DE102005061635A1 - In situ Verfahren zur Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen - Google Patents
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Abstract
Aufgabe
war es, die bislang nur in Ausnahmefällen sowie auf einzelne Chromosomen
beschränkte
Unterscheidung der homologen DNA-Sequenzen für alle Chromosomen bzw. Interphasekerne
entsprechend der Fragestellung zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Unterscheidung der DNA-Sequenzen über bekannte DNA-Polymorphismen sowie unter Anwendung der pod-FISH-Darstellung (parental-origin-differentiation-FISH), indem die Intensitäten der Fluoreszenzsignale des zu untersuchenden Materials, welche die DNA-Polymorphismen widerspiegeln, verglichen werden.
Das Verfahren findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik und Forschung.
Erfindungsgemäß erfolgt die Unterscheidung der DNA-Sequenzen über bekannte DNA-Polymorphismen sowie unter Anwendung der pod-FISH-Darstellung (parental-origin-differentiation-FISH), indem die Intensitäten der Fluoreszenzsignale des zu untersuchenden Materials, welche die DNA-Polymorphismen widerspiegeln, verglichen werden.
Das Verfahren findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik und Forschung.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur individuellen in situ Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen, wie z.B. auf Chromosomen und in Interphasekernen, und ermöglicht es, die elterliche Herkunft homologer DNA-Sequenzen bzw. deren Unterabschnitte darzustellen. Das Verfahren wird nachfolgend als pod-FISH (parental-origin-differentiation-FISH) bezeichnet (FISH = Fluoreszenz in situ Hybridisierung; Pinkel D, Gray JW, Trask B, van den Engh G, Fuscoe J, van Dekken H: Cytogenetic analysis by in situ hybridization with fluorescently labeled nucleic acid probes, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51, 1986, 151-157). Es basiert auf der Darstellung von DNA-Polymorphismen auf Einzelzellebene. Hierdurch ergeben sich weitläufige neue Anwendungsgebiete in der medizinischen Diagnostik und in der Forschung.
- Die Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen (z. B. auf Chromosomen, chromosomalen Abschnitten oder im Interphasekern) bezüglich ihrer elterlichen Herkunft ist derzeit in erster Linie mittels molekulargenetischer Verfahren möglich (Übersicht bei Schlötterer C: The evolution of molecular markers – just a matter of fashion? Nat Rev Genet 5, 2004, 63-69).
- Betrachtet man die DNA-Sequenz des menschlichen Erbgutes so kann man eine Reihe von hetero-, aber auch von euchromatischen DNA-Variationen finden. Interindividuelle euchromatische Unterschiede werden in ca. 0,1 % des menschlichen Genoms gefunden; einzige Ausnahme sind eineiige Zwillinge (Shastry BS: SNP alleles in human disease and evolution, J Hum Genet 47, 2002, 561-566). Den Hauptanteil an den Differenzen tragen Einzelbasenpaarunterschiede bei sog. SNPs (= single nucleotide polymorphisms), die im Mittel etwa jede tausendste Base betreffen und sowohl in kodierenden als auch nicht kodierenden Regionen des Genoms liegen können (Lee C: Vive la difference! Nat Genet 37, 2005, 660-661).
- Daneben gibt es noch eine ganze Reihe weiterer DNA Polymorphismen, wie kurze repetitive Sequenzen sogenannter Mini- und Mikrosatelliten, die in der Regel in nicht kodierenden Bereichen zu finden sind oder wenige Basenpaare betreffende Insertionen und Deletionen (INDELs = Insertion-Deletion Polymorphisms), siehe auch Schlötterer C: The evolution of molecular markers – just a matter of fashion? Nat Rev Genet 5, 2004, 63-69. Diese Variationen im Genom, die jeweils auch homologe Chromosomen eines Individuums betreffen, können derzeit nicht zu einer Unterscheidung der Chromosomen genutzt werden, da diese Polymorphismen auf DNA-Ebene nur eine bis wenige Basenpaare umfassen. Zudem muss die DNA für solche Untersuchungen aus einer Vielzahl von Einzelzellen extrahiert werden, was eine Einschränkung der Nachweisgrenze zur Folge hat.
