DE102005057250A1 - Wirkstoffe zur Steigerung der Stressabwehr in Pflanzen gegenüber abiotischem Stress und Methoden zu ihrer Auffindung - Google Patents

Wirkstoffe zur Steigerung der Stressabwehr in Pflanzen gegenüber abiotischem Stress und Methoden zu ihrer Auffindung Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die die Toleranz von Pflanzen gegenüber auf diese Pflanze einwirkenden abiotischem Stressoren, wie beispielsweise Temperatur (wie Kälte, Frost oder Hitze), Wasser (wie Trockenheit, Dürre oder Anoxia), oder die chemische Belastung (wie Mangel oder Überschuss an Mineralsalzen, Schwermetallen, gasförmigen Noxen) durch Expressionssteigerung pflanzenendogener Proteine erhöhen, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Erhöhung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stressoren.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die die Toleranz von Pflanzen gegenüber auf diese Pflanze einwirkenden abiotischem Stressoren, wie beispielsweise Temperatur (wie Kälte, Frost oder Hitze), Wasser (wie Trockenheit, Dürre oder Anoxia), oder die chemische Belastung (wie Mangel oder Überschuss an Mineralsalzen, Schwermetalle, gasförmige Noxen) durch Expressionssteigerung pflanzenendogener Proteine erhöhen, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Erhöhung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stressoren.
  • Es ist bekannt, dass Pflanzen auf natürliche Stressbedingungen, wie beispielsweise Kälte, Hitze, Trockenheit, Verwundung, Pathogenbefall (Viren, Bakterien, Pilze, Insekten) etc. aber auch auf Herbizide mit spezifischen oder unspezifischen Abwehrmechanismen reagieren [Pflanzenbiochemie, S. 393–462, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, Hans W. Heldt, 1996.; Biochemistry and Molecular Biology of Plants, S. 1102–1203, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, eds. Buchanan, Gruissem, Jones, 2000].
  • In Pflanzen sind zahlreiche Proteine und die sie codierenden Gene bekannt, die an Abwehrreaktionen gegen abiotischen Stress (z.B. Kälte, Hitze, Trockenheit, Salz) beteiligt sind. Diese gehören teilweise zu Signaltransduktionsketten (z.B. Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen) oder bewirken eine physiologische Antwort der Pflanzenzelle (z.B. Ionentransport, Entgiftung reaktiver Sauerstoff-Spezies). Zu den Signalkettengenen der abiotischen Stressreaktion gehören u.a. Transkriptionsfaktoren der Klassen DREB und CBF (Jaglo-Ottosen et al., 1998, Science 280: 104–106). An der Reaktion auf Salzstress sind Phosphatasen vom Typ ATPK und MP2C beteiligt. Ferner wird bei Salzstress häufig die Biosynthese von Osmolyten wie Prolin oder Sucrose aktiviert. Beteiligt sind hier z.B. die Sucrose-Synthase und Prolin-Transporter (Hasegawa et al., 2000, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51: 463–499). Die Stressabwehr der Pflanzen gegen Kälte und Trockenheit benutzt z.T. die gleichen molekularen Mechanismen. Bekannt ist die Akkumulation von sogenannten Late Embryogenesis Abundant Proteins (LEA-Proteine), zu denen als wichtige Klasse die Dehydrine gehören (Ingram and Bartels, 1996, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 277–403, Close, 1997, Physiol Plant 100: 291–296). Es handelt sich dabei um Chaperone, die Vesikel, Proteine und Membranstrukturen in gestressten Pflanzen stabilisieren (Bray, 1993, Plant Physiol 103: 1035–1040). Außerdem erfolgt häufig eine Induktion von Aldehyd-Deydrogenasen, welche die bei oxidativem Stress entstehenden reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) entgiften (Kirch et al., 2005, Plant Mol Biol 57: 315–332). Heat Shock Faktoren (HSF) und Heat Shock Proteine (HSP) werden bei Hitzestress aktiviert und spielen hier als Chaperone eine ähnliche Rolle wie die Dehydrine bei Kälte- und Trockenstress (Yu et al., 2005, Mol Cells 19: 328–333).
  • Die meisten der beschriebenen molekularen Mechanismen werden durch Induktion der Genexpression aktiviert. Dadurch ergibt sich die interessante Möglichkeit spezifische Stressantworten von Pflanzen mit Hilfe der Transkriptom-Analyse, z.B. durch Gene Expression Profiling (GEP) mit DNA Microarrays oder vergleichbaren Techniken zu charakterisieren (Rensink et al., 2005, Genome 48: 598–605, Cheong et al., 2002, Plant Physiology 129: 661–677). Auf diese Weise lassen sich spezifische Stress-reaktive Genexpressionsmuster erfassen und miteinander vergleichen.
  • Es ist weiter bekannt, dass chemische Substanzen die Toleranz von Pflanzen gegen abiotischen Stress erhöhen können. Derartige Substanzen werden dabei entweder durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenbehandung appliziert. So wird eine Erhöhung der abiotischen Stresstoleranz von Kulturpflanzen durch Behandlung mit Elicitoren der Systemic Acquired Resistance (SAR) oder Abscisinsäure-Derivaten beschrieben (Schading and Wei, WO-200028055, Abrams and Gusta, US-5201931, Churchill et al., 1998, Plant Growth Regul 25: 35–45).
  • Auch bei Anwendung von Fungiziden, insbesondere aus der Gruppe der Strobilurine werden ähnliche Effekte beobachtet, die häufig auch mit einer Ertragssteigerung einhergehen (Draber et al., DE-3534948, Bartlett et al., 2002, Pest Manag Sci 60: 309).
  • Desweiteren wurden Effekte von Wachstumsregulatoren auf die Stresstoleranz von Kulturpflanzen beschrieben (Morrison and Andrews, 1992, J Plant Growth Regul 11: 113–117, RD-259027). Bei osmotischem Stress ist eine Schutzwirkung durch Applikation von Osmolyten wie z.B. Glycinbetain oder deren biochemischen Vorstufen, z.B. Cholin-Derivate beobachtet worden (Chen et al., 2000, Plant Cell Environ 23: 609–618, Bergmann et al., DE-4103253). Auch die Wirkung von Antioxidantien wie z.B Naphtole und Xanthine zur Erhöhung der abiotischen Stresstoleranz in Pflanzen wurde bereits beschrieben (Bergmann et al., DD-277832, Bergmann et al., DD-277835). Die molekularen Ursachen der Anti-Stress-Wirkung dieser Substanzen sind jedoch weitgehend unbekannt.
