieler dieser Insulinpräparate
sind sogenannte Insulinanaloga, die vom humanen Insulin abgeleitet worden
sind durch Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder mehrerer
Aminosäuren. Die Begriffe „Insulinanaloga" und „Insuline"
werden hier synonym verwendet.
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Das
Konzept der intensivierten Insulintherapie versucht das Gesundheitsrisiko
abzumindern, indem eine stabile Kontrolle des Blutzuckerspiegels
durch frühe Gabe von Basalinsulinen angestrebt wird. Ein
Beispiel für ein gängiges Basalinsulin ist das
Medikament Lantus® (Wirkstoff:
Insulin Glargin = Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin).
Generell gilt es, bei der Entwicklung neuer, verbesserter Basalinsuline
die Zahl hypoglykämischer Ereignisse zu minimieren. Ein
ideales Basalinsulin wirkt dabei sicher in jedem Patienten mindestens
24 h Stunden. Idealerweise setzt die Insulinwirkung verzögert
und mit einem möglichst flachen Zeit-/Wirkungsprofil ein,
so dass die Gefahr einer kurzfristigen Unterzuckerung deutlich minimiert
ist und die Applikation sogar ohne vorherige Einnahme von Nahrungsmitteln
erfolgen kann. Eine gute Versorgung mit Basalinsulin ist dann gegeben,
wenn die Insulinwirkung möglichst lange gleichbleibend
anhält, d. h. der Körper mit einer konstanten
Menge Insulin versorgt wird. Damit ist die Gefahr hypoglykämischer
Ereignisse gering und eine Patienten- und tagesspezifische Variabilität
minimiert. Das pharmakokinetische Profil eines idealen Basalinsulins
sollte also durch einen verzögerten Wirkeintritt und durch
eine verzögerte, d. h. lang anhaltende und gleichmäßige
Wirkung gekennzeichnet sein.
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Jedoch
zeigt – trotz der bereits erreichten therapeutischen Vorteile – keines
der bisher beschriebenen Verzögerungsinsuline die pharmakokinetischen
Eigenschaften eines idealen Basalinsulins. Wünschens-wert sind
Insuline, die ein solch flaches und lang andauerndes Zeit-/Wirkungsprofil
haben, dass die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse und
der tagesabhängigen Varianz im Patienten weiter minimiert
ist und die Wirkdauer weiter verzögert ist, so dass unter
Umständen nicht mehr täglich Insulin verabreicht
werden muss. Dies würde eine vereinfachte Behandlung von
Diabetikern ermöglichen, insbesondere von älteren
und pflegebedürftigen Diabetikern, die sich Insulin nicht
mehr selber injizieren können und wäre somit auch
von großem volkswirtschaftlichem Nutzen. In der frühen
Phase des Diabetes Typ 2 wären solche Basalinsuline zudem
nützlich. Kliniker berichten, dass die bei vielen Menschen
vorhandene Phobie vor Spritzen sie davor zurückschrecken lässt,
rechtzeitig mit der Insulintherapie zu beginnen. Als Konsequenz
ergibt sich eine schlechte Blutzuckereinstellung, die diabetische
Spätfolgen nach sich zieht. Ein Basalinsulin, das die Anzahl
der durch Spritzen erfolgten Insulingaben vermindert, könnte
bewirken, dass Patienten leichter die Insulintherapie annehmen.
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Kohn
et al. (Peptides 28 (2007) 935–948) beschreiben,
dass man die Optimierung der Pharmakodynamik von Insulin dadurch
erreichen kann, dass man Insulinanaloga herstellt, deren isoelektrischer
Punkt (pl) durch Addition von Lysin oder Arginin an das B-Kettenende
oder den N-Terminus der A und B-Kette in Richtung des alkalischen
Bereichs verschoben ist, verglichen mit dem isoelektrischen Punkt
von Humaninsulin (pl = 5,6), so dass die Löslichkeit unter
physiologischen Bedingungen verringert ist und sich ein verlängertes
Zeit-/Wirkungsprofil ergibt. Verbindung 18 aus Kohn et al. (Arg
(A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin (pl experimentell
bestimmt = 7,3; pl berechnet = 7,58) wird dabei als beste Verbindung
im Sinne des Konzeptes dargestellt. Das hauptsächliche
Ziel bei der Gestaltung neuer Insulinanaloga sehen Kohn et al. daher
in der Addition von positiv geladenen Aminosäuren zur Aminosäuresequenz
von Humaninsulin zwecks Erhöhung des isoelektrischen Punktes
von pl = 5,6 in den neutralen Bereich.
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Es
wurde nun aber überraschend gefunden, dass solche Insulinanaloga
zu dem beschriebenen wünschenswerten basalen Zeit-/Wirkungsprofil
führen, die durch die Merkmale charakterisiert sind, dass
- • das B-Kettenende aus einem amidierten
basischen Aminosäurerest wie Lysin bzw. Argininamid besteht, und
- • die Aminosäureposition A8 durch einen Histidinrest
besetzt wird, und
- • die Aminosäureposition A21 durch einen Glycinrest,
Alaninrest, Serinrest oder Threoninrest besetzt wird, und
- • nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe
enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu
entspricht.
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Überraschenderweise
haben gerade die beschriebenen Insulinanaloga die gewünschten
vorteilhaften dem Ideal nahe kommenden Zeit-/Wirkungsprofile, d.
h. einen verzögerten flachem Wirkeintritt und eine längere
Wirkdauer auf. Damit wird die Gefahr von hypoglykämischen
Ereignissen deutlich minimiert. Die Verzögerung ist so
deutlich, dass sich der Effekt überraschend sogar in Modellversuchen
an Ratten nachweisen lässt, obwohl im Gegensatz dazu die
verzögerte Wirkung von Insulin Glargin in der Ratte nicht
eindeutig beobachtbar ist. In 1 ist
die hypoglykämische Wirkung der erfindungsgemäßen
Verbindung YKL202 verglichen mit der von Insulin Glargin dargestellt. Ähnliche
Ergebnisse werden im Hund erhalten. Damit sind neue Basalinsuline
bereitgestellt worden, die deutlich weniger häufig appliziert
werden müssen. Neben diesen beschriebenen pharmakokinetischen
Vorteilen weisen die erfindungsgemäßen Analoga
gegenüber Insulin Glargin bessere Eigenschaften in pharmakologischer
Hinsicht auf. Zudem zeigen die beanspruchten Insuline auch in physikalisch-chemischer
Hinsicht Vorteile.
