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Die
Erfindung betrifft einen neuen diagnostischen Marker CTproADM (C-terminales
Fragment des preproADM, SEQ ID No. 1) zur Diagnose und/oder Risikostratifizierung
von Krankheiten. Ferner ein Verfahren zur Diagnose und/oder Risikostratifizierung
von Erkrankungen, insbesondere Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz,
Infektionen und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege, wobei eine Bestimmung des Markers CT-proADM
(SEQ ID No. 1) oder ein Teilpeptid oder Fragment davon oder enthaltend
in einer Markerkombination (Panel, Cluster) an einem zu untersuchenden
Patienten durchgeführt
wird. Weiterhin betrifft die Erfindung eine diagnostische Vorrichtung
und ein Kit zur Durchführung
des Verfahrens.
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Im
Stand der Technik ist die proAdrenomedullin (proADM)- und Adrenomedullin-Bestimmung
in der Diagnose beschrieben (
EP 0622458 B1 ,
Lewis LK, Smith MW,
Yandle TG, Richards AM, Nicholls MG. Adrenomedullin (1–52) measured
in human plasma by radioimmunoassay: plasma concentration, adsorption,
and storage. Clin Chem 1998; 44: 571–7;
Ueda S,
Nishio K, Minamino N, Kubo A, Akai Y, Kangawa K, et al. Increased plasma
levels of adrenomedullin in patients with systemic inflammatory
response syndrome. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 132–6;
Kobayashi
K, Kitamura K, Etoh T, Nagatomo Y, Takenaga M, Ishikawa T, et al. Increased
plasma adrenomedullin levels in chronic congestive heart failure.
Am Heart J 1996; 131: 994–8;
Kobayashi
K, Kitamura K, Hirayama N, Date H, Kashiwagi T, Ikushima I, et al.
Increased plasma adrenomedullin in acute myocardial infarction.
Am Heart J 1996; 131: 676–80.),
insbesondere zwecks Diagnose von Sepsis (
EP 1121600 B1 ).
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N-terminale
Fragmente von (pre)proAdrenomedullin zur Diagnose sind ebenfalls
in
EP 0622458 B1 beschrieben,
wie PAMP (
Hashida S, Kitamura K, Nagatomo Y, Shibata Y,
Imamura T, Yamada K, et al. Development of an ultrasensitive enzyme
immunoassay for human proadrenomedullin N-terminal 20 peptide and direct
measurement of two molecular forms of PAMP in plasma from healthy
subjects and patients with cardiovascular disease. Clin Biochem
2004; 37: 14–21).
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Zudem
ist ein weiteres Fragment des proAdrenomedullins – nämlich das
so genannte midregionale proAdrenomedullin (MRproADM) in
EP 1488209 B1 zu
diagnostischen Zwecken offenbart (
Struck J, Tao C, Morgenthaler
NG, Bergmann A. Identification of an Adrenomedullin precursor fragment
in plasma of sepsis patients. Peptides 2004; 25: 1369–72;
Morgenthaler
NG, Struck J, Alonso C, Bergmann A. Measurement of midregional proadrenomedullin
in plasma with an immunoluminometric assay. Clin Chem 2005; 51:
1823–9;
Christ-Crain
M, Morgenthaler NG, Stolz D, Muller C, Bingisser R, Harbarth S,
et al. Proadrenomedullin to predict severity and outcome in communityacquired
pneumonia [ISRCTN04176397]. Crit Care 2006; 10: R96;
Christ-Crain
M, Morgenthaler NG, Struck J, Harbarth S, Bergmann A, Muller B.
Mid-regional pro-adrenomedullin as a prognostic marker in sepsis:
an observational study. Crit Care 2005; 9: R816–24).
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Es
besteht jedoch ein hohes Bedürfnis
für Erkrankungen,
insbesondere Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz, Infektionen
und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege eine sichere Diagnose zu stellen oder eine
(Risiko)Stratifizierung vorzunehmen, insbesondere hinsichtlich weiterer
klinischer Entscheidungen und insbesondere hinsichtlich des Schweregrades
von Erkrankungen, insbesondere bei Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz,
Infektionen und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen neuen Marker bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren zur Diagnose und/oder Risikostratifizierung von Erkrankungen,
insbesondere Herz-Kreislauferkrankungen,
Herzinsuffizienz, Infektionen und/oder Entzündungen von Lunge und Atemwege
bereitzustellen.
