DE102006023394A1

DE102006023394A1 - Herstellung und Verwendung eines antiviralen Chemotherapeutikums welches eine Wirtszelle dahingehend beeinflusst, dass die Replikation von Viren in der Zelle blockiert wird

Info

Publication number: DE102006023394A1
Application number: DE102006023394A
Authority: DE
Inventors: Gerd Prof. Wengler; Gisela Wengler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2007-11-22
Also published as: WO2007131591A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines Mittels zur Behandlung einer Virusinfektion sowie ein Arzneimittel und eine pharmazeutische Zusammensetzung. Sie umfasst die Herstellung und Verwendung einer pharmazeutischen Präparation, in der eine Exposition von Vertebraten- oder Insektenzellen an Lanthanoiden-Ionen den Zellstoffwechsel so verändert, dass die intrazelluläre Vermehrung von Viren gehemmt wird, ohne die Zellvermehrung zu blockieren. Da diese Veränderung wirksam wird, wenn die Exposition vor der Infektion der Zellen, während der Infektion oder nach der Infektion der Zellen stattfindet, ist eine darauf aufbauende Therapie sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verwendbar. Die Blockade der Virusreplikation stellt eine bei einer Teilmenge aller Viruserkrankungen wirksame Chemotherapie dar. Zurzeit wissen wird, dass die Vermehrung von Flaviviren durch diese Exposition blockiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung einer pharmazeutischen Präparation, in der eine Exposition von Vertebraten- oder Insektenzellen an Lanthanoiden-Ionen den Zellstoffwechsel so verändert, dass die intrazelluläre Vermehrung von Viren gehemmt wird, ohne die Zellvermehrung zu blockieren. Da diese Veränderung wirksam wird, wenn die Exposition vor der Infektion der Zellen, während der Infektion oder nach der Infektion der Zellen stattfindet, ist eine darauf aufbauende Therapie sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verwendbar. Die Blockade der Virusreplikation stellt eine bei einer Teilmenge aller Viruserkrankungen wirksame Chemotherapie da. Zurzeit wissen wir, dass die Vermehrung von Flaviviren durch diese Exposition blockiert wird.
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung und Verwendung eines antiviralen Chemotherapeutikums als Arzneimittel, welches eine Wirtszelle dahingehend beeinflusst, dass eine Replikation von Viren in der Zelle blockiert wird.
Die Chemotherapie von Viruskrankheiten umfasst ein großes Arbeitsgebiet. Üblicherweise werden bei diesen Arbeiten Substanzen entwickelt, die die Aktivität viraler Proteine hemmen und dadurch zur Hemmung der Virusvermehrung führen. Die Zielproteine dieser Substanzen können dabei entweder virale Strukturproteine oder virale Nichtstrukturproteine sein. Eines der Hauptprobleme dieses Therapieansatzes besteht darin, dass im Rahmen einer Virusinfektion eine starke Vermehrung der Viren im Wirtsorganismus abläuft und dabei eine große Zahl von Virusvarianten gebildet wird, die sich vom Elternvirus durch eine oder mehrere genetische Veränderungen unterscheiden. Unter diesen Virusvarianten sind im Allgemeinen auch vereinzelt solche Varianten, die ein Virusprotein synthetisieren, welches von dem antiviral wirkenden Chemotherapeutikum nicht mehr gehemmt wird, so dass diese Varianten im Wirtsorganismus hochwachsen. Wenn es möglich ist, werden daher heute Kombinationen verschiedener Chemotherapeutika bei der Therapie von Viruserkrankungen eingesetzt, da die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Mehrfachmutante mit den benötigten Eigenschaften der Mehrfachresistenz sehr gering ist. Insgesamt gibt es jedoch nur wenige Viruserkrankungen, die man z. Zt. mit einer solchen kombinierten Chemotherapie behandeln kann. Bekannt ist z.B. die Chemotherapie der Infektion mit dem humanen Immundefizienz Virus.
Eine alternative Form der Chemotherapie von Viruserkrankungen besteht darin, dass das Chemotherapeutikum in den Stoffwechsel der Wirtszelle eingreift und diesen Stoffwechsel so verändert, dass in der Zelle eine Virusvermehrung gehemmt oder sogar blockiert wird. Diese Strategie der antiviralen Chemotherapie wird nur selten verwendet. Eine praktisch wichtige und auch intensiv untersuchte Form einer solchen Chemotherapie ist die Therapie durch Gabe von Interferon, wie sie z.B. bei der chronischen Verlaufsform der Hepatitis C Virus Infektion beim Menschen verwendet wird. Prinzipiell wirken die Interferone in folgender Weise: Die Vermehrung von Viren in der Zelle führt in der infizierten Zelle zur Induktion der Synthese von Interferonen. Diese Interferone sind eine Gruppe verwandter Proteine. Diese Proteine werden von der infizierten Zelle in das extrazelluläre Medium abgegeben. Da die große Mehrzahl aller Zellen von Vertebraten Rezeptoren für Interferon an ihrer Oberfläche haben, binden die Interferone an die Oberfläche von uninfizierten Zellen. Diese Bindung initiiert eine Signalkaskade in diesen Zellen die dazu führt, dass in der Zelle zahlreiche Gene des zellulären Genoms aktiviert und transkribiert werden. Die Präsenz der daraus resultierenden Genprodukte in der Zelle führt dazu, dass die Zelle bei einer später eventuell erfolgenden Virusinfektion keine effiziente Virusreplikation mehr durchführt. Ein Mechanismus, der die Virusreplikation in diesen Zellen verhindert besteht z.B. darin, dass die Virusinfektion in den durch Interferon veränderten Zellen direkt die Apoptose auslöst. Die Apoptose ist ein programmierter Zelltod und das entsprechende Programm kann in Zellen durch verschiedene Signale ausgelöst werden. In Interferon behandelten Zellen wird es sehr effizient nach Virusinfektionen ausgelöst und der programmierte Tod der Wirtszelle tritt so schnell ein, dass die Virusvermehrung in den sterbenden Zellen stark reduziert oder sogar blockiert ist.
In der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls eine Hemmung der Virusvermehrung in behandelten Zellen hervorgerufen. Diese Hemmung unterscheidet sich jedoch grundlegend von der durch Interferon hervorgerufenen, unter anderem z.B. durch die folgenden drei Eigenschaften: (1) Die vorliegend beschriebene Hemmung wird in Zellen hervorgerufen, die mit Actinomycin D behandelt sind und in denen daher die Transkription zellulärer Gene blockiert ist. Diese Hemmung kann also nicht dadurch erzeugt werden, dass eine Induktion der Transkription zellulärer Gene zu einer Virusresistenz führt, wie das bei Interferonbehandlung der Fall ist. (2) Die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Hemmung der Virusvermehrung beruht nicht darauf, dass virusinfizierte Zellen besonders schnell sterben, wie es bei Interferonbehandlung der Fall ist. Ganz im Gegenteil führt die Behandlung von infizierten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung dazu, dass sie im Gegensatz zu unbehandelten, infizierten Zellen eine Virusinfektion überleben. (3) Interferone werden in Insekten nicht gebildet und sind in Insektenzellen unwirksam. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Induktion einer Hemmung der Virusvermehrung dagegen wirkt auch auf Insektenzellen.
Wir haben im Jahr 2004 den Einfluss von Lanthanoiden-Ionen auf die Eintrittsreaktion von Alphaviren in eine Wirtszelle untersucht. Alphaviren können unter speziellen experimentellen Bedingungen im Labor Wirtszellen durch Eintritt an der zellulären Oberflächenmembran, der Plasmamembran, infizieren. Dabei werden Oberflächenproteine der Alphaviren in die Plasmamembran der Wirtszelle eingelagert und bilden in dieser Membran kurzzeitig eine offene Proteinpore, durch die ionische Moleküle von weniger als 1000 Dalton Molekulargewicht fließen können. Auf der Suche nach Hemmstoffen, die diese Poren blockieren, haben wir zeigen können, dass, wenn Lanthanoiden-Ionen im Moment dieser Eintrittsreaktion anwesend sind, diese Ionen die Durchlässigkeit dieser Poren für Ionen blockieren. Die durchgeführten Untersuchungen haben weiterhin gezeigt, dass die Blockade der Poren den Eintritt von Alphaviren in das Zellinnere und deren nachfolgende Vermehrung unbeeinflusst lässt (A. Koschinski, G. Wengler, G. Wengler, N. Repp, Journal of General Virology, (2005), 86, 3311–3320)). Eine chemo-therapeutische Anwendung von Lanthanoid-Verbindungen zur Bekämpfung von Alpha-Virus-Infektionen und anderen Virusinfektionen, die eine typische Chemotherapie durch Hemmung der Funktion eines viralen Proteins dargestellt haben würde, ergab sich daher nicht.