  • Somit ist bekannt, dass Pflanzen über mehrere endogene Reaktionsmechanismen verfügen, die eine wirksame Abwehr gegenüber verschiedensten Schadorganismen und/oder natürlichem abiotischen Stress bewirken können. Eine Voraussage darüber, welche Abwehrreaktionen gezielt durch Anwendung von Wirkstoffen hervorgerufen oder moduliert werden können, war bisher jedoch nicht bekannt.
    •
  • Es besteht somit ein Bedarf nach einer Methode zum gezielten Auffinden molekularer Aktivatoren pflanzenendogener Abwehrmechanismen gegenüber abiotischem Stress (wie beispielsweise Hitze, Kälte, Trockenheit, Salinität, sowie Säuren-/und Basenbelastung) wodurch neuartige Wirkstoffe aufgefunden, neue Eigenschaften bekannter, aber andersartig wirkender Wirkstoffe identifiziert, oder aber bereits bekannte Moleküle oder Leitstrukturen auf die Verwendung als Induktoren der pflanzenendogenen Abwehrmechanismen gegenüber abiotischen Stressoren optimiert werden können.
  • Definitionen nachfolgend verwendeter Begriffe
  • Der Begriff „Blast-Analysen" (Blast = Basic Local Alignment Search Tool)", wie hier verwendet, beschreibt die Verwendung geeigneter Computer-Programme zur Klassifikation und zum Auffinden potentiell homologer Sequenzen (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403–410), wobei ein Vergleich (Alignment) zwischen einer Suchsequenz (query sequence) und allen Sequenzen einer oder mehrerer Datenbanken unter Vorgabe einer gewünschten Übereinstimmung in Form eines „Signifkanz-Kriteriums" (scoring function), erfolgt (R. Rauhut, Bioinformatik, S 38–107, Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001).
  • Der Begriff „cDNA" (complementary DNA), wie hier verwendet, beschreibt einen DNA-Einzelstrang, der zu einer RNA komplementär, und der durch eine enzymatische reverse Transkription in vitro synthetisiert wird. Die cDNA kann entweder der gesamten RNA-Länge entsprechen, oder aber nur eine Teilsequenz der als Matrix dienenden RNA darstellen.
  • Der Begriff „Cluster-Analyse", wie hier verwendet, bedeutet die Zusammenfassung der ermittelten Einzeldaten mittels eines hierfür entwickelten Computerprogramms, wobei Gruppen von Genen, die für Proteine mit ähnlicher Funktion kodieren, oder aber Gene mit ähnlichem Expressionsmuster zusammenfassend dargestellt werden. Hierdurch wird eine hierarchische Minimierung des komplexen Datenmusters erreicht, die in Form eines Dendrograms dargestellt werden kann. Die Cluster-Analyse ermöglicht die klassifizierende Bewertung der erhaltenen Datensätze, die deutlich über die bloße Akkumulierung beziehungsloser Daten hinausgeht.
  • Unter den Begriffen „DNA-Chip" und „DNA-Microarray", die hier synonym verwendet werden, wird ein Träger bezeichnet dessen Grundmaterial beispielsweise aus Glas oder Nylon besteht, auf dessen Grundmaterial DNA-Fragmente fixiert sind, wobei die Aufbringung der DNA beispielsweise durch (a) ein photolithographisches Verfahren (DNA wird direkt auf dem Arrayträger synthetisiert), (b) ein Microspotting-Verfahren (extern synthetisierte Oligonukleotide oder PCR-Produkte werden auf den Träger appliziert und kovalent gebunden), oder (c) durch eine Microspraying-Verfahren (extern synthetisierte Oligonukleotide oder PCR-Produkte werden mit einem Tintenstrahldrucker berührungsfrei auf den Träger gesprüht) erfolgen kann (R. Rauhut, Bioinformatik, S 197–199, Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001). Ein DNA-Chip, der genomische Sequenzen eines Organismus representiert, wird als „genomischer DNA-Chip" bezeichnet. Die Auswertung der mit Hilfe dieser DNA-Chips" erhaltenen Messwerte wird als „DNA-Chip-Analyse" bezeichnet.
  • Der Begriff „DNA-Chip-Hybridisierung", wie hier verwendet, bedeutet die Paarung zweier einzelstränger, komplementärer Nukleinsäuremoleküle, wobei eines der basenpaarenden Molekülpartner als DNA (Desoxribonukleinsäure) auf dem DNA-Chip in bevorzugt kovalent gebundener Form lokalisiert ist, während der andere in Form der RNA (Ribonukleinsäure) oder der hierzu korrespondierenden cDNA (komplementäre DNA) in Lösung vorliegt. Die Hybridisierung der gebundenen und nicht gebundenen Nukleinsäuren erfolgt auf dem DNA-Chip in wässriger Pufferlösung, gegebenenfalls unter zusätzlich denaturierenden Bedingungen, wie beispielsweise in Gegenwart von Dimethylsulfoxid, bei Temperaturen von 30–60°C, bevorzugt 40–50°C, besonders bevorzugt bei 45°C für 10–20 Stunden, bevorzugt für 14–18 Stunden, besonders bevorzugt für 16 Stunden unter ständiger Bewegung. Die Hygbridisierungsbedingungen können konstant beispielsweise in einem Hybridisierungsofen realisiert werden. Standardmäßig werden in einem solchen Hybridisierungsofen Bewegungen von 60 rpm (rounds per minute, Umdrehungen pro Minute) realisiert.
  • Die mit dem Begriff „EST-Sequenz" (Expressed Sequence Tag) bezeichnete Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, bedeutet eine kurze Sequenz von 200–500 Basen oder Basenpaaren.