- Der Blick auf das Genom und seine Variabilität wurde jedoch vor kurzem durch die Entdeckung sog. Kopiezahl-Polymorphismen (LCV = large scale copy number variations oder CNP = copy number polymorphisms) entscheidend verändert (Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C: Detection of largescale variation in the human genome, Nat Genet 36, 2004, 949-951; Sebat J, Lakshmi B, Troge J, Alexander J, Young J, Lundin P, Maner S, Massa H, Walker M, Chi M, Navin N, Lucito R, Healy J, Hicks J, Ye K, Reiner A, Gilliam TC, Trask B, Patterson N, Zetterberg A, Wigler M: Large-scale copy number polymorphism in the human genome, Science 305, 2004, 525-528.). Grundlage hierfür waren DNA-Chip-basierende Vergleiche verschiedener Individuen, welche Hunderte bisher nicht beschriebener Strukturvarianten im Genom aufzeigten. Diese umfassen Polymorphismen von Zehn- bis zu einigen Hunderttausend Basenpaaren Größe. Hierbei handelt es sich also um relativ ausgedehnte DNA-Bereiche, welche bei einzelnen Individuen bzw. einzelnen homologen Chromosomen verschiedentlich in Tandem dupliziert vorliegen oder auch komplett fehlen können.
- Zudem hat man durch noch hochauflösendere Techniken auch eine Reihe von individuellen submikroskopischen Inversionsvarianten nachweisen können (Tuzun E, Sharp AJ, Bailey JA, Kaul R, Morrison VA, Pertz LM, Haugen E, Hayden H, Albertson D, Pinkel D, Olson MV, Eichler EE: Fine-scale structural variation of the human genome, Nat Genet 37, 2005, 727-732). Es wird angenommen, dass diese bisher nicht bekannten Variationen im Genom die Expressionsrate einzelner Gene direkt beeinflussen und somit zu individuellen phänotypischen Unterschieden bis hin zu verschiedenen Krankheitsdispositionen und Medikamentenverträglichkeiten beitragen könnten (Lee C: Vive la difference! Nat Genet 37, 2005, 660-661).
- Bislang wurden insgesamt 643 solcher Kopiezahl-Polymorphismen beschrieben (Sebat J, Lakshmi B, Troge J, Alexander J, Young J, Lundin P, Maner S, Massa H, Walker M, Chi M, Navin N, Lucito R, Healy J, Hicks J, Ye K, Reiner A, Gilliam TC, Trask B, Patterson N, Zetterberg A, Wigler M: Large-scale copy number polymorphism in the human genome, Science 305, 2004, 525-528; Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C: Detection of large-scale variation in the human genome, Nat Genet 36, 2004, 949-951; Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP: Microarray based comparative genomic hybridisation (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features, J Med Genet 41, 2004, 241-248; Sharp AJ, Locke DP, McGrath SD, Cheng Z, Bailey JA, Vallente RU, Pertz LM, Clark RA, Schwartz S, Segraves R, Oseroff VV, Albertson DG, Pinkel D, Eichler EE: Segmental duplications and copy-number variation in the human genome, Am J Hum Genet 77, 2005, 78-88; Tuzun E, Sharp AJ, Bailey JA, Kaul R, Morrison VA, Pertz LM, Haugen E, Hayden H, Albertson D, Pinkel D, Olson MV, Eichler EE: Fine-scale structural variation of the human genome, Nat Genet 37, 2005, 727-732; de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA: Diagnostic genome profiling in mental retardation, Am J Hum Genet 77, 2005, 606-616; Schoumans J, Ruivenkamp C, Holmberg E, Kyllerman M, Anderlid BM, Nordenskjold M: Detection of chromosomal imbalances in children with idiopathic mental retardation by array based comparative genomic hybridisation (array-CGH), J Med Genet 42, 2005, 99-705), die in eine Datenbank zusammengefasst wurden (http://projects.tcag.ca/variation/).