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Die
Aufgabe wird zum einen durch die Bereitstellung des diagnostischen
Marker CT-proADM (C-terminales proAdrenomedullin, SEQ ID No. 1)
oder ein Teilpeptid oder Fragment davon gelöst zum anderen durch ein Verfahren
zur invitro Diagnose und/oder Risikostratifizierung von Erkrankungen
gelöst,
wobei eine Bestimmung des Markers CT-proADM (SEQ ID No. 1) oder ein Teilpeptid
oder Fragment davon oder enthaltend in einer Markerkombination (Panel,
Cluster) an einem zu untersuchenden Patienten durchgeführt wird
(nachstehend erfindungsgemäßes Verfahren).
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Der
Begriff „Risikostratifizierung" umfasst erfindungsgemäß das Auffinden
von erkrankten Patienten mit der schlechteren Prognose, zwecks intensiverer
Diagnostik und (Folge-) Therapie/Behandlung einer Erkrankung mit
dem Ziel einen möglichst
günstigen
Verlauf der Erkrankung herbeizuführen.
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Besonders
vorteilhaft kann daher mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine sichere
Diagnose und/oder Risikostratifizierung erfolgen. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
klinische Entscheidungen, die zu einer schnelleren Diagnose führen. Solche
klinische Entscheidungen umfassen ebenfalls weiterführende Behandlung
mittels Arzneimitteln zur Behandlung oder Therapie von Erkrankungen.
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Daher
betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Risikostratifizierung
von Patienten, insbesondere zur Stratifizierung von Patienten für klinische
Entscheidungen, vorzugsweise in der zeitlich kritischen Intensivmedizin
oder Notfallmedizin und zur Hospitalisierung von Patienten.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Diagnose und/oder Risikostratifizierung zur Prognose,
zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur
Beurteilung des Schweregrades und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung
von Erkrankungen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird dem zu untersuchenden Patienten Körperflüssigkeit oder Körpergewebe,
vorzugsweise Blut entnommen, wahlweise Vollblut, Serum oder erhältliches
Plasma und die Diagnose erfolgt in vitro/ex vivo, d. h. außerhalb
des menschlichen oder tierischen Körpers. Aufgrund der Bestimmung
des Markers CT-proADM (SEQ ID No. 1) oder Teilpeptide oder Fragmente
davon und seiner vorhandenen Menge in mindestens einer Patientenprobe
kann die Diagnose und/oder Risikostratifizierung erfolgen.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter „Erkrankungen" Krankheiten des
Menschen oder Tier, insbesondere Säugetier, verstanden. Solche
Erkrankungen, insbesondere humane Erkrankungen, sind im Pschyrembel,
De Gruyter, Berlin 2004 beschrieben.
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Besonders
vorteilhaft können
jedoch im Rahmen dieser Erfindung Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz,
Infektionen und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege diagnostiziert und/oder stratifiziert werden.
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Der
Begriff „Herz-Kreislauferkrankungen" umfasst erfindungsgemäß sämtliche
Erkrankungen des Herzens und des Blutkreislaufes, insbesondere solche
Indikationen, wie Bluthochdruck, koronare Herzerkrankungen, insbesondere
akutes Koronarsyndrom, (akuter) Myokardinfarkt, Angina Pectoris.
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Der
Begriff „akutes
Koronarsyndrom" umfasst
verschiedene Phasen der koronaren Herzerkrankung, die unmittelbar
lebensbedrohlich sind. Dies betrifft insbesondere die Notfallmedizin,
und zwar einen akuten Myokardinfarkt und/oder Angina pectoris sowie
einen plötzlichen
Herztod. Neben dem akuten Myokardinfarkt, der nach WHO-Kriterien
(WHO (1979): Nomenclature and criteria for diagnosis of
ischemic heart disease. Report of the Joint International Society
and Federation of Cardiology/World Health Organization task force
an standardization of clinical nomenclature, Circulation 59 (3):
607–609)
definiert ist als akutes, länger
als 20 Minuten andauerndes Brustschmerzereignis, verbunden mit ST- Streckenhebungen
und/oder einer Erhöhung
myokardialer Enzyme, wurde der Begriff der instabilen Angina pectoris
(AP) geprägt,
der erfindungsgemäß unter „akutes
Koronarsyndrom" zu
lesen ist (Hamm CW: Leitlinien: Akutes Koronarsyndrom (ACS) – Teil 1:
ACS ohne persistierende ST-Hebung. Z Kardiol (2004) 93: 72–90).