  • Die synonym gebrauchten Begriffe „Expressionsmuster", „Induktionsmuster" bzw. „Expressionsprofil", wie hier verwendet, beschreiben die zeitlich differenzierte und/oder gewebespezifische Expression der pflanzlichen mRNA, wobei das Muster direkt durch die erzeugte Intensität des Hybridisierungssignals der aus der Pflanze erhaltenen RNA oder deren korrespondierender cDNA mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie erhalten wird. Die gemessenen „Induktionswerte" ergeben sich durch direkte Verrechnung mit den korrespondierenden Signalen, die durch Verwendung eines synonymen Chips unter Hybridisierung mit einer nicht behandelten/gestressten Kontrollpflanze erhalten werden.
  • Der Begriff „Expressionszustand" der durch das vorgenommene „Gene Expression Profiling" erhalten wird, wie hier verwendet, beschreibt die gesamte erfasste Transkriptionsaktivität zellulärer Gene, die mit Hilfe eines DNA-Chips gemessen wird.
  • Der Begriff „Gesamt-RNA", wie hier verwendet, beschreibt die aufgrund des angewendeten Aufschlussverfahrens mögliche Repräsentanz verschiedener pflanzenendogener RNA-Gruppen, die in einer Pflanzenzelle vorliegen können, wie beispielsweise, cytoplasmatische rRNA (ribosomale RNA), cytoplasmatische tRNA (transfer RNA), cytoplasmatische mRNA (messenger RNA), sowie deren jeweilige nucleäre Vorläufer, ctRNA (chloroplastidäre RNA) und mtRNA (mitochondriale RNA), sie umfasst aber auch RNA-Moleküle, die von exogenen Organismen stammen können, wie beispielsweise von Viren, oder parasitierenden Bakterien und Pilzen.
  • Der Begriff „Nutzpflanzen", wie hier verwendet, bezeichnet Kulturpflanzen, die als Pflanzen für die Gewinnung von Nahrungsmitteln, Futtermitteln oder für technische Zwecke eingesetzt werden.
  • Der Begriff „Safener", wie hier verwendet, bezeichnet eine chemische Verbindung, die nicht pflanzenendogenen Ursprungs ist, und die die phytotoxischen Eigenschaften eines Pestizids gegenüber Nutzpflanzen aufhebt oder verringert, ohne dass die pestizide Wirkung gegenüber Schadorganismen, wie beispielsweise Unkräutern, Bakterien, Viren und Pilzen wesentlich vermindert wird.
  • Safener, die neben ihrer eigentlich bekannten Funktion ebenfalls zur Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren beitragen, sind vorzugsweise ausgewählt aus der nachstehend definierten Gruppe, wobei die Auswahl je nach abiotischem Stressor unterschiedlich erfolgen kann, die Verwendung nur eines einzelnen Saferners oder aber mehrerer Safener aus der selben oder aus verschiedenen Gruppen erfolgen kann:
    • a) Verbindungen der Formeln (I) bis (III),
      Figure 00070001
      Indizes folgende Bedeutungen haben: n' ist eine natürliche Zahl von 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3; T ist eine (C1 oder C2)-Alkandiylkette, die unsubstituiert oder mit einem oder zwei (C1-C4)Alkylresten oder mit [(C1-C3)-Alkoxy]-carbonyl substituiert ist; W ist ein unsubstituierter oder substituierter divalenter heterocyclischer Rest aus der Gruppe der teilungesättigten oder aromatischen Fünfring-Heterocyclen mit 1 bis 3 Heteroringatomen des Typs N oder O, wobei mindestens ein N-Atom und höchstens ein O-Atom im Ring enthalten ist, vorzugsweise ein Rest aus der Gruppe (W1) bis (W4),
      Figure 00070002
      m' ist 0 oder 1; R17, R19 sind gleich oder verschieden Halogen, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, Nitro oder (C1-C4)Haloalkyl; R18, R20 sind gleich oder verschieden OR24, SR24 oder NR24R25 oder ein gesättigter oder ungesättigter 3- bis 7-gliedriger Heterocyclus mit mindestens einem N-Atom und bis zu 3 Heteroatomen, vorzugsweise aus der Gruppe O und S, der über das N-Atom mit der Carbonylgruppe in (II) bzw. (III) verbunden ist und unsubstituiert oder durch Reste aus der Gruppe (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl substituiert ist, vorzugsweise ein Rest der Formel OR24, NHR25 oder N(CH3)2, insbesondere der Formel OR24; R24 ist Wasserstoff oder ein unsubstituierter oder substituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest, vorzugsweise mit insgesamt 1 bis 18 C-Atomen; R25 ist Wasserstoff, (C1-C6)Alkyl, (C1-C6)Alkoxy oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl; RX ist H, (C1-C8)Alkyl, C1-C8(Haloalkyl), (C1-C4)Alkoxy(C1-C8)Alkyl, Cyano oder COOR26, worin R26 Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl, (C1-C4)Alkoxy(C1-C4)alkyl, (C1-C6)Hydroxyalkyl, (C3-C12)Cycloalkyl oder Tri-(C1-C4)-alkylsilyl ist; R27, R28, R29 sind gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl, (C3-C12)Cycloalkyl oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl; R21 ist (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C2-C4)Alkenyl, (C2-C4)Haloalkenyl, (C3-C7)Cycloalkyl, vorzugsweise Dichlormethyl; R22, R23 ist gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, (C2-C4)Alkenyl, (C2-C4)Alkinyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C2-C4)Haloalkenyl, (C1-C4)Alkylcarbamoyl(C1-C4)alkyl, (C2-C4)Alkenylcarbamoyl-(C1-C4)alkyl, (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)alkyl, Dioxolanyl-(C1-C4)alkyl, Thiazolyl, Furyl, Furylalkyl, Thienyl, Piperidyl, substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, oder R22 und R23 bilden zusammen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring, vorzugsweise einen Oxazolidin-, Thiazolidin-, Piperidin-, Morpholin-, Hexahydropyrimidin- oder Benzoxazinring;