Vor diesem Hintergrund stellt sich die Aufgabe, die vorab angeführten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und preisgünstig herzustellende Substanzen sowie Verfahren zu deren Verabreichung aufzufinden, mit denen Viruserkrankungen wirksam verhindert bzw. behandelt werden können. Diese Substanzen und Verfahren sollen für Zellen und Organismen gut verträglich sein und die Proliferation gesunder Zellen nicht beeinträchtigen. Ferner sollen Art und Dauer der Anwendung variabel, nach Möglichkeit jedoch recht kurz sein. Schließlich wird angestrebt, Substanzen und Verfahren bereitzustellen, die auch die Vermehrung von Viren blockieren können, die durch Mutation verändert sind.
Dies erreicht man durch ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Virusinfektion, bei dem erfindungsgemäß als wesentlicher Bestandteil wenigstens eine mit einer Zelloberfläche wechselwirkende und aus der Gruppe der Lanthanoid-Verbindungen ausgewählte Verbindung eingesetzt wird. Diese setzt Lanthanoid Ionen frei, welche bei Wechselwirkung mit einer Zielzelle deren zellulären Stoffwechsel so verändern, dass eine intrazelluläre Vermehrung von Viren blockiert wird.
Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass ein primärer Anknüpfungspunkt einer mit einer verfahrensgemäßen Verbindung durchgeführten Chemotherapie die Wirtszelle und nicht das Virus selbst ist. Mithin können Virusmutationen das Verfahren nicht beeinträchtigen. Dies konnte besonders eindrucksvoll an Viren aus der Familie der Flaviviridae und insbesondere aus der Gruppe der Flaviviren gezeigt werden.
Im Vergleich zur exponentiellen Vermehrung von Viren ist die Vermehrung von Wirtszellen gering und damit auch die durch Mutation bei der Vermehrung erfolgende Entstehung von behandlungsresistenten Zellmutanten. Das ist insbesondere auch deswegen der Fall, weil Wirtszellen zumeist als diploide Zellen alle Gene zweimal enthalten und daher beide Gene durch Mutationen unabhängig voneinander verändert werden müssten, um auf das erfindungsgemäße Verfahren nicht mehr ansprechende resistente Zellen zu erzeugen. Daraus ergibt sich, dass das Auftreten von Resistenz gegen die verfahrensgemäße Behandlung gemäß der vorgelegten Erfindung relativ selten sein sollte. Darüber hinaus würden solche Zellen, die auf das erfindungsgemäße Verfahren nicht mehr reagieren, durch die Virusinfektion geschädigt werden und könnten keine Quelle andauernder Virusproduktion werden.
Wesentlich für die nach der Erfindung verfahrensgemäß eingesetzten Verbindungen ist ferner, dass sie an der Oberfläche einer infizierten oder zu infizierenden Zelle ihre Aktivität entfalten und deshalb ausschließlich mit besagter Zelloberfläche in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise kontaktiert man die erfindungsgemäßen Verbindungen nur für eine kurze Zeitspanne von weniger als 1 Minute mit der Zelloberfläche, wobei sie bereits ihre Wirkung entfalten. Dieser kurzzeitige Kontakt führt dazu, dass der Zellstoffwechsel derart verändert wird, dass die intrazelluläre Vermehrung von Viren blockiert wird. Diesen Effekt erreicht man, wenn Zellen vor der Virusinfektion, aber auch während oder nach der Virusinfektion mit wenigstens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen kontaktiert werden. Bei Vertebratenzellen haben sich eine oder mehrere aus der Gruppe von La³⁺-, Ce³⁺-, Ce⁴⁺-, Pr³⁺-, Nd³⁺-, oder Sm³⁺-Verbindungen ausgewählten Verbindungen als besonders wirksam erwiesen.
Die Erfindung beansprucht ferner selbständigen Schutz für ein Arzneimittel zur Behandlung einer Virusinfektion. Dieses beinhaltet als wesentlichen Bestandteil eine mit einer Zelloberfläche wechselwirkende und aus der Gruppe der Lanthanoid-Verbindungen ausgewählte Verbindung oder eine Kombination solcher Verbindungen. Lanthanoide umfassend die Elemente La (57) bis Lu (71) des Periodensystems, kommen alle als 3-fach positiv geladene Ionen vor. Daneben gibt es die Lanthanoid Ionen Ce⁴⁺, Pr⁴⁺ und Eu²⁺. Besonders gute Wirksamkeit an Vertebratenzellen ist bei Arzneimitteln nach der Erfindung zu beobachten, die als wesentlichen Bestandteil eine La³⁺, Ce³⁺, Ce⁴⁺, Pr³⁺ oder Nd³⁺ enthaltende Verbindung enthalten, insbesondere, wenn es sich um gut lösliche Chlorid-Salze und im Falle des Ce⁴⁺ um das Sulfat handelt. Bei Insektenzellen hingegen zeigten alle verwendeten Lanthanoid-Verbindungen eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Wirksamkeit.
Auch für eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Arzneimittel, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und zur Behandlung von Virusinfektionen eingesetzt wird, wird selbstständiger Schutz angestrebt. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße antivirale chemotherapeutisch wirkende Arzneimittel in Form von Infusionslösungen, Aerosolen, Salben, Tabletten, Kapseln, Zäpfchen oder Tropfen als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert. In flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen ist es in einer solchen Menge enthalten, dass bei kurzzeitigem Kontakt eine Lanthanoid Ionen Konzentration von 10 bis 1000 μmol/l und bevorzugt zwischen 50 und 500 μmol/l an der Oberfläche einer Zielzelle erreicht wird.
Laut Merck Index liegt für LaCl₃ Heptahydrat die LD₅₀ für Ratten bei oraler Zufuhr bei 4.2 g/kg und bei intraperetonealer Zufuhr bei 330 mg/kg. Da LaCl₃ × 7H₂O ein Molekulargewicht von 371 g/mol besitzt, entspricht eine Konzentration von 371 mg/kg in Wasser einer Konzentration von 1 mmol/l. Daraus ergibt sich, dass eine intraperetoneale Gabe von 330 mg LaCl₃ × 7H₂O pro kg bei der Ratte bei Aufnahme der Substanz in den tierischen Organismus im extrazellulären Raum des Tieres eine La³⁺ Konzentration ergeben sollte, die wesentlich höher ist als 1 mM, da davon auszugehen ist, dass das La³⁺ Ion auf Grund seiner Ladung im wesentlichen auf das extrazelluläre Kompartiment des Tieres beschränkt bleiben wird. Aus diesen Daten ergibt sich, dass eine kurzzeitige Exposition der Zelle zu einer wirksamen Konzentration an La³⁺ Ionen zwischen 50 μM La³⁺ und 500 μM La³⁺ ohne schwerwiegenden generellen toxischen Einfluss auf den Organismus möglich sein sollte. Man muss davon ausgehen, dass bei einer länger andauernden Exposition der Zellen im Bereich von Stunden oder Tagen eine wesentlich geringere Konzentration von Lanthanoid Ionen für die Induktion von Virusresistenz ausreicht. Mithin umfasst die Erfindung in einer interessanten Fortführung auch solche pharmazeutischen Zusammensetzungen, aus denen Lanthanoid Ionen über Stunden, Tage oder Wochen hinweg in geringer Konzentration freigesetzt werden.
Unter einer erfindungsgemäßen Verbindung sind alle Substanzen zu verstehen, die an einer Zielzelle zur Resistenzinduktion führen, aus der Gruppe der Lanthanoiden ausgewählt sind und Virusinfektionen durch Blockade der Virusreplikation verhindern, positiv beeinflussen bzw. zum Abklingen bringen. Diese Substanzen haben vorzugsweise eine ionische, salzartige Struktur, können jedoch auch aus Komplexen bestehend aus einem Lanthanoid Ion und organischen oder anorganischen Liganden bestehen. Als besonders wirksam an Vertebratenzellen haben sich Salze oder Komplexverbindungen mit den Kationen La³⁺, Ce³⁺, Ce⁴⁺, Pr³⁺, Nd³⁺ oder Sm³⁺ erwiesen. Beispiele sind LaCl₃ × 7H₂O, CeCl₃ × 7H₂O, Ce(SO₄)₂, PrCl₃ × 6H₂O und NdCl₃ × 6H₂O. Bei Insektenzellen hingegen konnte eine mehr oder minder stark ausgeprägte Wirksamkeit aller Lanthanoid-Ionen nachgewiesen werden.