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Es
wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Insulinanaloga
der Formel I
wobei
A-1
Lys, Arg oder einer Aminogruppe;
A0 Lys, Arg oder einer chemischen
Bindung;
A1 Arg oder Gly;
A5 Asp, Glu oder Gln;
A15
Asp, Glu oder Gln;
A18 Asp, Glu oder Asn;
A21 Ala, Ser,
Thr oder Gly;
B-1 Asp, Glu oder eine Aminogruppe;
B0 Asp,
Glu oder eine chemische Bindung;
B1 Asp, Glu, Phe oder eine
chemische Bindung;
B3 Asp, Glu oder Asn;
B4 Asp, Glu oder
Gin;
B29 Arg, Lys oder einer Aminosäure ausgewählt
aus einer Gruppe enthaltend die Aminosäuren Phe, Ala, Thr, Ser,
Val, Leu, Glu oder Asp, oder einer chemischen Bindung;
B30
Thr oder einer chemischen Bindung;
B31 Arg, Lys oder einer
chemischen Bindung;
B32 Arg-Amid oder Lys-Amid
entspricht,
wobei nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend
A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu entspricht,
das gewünschte pharmakologische Profil, d. h. einen verzögerten
Wirkeintritt und durch eine länger anhaltende und gleichmäßige
Wirkung, haben. Diese Insulinanaloga sind daher Gegenstand der Erfindung.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben
beschrieben, wobei ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend
A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu entspricht.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben
beschrieben, wobei bevorzugt A-1 Arg, A0 Arg, A5 Glu, A15 Glu, A18
Asp, A8 His, A21 Gly, B0 Glu, B3 Asp, B4 Glu, B30 Arg oder B30 Lys entspricht.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben
beschrieben, wobei dieses ausgewählt wird aus einer Gruppe
enthaltend
Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21),
Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1),
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1), Arg (A0),
Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1), Arg (A0),
Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1), Arg (A0),
His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1), Arg (A0),
His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg (A-1), Arg (A0),
His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), Glu (A5),
His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), Asp (A18),
His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), Glu (A15),
His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), His (A8),
Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), His (A8),
Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg (A0), His (A8),
Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
Arg
(A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
His
(A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin.
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Durch
die Angabe des Begriffs "Humaninsulin" in den Bezeichnungen der
genannten Insulinanaloga wird Bezug auf die Aminosäuresequenzen
der A- und B-Kette von Humaninsulin genommen und alle Abweichungen
(Additionen, Substitutionen, Deletionen) davon sind in einer gegebenen
Bezeichnung eines Insulinanalogons angegeben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei ein Vorläufer
des Insulinanalogs Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, der
Vorläufer enzmatisch zu zwei-kettigem insulin prozessiert
wird und eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms
mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das
Insulinanalogon isoliert wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Insulinanalogons
wie oben beschrieben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
von Diabetes Mellitus., insbesondere von Diabetes Mellitus Typ I
oder Typ II. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel
enthaltend ein Insulinanalogon wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend
ein Insulinanalog wie oben beschrieben, das therapeutisch zur Knorpelregeneration
eingesetzt wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend
ein Insulinanalog wie oben beschrieben, das therapeutisch zur Unterstützung
der beta-Zellregeneration eingesetzt wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons
wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in wässriger
Form enthaltend das gelöste Insulinanalogon vorliegt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons
wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form von Pulver
vorliegt, insbesondere in kristalliner und/oder amorpher Form.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons
wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form einer Suspension
vorliegt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons
wie oben beschrieben, wobei die Formulierung zusätzlich
ein chemisches Chaperon enthält.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für
einen Vorläufer eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für
die A-Kette eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für
die B-Kette eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor enthaltend eine
DNA wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Wirtsorganismus enthaltend
eine DNA wie oben beschrieben oder einen Vektor wie oben beschrieben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Präproinsulinanalogon,
dadurch gekennzeichnet, dass das C-Peptid an seinem N-Terminus den
Aminosäurerest Arginin trägt und sein C-Terminus
durch die Form Arg Arg, Arg Lys oder Lys Arg Arg gekennzeichnet
ist.
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Dem
Fachmann ist dabei klar, dass die erfindungsgemäßen
Insuline Gegenstand einer pharmazeutischen Formulierung sein können,
die nach Applikation vorteilhaft wirkt. Dabei geht man von wässrigen
Lösungen aus. Entsprechend müssen weitere Komponenten
mischbar sein. Die Gefahr viraler tierischer Kontamination wird
dadurch minimiert, dass die Zubereitung keine Komponenten enthalten
sollte, die aus tierischen Quellen stammen. Es ist weiterhin vorteilhaft,
durch Zusatz von Konservierungsmitteln eine mikrobielle Verunreinigung
zu verhindern. Durch den Zusatz isotoner Agentien kann eine mögliche
negative Auswirkung der Formulierung auf die Physiologie der Gewebezellen
an der Applikationsstelle kompensiert werden. Stabilisierend kann
sich der Zusatz von Protamin auswirken, so dass man weitgehend salzfreien
Insulinzubereitung gelangen kann, wenn man der Formulierung Protamin
zufügt. Der Zusatz von einer phenolischen Komponente kann zu
einer Stabilisierung der Struktur des verwendeten Insulinanalogons
führen und so unter anderem den Verzögerungseffekt
beim Wirkungseintritt zusätzlich bewirken. Der Formulierung
zugesetzt können auch Substanzen sein, die die Raumstruktur
der erfindungsgemäßen Verzögerungs-insuline
stabilisieren und zu besserer thermischen Stabilität führen.
Solche chemischen Chaperone können z. B. kurze synthetische
Peptide, die auch Aminosäureanaloga enthalten können
oder z. B. vom C-Peptid des Insulin abgeleitete Peptidsequenzen umfassen.