    • b) eine oder mehreren Verbindungen aus Gruppe: 1,8-Naphthalsäureanhydrid, Methyl-diphenylmethoxyacetat, 1-(2-Chlorbenzyl)-3-(1-methyl-1-phenylethyl)harnstoff (Cumyluron), O,O-Diethyl S-2-ethylthioethyl phosphordithioat (Disulfoton), 4-Chlorphenyl-methylcarbamat (Mephenate), O,O-Diethyl-O-phenylphosphorotioat (Dietholate), 4-Carboxy-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-essigsäure (CL-304415, CAS-Regno: 31541-57-8), Cyanomethoxyimino(phenyl)acetonitril (Cyometrinil), 1,3-Dioxolan-2-ylmethoxyimino(phenyl)acetonitril (Oxabetrinil), 4'-Chlor-2,2,2-trifluoracetophenon-O-1,3-dioxolan-2-ylmethyloxim (Fluxofenim), 4,6-Dichlor-2-phenylpyrimidin (Fenclorim), Benzyl-2-chlor-4-trifluormethyl-1,3-thiazol-5-carboxylat (Flurazole), 2-Dichlormethyl-2-methyl-1,3-dioxolan (MG-191), N-(4-Methylphenyl)-N'-(1-methyl-1-phenylethyl)harnstoff (Dymron), (2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure (2,4-D), (4-Chlorphenoxy)essigsäure, (R,S)-2-(4-Chlor-o-tolyloxy)propionsäure (Mecoprop), 4-(2,4-Dichlorphenoxy)buttersäure (2,4-DB), (4-Chlor-o-tolyloxy)essigsäure (MCPA), 4-(4-Chlor-o-tolyloxy)buttersäure, 4-(4-Chlorphenoxy)buttersäure, 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoesäure (Dicamba), 1-(Ethoxycarbonyl)ethyl 3,6-dichlor-2-methoxybenzoat (Lactidichlor) sowie deren Salze und Ester, vorzugsweise (C1-C8);
    • c) N-Acylsulfonamide der Formel (IV) und ihre Salze,
      Figure 00100001
      worin R30 Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest, einen Kohlenwasserstoffoxyrest, einen Kohlenwasserstoffthiorest oder einen Heterocyclylrest, der vorzugsweise über ein C-Atom gebunden ist, wobei jeder der letztgenannten 4 Reste unsubstituiert oder durch einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, Formyl, Carbonamid, Sulfonamid und Reste der Formel -Za-Ra substituiert ist, wobei jeder Kohlenwasserstoffteil vorzugsweise 1 bis 20 C-Atome aufweist und ein C-haltiger Rest R30 inklusive Substituenten vorzugsweise 1 bis 30 C-Atome aufweist; R31 Wasserstoff oder (C1-C4)-Alkyl, vorzugsweise Wasserstoff, oder R30 und R31 zusammen mit der Gruppe der Formel -CO-N- den Rest eines 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten Rings; R32 gleich oder verschieden Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, Formyl, CONH2, SO2NH2 oder einen Rest der Formel -Zb-Rb; R33 Wasserstoff oder (C1-C4)-Alkyl, vorzugsweise H; R34 gleich oder verschieden Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, CHO, CONH2, SO2NH2 oder einen Rest der Formel -Zc-Rc; Ra einen Kohlenwasserstoffrest oder einen Heterocyclylrest, wobei jeder der beiden letztgenannten Reste unsubstituiert oder durch einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Mono- und Di-[(C1-C4)-alkyl]-amino substituiert ist, oder einen Alkylrest, in dem mehrere, vorzugsweise 2 oder 3, nicht benachbarte CH2-Gruppen jeweils durch ein Sauerstoffatom ersetzt sind; Rb, Rc gleich oder verschieden einen Kohlenwasserstoffrest oder einen Heterocyclylrest, wobei jeder der beiden letztgenannten Reste unsubstituiert oder durch einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Phosphoryl, Halogen(C1-C4)-alkoxy, Mono- und Di-((C1-C4)-alkyl]-amino substituiert ist, oder einen Alkylrest, in dem mehrere, vorzugsweise 2 oder 3, nicht benachbarte CH2-Gruppen jeweils durch ein Sauerstoffatom ersetzt sind; Za eine divalente Gruppe der Formel -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CO-O-, -CO-S-, -O-CO-, -S-CO-, -SO-, -SO2-, -NR*-, -CO-NR*-, -NR*-CO-, -SO2-NR*- oder -NR*-SO2-, wobei die rechts angegebene Bindung der jeweiligen divalenten Gruppe die Bindung zum Rest Ra ist und wobei die R* in den letztgenannten 5 Resten unabhängig voneinander jeweils H, (C1-C4)-Alkyl oder Halo-(C1-C4)alkyl bedeuten; Zb, Zc unabhängig voneinander eine direkte Bindung oder eine divalente Gruppe der Formel -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CO-O-, -CO-S-, -O-CO-, -S-CO-, -SO-, -SO2-, -NR*-, -SO2-NR*-, -NR*-SO2-, -CO-NR*- oder -NR*-CO-, wobei die rechts angegebene Bindung der jeweiligen divalenten Gruppe die Bindung zum Rest Rb bzw. Rc ist und wobei die R* in den letztgenannten 5 Resten unabhängig voneinander jeweils H, (C1-C4)-Alkyl oder Halo-(C1-C4)-alkyl bedeuten; n eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise 0, 1 oder 2, insbesondere 0 oder 1, und m eine ganze Zahl von 0 bis 5, vorzugsweise 0, 1, 2 oder 3, insbesondere 0, 1 oder 2; bedeuten;
    • d) Acylsulfamoylbenzoesäureamide der allgemeinen Formel (V), gegebenenfalls auch in Salzform,
      Figure 00110001