Mithin lassen sich Arzneimittel nach der Erfindung in einer Verfahrensausgestaltung auch unmittelbar in wässrigen Lebensräumen einsetzen. Sie kommen dort in Kontakt mit Viren übertragenden Insekten und bewirken eine Reduzierung oder vollständige Unterdrückung der Vermehrung von Viren in diesen Tieren mit Außenskelett. Folglich wird auch einer Virusvermehrung in Vertebraten, die von besagten Insekten befallen werden, entgegengewirkt.
Unter dem Begriff Infektion versteht man nach der Erfindung einerseits den Eintritt des Virus in einen Wirtsorganismus, worauf eine Inkubationszeit folgt, nach der eine Erkrankung auftritt. Andererseits definiert die Infektion auch den Eintritt des Virus in eine Zelle. Daran schließt sich eine Latenzzeit an, nach welcher die Virusvermehrung beginnt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen alle gängigen Träger und Vehikel, mit denen Verbindungen nach der Erfindung an einen Wirkort, beispielsweise innerhalb eines Organismus gebracht werden können. Beispielsweise versteht man hierunter neben zu Infusionen geeigneten gelösten Zusammensetzungen auch Feststoffpräparationen mit Trägern wie Talk, Stärke, den verschiedensten Zuckern, Zellulose, pflanzlichen Extrakten und deren Polymerisate wie Gum Arabikum, die verschiedensten Polyethylenglykole und Poloxamere, unterschiedlichste Glyceride und gesättigte sowie ungesättigte Fettsäuren genauso wie verkapselte Zubereitungen auf Gelatine- oder Kollagenbasis. Besonders bevorzugt sind neben gelösten Zubereitungen auch solche Zubereitungen, bei denen die Verbindung in biologisch abbaubare Polymere wie beispielsweise Polylactide oder Polyglykolide eingebettet ist und retardiert an unterschiedlichen Wirkorten freigesetzt wird. Flüssige Zusammensetzungen umfassen alle für die Galenik herangezogenen Fluide, wie beispielsweise gereinigtes Wasser, Ethanol, Polyvinylpyrrolidon (PVP) sowie Polyvinylalkohol.
Unter der Bezeichnung Behandlung ist jegliches miteinander in Wechselwirkung Bringen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Zelloberfläche eines eukaryotischen Organismus zu verstehen. Ein Aufstreuen in fester Form bzw. die Einnahme eines Feststoffs als galenische oder pharmazeutische Zubereitung ist davon genauso eingeschlossen, wie die Infusion oder Applikation einer Lösung oder die Diffusion der an anderer Stelle verabreichten unter Umständen gelösten Verbindung an die Zelloberfläche als Wirkort. Eine Virusinfektion lässt sich nach der Erfindung zudem mit vernebelbaren Zubereitungen behandeln, die oral oder topisch gegeben werden.
Ferner versteht man unter Behandlung nicht nur einen dauernden Kontakt zwischen Verbindung und Zelloberfläche, sondern bevorzugt auch ein kurzzeitiges Wechselwirken mit dem Wirkort. Kurzzeitig bedeutet 5 Sekunden bis 5 Minuten, vorzugsweise 5 Sekunden bis 1 Minute und in einer besonders bevorzugten Ausführung 10 Sekunden bis 30 Sekunden. Selbst wenn das Arzneimittel nach nur momentaner Wechselwirkung mit der Zelle oder Zelloberfläche vollständig entfernt wird genügt dies bereits, um eine Virusvermehrung in einer noch nicht infizierten Zelle über viele Stunden zu verhindern oder eine Virusproliferation in einer bereits infizierten Zelle oder in einem infizierten Organismus über den gleichen Zeitraum zu unterdrücken.
Die durch die Wechselwirkung der erfindungsgemäßen Verbindung erzeugte Blockade der Virusvermehrung lässt mit der Zeit nach. Eine Wirkungsaufrechterhaltung kann daher insbesondere auch ein System wiederholter Gaben der Verbindung umfassen. Die Ergebnisse des Beispiels 2 führen zu dem Schluss, dass in vielen Fällen eine Wiederholung der Gabe der Verbindung im Abstand eines Tages bei entsprechender Dosierung ein wirksames Vorgehen darstellt.
Darüber hinaus ist der Begriff Behandlung nicht an einen bestimmten Zeitpunkt vor, während oder nach der Infektion einer Zelle durch ein Virus gekoppelt. Vielmehr lässt sich eine Zelle mit einem zeitlichen Vorlauf vor dem Eindringen des Virus in die Zelle genauso wie nach dem Eintritt in die Zelle mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandeln, um die Virusvermehrung zu unterdrücken. Unter einem zeitlichen Vorlauf versteht man bevorzugt 12 bis 0,5 Stunden und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 6 bis 0,5 Stunden, während nach der Infektion bedeutet, dass der Behandlungszeitpunkt vor dem Ende des intrazellulären Vermehrungszyklus der Viren liegt. Dieser Zeitpunkt hängt vom Virus und von der Wirtszelle ab und ist frühestens 10 Stunden nach dem Eintritt des Virus in die Zelle erreicht.
In einer weiteren Fortführung der Erfindung versteht man unter Behandlung das Kontaktieren der Zelloberfläche einer infizierten Zelle für wenigstens 10 Sekunden mit einer Verbindung nach der Erfindung.
Einer Virusinfektion kann umso schneller und effizienter begegnet werden, je früher die Behandlung eingeleitet wird, sprich je weniger Viruspartikel in einer infizierten Zelle oder im infizierten Organismus vorhanden sind. Grund hierfür ist, dass die Verbindung nach der Erfindung nur eine intrazelluläre Vermehrung von Viren verhindert, Viren jedoch nicht abtötet. Dies besorgt das mit zeitlicher Verzögerung sich gegen die Virusinfektion richtende Immunsystem.
Schließlich umfasst der Begriff Behandlung einen weiten Temperaturbereich, der bei 0°C beginnt und sich bis 50°C, jedenfalls aber bis zu einer maximalen Temperatur erstreckt, bei der Zielzellen noch lebensfähig sind.
Mit einem Arzneimittel oder Wirkstoff nach der Erfindung zu behandelnde Virusinfektionen sind alle diejenigen, bei denen Viren nach Gabe einer Verbindung aus der Gruppe der Lanthanoiden ihre Biosynthese zur Vermehrung in einer infizierten Zelle nicht mehr vollständig betreiben können. Unter diesen Infektionen sind insbesondere die durch Flaviviren hervorgerufenen Erkrankungen zu verstehen. Die in den einzelnen Genera zusammengehörigen Viren sind aufgelistet in: "Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses", Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses, Edited by C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger and L.A. Ball, ELSEVIER, Academic Press, 2005. Zur Zeit bekannte Flaviviren sind in diesem Buch auf den Seiten 986, 987 und 988 aufgelistet. Die mit den Flaviviren biochemisch verwandten Pestiviren und Hepaciviren findet man auf den Seiten 992, bzw. 996. Die wahrscheinlich verwandten Viren GBV-A und GBV-C sind im gleichen Buch auf den Seiten 996 und 997 angegeben. Auf den Seiten 981 bis 998 angeführter Text fasst Flaviviren, Pestiviren, Hepaciviren und die Viren GBV-A und GBV-C unter die Familie der Flaviviridae zusammen. Alle angegebenen Textstellen aus dem vorgenannten englischsprachigen Standardwerk sind ausdrücklich Bestandteil des Anmeldungstextes. Man kann davon ausgehen, dass gegenwärtig noch nicht alle Flaviviren und alle Flaviviridae identifiziert worden sind und dass in Zukunft das Genus Flaviviren und die Familie der Flaviviridae um weitere Virus-Spezies erweitert werden wird. Die im Anmeldetext formulierten Patentansprüche beziehen sich in entsprechender Weise auch auf diese noch zu entdeckenden Viren.
Folgende einzelnen Virustypen einer nicht abgeschlossenen Liste von Vertretern der Flaviviren sind nach der erfindungsgemäßen Behandlung einer Zelle oder eines Zellgewebes mit einer erfindungsgemäßen Verbindung aus der Gruppe der Lanthanoiden nicht mehr in der Lage, innerhalb einer Wirtszelle zu proliferieren: Absettarov, Alfuy, Apoi, Aroa, Bagaza, Banzi, Bouboui, Bussuquara, Cacipacore, Carey Island, Dakar bat, Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Edge Hill, Entebbe bat, Early Spring Meningitis, Gadgets Gully, Hanzalova, Hypr, Ilheus, Israel turkey meningoencephalitis, Japanische Encephalitis, Jugra, Jutiapa, Kadam, Karshi, Kedougou, Kokobera, Koutango, Kumlinge, Kunjin, Kyasanur Forest disease, Langat, Louping ill, Meaban, Modoc, Montana myotis leukoencephalitis, Murray valley Encephalitis, Naranjal, Negishi, Ntaya, Omsk hemoragisches Fieber, Phnom-Penh bat, Powassan, Rio Bravo, Rocio, Royal Farm, Russische Frühsommer Encephalitis, Saboya, St. Louis Encephalitis, Sal Vieja, San Perlita, Saumarez Reef, Sepik, Sokuluk, Spondweni, Stratford, Tembusu, Frühsommer Meningoencephalitis (FSME), Tyuleniy, Uganda S (US), Usutu, Wesselsbron, West Nile (WN), Yaounde, Gelbfieber (YF) und Zika.