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter „Herzinsuffizienz" ein akutes oder
chronisches Unvermögen des
Herzens, das Gewebe mit ausreichend Blut und infolge dessen genügend Sauerstoff
zu versorgen, um den Gewebestoffwechsel in Ruhe oder unter Belastung
sicherzustellen. Klinisch liegt eine Herzinsuffizienz vor, wenn
typische Symptome (Dyspnoe, Müdigkeit,
Flüssigkeitsretention)
bestehen, deren ursächlich
eine kardiale Funktionsstörung
im Sinne einer systolischen oder diastolischen Funktionsstörung zugrunde
liegt. Ebenfalls die chronische Herzinsuffizienz (CHF) ist erfindungsgemäß umfasst
(Kardiologie compact, herausgegeben von Chrisian Mewis,
Reimer Riessen und Ioakim Spyridopoulos, 2. unveränderte Auflage,
Thieme 2006). Ursachen einer Herzinsuffizienz können sein:
Herzklappenfehler (z. B. als Spätfolge
des rheumatischen Fiebers), Myokarditis (Herzmuskelentzündung),
Herzrhythmusstörungen,
Herzinfarkt neben zu hohem Blutdruck (Hypertonie) und/oder Arteriosklerose
(Verkalkung) der Herzkranzgefäße (koronare
Herzkrankheit). Weiterhin erfindungsgemäß umfasst sind hypertensive
Herzkrankheit mit (kongestiver) Herzinsuffizienz, Hypertensive Herz-
und Nierenkrankheit mit (kongestiver) Herzinsuffizienz, Primäre Rechtsherzinsuffizienz,
Sekundäre Rechtsherzinsuffizienz, Linksherzinsuffizienz
ohne Beschwerden (NYHA-Stadium I), Linksherzinsuffizienz mit Beschwerden
bei stärkerer
Belastung (NYHA-Stadium II), Linksherzinsuffizienz mit Beschwerden
bei leichterer Belastung (NYHA-Stadium III), Linksherzinsuffizienz
mit Beschwerden in Ruhe (NYHA-Stadium IV) und kardiogener Schock.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff „Infektionen der Lunge und
Atemwege" insbesondere
solche Infektionen verstanden, die durch Bakterien, Viren, Pilze
oder Parasiten verursacht werden, z. B. solche Indikationen wie
tiefe Atemwegsinfektion (LRTI: Lower respiratory tract infections),
Bronchitis, Pneumonie, Sarkoidose, Bronchiektasen, Nichtkardiales
Lungenödem.
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Erfindungsgemäß bevorzugt
sind zudem tiefe Atemwegsinfektion (LRTI: Lower respiratory tract
infections), Bronchitis, putride Bronchitis, Pneumonie. Ganz besonders
bevorzugt ist Pneumonie, insbesondere die ambulant erworbene Pneumonie
(CAP: community associated pneumonie), tiefe Atemwegsinfektion (LRTI: Lower
respiratory tract infections).
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter Pneumonie (Lungenentzündung) eine
akute oder chronische Entzündung
des Lungengewebes verstanden und dessen Infektion verursacht durch
Bakterien, Viren oder Pilze, selten auch toxisch durch Inhalation
giftiger Stoffe oder immunologisch. Für den Kliniker ist die Pneumonie eine
Konstellation verschiedener Symptome (Fieber oder Hypothermie, Schüttelfrost,
Husten, pleuritischer Thoraxschmerz, gesteigerte Sputumproduktion,
erhöhte
Atemfrequenz, Klopfschalldämpfung,
Bronchialatmen, ohrnahe Rasselgeräusche, Pleurareiben) in Kombination
mit mindestens einem auf dem Thorax-Röntgenbild erkennbaren Infiltrat
(Harrisons Innere Medizin, herausgegeben von Manfred Dietel,
Norbert Suttorp und Martin Zeitz, ABW Wissenschaftsverlag 2005.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter unter dem Begriff „Entzündungserkrankungen
der Lunge und Atemwege" bzw. „inflammatorische
Erkrankungen der Lunge und Atemwege" solche Indikationen verstanden, wie
Interstitielle Lungenerkrankungen und Lungenfibrosen, Chronisch
obstruktive Lungenerkrankungen (COPD), insbesondere COPD Infekt-Exazerbationen,
Asthma bronchiale, insbesondere Infekt-Exazerbationen bei Asthma
bronchiale, Bronchialkarzinom.
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COPD
bezeichnet erfindungsgemäß eine Gruppe
von chronischen Krankheiten, die durch Husten, vermehrten Auswurf
und Atemnot bei Belastung gekennzeichnet sind. In erster Linie sind
die chronisch-obstruktive Bronchitis und das Lungenemphysem zu nennen.