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Zur
Entwicklung von Depotformen können die erfindungsgemäßen
insuline in Nanopartikel eingebunden werden. Denkbar sind auch sogenannte „Slow
release" Formuierungen, bei denen das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin
reversibel an polymere Träger gebunden vorliegt.
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Die
erfindungsgemäßen insuline können parallel
zu schnellwirksamen Insulinen wie Apidra
®,
NovoRapid
®, Humalog
® oder
sich in Entwicklung befindlichen Insulinderivaten oder Formulierungen
mit entsprechendem Zeit-/Aktionsprofil oder inhalierbarem Insulin
oder nasal oder oral applizierten Insulinen, die sich in Entwicklung
befinden, verabreicht werden. Dabei ist es dem Fachmann klar, dass
dazu auch entsprechend formulierte Mischungen aus schnell wirksamen
und erfindungsgemäßem Verzögerungsinsulin
verwendet werden können. Weiterhin können die
erfindungsgemäßen Insuinanaloga in pharmazeutischen
Zubereitungen verwendet werden, die Peptide, die durch eine dem
GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) oder dem Exendin-4 bzw. Exendin-3
vergleichbare Aktivität beschrieben sind, enthalten. Beispiel
für solche Peptide stellen GLP-1 (7-37), Exenatide (Byetta
®) oder Peptide, deren Herstellung
in den Patentanmeldungen
WO
2006/058620 ,
WO 2001/04156 ,
WO 2004/005342 und
WO 98/08871 beschrieben
sind, dar. Besonders vorteilhaft sind dabei Formulierungen, die
eine Depotformulierung dieser Peptide enthalten. Vorteilhaft besonders
in der Anfangsphase der Typ II Diabetes Erkrankung sind Therapieformen,
die parallel zu Verabreichung der erfindungsgemäßen Pharmazeutika
vorsehen, die die Insulinwirkung erhöhen, wie z. B. Metformin.
Kombinationstherapien mit Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitoren, die
den Spiegel an Inkretinen erhöhen, sind wie Kombinationen
mit Sulfonylharnstoffen, die die Insulinausschüttung im
Pankreas erhöhen, ebenfalls möglich. Besonders
vorteilhaft können die erfindungsgemäßen
Verzögerungsinsuline dann eingesetzt werden, wenn durch
Applikation von Differenzierungsfaktoren, die Regeneration von Betazellen
aus entsprechenden Stammzellen eingeleitet wird. All diese Anwendungen
sind beispielhaft für die Therapie des Diabetes genannt
und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand
der Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen
Insuline in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung von
Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Typ II Diabetes.
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Weiterer
Erfindungsgegenstand ist auch eine Verwendung der erfindungsgemäßen
Insuline bei Regenerationspozessen, die das Skelett, wie z. B. die
Knorpelregeneration, betreffen. Bei dieser Verwendung kommt es darauf
an, kontrolliert das mitogene Potential von Insulinen zu nutzen,
ohne dabei eine starke metabolische Reaktion hervorzurufen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, das ein
erfindungsgemäßes Analogon enthält, welches
insbesondere eine wässrige Formulierung oder ein Pulver
darstellt.
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Das
Arzneimittel ist eine pharmazeutische Zubereitung, die vorzugsweise
eine Lösung oder Suspension zu Injektionszwecken ist; sie
ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem erfindungsgemäßen
Insulinanalog, und/oder mindestens einem von deren physiologisch
verträglichen Salzen in gelöster, amorpher und/oder
kristalliner – vorzugsweise in gelöster – Form.
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Die
Zubereitung weist vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 2,5 und
8,5, insbesondere zwischen etwa 4,0 und 8,5 auf, enthält
ein geeignetes Isotonisierungsmittel, ein geeignetes Konservierungsmittel und
gegebenenfalls einen geeigneten Puffer, sowie vorzugsweise auch
eine bestimmte Zink-Ionenkonzentration, in steriler wässriger
Lösung. Die Gesamtheit der Zubereitungsbestandteile außer
dem Wirkstoff bildet den Zubereitungs-Träger. Geeignete
Isotonisierungsmittel sind z. B. Glycerin, Glukose, Mannit, NaCl,
Calcium- oder Magnesium-Verbindungen wie CaCl2 etc.
Durch die Wahl des Isotonisierungsmittels und/oder Konservierungsstoffes
beeinflusst man die Löslichkeit der erfindungsgemäßen
Insuline bzw. deren physiologisch verträgliche Salze bei
schwach sauren pH-Werten.
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Geeignete
Konservierungsmittel sind z. B. Phenol, m-Cresol, Benzylalkohol
und/oder p-Hydroxybenzoesäureester.
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Als
Puffersubstanzen, insbesondere zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen
etwa 4,0 und 8,5 können z. B. Natriumacetat, Natriumcitrat,
Natriumphosphat etc. verwendet werden. Ansonsten sind zur Einstellung
des pH-Wertes auch physiologisch unbedenkliche verdünnte
Säuren (typischerweise HCl) bzw. Laugen (typischerweise
NaOH) geeignet.
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Wenn
die Zubereitung einen Zinkgehalt besitzt, ist ein solcher von 1 μg/ml
bis 2 mg/ml, insbesondere von 5 μg bis 200 μg
Zink/ml bevorzugt.
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Zwecks
Variation des Wirkstoffprofils der erfindungsgemäßen
Zubereitung kann auch unmodifiziertes Insulin, vorzugsweise Rinder-,
Schweine- oder Human-Insulin, insbesondere Humaninsulin, oder Insulinanaloga
und Derivate davon zugemischt werden. Ebenfalls können
ein oder mehrere Exendin-4 Derivate oder Peptide, die durch eine
dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) vergleichbare Aktivität
charakterisiert sind, zugemischt werden. Solche Arzneimittel (Zubereitungen)
sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Bevorzugte
Wirkstoffkonzentrationen sind solche entsprechend etwa 1–1500,
weiter bevorzugt etwa 5–1000 und insbesondere etwa 40–400
internationale Einheiten/ml.