- Insgesamt ist zu erwarten, dass durch immer hochauflösendere DNA-Chips sowie neuer Kartierungs- und Vergleichsstrategien (Buckley PG, Mantripragada KK, Piotrowski A, Diaz de Stahl T, Dumanski JP: Copy-number polymorphisms: mining the tip of an iceberg, Trends Genet 21, 2005, 15-317; Tuzun E, Sharp AJ, Bailey JA, Kaul R, Morrison VA, Pertz LM, Haugen E, Hayden H, Albertson D, Pinkel D, Olson MV, Eichler EE: Fine-scale structural variation of the human genome, Nat Genet 37, 2005, 727-732) weitere Kopiezahl- und Strukturvarianten beschrieben werden.
- Lediglich mittels Zytogenetik und in Ausnahmefällen ist es derzeit auf Einzelzellniveau möglich, die chromosomale Herkunft der jeweiligen väterlichen oder der mütterlichen Seite zuzuordnen; nämlich nur dann, wenn Variationen in der Ausprägung der mikroskopisch sichtbaren heterochromatischen Regionen z. B. der Chromosomen 1, 9, 16 und Y oder der kurzen Arme der akrozentrischen Chromosomen vorliegen (Wyandt HE und Tonk VS: Atlas of Human Chromosome Heteromorphisms. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande, 2004). Dies ermöglicht es, bei Vorhandensein von zytogenetisch sichtbaren Polymorphismen die Homologen der o.g. Chromosomen zu unterscheiden. Beim Fehlen solcher groben polymorphen Varianten sowie bei allen anderen Chromosomen des Menschen ist eine zytogenetische und somit einzelzellspezifische Unterscheidung der homologen Chromosomen in situ bislang nicht möglich. Dies hat zur Folge, dass eine ganze Reihe von Fragestellungen mit hoher wissenschaftlicher als auch medizinisch diagnostischer Relevanz derzeit nicht bearbeitet werden können.
- Es besteht deshalb seitens der Fachwelt ein großes Interesse, diese Probleme zu lösen.
- Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, die bislang nur in Ausnahmefällen sowie auf einzelne Chromosomen beschränkte Unterscheidung der homologen DNA-Sequenzen für das gesamte Genom entsprechend der Fragestellung zu ermöglichen.
- Insbesondere sollen durch die Erfindung die Segregation einzelner DNA-Sequenzen bzw. deren Abschnitte verfolgt (Stichwort: uniparentale Disomie = UPD), Homozygotisierungen im Rahmen von Alterungs- oder Krebsentstehungsprozessen nachgewiesen sowie die Mischung von Zellpopulationen verschiedener Individuen (z. B. nach einer Knochenmarkstransplantation oder bei mütterlicher Kontamination in der pränatalen Zytogenetik) dargestellt werden können.
- Erfindungsgemäß werden die DNA-Sequenzen bzw. Unterabschnitte von diesen auf an sich bekannte DNA-Polymorphismen untersucht. Entsprechend der Fragestellung werden zu den gefundenen DNA-Polymorphismen des zu untersuchenden Materials ein oder mehrere DNA-Sequenzen bzw. bacterial artificial chromosomes (BACs) ausgewählt (beispielsweise anhand einer oder mehrerer Datenbanken) oder diese sind anderweitig verfügbar. Die ausgewählten DNA-Sequenzen bzw. BACs werden vervielfältigt sowie beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Haptenen markiert. Zur besseren und insbesondere automatisierbaren Auswertung bietet sich dabei vorzugsweise eine Vielfarbendarstellung an, wobei entweder unmittelbar Vielfarben-FISH-Ansätze markiert werden oder gemessene Signalintensitäten werden über eine Software in Farben (Pseudofarben) umgerechnet.
- Die so gewonnenen Sonden werden entsprechend der Fragestellung beispielsweise in Chromosomen-spezifischen Sets zusammengestellt und zusammen mit vorzugsweise Cot-1 DNA denaturiert. Auf diese Weise werden einzelsträngige DNA-Sonden gewonnen, die mit homologen Sequenzen des zu untersuchenden Materials vorzugsweise bei ca. 37 °C auf einem Träger hybridisiert werden. Nach Waschen, Spülen, Dehydrieren und Trocknen dieser auf dem Träger hybridisierten DNA-Sonden werden diese zur fluoreszenzmikroskopischen Auswertung mit einer Gegenfärbung, z. B. DAPI, versehen.