      worin X3 CH oder N; R35 Wasserstoff, Heterocyclyl oder einen Kohlenwasserstoffrest, wobei die beiden letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, CHO, CONH2, SO2NH2 und Za-Ra substituiert sind; R36 Wasserstoff, Hydroxy, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C2-C6)-Alkinyl, (C1-C6)-Alkoxy, (C2-C6)-Alkenyloxy, wobei die fünf letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Hydroxy, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkoxy und (C1-C4)-Alkylthio substituiert sind, oder R35 und R36 zusammen mit dem sie tragenden Stickstoffatom einen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten Ring; R37 Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, CHO, CONH2, SO2NH2 oder Zb-Rb; R38 Wasserstoff, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl oder (C2-C4)-Alkinyl; R39 Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Carboxy, Phosphoryl, CHO, CONH2, SO2NH2 oder Zc-Rc; Ra einen (C2-C20)-Alkylrest, dessen Kohlenstoffkette ein- oder mehrfach durch Sauerstoffatome unterbrochen ist, Heterocyclyl oder einen Kohlenwasserstoffrest, wobei die zwei letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Mono- und Di-[(C1-C4)-alkyl]-amino substituiert sind; Rb, Rc gleich oder verschieden einen (C2-C20)-Alkylrest, dessen Kohlenstoffkette ein- oder mehrfach durch Sauerstoffatome unterbrochen ist, Heterocyclyl oder einen Kohlenwasserstoffrest, wobei die zwei letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Phosphoryl, (C1-C4)-Haloalkoxy, Mono- und Di-[(C1-C4)-alkyl]-amino substituiert sind; Za eine divalente Einheit aus der Gruppe O, S, CO, CS, C(O)O, C(O)S, SO, SO2, NRd, C(O)NRd oder SO2NRd; Zb, Zc gleich oder verschieden eine direkte Bindung oder eine divalente Einheit aus der Gruppe O, S, CO, CS, C(O)O, C(O)S, SO, SO2, NRd, SO2NRd oder C(O)NRd; Rd Wasserstoff, (C1-C4)-Alkyl oder (C1-C4)-Haloalkyl; n eine ganze Zahl von 0 bis 4, und m für den Fall, dass X für CH steht, eine ganze Zahl von 0 bis 5, und für den Fall, dass X für N steht, eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeuten;
    • e) Verbindungen von Typ der Acylsulfamoylbenzoesäureamide, z.B. der nachfolgenden Formel (VI), die z.B. bekannt sind aus WO 99/16744,
      Figure 00130001
      z.B. solche worin R21 = Cyclo-Propyl und R22 = H ist (S3-1 = 4-Cyclopopylaminocarbonyl-N-(2 methoxybenzoyl)benzolsulfonamid), R21 = Cyclo-Propyl und R22 = 5-Cl ist (S3-2), R21 = Ethyl und R22 = H ist (S3-3), R21 = iso-Propyl und R22 = 5-Cl ist (S3-4) und R21 = iso-Propyl und R22 = H ist (S3-5);
    • f) Verbindungen vom Typ der N-Acylsulfamoylphenylharnstoffe der Formel (VII), die z.B. bekannt sind aus der EP-A-365484,
      Figure 00130002
      worin A für einen Rest aus der Gruppe
      Figure 00140001
      Rα und Rβ unabhängig voneinander für Wasserstoff, C1-C8-Alkyl, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C6 Alkenyl, C3-C6-Alkinyl,
      Figure 00140002
      Rα und Rβ gemeinsam für eine C4-C6-Alkylenbrücke oder eine durch Sauerstoff, Schwefel, SO, SO2, NH oder -N(C1-C4-Alkyl)- unterbrochene C4-C6-Alkylenbrücke, Rγ für Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl, Ra und Rb unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Cyan, Nitro, Trifluormethyl, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, C1-C4-Alkylthio, C1-C4-Alkylsulfinyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, -COORj, -CONRkRm, -CORn, -SO2NRkRm oder -OSO2-C1-C4-Alkyl, oder Ra und Rb gemeinsam für eine C3-C4-Alkylenbrücke, die durch Halogen oder C1-C4-Alkyl substituiert sein kann, oder eine C3-C4-Alkenylenbrücke, die durch Halogen oder C1-C4-Alkyl substituiert sein kann, oder eine C4-Alkadienylenbrücke, die durch Halogen oder C1-C4-Alkyl substituiert sein kann, und Rg und Rh unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, Trifluormethyl, Methoxy, Methylthio oder -COORj stehen, wobei Rc Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl oder Methoxy, Rd Wasserstoff, Halogen, Nitro, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, C1-C4-Alkylthio, C1-C4-Alkylsulfinyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, -COORj oder -CONRkRm, Re Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, -COORj, Trifluormethyl oder Methoxy, oder Rd nd Re gemeinsam für eine C3-C4-Alkylenbrücke, Rf Wasserstoff, Halogen oder C1-C4-Alkyl, RX und RY unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, C1-C4-Alkylthio, -COOR4, Trifluormethyl, Nitro oder Cyan, Rj, Rk und Rm unabhängig voneinander Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl, Rk und Rm gemeinsam eine C4-C6-Alkylenbrücke oder eine durch Sauerstoff, NH oder -N(C1-C4-Alkyl)- unterbrochene C4-C6-Alkylenbrücke, und Rn C1-C4-Alkyl, Phenyl oder durch Halogen, C1-C4-Alkyl, Methoxy, Nitro oder Trifluormethyl substituiertes Phenyl bedeuten, bevorzugt 1-[4-(N-2-Methoxybenzoylsulfamoyl)phenyl]-3-methylharnstoff, 1-[4-(N-2-Methoxybenzoylsulfamoyl)phenyl]-3,3-dimethylharnstoff, 1-[4-(N-4,5-Dimethylbenzoylsulfamoyl)phenyl]-3-methylharnstoff, 1-[4-(N-Naphthoylsulfamoyl)phenyl]-3,3-dimethylharnstoff,
    • g) Verbindungen vom Typ der Acylsulfamoylbenzoesäureamide der Formel (VIII), bekannt aus EP-A-1019368, gegebenenfalls auch in Salzform,
      Figure 00150001
      worin R1 bedeutet Methyl, Methoxy oder Trifluormethoxy; R2 bedeutet Wasserstoff, Chlor oder Methyl; R3 bedeutet Wasserstoff, Ethyl oder Propargyl; R4 bedeutet Ethyl, Cyclopropyl, iso-Propyl oder Propargyl, oder R3 und R4 bilden gemeinsam die Gruppe (CH2)4, einschließlich der Stereoisomeren und der in der Landwirtschaft gebräuchlichen Salze.