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Die
erfindungsgemäßen Insulinanaloga werden zunächst
als Vorstufe, die noch nicht das Amid umfasst, biotechnologisch
hergestellt. Dem Fachmann ist geläufig, das es eine Vielzahl
von Möglichkeiten zur Herstellung von Insulinen gibt. Als
Wirtszellsysteme finden dabei Bakterien, Hefen und höhere
Pflanzen bzw. fermentativ zu kultivierende Pflanzenzellen Verwendung.
Falls die Kostenbetrachtung es erlaubt sind auch Expressionssysteme,
die tierische Zellen als Wirtssystem nutzen, denkbar. Voraussetzung
dafür ist aber eine sichere Freiheit von tierischen Viren.
Somit ist klar, dass die beispielhaft beschriebenen Expressionssysteme
nur einen kleinen Ausschnitt der für die rekombinante Herstellung
von Proteinen entwickelten Wirts/Vektorsysteme darstellen. In der
Anmeldung werden z. B. biotechnologische Verfahren, die Hefe- oder
Pflanzensysteme wie Moose, Algen oder höhere Pflanzen wie
Tabak, Erbse, Distel, Gerste, Mais oder Raps zur Grundlage haben nicht
beschrieben. Dennoch sind Wirts/Vektor Systeme sowie kodierende
DNA-Sequenzen, die die Herstellung der Zielpeptide in entsprechenden
biotechnologischen Expressionssystemen erlauben, ebenfalls Bestandteil
der Erfindung. Wirtsorganismen können also insbesondere
ausgewählt werden aus dem Pflanzenreich aus Organismen
der ersten Abteilung Schizophyta enthaltend Schizomcetes, Bakterien
oder Blaualgen, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta V. Klasse
Chlorophyceae, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta VII. Klasse
Rhodophyceae, Organismen der 3. Abteilung Mycophyta, Organismen
der 5. Abteilung Bryophyta und Organismen der 7. Abteilung Spermatophyta.
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In
der Europäischen Patentanmeldung
EP-A 1 222 207 ist ein Plasmid
pINT358d beschrieben, das für ein Prä-Proinsulin
codiert, welches ein verändertes C-Peptid umfasst. Mit
Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist es nun möglich,
gezielt die das Proinsulin kodierende Sequenz so zu verändern,
dass Prä-Proinsuline exprimiert werden können,
die als Vorstufen für die erfindungsgemäßen
Insulin dienen können. Entsprechende Fusionsproteine müssen
nicht notwendigerweise intrazellulär hergestellt werden.
Es ist dem Fachmann klar, dass solche Proteine auch durch bakterielle
Expression mit anschließender Sekretion in das Periplasma
und/oder in den Kulturüberstand hergestellt werden können.
Die Europäische Patentanmeldung
EP-A 1 364 029 beschreibt
dies beispielhaft. Die Proinsulinvorstufen, die zu den erfindungsgemäßen
Analoga führen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Die
so hergestellten Proinsuline können prinzipiell zu einer
Insulinanalogavorstufe umgewandelt werden, die in Position A0 Lysin
oder Arginin umfasst und am C-terminalen Ende der B-Kette Lysin
oder Arginin trägt. Alternativ kann eine positiv geladene
Aminosäure semisynthetisch an den N-Terminus der A-Kette
addiert werden, wenn Lysin oder Arginin nicht ohnehin schon vorliegen.
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Liegen
die erfindungsgemäßen Proinsuline nach intrazellulärer
Expression in Bakterien als Einschlusskörper oder löslich
vor, müssen diese Vorstufen durch in vitro Faltung in die
richtige Konformation gefaltet werden, bevor die Prozessierung und
biochemische Modifikation vorgenommen werden kann. Dabei erlaubt
das beschriebene Fusionsprotein eine direkte Faltung nach Denaturierung
mittels Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid, Faltungsintermediate
sind dabei ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Zur
Anreicherung der einzelnen Zwischenstufen finden biochemische Methoden
insbesondere Trennverfahren Verwendung, deren zugrunde liegenden
Prinzipien publiziert und sogar Gegenstand von Lehrbüchern
sind. Dem Fachmann ist klar, dass solche Prinzipien in Folge kombiniert
werden können und so zu Verfahren führen können,
die in ihre Abfolge vorher nicht publiziert wurden. Verfahren, die
zur Reinigung der erfindungsgemäßen Analoga führen
sind somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Insulinanaloga, wobei ein
Vorläufer des Insulinanalogons rekombinant hergestellt
und enzymatisch zu einer 2-kettigen Insulinvorstufe umgewandelt
wird, die N-terminal zu Aminosäure 1 der A-Kette Arginin
bzw. Lysin trägt und am C-terminalen Ende der B-Kette einen
Lysin oder Argininrest aufweist, der mit Argininamid oder Lysinamid
in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität in das Amid
und somit in das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin überführt
und über ein biochemischer Reinigungsverfahren hochrein
dargestellt wird.
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Figurenlegende:
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1: Blutzuckersenkende
Wirkung von erfindungsgemäßen Insulinanaloga in
Ratten
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Die
folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgedanken illustrieren,
ohne dabei beschränkend zu wirken.
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Beispiel 1: Herstellung des Vektorderivates
pINT3580, das für Gly (A21)-Insulin und ein modifiziertes
C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze Arg Arg trägt, kodiert.
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Die
Europäische Patentanmeldung
EP-A 1 222 207 beschreibt die Plasmide pINT358d,
pINT91d und die Primer-Sequenz Tir. DNA dieser Produkte findet Verwendung
in der Konstruktion des Plasmides pINT3580. Das Plasmid pINT358d
ist dabei durch eine Gensequenz charakterisiert, die für
ein modifiziertes C-Peptid mit besonderen Eigenschaften kodiert.
Drei Primersequenzen werden synthetisiert:
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Dieser
Primer dient nach Aufarbeitung dazu in Position 21 der A-Kette der
von pINT358d kodierten Proinsulinsequenz Glycin (fett gedruckt,
unterstrichen) anstelle von Asparagin einzuführen.
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Dieser
Primer dient, wie der Primer arg_cjunc_rev, zur Einführung
von Arginin anstelle von Lysin an der Insulin A-/B-Kettengrenze.