Unter Zelloberflächen im Sinne von Anspruch 1 ist die Zellmembran zu verstehen, die das Zytoplasma begrenzt und von der Umgebung abgrenzt. In der Regel ist diese Membran aus Phospholipiden und in manchen Fällen Terpenen wie Cholesterin und verwandten Verbindungen als Membranverstärkern aufgebaut. Weitere Bestandteile der Membran sind Proteine, die sowohl perifer als auch als transmembranaler Baustein bzw. Komplex, beispielsweise als Pore oder Kanal angeordnet sind. Ferner umfassen einige Zellmembranen inner- und oder außerseits Schichten aus zuckerartigen vernetzten Molekülen, beispielsweise Glykanen und/oder Proteoglykanen.
Zelloberflächen nach der Erfindung umfassen Membranen verschiedenster eukaryotischer Zelltypen, insbesondere von Insekten und Wirbeltieren und besonders diejenigen Zelltypen, in denen sich Viren vermehren. Hierzu gehören insbesondere solche des Blutes wie Leuco- und Erythrocyten, die verschiedenen Zellen der Immunabwehr, beispielsweise B-Zellen, T-Zellen, T-Helferzellen, Macrophagen aber genauso Gewebszellen wie Basalzellen, Endothelzellen, BHK-Zellen, Verozellen, Insektenzellen, wie beispielsweise C2-Insektenzellen und Zellen der einzelnen Organe von Vertebraten, insbesondere Säugern. Auch maligne Zellen, wie die bei onkologischen Erkrankungen auftretenden Tumorzellen, Karzinomzellen, Myelomzellen, Blastomzellen und andere histologisch veränderte Zellen weisen Zelloberflächen nach der Erfindung auf.
Unter Mitteln, die auf Insekten anziehend wirken sind alle Verbindungen zu begreifen, die ein Insekt anlocken oder ihm zur Nahrung dienen. In erster Linie sind hier die Pheromone und insbesondere Sexualpheromone beispielsweise der verschiedenen Mücken- bzw. Moskitoarten, aber auch von Fliegen, Heuschrecken, Wespen, Bienen und Hummeln zu begreifen. Es handelt sich hierbei in der Regel um Abkömmlinge des Isoprens mit einer oder mehreren Doppelbindungen. Ferner fallen hierunter Duftstoffe, die aus Drüsen der Wirbeltiere abgegeben werden, beispielsweise die unterschiedlichen im Schweiß vorhandenen Verbindungen. Auch als Süßmittel in Nahrungsmitteln bzw. als Bitterstoffe in Getränken wie Bier eingesetzte Substanzen, also in der Regel auf einen Zucker zurückzuführende Spezies fallen unter den Begriff des auf Insekten anziehend wirkenden Mittels.
Bei Untersuchungen des Einflusses der Salze von Lanthanoid Ionen auf die Vermehrung von Flaviviren wurde überraschenderweise gefunden, dass eine kurzzeitige Exposition von Wirtszellen mit diesen Ionen eine intrazelluläre Vermehrung von Flaviviren blockiert. Unsere Experimente zeigen, dass diese Blockade auch dann eintritt, wenn die Exposition bei 0°C vorgenommen wird. Auf Grund dieser Tatsachen muss man davon ausgehen, dass der Kontakt der Lanthanoid Ionen mit der Zelle eine Veränderung der Zellbiochemie auslöst, die dazu führt, dass die Vermehrung der Viren blockiert wird. Wie diese Veränderung ausgelöst wird, ist z. Zt. unbekannt. Mögliche Mechanismen sind z.B. als erster Schritt eine Wechselwirkung der Lanthanoid Ionen mit einem Rezeptor an der Zelloberfläche oder ein Einstrom von Lanthanoid Ionen in die Zielzelle durch Ionenporen an der Plasmamembran. Für eine praktische Verwendung von Lanthanoid-Verbindungen ist es von besonderer Bedeutung und von Vorteil, dass die Behandlung uninfizierter Zellen mit erfindungsgemäßen Substanzen die Lebensfähigkeit und Vermehrung dieser Zellen nicht beeinträchtigt. Da der die Virusvermehrung hemmende Effekt gleichsam auftritt, wenn ein Wirkkontakt vor der Infektion der Zelle, während der Infektion oder nach der Infektion der Zelle stattfindet, ist eine entsprechende mit den erfindungsgemäßen Verbindungen durchführbare Therapie sowohl prophylaktisch als auch post infectionem möglich.
Überraschenderweise wurde weiterhin gefunden, dass verschiedene Lanthanoid Ionen trotz ihrer großen chemischen Ähnlichkeit sich in ihrer Aktivität, eine Blockade der Virusreplikation auszulösen, stark unterscheiden. In Vertebratenzellen waren La³⁺, Ce³⁺ und Ce⁴⁺ Ionen sehr wirksam, Pr³⁺ und Nd³⁺ waren etwas weniger wirksam, Sm³⁺ war sehr schwach wirksam und alle weiteren Lanthanoide zeigten keine klar erkennbare Wirksamkeit. Auch in Insektenzellen waren La³⁺ und Ce³⁺ Ionen sehr wirksam, aber in diesen Zellen lösten auch alle anderen Lanthanoid Ionen einen meist stark ausgeprägten virusproliferationshemmenden Effekt aus. Dieser Befund ist von besonderer Bedeutung, da es zahlreiche Viruserkrankungen gibt, bei denen sich das Virus nicht direkt von Wirbeltier zu Wirbeltier ausbreitet, sondern bei denen es durch ein Insekt von Wirbeltier zu Wirbeltier übertragen wird und bei denen bei dieser Übertragung eine Vermehrung des Virus im Insekt stattfindet. Wird also eine Virusvermehrung im Insekt unterdrückt oder vollständig unterbunden, kann auch ein hiermit einhergehendes Infektionsrisiko von Vertebraten wie u.a. Menschen stark eingeschränkt oder aber vollständig ausgeschlossen werden.
Aus den obigen Darlegungen ergibt sich, dass das erfindungsgemäße Verfahren sowie das Arzneimittel und die pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung die Vermehrung von Flaviviren blockieren. Sie haben aber keinen Einfluss auf die Vermehrung von Alphaviren. Viren benötigen für ihre Vermehrung zelluläre Komponenten. Man kann wohl davon ausgehen, dass die Einwirkung eines Lanthanoid Ions dazu führt, dass eine zelluläre Komponente, die für die Replikation von Flaviviren benötigt wird, so verändert wird, dass diese Komponente für eine Virusreplikation nicht mehr verwendet werden kann. Im Falle der Replikation von Alphaviren wird entweder diese zelluläre Komponente nicht benötigt oder die Veränderung dieser Komponente ist mit ihrer Funktion bei der Alphavirus-Vermehrung vereinbar. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass die erfindungsgemäße Verwendung von Lanthanoid-Verbindungen in der hier dargelegten Form nicht universell für eine Chemotherapie aller Viruserkrankungen heranzuziehen ist, sondern nur bei einer Teilmenge aller Virusinfektionen wirksam sein wird. Zur Zeit wissen wir, dass die Flaviviren und die durch sie hervorgerufenen Erkrankungen Mitglieder dieser Teilmenge sind. Eine Übersicht über die z. Zt. bekannten Flaviviren und über ihre Übertragung durch Insekten ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Die Tabelle zeigt, dass viele Flavivirus Erkrankungen durch Insekten übertragen werden und dass daher eine mögliche Anwendung der durch Lanthanoid Ionen hervorgerufenen Blockade der Virusreplikation in Insektenzellen von großer Bedeutung ist. Flaviviren sind wichtige Krankheitserreger. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass weltweit jährlich allein 50 Millionen Dengue-Erkrankungen auftreten, die ungefähr 500.000 Krankenhausaufenthalte verursachen.