  • Die Verbindungen der Formel (I) sind z.B. aus EP-A-0 333 131 (ZA-89/1960), EP-A-0 269 806 (US-A-4,891,057), EP-A-0 346 620 (AU-A-89/34951), EP-A-0 174 562, EP-A-0 346 620 (WO-A-91/08 202), WO-A-91/07 874 oder WO-A 95/07 897 (ZA 94/7120) und der dort zitierten Literatur bekannt oder können nach oder analog den dort beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
  • Die Verbindungen der Formel (II) sind aus EP-A-0 086 750, EP-A-0 94349 (US-A-4,902,340), EP-A-0 191736 (US-A-4,881,966) und EP-A-0 492 366 und dort zitierter Literatur bekannt oder können nach oder analog den dort beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Einige Verbindungen sind ferner in EP-A-0 582 198 und WO 2002/34048 beschrieben.
  • Die Verbindungen der Formel (III) sind aus zahlreichen Patentanmeldungen bekannt, beispielsweise US-A-4,021,224 und US-A-4,021,229.
  • Verbindungen der Gruppe (b) sind weiterhin aus CN-A-87/102 789, EP-A-365484 sowie aus "The Pesticide Manual", The British Crop Protection Council and the Royal Society of Chemistry, 11th edition, Farnham 1997, bekannt.
  • Die Verbindungen der Gruppe (c) sind in der WO-A-97/45016, die der Gruppe (d) in der WO-A-99/16744, die der Gruppe B (e) in der EP-A-365484 und die der Gruppe (g) in EP-A-1019368 beschrieben.
  • Die zitierten Schriften enthalten ausführliche Angaben zu Herstellungsverfahren und Ausgangsmaterialien und nennen bevorzugte Verbindungen. Auf diese Schriften wird ausdrücklich Bezug genommen, sie gelten durch Zitat als Bestandteil dieser Beschreibung.
  • Bevorzugt sind als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I) und/oder (II) bei denen die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C18)-Alkyl, (C3-C12)-Cycloalkyl, (C2-C8)-Alkenyl und (C2-C18)Alkinyl, wobei die C-haltigen Gruppen durch einen oder mehrere, vorzugsweise bis zu drei, Reste R50 substituiert sein können;
    R50 ist gleich oder verschieden Halogen, Hydroxy, (C1-C8)-Alkoxy, (C1-C8)Alkylthio, (C2-C8)Alkenylthio, (C2-C8)Alkinylthio, (C2-C8)Alkenyloxy, (C2-C8)Alkinyloxy, (C3-C7)Cycloalkyl, (C3-C7)Cycloalkoxy, Cyano, Mono- und Di-(C1-C4)-alkyl)-amino, Carboxy, (C1-C8)Alkoxycarbonyl, (C2-C8)Alkenyloxycarbonyl, (C1-C8)Alkylthiocarbonyl, (C2-C8)Alkinyloxycarbonyl, (C1-C8)Alkylcarbonyl, (C2-C8)Alkenylcarbonyl, (C2-C8)Alkinylcarbonyl, 1-(Hydroxyimino)-(C1-C6)-alkyl, 1-[(C1-C4)Alkylimino]-(C1-C4)-alkyl, 1-[(C1-C4)Alkoxyimino]-(C1-C6)-alkyl, (C1-C8)Alkylcarbonylamino, (C2-C8)Alkenylcarbonylamino, (C2-C8)Alkinylcarbonylamino, Aminocarbonyl, (C1-C8)Alkylaminocarbonyl, Di-C1-C6)-alkylaminocarbonyl, (C2-C6)Alkenylaminocarbonyl, (C2-C6)Alkinylaminocarbonyl, (C1-C8)Alkoxycarbonylamino, (C1-C8)Alkylaminocarbonylamino, (C1-C6)Alkylcarbonyloxy, das unsubstituiert oder durch R51 substituiert ist, (C2-C6)Alkenylcarbonyloxy, (C2-C6)Alkinylcarbonyloxy, (C1-C8)Alkylsulfonyl, Phenyl, Phenyl-(C1-C6)-alkoxy, Phenyl-(C1-C6)-alkoxycarbonyl, Phenoxy, Phenoxy-(C1-C6)-alkoxy, Phenoxy-(C1-C6)-alkoxycarbonyl, Phenylcarbonyloxy, Phenylcarbonylamino, Phenyl-(C1-C6)-alkylcarbonylamino, wobei die letztgenannten 9 Reste im Phenylring unsubstituiert oder ein- oder mehrfach, vorzugsweise bis zu dreifach durch Reste R52 substituiert sind; SiR'3, -O-SiR'3, R'3Si-(C1-C8)-alkoxy, -CO-O-NR'2, -O-N=CR'2, -N=CR'2, -O-NR'2, -NR'2, CH(OR')2, -O-(CH2)m -CH(OR')2, -CR'''(OR')2, -O-(CH2)mCR'''(OR'')2 oder durch R''O-CHR'''CHCOR''-(C1-C6)-alkoxy,
    R51 ist gleich oder verschieden Halogen, Nitro, (C1-C4)Alkoxy und unsubstituiertes oder mit einem oder mehreren, vorzugsweise bis zu drei Resten R52 substituiertes Phenyl;
    R52 ist gleich oder verschieden Halogen, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)-Haloalkoxy oder Nitro;
    R' ist gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere, vorzugsweise bis zu drei, Reste R52 substituiertes Phenyl oder zwei Reste R' bilden zusammen eine (C2-C6)Alkandiylkette;
    R'' ist gleich oder verschieden (C1-C4)Alkyl oder zwei Reste R'' bilden zusammen eine (C2-C6)Alkandiylkette;
    R''' ist Wasserstoff oder (C1-C4)Alkyl;
    m ist 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6.