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Das
Codon für das einzuführende Arginin ist in beiden
Primern fett gedruckt. Mit DNA des Plasmides pINT358d als Matrize
wird mit den Primerpaaren Tir/arg_cjunc_rev und arg_cjuncf/pint3580_glya21rev
entsprechend der Europäischen Patentanmeldung
EP-A 1 222 207 je eine PCR
durchgeführt. Aliquots der Produkte beider Reaktionen werden
kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar Tir/pint3580_glya21rev
in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion wird
nach gelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches gereinigt
und mit den Restriktionsenzymen Sal1/Nco1 nach Angaben des Herstellers
in ein und derselben Reaktion verdaut, das Reaktionsgemisch gelelektrophoretisch
aufgetrennt und das die Proinsulinsequenz kodierende DNA-Fragment
isoliert. Das Fragment wird anschließend über
eine DNA-Ligasereaktion in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d
Vektor DNA insertiert.
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Mit
dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli Bakterienzellen transformiert.
Das Transformationsgemisch wird auf Selektionsplatten, die 25 mg/l
Ampicillin enthalten, ausplattiert. Plasmid DNA wird von Kolonien
isoliert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Richtige
Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3580.
-
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmides
pINT3581 kodierend für His (A8), Gly (A21)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben über
3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion
wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete
pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und
pint3580_glya2lrev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
-
Das
Codon, das für Histidin in Position 8 der A-Kette kodiert
ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel
1 beschrieben durchgeführt. Template für PCR1
und 2 ist DNA des Plasmides pINT3580. PCR1 wird mit dem Primerpaar
Tir/pint3580_Ha8rev und PCR2 mit dem Primerpaar pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev
durchgeführt. In PCR3 wird mit dem Primer paar Tir/pint3580_glya21rev eingesetzt.
Template ist dabei ein Gemisch der Reaktionsprodukte von PCR1 und
PCR2. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3581.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid
entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid
entsteht.
-
Beispiel 3: Konstruktion des Plasmides
pINT3582 kodierend für His (A8), Glu (A5), Gly (A21)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über
3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion
wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete
pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und
pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
-
Das
Codon, das für Glutaminsäure in Position 5 der
A-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion
wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template
ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung
pINT3582.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Beispiel 4: Konstruktion des Plasmides
pINT3583 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur
eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird
nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d
Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer
Primer wird synthetisiert:
-
Das
Codon, das für Asparaginsäure in Position 18 der
A-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides
pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3583.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Beispiel 5: Konstruktion des Plasmides
pINT3585 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur
eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird
nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d
Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer
Primer wird synthetisiert:
-
Das
Codon, das für Glutaminsäure in Position 15 der
A-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides
pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3585.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Beispiel 6: Konstruktion des Plasmides
pINT3588 kodierend für His (A8), Gly (A21), Asp (B3)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über
3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion
wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete
pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und
pint3580_glya2lrev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
-
Das
Codon, das für Asparagin in Position 3 der Insulin B-Kette
kodiert ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie
ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA
des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung
pINT3588.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Beispiel 7: Konstruktion des Plasmides
pINT3593 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B4) Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über
3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion
wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete
pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und
pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert :
-
Das
Codon, das für Glutamin in Position 4 der Insulin B-Kette
kodiert, ist fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins
Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des
Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3593.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Beispiel 8: Konstruktion des Plasmides
pINT3597 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B0)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion erfolgt über 2 Polymerase Kettenreaktionen.
Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer
werden synthetisiert:
-
Dabei überlappen
sich die beiden Primer partial. Pint3581_Eb0f2 enthält
eine Nco1-Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt.
Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0
am Anfang B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template
für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581.
-
PCR1
wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev. Template
für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar
pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt
aus PCR2 übereckt die vollständige Präproinsulinsequenz.
Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in
die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert.
Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3597.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Argininamid entsteht.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31),
Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung
mit Lysinamid entsteht.
-
Ersetzt
man das Codon für Glutaminsäure in Position B0
durch das Codon von Asparaginsäure und folgt dem Beispiel,
so gelangt man zu Plasmiden, die in Position B0 anstelle von Glutaminsäure
Asparaginsäure tragen.
-
Beispiel 9: Konstruktion des Plasmides
pINT3700 kodierend für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion dient dazu, an der Grenze zwischen Präsequenz
und Start der B-Kette anstelle des Codons für Arginin das
Codon für Lysin einzuführen. Die Konstruktion
erfolgt über zwei Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet
wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert.
-
-
Dabei überlappen
sich die beiden Primer partial und pint3581_Eb0f2 enthält
eine NcoI-Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt.
Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0
am Anfang B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template
für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581. PCR1 wird mit
dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt.
Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit
dem Primerpaar pint3581_Eb- 1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt.
Das Produkt aus PCR2 überdeckt die vollständige
Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion
wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete
pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung
pINT3700.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen
stellt man zunächst durch Umsetzung mit Trypsin und Lysyl-Endopeptidase
C die Zwischenstufe Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin
her, die anschließend über Amidierung mit Argininamid
zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid
entsteht.
-
Beispiel 10: Konstruktion des Plasmides
pINT3701 kodierend für Gly (A21) Lys (B0)-Präproinsulin
-
Die
Konstruktion dient dazu, an der Grenze zwischen Präsequenz
und Start der B-Kette anstelle des Codons für Arginin das
Codon für Lysin einzuführen. Folgt man der Konstruktionsstrategie
aus Beispiel 10, verwendet aber als Template für PCR1 DNA
des Plasmides pINT358d, so gelangt man zu dem Plasmid pINT3701,
das wie das ursprüngliche Plasmid pINT358d dadurch charakterisiert
ist, das die Grenze zwischen C-Peptid und A-Kette durch die Aminosäurefolge
Lys-Arg gebildet wird
-
Beispiel 11: Konstruktion des Plasmides
pINT3702 kodierend für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin mit
dem C-Peptid gemäß Beispiel 10
-
Folgt
man dem im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionsplan, verwendet
aber als Template DNA des Plasmides pINT3701, so gelangt man zu
dem Plasmid pINT3702.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen
stellt man zunächst durch Umsetzung nur mit Lysyl-Endopeptidase
C die Zwischenstufe Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin her,
die anschließend über Amidierung mit Argininamid
zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid
entseht.