Beide Krankheitsbilder sind dadurch gekennzeichnet, dass vor allem
die Ausatmung (Exspiration) behindert ist. Eine umgangssprachliche
Bezeichnung für
das Hauptsymptom der COPD ist zudem „Raucherhusten". Die Erfindung ist
besonders vorteilhaft bei akuten Exazerbationen.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter „CT-proADM" ein freies humanes Protein oder Polypeptid
bestehend aus 33 Aminosäuren
mit der Aminosäuresequenz – SEQ ID
No. 1: SLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL – verstanden, bzw. ein Fragment
mit einer Aminosäuresequenz
von 153–185
(Position 153 ist Ser, Position 185 ist Leu) der SEQ ID No. 2 (1)
des preproAdrenomedullins (Kitamura K, Sakata J, Kangawa
K, Kojima M, Matsuo H, Eto T. Cloning and characterization of cDNA
encoding a precursor for human adrenomedullin Biochem Biophys Res
Commun 1993; 194: 720–725)
oder Teilpeptide und/oder Fragmente davon. Solche Fragmente können zum
Beispiel die Aminosäurensequenzen
1–15 der
SEQ ID No. 1 bzw. 153–167
des preproAdrenomedullins (1) oder
19–33
der SEQ ID No. 1 bzw. 171–185
des preproAdrenomedullins (1) sein
(siehe Beispiele). CT-proADM wird aufgrund der vasokonstriktiven
Wirkung ebenfalls als Adrenotensin bezeichnet (Gumusel B,
Chang JK, Hyman A, Lippton H. Adrenotensin: an ADM gene product
with the opposite effects of ADM. Life Sci 1995; 57: PL87–90).
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Ferner
kann das erfindungsgemäße „CT-proADM" Modifikationen aufweisen,
wie Glykolisierung, Lip(o)idisierung oder Derivatisierungen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Bestimmung von „CT-proADM" (SEQ ID No. 1) zusätzlich mit
weiteren Markern erfolgen, wobei das „CT-proADM" in einer Markerkombination (Panel,
Cluster) enthalten ist, und zwar vorzugsweise solche, die bereits
auf eine Erkrankung hinweisen. Bevorzugt sind jedoch solche Marker,
die wiederum auf die im Rahmen dieser Erfindungen bevorzugten Indikationen/Erkrankungen
hinweisen und einen synergetischen Effekt bewirken können.
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Daher
betrifft die Erfindung eine solche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens,
wobei die Bestimmung zusätzlich
mit mindestens einem weiteren Marker ausgewählt aus der Gruppe inflammatorischer
Marker, cardiovaskulärer
Marker, neurohormonaler Marker oder ischämischer Marker an einem zu
untersuchenden Patienten durchgeführt wird.
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Erfindungsgemäß kann der
inflammatorische Marker aus mindestens einem Marker aus der Gruppe C-reaktivem
Protein (CRP), Cytokinen, wie etwa TNF-alpha, Interleukinen, wie
etwa IL-6, Procalcitonin (1–116, 3–116) und
Adhäsionsmolekülen, wie
VCAM oder ICAM ausgewählt
sein sowie der cardiovaskuläre
Marker aus mindestens einem Marker aus der Gruppe Kreatinkinase,
Myeloperoxidase, Copeptin, Myoglobin, natriuretisches Protein, insbesondere
ANP (bzw. ANF), proANP, NT-proANP, BNP, proBNP, NT-proBNP oder jeweils eine
Teilsequenz davon, kardiale Troponin, CRP ausgewählt sein. Ferner werden hierunter
ebenfalls Kreislaufregulierende (Pro)Hormone verstanden, insbesondere
wie pro-Gastrin-Releasing
Peptid (proGRP), pro-Endothelin (proEnd), pro-Leptin, pro-Neuropeptid-Y, pro-Somatostatin,
pro-Neuropeptid-YY,
pro-Opiomelanocortin, Copeptin oder jeweils eine Teilsequenz davon.
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Der
ischämische
Marker kann aus mindestens einem Marker aus der Gruppe Troponin
I und T, CK-MB ausgewählt
sein. Darüber
hinaus kann der neurohormonale Marker mindestens ein natriuretisches
Protein sein, insbesondere ANP (bzw. ANF), proANP, NT-proANP, BNP,
proBNP, NT-proBNP oder jeweils eine Teilsequenz davon.
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Besonders
bevorzugt sind Markerkombinationen von CT-proADM mit einem Prohormon,
insbesondere proBNP, NT-proBNP.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren mittels parallelen
oder simultanen Bestimmungen der Marker durchgeführt werden (z. B. Multititerplatten
mit 96 und mehr Kavitäten),
wobei die Bestimmungen an mindestens einer Patientenprobe durchgeführt werden.