Am Beispiel der Dengue-Infektion des Menschen lassen sich die Einsatzmöglichkeiten der Erfindung folgendermaßen beschreiben: Nach Ausbruch der Krankheit sind das Arzneimittel, die pharmazeutische Zusammensetzung und die erfindungsgemäßen Verfahren wirksam, da sie die bestehende Virusvermehrung und eine Virusausbreitung im erkrankten Organismus hemmen. In der Inkubationsphase der Infektion, also nach dem ersten Eintritt des Virus in den Menschen und vor dem Ausbruch von Krankheitssymptomen, sind sie ebenfalls bereits wirksam, da eine bestehende Virusreplikation in primär infizierten Zellen gehemmt wird und nicht infizierte Zellen so verändert werden, dass sie eine Replikation des Virus nicht mehr erlauben. Schließlich ist die Erfindung vor der Infektion des Menschen mit dem Virus bereits prophylaktisch wirksam, da sie dazu führt, dass Zellen des Wirts keine Virusreplikation unterhalten können.
Weil die Erfindung auch eine Replikation in Insektenzellen blockiert, kann sie darüber hinaus dazu verwendet werden, das Virus in einer Insektenpopulation zu bekämpfen, die als Überträger auf den Menschen fungiert. Im Falle des Dengue Virus ist die Mücke Aedes Aegypti ein wichtiger Überträger. Dieses Insekt lebt in der häuslichen Umgebung des Menschen, z.B. in Gartenteichen oder im Blumenwasser. Derart wässrige Lebensräume von Insekten sind gute Zielräume für die Anwendung der Erfindung, denn Salze der Lanthanoiden wie z.B. LaCl₃ oder andere sind gut wasserlöslich und können somit mühelos in besagte Lebensräume verbracht werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert, in denen die Hemmung der Replikation von Flaviviren beschrieben wird. Selbstverständlich erstreckt sich der Erfindungsgedanke nicht nur auf die Bekämpfung von Flaviviren, sondern auf alle Viren, deren Vermehrung erfindungsgemäß gehemmt oder vollständig unterdrückt werden kann.
Nachfolgend wurden Expositionen von Zellen zu Ionen seltener Erden, wenn nicht besondere Angaben gemacht werden, unter unseren Standardbedingungen durchgeführt. In unseren Standardbedingungen für die Behandlung von Gewebekulturzellen in Monolayer-Kulturen mit Ionen seltener Erden wurden die Zellen in Puffer E mit den zu analysierenden Ionen inkubiert. Puffer E enthält 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM Glukose und 10 mM HEPES, pH 7.4. Puffer E ist ein physiologischer Puffer, der die Lebensfähigkeit von Zellen nicht beeinträchtigt. Die Salze aller verwendeten Ionen wurden als Trichlorid-Salze, als Trifluormethansulfonat-Salze oder als Sulfat-Salze so eingesetzt, dass Stammlösungen von 100 mM jedes Salzes in H₂O eingesetzt wurden und das Salz kurz vor der Verwendung in Puffer E ohne Ca²⁺ zu der jeweils angegebenen Konzentration zugesetzt wurde, gefolgt von der Zugabe von CaCl₂ zu 2 mM aus einer 1 M Vorratslösung von CaCl₂ in H₂O. Unter diesen Bedingungen sind alle verwendeten Lanthanoid Ionen und auch Sc³⁺ und Y³⁺ Ionen ohne Bildung eines Präzipitats zu einer Konzentration von 1 mM in Puffer E löslich. In unserem Standardexperiment läuft die Exposition von Zellen an die zu analysierenden Ionen folgendermaßen ab: Das Medium der Zellkulturen wird verworfen, die Zellkultur wird 1 × mit eiskaltem Puffer E gewaschen, die Kulturschale wird schwimmend auf einem Eis – Wasser Gemisch inkubiert und Puffer E mit dem zu analysierenden Ion wird auf den Zellrasen gegeben. Nach 30 sec Inkubation bei 0°C wird der Puffer verworfen, der Zellrasen wird 1 × mit Puffer E gewaschen und danach in Wachstumsmedium weiter bei 37°C inkubiert, wie für die einzelnen Experimente beschrieben. Als Wachstumsmedium wurde Eagle's Medium in der Modifikation nach Dulbecco mit 5. v/v fötalem Kälberserum verwendet.
Beispiel 1:
Einfluss einer Behandlung von Gewebekulturzellen vor der Infektion mit Lanthanoid Ionen auf die Fähigkeit der Zellen, eine nachfolgende Infektion mit dem West Nil Virus zu überleben.
8 halbkonfluente Kulturen von BHK-21 Zellen wurden in diesem Experiment verwendet. Eine Zellkultur wurde gar keiner Behandlung unterzogen und wuchs als unbehandelte, nicht infizierte Kontrolle weiter. 7 Zellkulturen wurden für 30 sec entweder mit Puffer E ohne Lanthanoid Ion oder mit einem solchen Ion mit einer Konzentration von 500 μM für 30 sec bei 0°C behandelt. Die folgenden Salze wurden im Experiment verwendet: LaCl₃ × 7 H₂O, CeCl₃ × 7 H₂O, GdCl₃ × 6 H₂O, TbCl₃ × 6 H₂O, Yb-trifluoromethansulfonat und Lu-trifluoromethansulfonat. Nach dieser Behandlung wurden die Kulturen mit Vollmedium bei 37°C unter Wachstumsbedingungen für 2 Stunden inkubiert. Danach wurden diese 7 Kulturen mit West Nil Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle (PBE = Plaque bildende Einheit) infiziert und weitere 24 Stunden in Wachstumsmedium bei 37°C inkubiert. Lichtmikroskopische Aufnahmen mit 20 × Objektivvergrößerung und 320 × Gesamtvergrößerung aller 8 Kulturen nach Ablauf dieser Zeit sind in 1 gezeigt.
Man erkennt, dass die infizierte Kultur, die mit Kontrollpuffer ohne das Ion einer seltenen Erde vorbehandelt wurde (Kontrolle ohne Ion), erwartungsgemäß einen starken, durch die Virusvermehrung hervorgerufenen zytolytischen Effekt in Form abgelöster, runder, stark lichtbrechender Zellen zeigt. Dieser Effekt ist auch in den mit Gd³⁺, Tb³⁺, Yb³⁺ oder Lu³⁺ vorbehandelten infizierten Kulturen sichtbar. Die Daten zeigen ferner deutlich, dass die kurze Vorbehandlung mit La³⁺ oder mit Ce³⁺ die Zellen gegen das Auftreten des zytolytischen Effekts durch die Virusinfektion schützt. Zudem sieht man, dass diese Zellen nach der Virusinfektion zu einem konfluenten Zellrasen hochgewachsen sind, der in der mikroskopischen Betrachtung vergleichbar aussieht wie der Zellrasen, der gänzlich unbehandelten, nicht infizierten Zellkultur (Kontrolle ohne Infektion, ohne Ion).
Beispiel 2:
Einfluss einer Behandlung von West Nil Virus infizierten Gewebekulturzellen mit Lanthanoid Ionen auf die Entwicklung des zytolytischen Effekts und die Fähigkeit zum Zellwachstum.
Im Gegensatz zu dem in 1 beschriebenen Vorgehen wurden hier die Zellen zuerst infiziert und nach der Infektion mit Ionen behandelt. 7 frisch konfluente BHK-21 Zellkulturen wurden mit West Nil Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert. 1,5 Stunden nach der Infektion wurden 6 Kulturen mit dem Standardverfahren mit einem Lanthanoid Ion behandelt durch Inkubation mit 500 μM des entsprechenden Salzes (siehe Beispiel 1) für 30 sec bei 0°C. Folgende 6 Ionen wurden verwendet: La³⁺, Ce³⁺, Gd³⁺, Tb³⁺, Yb³⁺ und Lu³⁺. Die 7. Kultur wurde als Kontrollkultur mit Puffer E ohne Lanthanoid Ion behandelt. Für jede der 7 Kulturen wurde diese Behandlung während der Folgezeit alle 12 Stunden wiederholt. 30 Stunden nach der Infektion wurden alle Kulturen mit Trypsin abgelöst und mit einer 1 : 10 Verdünnung wurden die Zellen erneut auf Petrischalen ausgesät und in Vollmedium weiter bei 37°C inkubiert. Lichtmikroskopische Aufnahmen mit 20 × Objektivvergrößerung und 320 × Gesamtvergrößerung aller 7 Kulturen, die 18 Stunden nach dieser Aussaat aufgenommen wurden, sind in 2 gezeigt. Das jeweils verwendete Ion ist in den einzelnen Teilen der 2 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen das Folgende: Erwartungsgemäß gibt es in der Kontrollkultur, die mit Puffer der kein Lanthanoid Ion enthält, behandelt wurde, nur sehr wenige Zellen, die die Virusinfektion und die nachfolgende Zellverdünnung überlebt haben. Gleiches gilt für Kulturen, die nach der Infektion mit Gd³⁺, Tb³⁺, Yb³⁺ oder Lu³⁺ behandelt wurden. Ganz anders ist das Ergebnis bei Behandlung der Zellen mit La³⁺ oder Ce³⁺. Hier wachsen die Zellen trotz Virusinfektion und einer 1 : 10 Verdünnung zu einem konfluenten Zellrasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit La³⁺ oder Ce³⁺ dazu führt, dass West Nil Virus infizierte Zellen ohne die Entwicklung eines zytolytischen Effekts über mehrere Zellteilungen weiterwachsen.