-
Beispiel 12: Herstellung des Vektorderivates
pINT3703, das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin
und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze das
Tri-Peptid Lys-Arg-Arg trägt, kodiert.
-
Benutzt
wird DNA des Plasmides pINT3702 als Template, sowie die Primer pint3580_glya21rev
und Tir. Zwei Primersequenzen werden synthetisiert.
-
-
Dieser
Primer dient wie der Primer arg_cjunc_rev zur Einführung
von Arginin an der Insulin A-/B-Kettengrenze.
-
-
Das
Codon für das einzuführende Arginin ist in beiden
Primern fett gedruckt. Mit DNA des Plasmides pINT3702 als Matrize
werden mit den Primerpaaren Tir/3702_cjunc_rev und 3702_arg_cjuncf/pint3580_glya21rev
entsprechend
EP-A 1
222 207 je eine PCR durchgeführt. Aliquots der Produkte
beider Reaktionen werden kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar
Tir/pint3580_glya21rev in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt
dieser Reaktion wird nach gelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches
gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sal1/Nco1 nach Angaben
des Herstellers in ein und derselben Reaktion verdaut, das Reaktionsgemisch
gelelektrophoretisch aufgetrennt und das die Proinsulinsequenz kodierende
DNA-Fragment isoliert. Das Fragment wird anschließend über
eine DNA-Ligasereaktion in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d
Vektor DNA insertiert.
-
Mit
dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli Bakterienzellen transformiert.
Das Transformationsgemisch wird auf Selektionsplatten, die 25 mg/l
Ampicillin enthalten ausplattiert. Plasmid DNA wird von Kolonien
isoliert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Richtige
Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3702.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen,
stellt man zunächst durch Umsetzung mit Lysyl-Endopeptidase
C die Zwischenstufe Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des
Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über
Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt
wird.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid
entsteht.
-
Es
ist dem Fachmann klar, dass man entsprechend den Beispielen 3–8
Asparaginsäure oder Glutaminsäure in die entsprechenden
Positionen der A bzw. B-Kette einführen kann. Diese Proinsuline
sind Vorstufe für die Verbindungen
YKL202-10a | Arg
(A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-10b | Arg
(A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-11a | Arg
(A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-11b | Arg
(A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-12a | Arg
(A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-12b | Arg
(A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-13a | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-13b | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-14a | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-14b | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-15a | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin |
YKL202-15b | Arg
(A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin |
-
Beispiel 13: Herstellung des Vektorderivates
pINT3704, das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin
kodiert
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung des Vektorderivates pINT3704,
das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin
kodiert und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze
das Tri-Peptid Lys-Arg-Arg trägt, und bei dem die Aminosäure
Glycin, welche in Humaninsulin in Position A21 vorkommt, deletiert
ist.
-
Folgt
man dem in Beispiel 12 beschrieben Syntheseschema und ersetzt die
Primer 3702_arg_cjuncf und 3702_arg_cjuncfrev durch die Primer 3703_Δ Ga1f
und 3703_Δ Ga1rev und benutzt DNA des Plasmides pINT3073
als Template, so gelangt man zu dem Plasmid pINT3704, das dadurch
gekennzeichnet ist, das das in dem kodierten Präproinsulin
die Aminosäure Glycin in Position1 der A-Kette deletiert
ist und der übrige Sequenzverlauf dem, der von pINT3703
kodierten Sequenz entspricht.
-
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen,
stellt man zunächst durch Umsetzung mit Lysyl-Endopeptidase
C die Zwischenstufe Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), des
Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über
Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt
wird.
-
Das
von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für
die Verbindung Arg (A0), Arg (Al), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid
entsteht.
-
Dem
Fachmann ist klar, dass man entsprechend Beispiel 12 negativ geladene
Aminosäuren in die Präproinsulinsequenz einführen
kann. Auch lässt sich in Analogie zu Beispiel 13 aus dem
Plasmid pINT3702 ein Plamid herstellen, dass für eine Proinsulinsequenz
kodiert, die die Herstellung von Insulinderivaten erlaubt, die in
Position 1 der A-Kette ein Arginin als N-terminale Aminosäure
tragen.
-
Beispiel 14: Expression der Proinsulinderivate
-
Die
Expression wird entsprechend Beispiel 1 der Europäischen
Patentanmeldung
EP-A
1 222 207 durchgeführt.
-
Beispiel 15: Faltung der Proinsulinderivate
-
Die
Faltung erfolgt prinzipiell nach der in
EP-A 0 668 282 beschriebenen
Methode.
-
Beispiel 16: Prozessierung der Proinsuline
aus den Beispielen 2–8 mittels Trypsin
-
Es
erfolgt die enzymatische Prozessierung der gefalteten Präproinsulin
zu der zweikettigen Arg (A0)-Insulinvorstufe, deren C-terminales
B-Kettenende durch Lysin oder Arginin charakterisiert ist. Die enzymatische
Prozessierung der gefalteten Präproinsulinvorstufe erfolgt
wie z. B. in Beispiel 4 von
WO91/03550 beschrieben.
Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei der Einsatz der in
WO 2007/031187 A1 beschriebenen
Trypsinvariante.
-
Beispiel 17: Prozessierung der Proinsuline
aus den Beispielen 9–13 mittels Endoproteinase Lys-C
-
Endoprotease
Lys-C aus Achromobacter lyticus ist kommerziell erhältlich
(Merck/Calbiochem). Die Reaktion wird leicht modifiziert wie von
Jekel, P. A. et al. [Anal. Biochem. 134, 347–354,(1983)]
beschrieben durchgeführt. Es wird ein pH von 9,5 eingestellt
und die Reaktionstemperatur beträgt 30°C.
-
In
der Eintopfreaktion wir die Präsequenz abgespalten und
das C-Peptid beginnend mit Thr (B30) herausgespalten, so dass das
C-terminale Ende der B-Kette von Lysin gebildet wird, das als reaktive
Stelle für die enzymkatalysierte Kupplungsreaktion vorliegt.