- Die Fluoreszenzsignaleintensitäten, der auf homologen DNA-Sequenzen des Untersuchungsmaterials hybridisierten DNA-Sonden, werden innerhalb des Präparates verglichen (z.B. jeweils innerhalb einer Metaphaseplatte oder eines Interphasekerns). Wobei zur Unterscheidung der auszuwertenden DNA-Sequenzen reproduzierbare Intensitätsunterschiede der Fluoreszenzsignale dienen.
- Das vorgestellte Verfahren ermöglicht es zum ersten Mal, die molekulargenetische Ebene der DNA-Polymorphismen mit den mikroskopisch sichtbaren homologen Chromosomen bzw. Interphasekernen zu verbinden und diese für eine Unterscheidung der gleichaussehenden Chromosomenpaare zu nutzen.
- Die technische Umsetzung erfolgt vorzugsweise über bacterial artificial chromosomes (BACs, vgl. Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M: Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector, Proc Natl Acad Sci USA 89, 1992, 8794-8797), welche aus den entsprechend polymorphen Bereichen des Genoms stammen.
- Diese BACs aus dem humanen Genomprojekt sind in der Regel komplett sequenziert, kartiert und kommerziell erhältlich. Für die hier vorgestellte FISH Technik wurden vor allem solche Polymorphismen/BACs ausgewählt, die auch deletiert im Genom vorkommen können und einen gewissen Abstand zueinander einhalten. Dies erleichtert die anschließende Darstellung und Analyse der BACs über die Fluoreszenz in situ Hybridisierung.
- Zur Zeit stehen für die sog. parental origin differentiation (pod)-FISH 158 solcher BACs über das gesamte Genom verteilt zur Verfügung (vgl. Tabelle in
4 ). - Diese Anzahl ist – basierend auf neu erzielten Daten der hochauflösenden DNA-Chips sowie neuer Kartierungs- und Vergleichsstrategien (z. B. Buckley PG, Mantripragada KK, Piotrowski A, Diaz de Stahl T, Dumanski JP: Copy-number polymorphisms: mining the tip of an iceberg, Trends Genet 21, 2005, 315-317 oder Tuzun E, Sharp AJ, Bailey JA, Kaul R, Morrison VA, Pertz LM, Haugen E, Hayden H, Albertson D, Pinkel D, Olson MV, Eichler EE: Fine-scale structural variation of the human genome, Nat Genet 37, 2005, 727-732) – beliebig erweiterbar.
- Für die praktische Bearbeitung hat es sich gezeigt, dass derzeit die Zusammenstellung der BACs in chromosomenspezifischen Hybridisierungs-Sets sowie die Markierung der BACs eines Sets mit unterschiedlichen Fluorochromen von Vorteil ist. Methodisch bedingt, erfolgt die Auswertung vorzugsweise an mindestens 10–20 homologen Sequenzen (Metaphaseplatten) des zu untersuchenden Materials, um mögliche Hybridisierungsunterschiede innerhalb des Trägers zu relativieren. Die Zusammenstellung der Chromosomen-spezifischen Sets kann aber variabel gehandhabt werden, so dass neu beschriebene polymorphe Bereiche ebenfalls berücksichtigt werden können. Auch gesamtgenomische, nicht Chromosomen-spezifische Sets, die eine Unterscheidung aller homologen Chromosomen einer Zelle nach einer bis weniger Hybridisierungen erlauben, sind prinzipiell möglich.
- Prinzipiell eignen sich auch die oben beschriebenen SNPs und INDELs für eine in situ Unterscheidung der homologen Chromosomen indem man diese z. B. über Fluoreszenzen unter dem Mikroskop sichtbar macht.
- Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können z. B. die Segregation einzelner Chromosomen bzw. deren Abschnitte verfolgt werden (uniparentale Disomie), Homozygotisierungen im Rahmen von Alterungs- oder Krebsentstehungsprozessen nachgewiesen werden und die Mischung von Zellpopulationen verschiedener Individuen (z. B. nach einer Knochenmarkstransplantation oder bei mütterlicher Kontamination) in der pränatalen Zytogenetik dargestellt werden. Die Methode ermöglicht es aber prinzipiell, auch unabhängig von Chromosomen Unterschiede in homologen Sequenzen darzustellen z. B. im Interphasekern, wobei der Interphasekern fixiert oder in Suspension untersucht werden kann.
- Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Beispielen näher erläutert werden.
- Es zeigen:
-
1 : Schematische Darstellung einer FISH-Hybridisierung des polymorphen BACs RP11-488I20. Gezeigt sind homologe Chromosomen 15 einer Metaphase mit Fluoreszenzsignalen (jeweils durch Stern symbolisiert). Die Pfeile weisen auf eine unterschiedliche Signalintensität zwischen den homologen Sequenzen hin. Die Bänderung der Chromosomen und deren Beschriftung erfolgte nach ISCN 2005 (Shaffer L. G., Tommerup N: „An international System for Human Cytogenetic Nomenclature", S. Karger, Basel 2005). -
2 : Schematisches Beispiel einer Multicolor-pod-FISH Hybridisierung, bei der fünf polymorphe BACs von Chromosom 16 in fünf verschiedenen Fluorochromen (symbolisiert durch unterschiedliche Schraffierung der Sterne) markiert und hybridisiert wurden. Die Pfeile weisen auf eine unterschiedliche Signalintensität zwischen den homologen Sequenzen hin. - Die Bänderung der Chromosomen und deren Beschriftung erfolgte nach ISCN 2005 (Shaffer L. G., Tommerup N: „An international System for Human Cytogenetic Nomenclature", S. Karger, Basel 2005).
-
3 : Beispiel der pod-FISH Bestätigung einer molekulargenetisch gesicherten maternalen Heterodisomie. Angewendet wurde ein aus sechs BAC-Sonden bestehendes pod-FISH-Set für Chromosom 15. Gezeigt sind Beispielbilder der Auswertungen beim Vater (A), bei der Mutter (B) und beim Kind (C). - Die Bänderung der Chromosomen und deren Beschriftung erfolgte nach ISCN 2005 (Shaffer L. G., Tommerup N: „An international System for Human Cytogenetic Nomenclature", S. Karger, Basel 2005).
-
4 : Tabellarische Übersicht über die 158 bislang eingesetzten und getesteten polymorphen BACs.
(Angaben nach NCBI Build 35.1, http://www.ncbi.nih.gov/) - In
1 wurde der Chromosom 15q-spezifische BAC RP11-500O23 aus der Internetdatenbank (http://projects.tcag.ca/variation und http://www.ncbi.nih.gov) ausgewählt, erworben, vervielfältigt, markiert sowie als FISH-Sonde auf eine Metaphase hybridisiert; auf einem der beiden Chromosomen 15 ist ein sehr starkes, auf dem anderen nur ein sehr schwaches Hybridisierungssignal sichtbar (siehe Sterndarstellung in1 ). Somit kann hier ein homologes Chromosom 15 vom anderen und ansonsten identisch aussehenden Chromosom 15 durch diesen, polymorphen BAC' anhand des Intensitätsunterschiedes der Fluoreszenzsignale unterschieden werden. - In
2 wurde ein schon zytogenetisch, durch einen Heterochromatinpolymorphismus in 16q12 vom anderen Chromosom unterscheidbares Chromosom 16 mit fünf verschiedenen und unterschiedlich farblich markierten polymorphen BACs hybridisiert. Zwei der fünf BACs zeigen einen unterscheidbaren Polymorphismus und ermöglichen so, unabhängig vom hier zur internen Kontrolle eingesetzten zytogenetisch sichtbaren Polymorphismus, eine verlässliche Unterscheidung der beiden homologen Chromosomen durch Intensitätsvergleich der Fluoreszenzsignale. Die Fluoreszenzsignale sind wiederum durch Sterndarstellung symbolisiert, wobei die Pfeile auf unterschiedlich starke Intensitäten zweier Fluoreszenzsignale hinweisen (linkes Chromosom jeweils hohe Intensität, rechtes Chromosom jeweils geringere Intensität). An diesem Bespiel kann auch die Reproduzierbarkeit der pod-FISH Methode gezeigt werden, da Signalunterschiede einem über den Heterochromatinpolymorphismus zugeordneten Chromosom in jeder Metaphaseplatte des Untersuchungsmaterials das gleiche Hybridisierungsmuster wiederzufinden ist. - Eine klinisch diagnostische Anwendung ist in