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Ferner
kann das erfindungsgemäße Verfahren
und dessen Bestimmungen an einem Analyseautomaten, insbesondere
mittels einem Kryptor (http://www.kryptor.net/)
durchgeführt
werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Verfahren
und dessen Bestimmungen mittels einem Schnelltest durchgeführt werden
(z. B. lateral-flow Test), sei es in Einzel- oder Multiparameterbestimmung.
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Ferner
betrifft die Erfindung die Verwendung von CT-proADM (SEQ ID No.
1) oder Teilpeptide oder Fragmente davon zur invitro Diagnose und/oder
Risikostratifizierung von Erkrankungen, insbesondere von Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz,
Infektionen und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung die Verwendung von CT-proADM (SEQ ID No. 1)
oder Teilpeptide oder Fragmente davon zur Kardialdiagnostik.
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Ferner
betrifft die Erfindung die Verwendung von CT-proADM (SEQ ID No.
1) oder Teilpeptide oder Fragmente davon oder enthaltend in einer
Markerkombination (Panel, Cluster) zur invitro Diagnose und/oder Risikostratifizierung
von Erkrankungen, insbesondere Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz,
Infektionen und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege, sowie insbesondere unter Berücksichtigung
der oben genannten Ausführungsformen.
Die Markerkombination kann ggfs. einen weiteren geeigneten Marker
enthalten.
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Eine
weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer entsprechenden diagnostischen
Vorrichtung oder die Verwendung einer solchen Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird unter einer solchen diagnostischen
Vorrichtung, insbesondere ein Array oder Assay verstanden (z. B.
Immunoassay, ELISA etc.), im weitesten Sinne eine Vorrichtung zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Die
Erfindung betrifft zudem ein Kit oder die Verwendung eines solchen
Kit zur in-vitro Diagnose und Risikostratifizierung von Erkrankungen,
insbesondere Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz, Infektionen
und/oder Entzündungen
von Lunge und Atemwege, wobei eine Bestimmung von CT-proADM (SEQ
ID No. 1) oder Teilpeptide oder Fragmente davon oder enthaltend
in einer Markerkombination (Panel, Cluster) an einem zu untersuchenden
Patienten durchgeführt
wird, insbesondere unter Berücksichtigung
der oben genannten Ausführungsformen.
Solche Nachweisreagenzien umfassen z. B. Antikörper, etc.
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Ferner
betrifft die Erfindung daher Antikörper, insbesondere monoklonale
Antikörper
zur Detektion von CT-proADM, die CTproADM, vorzugsweise an den Bindungsstellen
1–15 oder
19–33
der SEQ ID. No. 1 jeweils unabhängig
voneinander einzeln bindet oder an eines von beiden Bindungsstellen
bindet oder an beiden Bindungsstellen binden.
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Nachfolgende
Beispiele und Figuren dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, jedoch
ohne die Erfindung auf diese Beispiele und Figuren zu beschränken.
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Beispiele:
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Immunoassay
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Peptidsynthesen
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Abgeleitet
von der bekannten Aminosäuresequenz
von preproADM wurden zwei Bereiche ausgewählt (Pos. 153–167, 171–185). Die
Bereiche wurden, jeweils ergänzt
um einen N-terminalen Cystein-Rest, nach Standardverfahren als lösliche Peptide
chemisch synthetisiert, gereinigt, mittels Massenspektrometrie und
Reversed Phase HPLC qualitätskontrolliert
und in Aliquots lyophilisiert (Firma JPT, Berlin, Deutschland).
Die Aminosäuresequenzen
der Peptide lauten:
PSK16 CSLPEAGPGRTLVSSK Pos. 153–167
PHL16
CHGAPAPPSGSAPHFL Pos. 171–185
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Desweiteren
wurde ein Peptid synthetisiert, das den Bereich Pos. 153–185 von
preproADM abdeckt (PSL33 SLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL).
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Konjugation und Immunisierung
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Mittels
MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid Ester) wurden die Peptide
PSK16 und PHL16 an das Trägerprotein
KLH (Keyhole limpet hemocyanin) konjugiert (s. Arbeitsanleitung „NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" Firma PIERCE, Rockford,
IL, USA). Mit diesen Konjugaten wurden Schafe nach folgendem Schema
immunisiert: Jedes Schaf erhielt initial 100 μg Konjugat (Massenangabe bezogen
auf den Peptid-Anteil des Konjugats) und anschließend 4-wöchentlich
je 50 μg
Konjugat (Massenangabe bezogen auf den Peptid-Anteil des Konjugats).