-
Beispiel 18: Herstellung der Arg-NH2 bzw. Lys-NH2 Insulinverbindung
aus der zweikettigen Vorstufe über Kupplung mit Arginin – bzw.
Lysinamid
-
Unabhängig
von der Positionierung der zusätzlichen sauren Aminosäuren
wird eine Standardreaktion wie folgt durchgeführt: 100
mg Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31)-Insulinanalog werden in 0.95 ml
Argininamidlösung (446 g/L) gelöst, 0.13 ml M
Na-Acetatpuffer (pH 5.8) und 2 ml DMF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird
auf 12°C gekühlt und durch Zugabe von 0.094 ml
Trypsin (0.075 mg, Roche Diagnostics) gestartet. Nach 8 h wird die
Reaktion durch Zugabe von TFA bis pH 2.5 gestoppt und per HPLC analysiert.
Es bildet sich > 60%.
Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH
2-Insulinanalogon
Nach Zusatz von Trypsininhibitorlösung erfolgt die Reinigung
des amidierten Analogs in Analogie zu
US
5,656,722 .
-
Die
Herstellung der entsprechenden Lysinamid-Verbindung erfolgt analog.
Allerdings geht man von einer wässrigen Lysinamid Stammlösung
aus, die 366g/L Lysinamid gelöst enthält.
-
Beispiel 19: Semisynthetische Herstellung
von Lys (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid
-
Die
in Beispiel 11 beschriebene Verbindung YKL202-8, die einem Insulinderivat
der Struktur Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid
entspricht, dient als Ausgangsmaterial zur Herstellung der Verbindung
YKL202-11, die Lys (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid.
200 mg der Verbindung werden in 40 ml eines 100 mMl Na2 HPO4/CH3CN (50:50)-Gemisches
gelöst und ein pH von 7,7–8,2 eingestellt. Als
weiteres Material wird ein Boc-Lys (Boc)-NHS Ester hergestellt indem
man 0,3 mM Boc-Lys (Boc)-OH, 0,4 mM N-hydroxysuccineimide (NHS)
und 0,4 mM Dicyclohexylcarbodiimid (DCVC) in Dichlormethan 40 Minuten
mischt. Das Reaktionsgemisch im Rotationsvakuumverdampfer zur Trockene
eingeengt. Das Gemisch wird anschließend in 5 ml Methanol
aufgenommen und dem gelösten Ausgangsinsulin zugesetzt.
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mindestens 60, maximal aber
120 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von
200 μl TFA gestoppt. Die Masse der Reaktionsprodukte wird über
LC-MS massenspektroskopisch charakterisiert, um den Nachweis zu
erbringen, dass monoacyliertes Produkt, das aus drei Komponenten
besteht vorliegt. Die Komponenten werden über HPLC getrennt.
Dabei werden auch di-acylierte und tri-acylierte Nebenprodukte abgetrennt.
Die Fraktionen der HPLC-Trennung werden massenspektrokopisch analysiert.
Die 3 Fraktionen, in denen jeweils monoacyliertes Produkt enthalten,
werden einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, deren
Interpretation die Identifikation der HPLC-Fraktion erlaubt, die
die gewünschte Verbindung enthält von der anschließend
durch Hydrolyse die Boc-Schutzgruppen entfernt werden. Nach erneuter HPLC-Reinigung
wird das gewünschte Produkt auf seine biologischen Eigenschaften
getestet.
-
Beispiel 20: Herstellung des Plasmides
pINT358_ha8, das für His (A8), Gly (A21) Proinsulin kodiert.
-
Folgt
man dem Herstellungsschema aus Beispiel 2 und verwendet als Template
für die PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT358d, so gelangt
man zu dem Plasmid pINT358_ha8, das für His (A8), Gly (A21)
Proinsulin kodiert. Das von dem Plasmid kodierte Proinsulin dient
als, dient als Vorstufe für die Verbindung der Form His
(A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH
2-Humaninsulin
charakterisiert. Die Prozessierung des Präproinsulins zu
His (A8), Gly (A21), Arg (B31) als Zwischenstufe vor Amidierung
erfolgt dabei wie in
WO91/03550 beschrieben.
Dabei setzt man herkömmliches Trypsin ein.
-
Beispiel 21: Formulierung der amidierten
Insulinderivate
-
Um
die erfindungsgemäßen Insulinderivate auf ihre
biologisch, pharmakologischen und physikalisch chemischen Eigenschaften
zu testen, wurde von den Verbindungen wie folgt eine Lösung
hergestellt: Das erfindungsgemäße Insulinderivat
wurde mit einer Zielkonzentration von 240 ± 5 μM
in 1 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid)
aufgelöst. Hierzu wurde von dem gefriergetrockneten Material
zunächst eine um etwa 30% höhere Menge als aufgrund
des Molekulargewichts und der angestrebten Konzentration benötigt eingewogen.
Danach wurde die vorliegende Konzentration mittels analytischer
HPLC bestimmt und die Lösung anschließend auf
das zur Erreichung der Zielkonzentration erforderliche Volumen 5
mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink aufgefüllt.
Falls erforderlich, wurde dabei der pH-Wert auf 3,5 ± 0,1
nachjustiert. Nach der endgültigen Analyse durch HPLC zur
Absicherung der Zielkonzentration von 240 ± 5 μM
wurde die fertige Lösung mittels einer Spritze mit einem
0,2 μm Filtervorsatz in ein mit einem Septum und einer
Bördelkappe verschlossenes steriles Fläschchen überführt.
Für die kurzfristige, einmalige Testung der erfindungsgemäßen
Insulinderivate wurde keine Optimierung der Formulierungen, z. B.
hinsichtlich eines Zusatzes isotonischer Agentien, Konservierungsmittel
oder Puffersubstanzen, vorgenommen.