Beispiel 3:
Einfluss der Behandlung mit La³⁺ oder Lu³⁺ nach dem Viruseintritt auf den zeitlichen Verlauf der Vermehrung von West Nil Virus.
Drei BHK-21 Zellkulturen auf Petrischalen wurden mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle mit West Nil Virus infiziert. 1,5 Stunden nach der Infektion wurde je eine der Zellkulturen für 10 sec bei 37°C als Kontrolle mit Puffer E ohne Lanthanoid Ion behandelt oder mit Pufferlösung mit entweder 500 μM La³⁺ Ionen oder 500 μM Lu³⁺ Ionen. Die Kulturen wurden anschließend in Wachstumsmedium für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kinetik der Vermehrung des Virus in den 3 Kulturen wurde durch Plaqueanalysen aus Aliquots aus den Wachstumsmedien dieser 3 Kulturen bestimmt. Jedes infektiöse Virusteilchen wurde dabei als Bildner eines Plaques auf einem konfluenten BHK-21 Zellrasen nachgewiesen. Die so erhaltenen Wachstumskurven für das West Nil Virus in der unbehandelten Kontrollkultur (o-o-o-o), in der mit La³⁺ behandelten Kultur (☐-☐-☐-☐) und in der mit Lu³⁺
behandelten Kultur sind in 3 wiedergegeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass in der Kontrollkultur 12 Stunden nach Infektion der maximale Virustiter fast erreicht wird und dass in der mit La³⁺ behandelten Kultur keine Virusvermehrung in diesem Zeitraum stattgefunden hat. Noch 36 Stunden nach der Infektion ist der Virustiter der mit La³⁺ behandelten Kultur weniger als 1. des Titers der unbehandelten Kontrollkultur. Die Daten zeigen weiterhin, dass die Behandlung mit Lu³⁺ Ionen keine Hemmung der Virusvermehrung hervorruft. Die Resultate belegen, dass die Hemmung der Virusvermehrung nicht durch eine Hemmung des Eintritts der Viren in die Zelle hervorgerufen wird, sondern dass ein späterer Schritt der Virusvermehrung, der nach dem Viruseintritt stattfindet, durch eine Behandlung mit dem wirksamen Ion gehemmt wird.
Beispiel 4:
Einfluss einer Behandlung von West Nil Virus infizierten BHK-21 Zellen mit den Ionen seltener Erden auf die Entwicklung des virusbedingten zytolytischen Effekts.
Folgende 14 Lanthanoiden wurden analysiert: LaCl₃, CeCl₃, PrCl₃, NdCl₃, SmCl₃, EuCl₃, GdCl₃, TbCl₃, DyCl₃, HoCl₃, ErCl₃, TmCl₃, Yb-trifluormethansulfonat und Lu-trifluormethansulfonat. Diese Verbindungen umfassen alle Lanthanoiden mit Ausnahme von Promethium, welches ein instabiles, radioaktives Element ist. Außerdem wurden die Verbindungen ScCl₃ und YCl₃ analysiert, an die sich die Gruppe der Lanthanoiden anschließt. 17 halbkonfluente Kulturen von BHK-21 Zellen wurden mit West Nil Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert. 1,5 Stunden nach der Infektion wurde eine Kultur einer Kontrollbehandlung ohne Ion einer seltenen Erde unterworfen und die anderen 16 Kulturen nach dem Standardverfahren mit dem Ion einer seltenen Erde behandelt, und zwar durch Inkubation in Puffer E mit 500 μM des entsprechenden Salzes für 30 sec bei 0°C. Danach wurden alle 17 Kulturen für 28 Stunden bei 37°C in Wachstumsmedium bei 37°C inkubiert. Lichtmikroskopische Aufnahmen mit 20 × Objektivvergrößerung und 320 × Gesamtvergrößerung aller 17 Kulturen nach dieser Inkubation sind in 4 gezeigt. Das Ion, welches jeweils verwendet wurde, ist in den einzelnen Teilen der Figur angegeben.
Die Ergebnisse zeigen das Folgende: Erwartungsgemäß ist in der Kontrollkultur, die mit Puffer ohne Ion einer seltenen Erde behandelt wurde, ein starker zytolytischer Effekt sichtbar in Form von zahlreichen abgerundeten, refraktilen Zellen. Es ist deutlich sichtbar, dass die Behandlung mit LaCl₃ und CeCl₃ die Zellen vor der Entwicklung des zytolytischen Effekts sehr wirksam geschützt hat. Ein geringer zytolytischer Effekt ist in den mit PrCl₃ und mit NdCl₃ behandelten Kulturen sichtbar, aber es ist klar erkennbar, dass diese Ionen eine deutliche Hemmung der Entwicklung des zytolytischen Effekts bewirken. Die Daten zeigen darüber hinaus, dass die mit La³⁺, Ce³⁺, Pr³⁺ oder Nd³⁺ behandelten Zellen trotz der Virusinfektion zu einem dichten Zellrasen hochgewachsen sind. Bei den Sm³⁺ Ionen ist die Hemmung des zytolytischen Effekts fraglich und gegebenenfalls sehr gering und bei den nachfolgenden Ionen nicht mehr erkennbar. An diesen Ergebnissen erkennt man, dass die verwendeten Ionen trotz ihrer großen chemischen Ähnlichkeit sich funktionell in ihrem Einfluss auf die Entwicklung des zytolytischen Effekts stark unterscheiden. In der verwendeten Reihenfolge steigt die Ordnungszahl des verwendeten Lanthanoid Ions und parallel dazu wird der Ionenradius des Lanthanoid Ions geringer, eine Erscheinung die als Lanthanoidenkontraktion bezeichnet wird. Daher zeigt dieses Experiment, dass die Wirksamkeit der Lanthanoid Ionen mit sinkendem Ionenradius abnimmt und dass die beiden Ionen mit dem größten Radius, La³⁺ und Ce³⁺ die größte Wirksamkeit aufweisen. Die Ionen Sc³⁺ und Y³⁺, die einen wesentlich kleineren Ionenradius als Sm³⁺ Ionen haben, sind ebenfalls unwirksam.
Beispiel 5:
Einfluss einer Behandlung von West Nil Virus infizierten Zellen nach der Infektion mit La³⁺ auf die Synthese von virusspezifischen Proteinen.
4 frisch konfluente Kulturen von BHK-21 Zellen wurden in diesem Experiment benutzt. 2 Kulturen wurden mit West Nil Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert und 2 Kulturen wurden scheininfiziert. 1,5 Stunden später wurden eine infizierte und eine scheininfizierte Kultur mit 500 μM La³⁺ für 30 sec bei 0°C behandelt. Zur gleichen Zeit wurden eine infizierte und eine scheininfizierte Kultur einer Kontrollbehandlung ohne La³⁺ Ionen unterworfen. 10 Stunden später wurde in allen 4 Kulturen die Zellproteinsynthese analysiert. Dazu wurden die Kulturen für 30 min mit ³⁵S-markierten Aminosäuren inkubiert, die Zellen wurden danach in denaturierendem Puffer abgelöst und in ihnen enthaltene Proteine wurden auf einem denaturierenden Gel elekrophoretisch getrennt. Die resultierende Trennung spiegelt im Wesentlichen das Molekulargewicht des Proteins wider. Das Gel wurde getrocknet und durch Exposition an einem Röntgenfilm wurden die radioaktiv markierten Proteine im Gel lokalisiert. Das auf diesem Röntgenfilm entstandene Autoradiogramm der Proteine, die in den 4 Kulturen während der 30 minütigen Markierungszeit synthetisiert wurden, ist in 5 gezeigt zusammen mit der Herkunft der Lysate, die in den einzelnen Spuren des Gels aufgetrennt wurden.