Beginnend mit dem vierten Monat nach Beginn der Immunisierung wurden
4-wöchentlich
je Schaf 700 ml Blut abgenommen und daraus durch Zentrifugation
Antiserum gewonnen. Konjugationen, Immunisierungen und Gewinnung
von Antiseren wurden von der Firma MicroPharm, Carmarthenshire, UK,
durchgeführt.
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Reinigung der Antikörper
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In
einem 1-Schritt Verfahren wurden aus den Antiseren, die beginnend
mit dem vierten Monat nach der Immuniserung gewonnen worden waren,
die Peptid-spezifischen Antikörper
präpariert.
Hierzu wurden zunächst
die Peptide PSK16 und PHL16 an SulfoLink Gel gekoppelt (s. Arbeitsanleitung „SulfoLink
Kit" Firma PIERCE,
Rockford, IL, USA). Dabei wurden zur Kopplung je 5 mg Peptid
pro 5 ml Gel angeboten.
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Die
Affinitätsreinigung
von Peptid-spezifischen Antikörpern
aus Schaf Antiseren gegen die Peptide wurde wie folgt durchgeführt:
Die
Peptid-Säulen
wurden zunächst
dreimal im Wechsel mit je 10 ml Elutionspuffer (50 mM Citronensäure, pH 2.2)
und Bindungspuffer (100 mM Natriumphosphat, 0.1% Tween, pH 6.8)
gewaschen. 100 ml der Antiseren wurden über 0,2 μm filtriert und mit dem vorhandenen
Säulenmaterial
versetzt. Dazu wurde das Gel quantitativ mit 10 ml Bindungspuffer
aus der Säule
gespült.
Die Inkubation erfolgte über
Nacht bei Raumtemperatur unter Schwenken. Die Ansätze wurden
quantitativ in Leersäulen
(NAP 25, Pharmacia, entleert) überführt. Die
Durchläufe
wurden verworfen. Anschließend
wurde mit 250 ml Bindungspuffer proteinfrei (Proteingehalt des Wascheluats < 0,02 A280 nm) gewaschen.
Auf die gewaschene Säulen
wurde Elutionspuffer gegeben, und es wurden Fraktionen à 1 ml
gesammelt. Von jeder Fraktion wurde der Proteingehalt mittels der
BCA-Methode (s. Arbeitsanleitung Firma PIERCE, Rockford,
IL, USA) bestimmt.
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Fraktionen
mit Proteinkonzentrationen > 0.8
mg/ml wurden gepoolt. Nach Proteinbestimmung der Pools mittels der
BCA-Methode ergaben
sich Ausbeuten von 34 mg für
den anti-PSK16 Antikörper
und 48 mg für
den anti-PHL16 Antikörper.
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Markierung
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Über NAP-5
Gelfiltrationssäulen
(Pharmacia) wurden 500 μl
des gereinigten anti-PSK16 Antikörpers s.
o.) in 1 ml 100 mM Kalium-Phosphatpuffer (pH 8,0) nach Arbeitsanleitung
umgepuffert. Die Proteinkonzentationen der Antikörperlösung wurden mit 100 mM Kalium-Phosphatpuffer
(pH 8,0) auf 1,5 mg/ml eingestellt.
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Zur
Chemilumineszenzmarkierung wurde der Antikörper wie folgt weiterbehandelt:
67 μl der
Antikörperlösung wurden
mit 10 μl
MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; Firma HOECHST Behring) versetzt
und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 423 μl 1 M Glycin
zugesetzt und weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde
der Markierungsanastz über
eine NAP-5 Gelfiltrationssäule
(Pharmacia) in 1 ml Laufmittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl,
pH 7.4) nach Arbeitsanleitung umgepuffert und dabei von niedermolekularen
Bestandteilen befreit. Zur Abtrennung letzter Reste nicht an Antikörper gebundenen
Labels wurde eine Gelfiltrations-HPLC durchgeführt (Säule: Waters Protein Pak SW300).
Die Probe wurde aufgetragen und bei einer Flußrate von 1 ml/min mit Laufmittel
A chromatographiert. Mit einem Duchflußphotometer wurden die Wellenlängen 280
nm und 368 nm gemessen. Das Absorbtionsverhältnis 368 nm/280 nm als Maß für den Markierungsgrad
des Antikörpers
betrug am Peak 0.10 +/– 0.01.
Die monomeren Antikörper
enthaltenden Fraktionen (Retentionszeit 8–10 min) wurden gesammelt und
in 3 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin,
0.1% Natrium Azid, pH 7.4, gesammelt.
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Kopplung
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Bestrahlte
5 ml Polystyrolröhrchen
(Firma Greiner) wurden mit gereinigtem anti-PHL16 Antikörper wie folgt
beschichtet: Der Antikörper
wurde in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.8 zu einer Konzentration
von 6.6 μg/ml
verdünnt.