  • Besonders bevorzugt sind als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I) und/oder (II), bei denen die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl oder (C3-C7)Cycloalkyl, wobei die vorstehenden C-haltigen Reste unsubstituiert sind oder ein- oder mehrfach durch Halogen oder ein- oder zweifach, vorzugsweise einfach, durch Reste R50 substituiert sind,
    R50 ist gleich oder verschieden Hydroxy, (C1-C4)Alkoxy, Carboxy, (C1-C4)Alkoxycarbonyl, (C2-C6)Alkenyloxycarbonyl, (C2-C6)Alkinyloxycarbonyl, 1-(Hydroxyimino)-(C1-C4)-alkyl, 1-[(C1-C4)Alkylimino]-(C1-C4)-alkyl und 1-[(C1-C4)Alkoxyimino]-(C1-C4)-alkyl; -SiR'3, -O-N=CR'2, -N=CR'2, -NR'2, und -O-NR'2, worin R' gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl oder paarweise eine (C4-C5)Alkandiylkette bedeutet,
    R27, R28, R29 sind gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C6)Haloalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder Phenyl, das unsubstituiert oder durch einen oder mehrere der Reste aus der Gruppe Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Mono- und Di-[(C1-C4)alkyl]-amino, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Haloalkoxy, (C1-C4)Alkylthio und (C1-C4)Alkylsulfonyl substituiert ist;
    Rx ist Wasserstoff oder COOR24, worin R26 Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl, (C1-C4-Alkoxy)-(C1-C4)-alkyl, (C1-C6)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder Tri-(C1-C4)-alkylsilyl bedeutet,
    R17, R19 sind gleich oder verschieden Halogen, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, (C1 oder C2)-Haloalkyl, vorzugsweise Wasserstoff, Halogen oder (C1 oder C2)-Haloalkyl.
  • Ganz besonders bevorzugt sind als Safener bekannte Verbindungen in welchen die Symbole und Indizes in Formel (I) folgende Bedeutungen haben:
    R17 ist Halogen, Nitro oder (C1-C4)Haloalkyl;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3;
    R18 ist ein Rest der Formel OR24,
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl oder (C3-C7)Cycloalkyl, wobei die vorstehenden C-haltigen Reste unsubstituiert sind oder ein- oder mehrfach, vorzugsweise bis zu dreifach, durch gleiche oder verschiedene Halogen-Reste oder bis zu zweifach, vorzugsweise einfach, durch gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Hydroxy, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Alkoxycarbonyl, (C2-C6)Alkenyloxycarbonyl, (C2-C6)Alkinyloxycarbonyl, 1-(Hydroxyimino)-(C1-C4)-alkyl, 1-[(C1-C4)Alkylimino]-(C1-C4)-alkyl, 1-[(C1-C4)Alkoxyimino]-(C1-C4)-alkyl und Reste der Formeln -SiR'3, -O-N=R'2, -N=CR'2, -NR'2 und -O-NR'2 substituiert sind, wobei die Reste R' in den genannten Formeln gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl oder paarweise (C4 oder C5)Alkandiyl bedeuten;
    R27, R28, R29 sind gleich oder verschieden Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C6)Haloalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder Phenyl, das unsubstituiert oder durch einen oder mehrere der Reste aus der Gruppe Halogen, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, Nitro, (C1-C4)Haloalkyl und (C1-C4)Haloalkoxy substituiert ist, und
    RX ist Wasserstoff oder COOR26, worin R26 Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl, (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)-alkyl, (C1-C6)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder Tri-(C1-C4)-alkylsilyl ist.
  • Ganz besonders bevorzugt sind auch als Safener bekannte Verbindungen der Formel (II), bei denen die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    R19 ist Halogen oder (C1-C4)Haloalkyl;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3, wobei (R19)n, vorzugsweise 5-Cl ist;
    R20 ist ein Rest der Formel OR24;
    T ist CH2 oder CH(COO-(C1-C3-Alkyl)) und
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl oder (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)-alkyl, vorzugsweise Wasserstoff oder (C1-C8)Alkyl.
  • Insbesondere bevorzugt sind dabei als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I) bei denen die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    W ist (W1);
    R17 ist Halogen oder (C1-C2)Haloalkyl;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3, wobei (R17)n' vorzugsweise 2,4-Cl2 ist;
    R18 ist ein Rest der Formel OR24;
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl, (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)-alkyl oder Tri-(C1-C2)-alkylsilyl, vorzugsweise (C1-C4)Alkyl;
    R27 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C8)Haloalkyl oder (C3-C7)Cycloalkyl, vorzugsweise Wasserstoff oder (C1-C4)Alkyl, und
    Rx ist COOR26, worin R26 Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl, (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)-alkyl oder Tri-(C1-C2)-alkylsilyl, vorzugsweise Wasserstoff oder (C1-C4)Alkyl ist.
  • Insbesondere bevorzugt sind auch als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I), worin die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    W ist (W2);
    R17 ist Halogen oder (C1-C2)Haloalkyl;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3, wobei (R17)n' vorzugsweise 2,4-Cl2 ist;
    R18 ist ein Rest der Formel OR24;
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl, (C1-C4-Alkoxy)-C1-C4-alkyl oder Tri-(C1-C2)-alkyl-silyl, vorzugsweise (C1-C4)Alkyl, und
    R27 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl, vorzugsweise Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl oder Phenyl, das unsubstituiert oder durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe Halogen, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, Nitro, Cyano oder (C1-C4)Alkoxy substituiert ist.
  • Insbesondere bevorzugt sind auch als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I), worin die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
    W ist (W3);
    R17 ist Halogen oder (C1-C2)Haloalkyl;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3, wobei (R17)n' vorzugsweise 2,4-Cl2 ist;
    R18 ist ein Rest der Formel OR24;
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C8)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C1-C4)Hydroxyalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl, (C1-C4)Alkoxy-(C1-C4)-alkyl oder Tri-(C1-C2)-alkylsilyl, vorzugsweise (C1-C4)Alkyl, und
    R28 ist (C1-C8)Alkyl oder (C1-C4)Haloalkyl, vorzugsweise C1-Haloalkyl.
  • Insbesondere bevorzugt sind auch als Safener bekannte Verbindungen der Formel (I), worin die Symbole und Indizes folgende Bedeutung haben:
    W ist (W4);
    R17 ist Halogen, Nitro, (C1-C4)Alkyl, (C1-C2)Haloalkyl, vorzugsweise CF3, oder (C1-C4)Alkoxy;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3;
    m' ist 0 oder 1;
    R18 ist ein Rest der Formel OR24;
    R24 ist Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, Carboxy-(C1-C4)-alkyl, (C1-C4)Alkoxycarbonyl-(C1-C4)-alkyl, vorzugsweise (C1-C4)Alkoxy-CO-CH2-, (C1-C4)Alkoxy-CO-C(CH3)H-, HO-CO-CH2- oder HO-CO-C(CH3)H-, und
    R29 ist Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, (C3-C7)Cycloalkyl oder Phenyl, das unsubstituiert oder durch einen oder mehrere der Reste aus der Gruppe Halogen, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Haloalkyl, Nitro, Cyano und (C1-C4)Alkoxy substituiert ist.