3 schematisch vorgestellt. Es handelt sich um die Darstellung bzw. den Nachweis von Uniparentalen Disomien (= UPD), d. h. ein Kind hat nicht wie üblich, je ein homologes Chromosom von jedem Elternteil erhalten, sondern das vorhandene Chromosomenpaar stammt ausschließlich von einem Elternteil. Eine Untersuchung dieses mitunter krankheitsverursachenden Phänomens erfolgte bislang nur auf molekulargenetischer DNA-Ebene. Da sich die Strukturvarianten von Mensch zu Mensch unterscheiden können und damit auch von Chromosom zu Chromosom bzw. von Chromosomenabschnitt zu Chromosomenabschnitt, wird es damit erstmals möglich, die Vererbung des mütterlichen und väterlichen homologen Chromosoms auf Einzelzellniveau in situ nachzuvollziehen. Gleichermaßen ist es aber auf diese Weise auch möglich, Vaterschaften nachzuweisen. In3 lässt sich anhand eines Vielfarben-Sondenansatzes für Chromosom 15 sowie der unterschiedlichen Signalstärken der Fluoreszenzsignale auf allen gezeigten Chromosomen ein individuelles Hybridisierungsmuster erzeugen. Beim Vergleich der Muster zwischen Mutter, Vater und Kind, lässt sich keines der Muster des Vaters beim Kind wiederfinden. Das Kind zeigt jedoch auf beiden homologen Chromosomen 15 das gleiche Hybridisierungsmuster wie die Mutter. Folglich hat das Kind beide Chromosomen 15 von der Mutter geerbt. Es liegt also eine maternale Heterodisomie vor, die unabhängig von diesem Verfahren im übrigen auch über eine an sich bekannte Mikrosatellitenanalyse bestätigt werden konnte. -
4 zeigt eine tabellarische Übersicht über die 158 bislang eingesetzten und getesteten polymorphen BACs. Eine Erweiterung dieses Sondensets mit neu entdeckten CNP/LCV-Polymorphismen ist jederzeit möglich. - Nachfolgend sollen als Übersicht weitere Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung genannt werden (ohne diese explizit darzustellen) für welche das vorgestellte Verfahren zur Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen über bekannte DNA-Polymorphismen, Anwendung der pod-FISH-Darstellung (parental-origin-differentiation-FISH) sowie Fluoreszenzsignalvergleich vorteilhaft eingesetzt werden kann:
Es wird vermutet, dass der Verlust von Heterozygotie durch „Notreparaturen" der DNA infolge von Krebsentstehungsprozessen ebenfalls eine Rolle spielt (Gorletta TA, Gasparini P, D'Elios MM, Trubia M, Pelicci PG, Di Fiore PP: Frequent loss of heterozygosity without loss of genetic material in acute myeloid leukemia with a normal karyotype, Genes Chromosomes Cancer 44, 2005, 334-337). Ein ähnlicher Mechanismus wird auch beim Altern von Zellen vermutet. Dieser Verlust von Heterozygotie, der sich anscheinend in der Regel nicht über ganze Chromosomen erstreckt, ist streng genommen auch eine Form von UPD (uniparentale Disomie) und kann über diese Methode nachgewiesen werden. - Das vorgeschlagene Verfahren ist prinzipiell auch am Interphasekern, der fixiert oder in Suspension vorliegt, anwendbar. Damit ist die Möglichkeit einer Automatisierung des Verfahrens gegeben. Zudem ermöglicht der Interphasekernansatz den Zugang zu Geweben, in denen sich Chromosomen zytogenetisch nur schwer bzw. gar nicht darstellen lassen.