In jedes Röhrchen
wurden 300 μl
dieser Lösung
pipettiert. Die Röhrchen
wurden 20 Stunden bei 22°C
inkubiert. Die Lösung
wurde abgesaugt. Dann wurde jedes Röhrchen mit 4.2 ml 10 mM Natriumphosphat,
2% Karion FP, 0.3% Bovines Serum Albumin, pH 6.5 befüllt. Nach
20 Stunden wurde die Lösung
abgesaugt. Schließlich
wurden die Röhrchen
in einem Vakuumtrockner getrocknet.
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Durchführung
und Auswertung des Immunoassays
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Als
Standardmaterial diente Peptid PSL33, das seriell in Pferdenormalserum
(Firma SIGMA) verdünnt wurde.
Den so hergestellten Standards wurden Konzentrationen gemäß der Peptideinwaage
zugeschrieben.
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Der
Sandwichimmunoassay wurde wie folgt angesetzt: In die jeweiligen
mit Antikörpern
beschichteten Teströhrchen
wurden 50 μl
Standards bzw. Proben sowie 200 μl
Assaypuffer (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum
Albumin, 0.1% unspez. Schaf IgG, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4), enthaltend
1 Million RLU (relative light units) des MA70-markierten Antikörpers, pipettiert.
Es wurde 2 Stunden bei 22°C
unter Schütteln
inkubiert. Dann wurde 4-mal mit je 1 ml Waschlösung (0.1% Tween 20) pro Röhrchen gewaschen, abtropfen
gelassen und die am Röhrchen
gebundene Chemilumineszenz in einem Luminometer (Firma BERTHOLD,
LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG) vermessen. Unter Verwendung der
Software MultiCalc (Spline Fit) wurden die CT-proADM Konzentrationen
der Proben an der Standardkurve abgelesen.
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Analyt,
der mit dem beschriebenen Assay gemessen werden kann, wird bezeichnet
als C-terminales proAdrenomedullin (CT-proADM).
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Klinische Wertigkeit
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Normalbereich
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CT-proADM
Konzentrationen wurden in Proben von gesunden Kontrollpersonen (n
= 200) bestimmt. Der Median lag bei 77,6 pmol/L, der kleinste gemessene
Wert bei 46,6, der größte bei
136,2 pmol/L, die 95% Percentilen bei 58,6 bzw. 113,8 pmol/L.
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Herzinsuffizienz/Schweregrad
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Es
wurden CT-proADM Konzentrationen bei Patienten mit chronischer oder
akut dekompensierter Herzinsuffizienz vermessen. CT-proADM Konzentrationen
waren mit dem Schweregrad der Herzinsuffizienz assoziiert: Die Mittelwerte
der CT-proADM Konzentrationen bei den vier Schweregrad-Kategorien
NYHA I–IV waren:
85, 107, 140,4 bzw. 242,7 pmol/L (s. 2).
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Chronische Herzinsuffizienz/Diagnose
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Von
einem Kollektiv von 316 Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz
sowie 200 gesunden Kontrollen wurden CT-proADM Werte bestimmt. Die Receiver-Operator-Characteristics
Analyse ergab eine AUC von 0,79. Bei einem Cut-off-Wert von 122
pmol/L ergab sich eine Sensitivität von 39,7% bei einer Spezifität von 98%.
Bei einem Cut-off-Wert von 113 pmol/L ergab sich eine Sensitivität von 46,3%
bei einer Spezifität
von 95%.
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Chronische Herzinsuffizienz/Prognose
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Von
einem Kollektiv von 316 Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz
wurden CT-proADM Werte bestimmt. Die Patienten wurden über einen
mittleren Zeitraum von 360 Tagen beobachtet. In diesem Zeitraum starben
42 Patienten, 274 überlebten.
Durch Receiver-Operator-Characteristics Analyse wurde der beste Cut-off-Wert
(definiert als das größte Produkt
aus Sensitivität
und Spezifität)
zur Prognose der Mortalität
ermittelt: 119.7 pmol/L. Bei diesem Cut-off-Wert betrug die Sensitivität der Prognose
73,2%, die Spezifität
betrug 62,2%. Die Likelihood Ratio zu versterben betrug bei einem
Cut-off-Wert von
119,7 pg/ml: 1.9.
| <119,7 pmol/L | >119,7 pmol/L |
Überlebende | 172 | 103 |
Tote | 11 | 30 |
-
Akute Herzinsuffizienz/Diagnose
-
Von
einem Kollektiv von 125 Patienten mit akuter Atemnot wurden CT-proADM
Werte bestimmt. Von den 125 Patienten hatten 69 Patienten Herzinsuffizienz.