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Beispiel 22: Herstellung von His (A8),
Gly (A21), Arg (B31) Humaninsulin mittels Hefeexpression
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EP-A 1 364 032 beschreibt
die Expression und Sekretion eines Fusionsporteins aus Hirudin und
Miniproinsulin durch Hefe. Als besonders vorteilhafte Hefewirtsorganismen
werden dabei S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris
benannt. In Beispiel 4 der genannten Patentanmeldung ist die Konstruktion
eines Plasmides beschrieben, das die Herstellung des Fusionsprotein
in P. pastoris erlaubt und dessen DNA als Template zur Herstellung
eines Miniproinsulins dient, dessen Aminosäuresequenz in
der A-Kette in den Positionen A8, A15, A18 und A21 durch die Aminosäuren
Histidin (A8), Glutaminsäure (A15), Asparaginsäure (A18)
und Glycin (A21) charakterisiert ist. Verwendet wird der Primer
pichia_H_if1. Neu synthetisiert und nach Synthese gereinigt werden
folgende Primer:
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Das
fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 21.
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-
Das
fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 8.
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-
Das
fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 8.
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Äquimolare
Mengen (1 μg) an Primer pichia_G21_rev und Primer pichia_H8f,
die sich partial überdecken, werden in Gegenwart einer
thermophilen Polymerase und Polymerasepuffer, der die 4 Deoxynukleotide dATP,
dCTP, dGTP und dTTP 5' enthält, bei 95°C denaturiert,
anschließend 10–15 Minuten bei 56°C inkubiert. Das
Reaktionsvolumen dieser Reaktion 1 beträgt 25 μl.
In einer Standard Polymerasekettenreaktion (Reaktion 2) werden parallel
die Primer pichia_H_if1 und pichia-a1-12rev mit der beschriebenen
Template DNA umgesetzt. In einer weiteren Polymerasekettenreaktion
werden die Reaktionsprodukte der Reaktionen 1 und 2 als Template
mit den Primern pichia_H_if1/pichia_G21rev umgesetzt. Das Reaktionsprodukt
dieser Reaktion wird mittels Gelelektrophorese gereinigt. Nach Umsetzung
mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacII wird das DNA-Fragment,
welches das Fusionsprodukt überdeckt in, Analogie zu Beispiel
4 in den beschrieben Vektor pPlCZαA eingesetzt. Es entsteht
das Plasmid pPIC_ins202. Unter Anwendung des beschriebenen kommerziell
erhältlichen Expressions-Kits erfolgt die Expression des
von dem Plasmid kodierten Fusionsproteins. Nach Herstellung der
His (A8), Gly (A21), Arg (B31)-Humaninsulinvorstufe erfolgt nun
die Kupplung von Arginin-Amid entsprechend der Beschreibung an Arginin
(B31). Es entsteht die Verbindung His (A8), Gly (A21), Arg (B31),
Arg (B32)-NH2-Insulin, die bereits ein neues Verzögerungsinsulin
entsprechend Beispiel 20 darstellt und im Rattenversuch getestet
wird.
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Die
Verbindung kann aber auch als Zwischenstufe zur Darstellung der
Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31) Arg (B32)-NH2-Insulin, die in Anlehnung an Kohn et al.
[Peptides 28 (2007) 935–948] hergestellt
wird, dienen. Dazu werden 200 mg der Verbindung His (A8), Gly (A21),
Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin in
40 ml eines Gemisches von 100 mM Na2HPO4/CH3CN (50:50) gelöst
und ein pH von 7,7–8,2 eingestellt.
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Als
weiteres Material wird ein Boc-Arg-NHS Ester hergestellt, indem
man 0,3 mM Boc-Arg-OH, 0,4 mM N-hydroxysuccineimide (NHS) und 0,4
mM Dicyclohexylcarbodiimid (DCVC) in Dichlormethan 40 Minuten mischt.
Das Reaktionsgemisch wird im Rotationsvakuumverdampfer zur Trockene
eingeengt. Das Gemisch wird anschließend in 5 ml Methanol
aufgenommen und dem gelösten Ausgangsinsulin zugesetzt.
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mindestens 60, aber maximal
120 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von
200 μl TFA gestoppt. Die Masse der Reaktionsprodukte wird über
LC-MS massenspektroskopisch charakterisiert, um den Nachweis zu
erbringen, dass monoacyliertes Produkt, das aus drei Komponenten
besteht, vorliegt. Die Komponenten werden über HPLC getrennt.
Dabei werden auch di-acylierte und tri-acylierte Nebenprodukte abgetrennt.
Die Fraktionen der HPLC-Trennung werden massenspektrokopisch analysiert.
Die drei Fraktionen, die jeweils monoacyliertes Produkt enthalten,
werden einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, deren
Interpretation die Identifikation der HPLC-Fraktion erlaubt, die
die gewünschte Verbindung enthält von der anschließend
durch schonende Hydrolyse die Boc-Schutzgruppen entfernt werden.
Nach erneuter HPLC-Reinigung wird das gewünschte Produkt
auf seine biologischen Eigenschaften getestet.
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Beispiel 23: Evaluierung der blutzuckersenkenden
Wirkung von neuen Insulinanaloga in der Ratte
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Die
blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga
wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen
Wistarratten geprüft. Männlichen Ratten wird eine
Dosis von 9 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar
vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen
Abständen bis zu acht Stunden nach der Injektion werden
den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt.
Das Experiment zeigt deutlich (vgl. 1),
dass das erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem
deutlich verzögerten Wirkeintritt und einer längeren,
gleichmäßigen Wirkdauer führt.
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Beispiel 24: Evaluierung der blutzuckersenkenden
Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
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Die
blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga
wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen
Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine
Dosis von 6 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar
vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen
Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion
werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt
bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich, dass das erfindungsgemäße
Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten, flachen
Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen
Wirkdauer führt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2006/058620 [0030]
- - WO 2001/04156 [0030]
- - WO 2004/005342 [0030]
- - WO 98/08871 [0030]
- - EP 1222207 A [0041, 0047, 0050, 0092, 0102]
- - EP 1364029 A [0041]
- - EP 0668282 A [0103]
- - WO 91/03550 [0104, 0110]
- - WO 2007/031187 A1 [0104]
- - US 5656722 [0107]
- - EP 1364032 A [0112]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Peptides 28
(2007) 935–948 [0006]
- - Anal. Biochem. 134, 347–354,(1983) [0105]
- - Peptides 28 (2007) 935–948 [0117]