Die Ergebnisse ergeben das Folgende: Die radioaktiven Proteine aus uninfizierten Zellen nach einer Kontrollbehandlung ohne La³⁺ zeigen ein erwartetes, sehr komplexes Muster (Spur 1). Das Muster der radioaktiven Proteine aus kontrollbehandelten, infizierten Zellen, welches in der nächsten Spur gezeigt ist, ist demgegenüber stark verändert: In diesen Zellen werden große Mengen virusspezifischer Proteine synthetisiert, die als auffällige Einzelbanden im Muster des Autoradiogramms sichtbar sind. 3 dieser Proteine (die Proteine NS5, NS4 und V3) sind durch Dreiecke gekennzeichnet. Die Virusinfektion führt also erwartungsgemäß in den nicht mit La³⁺ behandelten Kontrollkulturen zu einer deutlich sichtbaren Synthese von viralen Proteinen. Entscheidend ist, dass bei einer La³⁺ Behandlung auch in den West Nil Virus infizierten Zellen keine erkennbare Synthese von virusspezifischen Proteinen stattfindet, wie man Spur 4 durch Zusammenschau mit Spur 3 entnehmen kann. Es ist aus dem Vergleich dieser Spuren deutlich sichtbar, dass in den mit La³⁺ behandelten Kulturen das Muster an Proteinen, welches während der Markierungszeit synthetisiert wurde, keinen erkennbaren Unterschied zwischen den uninfizierten (Spur 3) und den infizierten (Spur 4) Zellen aufweist. Die Daten zeigen, dass die Behandlung von West Nil Virus infizierten Zellen mit La³⁺ Ionen 1,5 Stunden nach der Infektion dazu führt, dass die spätere Synthese viraler Proteine ausbleibt. Ein weiteres sehr wichtiges Ergebnis dieser Analysen ist die Tatsache, dass in den uninfizierten, kontrollbehandelten Zellen (Spur 1), in den uninfizierten mit La³⁺ behandelten Zellen (Spur 3) und in den infizierten mit La³⁺ behandelten Zellen (Spur 4) ein gleichartiges komplexes Muster von Proteinen synthetisiert wird. Diese Daten zeigen, dass die La³⁺ Behandlung keinen hemmenden Einfluss auf die Synthese zellulärer Proteine hat, sondern spezifisch die Synthese viraler Proteine in infizierten Zellen unterdrückt.
Beispiel 6:
Einfluss einer Behandlung von Uganda S Virus infizierten Zellen nach der Infektion mit La³⁺ auf die Synthese von virusspezifischen Nukleinsäuren.
Die Ergebnisse des 1. Teils dieses Experiments sind in den Teilen (a), (b), (c) und (d) der 6 gezeigt. 4 frisch konfluente Kulturen von BHK-21 Zellen wurden für diesen Teil des Experiments benutzt. 2 Kulturen wurden mit dem Uganda S Flavivirus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert, 2 Kulturen wurden scheininfiziert und alle Kulturen wurden anschließend in Wachstumsmedium bei 37°C inkubiert. Eine Stunde später wurde zum Wachstumsmedium aller Platten Actinomycin D zu 1 μg/ml zugesetzt, welches an die zelluläre DNS bindet und die Transkription der zellulären DNS blockiert. Die Replikation der viralen RNS, die unabhängig von einem DNS-Intermediat ist, wird durch diese Behandlung nicht beeinträchtigt. 30 Minuten nach der Actinomycin D Zugabe wurde je eine der beiden infizierten Platten mit La³⁺ Ionen behandelt (500 μM La³⁺, 30 sec, 0°C) oder ohne La³⁺ kontrollbehandelt und anschließend mit Wachstumsmedium weiter bei 37°C inkubiert. Die beiden scheininfizierten Platten wurden ebenso behandelt. 8,5 Stunden später wurden alle 4 Zellkulturen für 30 Minuten mit Markierungsmedium für die radioaktive Markierung der in diesem Zeitraum synthetisierten RNS durch das radioaktive Isotop ³²P inkubiert. Die Zellen wurden danach abgelöst und die RNS wurde durch Phenolextraktion isoliert. Die RNS Moleküle wurden dann durch Zentrifugation über einen Zuckergradienten in Fraktionen aufgetrennt. Das Profil der Verteilung der radioaktiven RNS, welches aus den 4 RNS Präparaten nach dieser Zentrifugation erhalten wurde, ist in 6 gezeigt. Die Fraktion 1 enthält die am schnellsten und daher am weitesten sedimentierenden großen Moleküle und die Fraktion 18 die kleinsten Moleküle, die nicht sedimentiert sind. Die durchgehende dünne Linie zeigt den Verlauf der optischen Dichte im Gradienten, der in einer Durchflußküvette gemessen wurde. Die beiden Spitzen in diesem Profil in den Fraktionen 8 und 11 zeigen die Sedimentation der zellulären, ribosomalen 28 S bzw. 18 S RNS Moleküle. Die dunkle, gestrichelte Linie mit den einzelnen Meßpunkten stellt die Verteilung der radioaktiven Moleküle dar, wie sie im Flüssigkeitszähler bestimmt wurde. Welche RNS Präparation jeweils analysiert wurde, ist für jeden Gradienten in dieser Figur angegeben.
Die Verteilung der radioaktiven RNS in den Gradienten zeigt das Folgende: Teil (a) zeigt, dass in nicht infizierten Zellen ohne La³⁺ Behandlung keine hochmolekularen RNS Moleküle synthetisiert werden, die in den Gradienten sedimentieren. Das ist so zu erwarten, da die Synthese zellulärer hochmolekularer RNS durch das Actinomycin D blockiert wurde. Teil (b) zeigt erwartungsgemäß, dass in uninfizierten, mit La³⁺ behandelten Zellen ebenfalls keine hochmolekulare RNS unter Antinomycin D synthetisiert wird. Teil (c) zeigt ein völlig anderes Bild als die Teile (a) und (b). In den infizierten Zellen werden hochmolekulare RNS Moleküle synthetisiert, die in den Gradienten sedimentieren. Der durch einen Pfeil markierte Radioaktivitätsgipfel in Fraktion 4 enthält die neu synthetisierte, radioaktiv markierte 42 S Genom RNS des Uganda S Virus. Das RNS Profil von Teil (c) ist das Profil, welches für diese Analyse aus infizierten Zellen bekannt und genau charakterisiert ist. Das entscheidende Ergebnis dieses Experiments ist im Profil von Teil (d) enthalten. Diese Daten zeigen, dass in den infizierten Zellen keine virale RNS mehr synthetisiert wird, wenn diese Zellen bei 1,5 Stunden nach der Infektion für 30 sec mit La³⁺ behandelt worden sind. Die Ergebnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass die oben in Beispiel 5 gezeigte Hemmung der viralen Proteinsynthese durch die La³⁺ Behandlung darauf beruht, dass die La³⁺ Behandlung die Synthese der viralen RNS blockiert und dass daher auch keine virale Boten-RNS für die Translation viraler Proteine zur Verfügung steht.
Im 2. Teil dieses Experiments wurden die Experimente des 1. Teils mit Insektenzellen an Stelle von BHK-21 Vertebratenzellen wiederholt. 4 frisch konfluente Kulturen von C2 Insektenzellen wurden benutzt. Diese C2 Zellen entstammen eine Zelllinie aus dem Insekt Aedes Albopictus. Die 4 Zellkulturen wurden experimentell genau so behandelt wie die 4 BHK-21 Zellkulturen des 1. Teils dieses Experiments und es wurden die gleichen Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Teilen (a'), (b'), (c') und (d') der 6 gezeigt. Der Sinn dieser Wiederholung des Experiments liegt in der Beantwortung der Frage, ob eine La³⁺ Behandlung auch bei Insektenzellen wirksam ist. Die in dieser Figur gezeigten Ergebnisse geben eindeutig an, dass eine La³⁺ Behandlung auch in Insektenzellen zu einer Blockierung der Synthese von virusspezifischer RNS führt. In vielen Fällen von menschlichen Erkrankungen durch Flaviviren wird ein Virus durch ein Insekt auf den Menschen übertragen und breitet sich nicht von Mensch zu Mensch aus. Die Frage nach der Aktivität von Lanthanoid Ionen bei der Hemmung der Replikation von Flaviviren in Insektenzellen ist daher praktisch von erheblicher Bedeutung.
Beispiel 7:
Einfluss einer spät im Verlauf der Infektion vorgenommenen La³⁺ Behandlung von Uganda S infizierten Zellen auf die Fortführung der Synthese virusspezifischer Nukleinsäuren.
2 frisch konfluente Kulturen von BHK-21 Zellen wurden in diesem Experiment verwendet. Beide Kulturen wurden mit Uganda S Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert und danach bei 37°C in Wachstumsmedium mit 1 μg/ml Actinomycin D zur Blockade der Transkription der zellulären DNS inkubiert. Unter diesen Bedingungen repliziert sich das Uganda S Virus sehr effizient und hat nach ca. 12 Stunden Inkubation den maximalen Virustiter erreicht. In diesem Experiment wurde bei 9.5 Stunden nach der Infektion eine Zellkultur mit La³⁺ (500 μM, 30 sec, 0°C) behandelt und die andere Kultur parallel als Kontrollkultur ohne La³⁺ der gleichen Behandlung unterzogen. Beide Kulturen wurden dann für eine weitere Stunde in Wachstumsmedium inkubiert und danach wurde die RNS, die in diesen Zellkulturen zwischen 10,5 Stdn. und 11,5 Stdn. nach der Infektion synthetisiert wurde, mit ³²P radioaktiv markiert, anschließend isoliert, durch Zentrifugation über Sucrosegradienten aufgetrennt und die Gradienten wurden genau so analysiert wie in Beispiel 6 beschrieben.