Die Receiver-Operator-Characteristics
Analyse für
die Differentialdiagnose der Herzinsuffizienz ergab eine AUC von
0,75. Bei einem Cut-off-Wert
von 410 pmol/L ergab sich eine Sensitivität von 12,4% bei einer Spezifität von 98%.
Bei einem Cut-off-Wert von 315 pmol/L ergab sich eine Sensitivität von 18,3%
bei einer Spezifität
von 95%.
-
Akute Herzinsuffizienz/Prognose
-
Von
einem Kollektiv von 69 Patienten mit akut dekompensierter Herzinsuffizienz
wurden CT-proADM Werte bestimmt. Die Patienten wurden über einen
Zeitraum von 360 Tagen beobachtet. In diesem Zeitraum starben 21
Patienten, 48 überlebten.
Durch Receiver-Operator-Characteristics Analyse wurde der beste Cut-off-Wert (definiert
als das größte Produkt
aus Sensitivität
und Spezifität)
zur Prognose der Mortalität
ermittelt: 192 pmol/L. Bei diesem Cut-off-Wert betrug die Sensitivität der Prognose
66,6%, die Spezifität
betrug 75%. Die Likelihood Ratio der Mortalität betrug bei einem Cut-off-Wert
von 192 pmol/L: 2,5.
| <192 pmol/L | >192 pmol/L |
Überlebende | 36 | 12 |
Tote | 7 | 14 |
-
Myokardinfarkt/Prognose
-
Von
287 Patienten mit akutem Herzinfarkt wurden drei Tage nach Eintreten
des Herzinfarkts Proben gewonnen und es wurde CT-proADM gemessen. Die Patienten wurden über einen
Zeitraum von 360 Tagen beobachtet. In diesem Zeitraum hatten 220
Patienten kein adverses Ereignis, 67 starben oder wurden wegen Herzinsuffizizienz
rehospitalisiert. Durch Receiver-Operator-Characteristics Analyse wurde der beste Cut-off-Wert
(definiert als das größte Produkt
aus Sensitivität
und Spezifität)
zur Prognose der Mortalität
bzw. Rehospitalisierung wegen Herzinsuffizienz ermittelt: 161,9
pmol/L. Bei diesem Cut-off-Wert betrug die Sensitivität der Prognose
67,2%, die Spezifität
betrug 79,1%. Die Likelihood Ratio eines adversen Ereignisses betrug bei
einem Cut-off-Wert von 161,9 pmol/L: 3.2.
| <161,9 pmol/L | >161,9 pmol/L |
Keine
adverses Ereignis | 174 | 46 |
Tot/Herzinsuffizienz | 22 | 45 |
-
Pneumonie/Schweregrad und Prognose
-
Von
142 Patienten mit ambulant erworbener Pneumonie wurden bei Aufnahme
ins Krankenhaus Proben gewonnen und es wurde CT-proADM gemessen. Die Patienten wurden über einen
Zeitraum von 70 Tagen beobachtet. In diesem Zeitraum starben 10
Patienten. CT-proADM Konzentrationen stiegen mit dem PSI (Pneumonia
Severity Index), einem Score für
den Schweregrad der Erkrankung (
3) und waren
im Median mit 135 pmol/L gegenüber
gesunden Kontrollen (77 pmol/L) erhöht. Für die Prognose der Mortalität erbrachte die
Receiver-Operator-Characteristics
Analyse eine AUC von 0,89. Durch Receiver-Operator-Characteristics Analyse wurde
der beste Cut-off-Wert (definiert als das größte Produkt aus Sensitivität und Spezifität) zur Prognose
der Mortalität
ermittelt: 194,5 pmol/L. Bei diesem Cut-off-Wert betrug die Sensitivität der Prognose 100%,
die Spezifität
betrug 81,2%. Die Likelihood Ratio der Mortalität betrug bei einem Cut-off-Wert
von 194,5 pmol/L: 5.5.
| <194,5 pmol/L | >194,5 pmol/L |
Keine
adverses Ereignis | 108 | 24 |
Tot | 0 | 10 |
-
Exacerbierte COPD
-
Von
53 Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und gleichzeitiger
Infektion der unteren Atemwege wurde CT-proADM gemessen. Mit im Median 106 pmol/L
waren diese Patienten gegenüber
gesunden Kontrollen (77 pmol/L) erhöht, lagen jedoch niedriger
als Pneumonie Patienten (s. o. 135 pmol/L).
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.