- Die erfindungsgemäße Methode kann zwischen homologen Chromosomen bzw. deren Abschnitten und damit auch zwischen verschiedenen homologen Chromosomen unterschiedlicher Individuen unterscheiden. Deshalb sind auch Zellgemische unterschiedlicher Individuen auf chromosomaler Ebene oder auch im Interphasekern unterscheidbar. Solche Zellgemische spielen beispielsweise eine Rolle bei mütterlich kontaminierten Kulturen in der pränatalen Zytogenetik oder bei gleichgeschlechtlichen Knochenmarkstransplantationen.
- In der Forschung können mit der pod-FISH Methode Fragen bearbeitet werden wie z. B.:
- – Werden bei chromosomalen Trisomien/Monosomien die mütterlichen oder die väterlichen Chromosomen bevorzugt bzw. liegt eine komplette UPD vor?
- – Werden komplexe neu entstandene chromosomale Umbauten bevorzugt durch einen der beiden Eltern vererbt?
Claims (5)
- In situ Verfahren zur Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen, bei dem Chromosomen bzw. Interphasekerne des zu untersuchenden Materials fluoreszenzmikroskopisch anhand polymorpher Unterschiede auf der DNA-Ebene ausgewertet und verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Sequenzen bzw. Unterabschnitte von diesen auf bekannte DNA-Polymorphismen untersucht werden, dass zu den gefundenen DNA-Polymorphismen des zu untersuchenden Materials ensprechend der Fragestellung ein oder mehrere DNA-Sequenzen bzw. bacterial artificial chromosomes (BACs) ausgewählt, vervielfältigt und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Haptenen markiert werden, dass die so gewonnenen Sonden entsprechend der Fragestellung z. B. in Chromosomen-spezifischen Sets zusammengestellt und zusammen mit vorzugsweise Cot-1 DNA denaturiert werden, dass die nun einzelsträngigen DNA-Sonden mit homologen Sequenzen des zu untersuchenden Materials vorzugsweise bei ca. 37 °C auf einem Träger hybridisiert und dieser anschließend gewaschen, gespült, dehydriert, getrocknet sowie zur fluoreszenzmikroskopischen Auswertung mit einer Gegenfärbung, z.B. DAPI, versehen werden und dass die Fluoreszenzsignale des zu untersuchenden Materials sowie der auf dem Träger hybridisierten DNA-Sonden miteinander verglichen und zur Unterscheidung der DNA-Sequenzen in Hinsicht auf reproduzierbare Intensitätsunterschiede ausgewertet werden.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gefundenen DNA-Polymorphismen des zu untersuchenden Materials aus einer oder mehreren Datenbanken ausgewählt werden.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten und vervielfältigten DNA-Sequenzen bzw. bacterial artificial chromosomes (BACs) zwecks besserer und vorzugsweise automatischer Auswertbarkeit vielfarbig markiert werden.
- Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzen bzw. bacterial artificial chromosomes (BACs) unmittelbar als Vielfarben-FISH-Ansätze markiert werden.
- Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass von den DNA-Sequenzen bzw. bacterial artificial chromosomes (BACs) die Fluoreszenzsignalintensitäten gemessen und diese in Farben (Pseudofarben) umgerechnet werden.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE200510061635 DE102005061635A1 (de) | 2005-12-20 | 2005-12-20 | In situ Verfahren zur Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen |
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Family Applications (1)
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DE200510061635 Withdrawn DE102005061635A1 (de) | 2005-12-20 | 2005-12-20 | In situ Verfahren zur Unterscheidung homologer DNA-Sequenzen |
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-
2005
- 2005-12-20 DE DE200510061635 patent/DE102005061635A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MATTHAEI,Anja,et.al.:Small Reciprocal Insertion detected by Spectral Karyotyping (SKY) and delimited by Array-CGH Analysis.In:Eur.J.Med. Genet 48, 2005, S.328-338 * |
MATTHAEI,Anja,et.al.:Small Reciprocal Insertion detected by Spectral Karyotyping (SKY) and delimited by Array-CGH Analysis.In:Eur.J.Med. Genet 48, 2005, S.328-338; |
NEWMAN,Tera,L.,et.al.: A genome-wide survey of structural variation between human and chimpanzee.In:Genome Res. 2005, 15,S.1344-1356 * |
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