Die erhaltenen Gradientenprofile der beiden RNS Präparationen sind in 7 gezeigt. In der nicht mit La³⁺ behandelten Kultur wurde erwartungsgemäß die virale RNS repliziert, was sich im Auftreten von radioaktiv markierter 42 S Genom RNS in der Region um Fraktion 5 des Gradienten zeigt. Interessanterweise erkennt man in der anderen Gradientenanalyse, dass die Replikation von viraler RNS und die Synthese von viraler 42 S Genom RNS in infizierten Zellen auch dann blockiert wird, wenn die La³⁺ Behandlung erst 9,5 Stunden nach der Infektion vorgenommen wird, da keine radioaktiv markierte virale RNS auf dem Gradienten sichtbar ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die viralen RNS Replikase-Komplexe, die 9,5 Stunden nach der Infektion sehr aktiv virale Genom RNS synthetisieren, durch die Behandlung mit La³⁺ inaktiviert werden. Dieses Ergebnis ist praktisch sehr bedeutsam da es zeigt, dass eine Behandlung mit einem geeigneten Ion einer seltenen Erde nicht nur die Bildung neuer aktiver viraler Replikationskomplexe verhindern kann, sondern auch zur Inaktivierung bereits bestehender aktiver Replikationskomplexe führt.
Beispiel 8:
Einfluss der Behandlung von Uganda S Virus infizierten BHK-21 – und C2 Zellen nach der Infektion mit Ce³⁺ und Lu³⁺ auf die Synthese virusspezifischer Nukleinsäuren.
Je 3 frisch konfluente Kulturen von BHK-21 Zellen und von C2 Zellen wurden mit Uganda S Virus mit einer Multiplizität von ca. 5 PBE/Zelle infiziert und 1 Stunde in Wachstumsmedium inkubiert. Danach wurde dem Medium Actinomycin D zu 1 μg/ml zugesetzt und 30 Minuten später wurde jeweils eine Zellkultur mit Kontrollösung ohne ein Lanthanoid Ion, mit 500 μM Ce³⁺ oder mit 500 μM Lu³⁺ nach dem Standardverfahren behandelt. Alle Kulturen wurden für weitere 7 Stunden mit Vollmedium mit Actinomycin D inkubiert und danach wurde die RNS-Synthese in allen 6 Kulturen durch Markierung mit ³²P, Isolierung der RNS und Analyse der RNS durch Gradientenzentrifugation genau so analysiert, wie im Beispiel 6 beschrieben. Die Analysen der RNS Moleküle aus den BHK-21 Zellen sind in den Teilen (a), (b) und (c) der 8 gezeigt. Die Analysen der RNS Moleküle aus den C2 Zellen sind in den Teilen (a'), (b') und (c') dieser Figur gezeigt.
Die Verteilung der radioaktiven RNS in den Gradienten zeigt das Folgende: Erwartungsgemäß werden in den Kontrollen, die nicht mit einem Lanthanoid Ion behandelt wurden, die virusspezifischen Nukleinsäuren synthetisiert und eine Behandlung der Zellkulturen mit 500 μM Ce³⁺ Ionen führt sowohl in BHK-21 Zellen (Teil b) als auch in C2 Zellen (Teil b') zu einer Blockade der Synthese der viralen RNS. Ebenfalls erwartet ist auf Grund der Ergebnisse der Beispiele 3 und 4 der Befund, dass eine Behandlung von BHK-21 Zellen mit Lu³⁺ die virale RNS-Synthese nicht hemmt (Teil c). Das unerwartete Ergebnis dieses Experiments zeigt der Teil (c') aus dem hervorgeht, dass in C2 Insektenzellen die Lu³⁺ Behandlung der Zellen eine Hemmung der Replikation der Virus-RNS hervorruft. Da ähnliche Ergebnisse auch bei Verwendung von Gd³⁺, Tb³⁺ und Yb³⁺ erhalten wurden, zeigen diese Analysen, dass die in Vertebratenzellen beobachtete auf wenige Lanthanoid Ionen beschränkte antivirale Wirksamkeit in Insektenzellen nicht vorhanden ist. Insgesamt ergeben die Daten, dass in Insektenzellen im Gegensatz zu Vertebratenzellen alle Lanthanoid Ionen eine, wenn auch individuell verschiedene, Aktivität bei der Induktion einer Hemmung der Replikation der viralen RNS aufweisen.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar.
Man erkennt, dass ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines Mittels zur Behandlung einer Virusinfektion, ein Arzneimittel und eine pharmazeutische Zusammensetzung Gegenstand der Erfindung sind. Diese umfasst mithin die Herstellung und Verwendung einer pharmazeutischen Präparation, in der eine Exposition von Vertebraten- oder Insektenzellen an Lanthanoiden-Ionen den Zellstoffwechsel so verändert, dass die intrazelluläre Vermehrung von Viren gehemmt wird, ohne die Zellvermehrung zu blockieren. Da diese Veränderung wirksam wird, wenn die Exposition vor der Infektion der Zellen, während der Infektion oder nach der Infektion der Zellen stattfindet, ist eine darauf aufbauende Therapie sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verwendbar. Die Blockade der Virusreplikation stellt eine bei einer Teilmenge aller Viruserkrankungen wirksame Chemotherapie dar. Zurzeit wissen wir, dass die Vermehrung von Flaviviren durch diese Exposition blockiert wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Virusinfektion, dadurch gekennzeichnet, dass als wesentlicher Bestandteil wenigstens eine mit einer Zelloberfläche wechselwirkende und aus der Gruppe der Lanthanoid-Verbindungen ausgewählte Verbindung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch einen oder mehrere aus der Familie der Flaviviridae umfassenden Gruppe stammenden Viren hervorgerufene Virusinfektion behandelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch einen oder mehrere aus der Gruppe der Flaviviren stammenden Viren hervorgerufene Virusinfektion behandelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Verbindung oder eine Mischung von Verbindungen aus der Gruppe der Lanthanoid-Salze eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Gruppe der Lanthanoid-Verbindungen ausgewählte Verbindung zur Behandlung der Virusinfektion ausschließlich mit der Zelloberfläche in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung kurzzeitig mit der Zelloberfläche in Kontakt gebracht wird, insbesondere für Zeitspannen von weniger als einer Minute.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Virusinfektionen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit einem zeitlichen Vorlauf vor der Infektion eingesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Virusinfektionen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung während und/oder nach der Infektion eingesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Virusinfektionen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in Abständen – vorzugsweise Tagesabständen – wiederholt eingesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Virusinfektionen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einem Temperaturbereich von 0°C bis 50°C eingesetzt wird und vorzugsweise in einem Bereich von 0°C bis zu einer Temperatur, bei der Zielzellen noch lebensfähig sind.
Arzneimittel zur Behandlung einer Virusinfektion, dadurch gekennzeichnet, dass es als wesentlichen Bestandteil eine mit einer Zelloberfläche wechselwirkende und aus der Gruppe der Lanthanoid-Verbindungen ausgewählte Verbindung oder eine aus dieser Gruppe ausgewählte Kombination von Verbindungen umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ionisch ist.
Arzneimittel nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es als wesentlichen Bestandteil eine mit der Zelloberfläche wechselwirkende La³⁺-, Ce³⁺-, Ce⁴⁺-, Pr³⁺-, Nd³⁺-, oder Sm³⁺-Verbindung oder eine Mischung daraus umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13, hergestellt und eingesetzt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Behandlung von Virusinfektionen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel gelöst ist und eine Lanthanoid-Ionen-Konzentration von 10 bis 1000 μM und vorzugsweise von 50 bis 1000 μM und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform zwischen 100 und 500 μM an einer Zielzelle aufweist.
Verfahren zur Reduzierung oder vollständigen Unterdrückung einer Vermehrung von Viren in Insekten und Vertebraten durch Behandlung eines wässrigen Lebensraums mit einem als Wirkstoff einsetzbaren Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff gelöst dem wässrigen Lebensraum zugesetzt wird, wobei die Lösung Mittel enthält, die auf Insekten anziehend wirken.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der gelöste Wirkstoff eine Lanthanoid-Ionen-Konzentration von 1 bis 1000 μM, vorzugsweise von 100 bis 700 μM und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform zwischen 400 und 500 μM an einer Zielzelle aufweist.