  • Folgende Gruppen von als Safener bekannte Verbindungen sind insbesondere als Wirkstoffe für die Erhöhung der Toleranz von Pflanzen gegenüber abiotischen Stressoren geeignet:
    • a) Verbindungen vom Typ der Dichlorphenylpyrazolin-3-carbonsäure (d.h. der Formel (I), worin W = (W1) und (R17)n' = 2,4-Cl2), vorzugsweise Verbindungen wie 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(ethoxycarbonyl)-5-methyl-2-pyrazolin-3-carbonsäureethylester (I-1, Mefenpyr-diethyl), Mefenpyr-dimethyl und Mefenpyr (I-0), und verwandte Verbindungen, wie sie in der WO-A 91/07874 beschrieben sind;
    • b) Derivate der Dichlorphenylpyrazolcarbonsäure (d.h. der Formel (I), worin W = (W2) und (R17)n' = 2,4-Cl2 ist), vorzugsweise Verbindungen wie 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-methyl-pyrazol-3-carbonsäureethylester (I-2), 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-isopropyl-pyrazol-3-carbonsäureethylester (I-3), 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(1,1-dimethyl-ethyl)pyrazol-3-carbonsäureethylester (I-4), 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-phenyl-pyrazol-3-carbonsäureethylester (I-5) und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-0 333 131 und EP-A-0 269 806 beschrieben sind;
    • c) Verbindungen vom Typ der Triazolcarbonsäuren (d.h. der Formel (I), worin W = (W3) und (R17)n' = 2,4-Cl2 ist), vorzugsweise Verbindungen wie Fenchlorazol-ethyl, d.h. 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-trichlormethyl-(1H)-1,2,4-triazol-3-carbonsäureethylester (I-6), und verwandte Verbindungen (siehe EP-A-0 174 562 und EP-A-0 346 620);
    • d) Verbindungen vom Typ der 5-Benzyl- oder 5-Phenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäure oder der 5,5-Diphenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäure wie Isoxadifen (I-12), (worin W = (W4) ist), vorzugsweise Verbindungen wie 5-(2,4-Dichlorbenzyl)-2-isoxazolin-3-carbonsäureethylester (I-7) oder 5-Phenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäureethylester (I-8) und verwandte Verbindungen, wie sie in WO-A-91/08202 beschrieben sind, oder der 5,5-Diphenyl-2-isoxazolin carbonsäureethylester (I-9, Isoxadifen-ethyl) oder -n-propylester (I-10) oder der 5-(4-Fluorphenyl)-5-phenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäureethylester (I-11), wie sie in der WO-A-95/07897 beschrieben sind.
    • e) Verbindungen vom Typ der 8-Chinolinoxyessigsäure, z.B. solche der Formel (II), worin (R19)n' = 5-Cl, R20 = OR24 und T = CH2 ist, vorzugsweise die Verbindungen (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-(1-methylhexyl)-ester (II-1, Cloquintocetmexyl), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-(1,3-dimethyl-but-1-yl)-ester (II-2), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-4-allyl-oxy-butylester (II-3), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-1-allyloxy-prop-2-ylester (II-4), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäureethylester (II-5), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäuremethylester (II-6), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäureallylester (II-7), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-2-(2-propyliden-iminoxy)-1-ethylester (II-8), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure-2-oxo-prop-1-ylester (II-9), (5-Chlor-8-chinolinoxy)essigsäure (II-10) und dessen Salze wie sie z.B. in der WO-A-2002/34048 beschrieben sind, und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-0 860 750, EP-A-0 094 349 und EP-A-0 191 736 oder EP-A-0 492 366 beschrieben sind.
    • f) Verbindungen vom Typ der (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäure, d.h. der Formel (II), worin (R19)n' = 5-Cl, R20 = OR24, T = -CH(COO-Alkyl)- ist, vorzugsweise die Verbindungen (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäurediethylester (II-11), (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäurediallylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäure-methyl-ethylester und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-0 582 198 beschrieben sind.
    • g) Verbindungen vom Typ der Dichloracetamide, d.h. der Formel (III), vorzugsweise: N,N-Diallyl-2,2-dichloracetamid (Dichlormid (III-1), aus US-A 4,137,070), 4-Dichloracetyl-3,4-dihydro-3-methyl-2H-1,4-benzoxazin (IV-2, Benoxacor, aus EP 0 149 974 ), N1,N2-Diallyl-N2-dichloracetylglycinamid (DKA-24 (III-3), aus HU 2143821), 4-Dichloracetyl-1-oxa-4-aza-spiro[4,5]decan (AD-67), 2,2-Dichlor-N-(1,3-dioxolan-2-ylmethyl)-N-(2-propenyl)acetamid (PPG-1292), 3-Dichloracetyl-2,2,5-trimethyloxazolidin (R-29148, III-4), 3-Dichloracetyl-2,2-dimethyl-5-phenyloxazolidin, 3-Dichloracetyl-2,2-dimethyl-5-(2-thienyl)oxazolidin, 3-Dichloracetyl-5-(2-furanyl)-2,2-dimethyloxazolidin (Furilazole (III-5), MON 13900), 1-Dichloracetyl-hexahydro-3,3,8a-trimethylpyrrolo[1,2-a]pyrimidin-6(2H)-on (Dicyclonon, BAS 145138),
    • h) Verbindungen der Gruppe (b), vorzugsweise 1,8-Naphthalsäureanhydrid (b-1), Methyl-diphenylmethoxyacetat (b-2), Cyanomethoxyimino(phenyl)acetonitril (Cyometrinil) (b-3), 1-(2-Chlorbenzyl)-3-(1-methyl-1-phenylethyl)harnstoff (Cumyluron) (b-4), O,O-Diethyl S-2-ethylthioethyl phosphordithioat (Disulfoton) (b-5), 4-Chlorphenyl-methylcarbamat (Mephenate) (b-6), O,O-Diethyl-O-phenylphosphorotioat (Dietholate) (b-7), 4-Carboxy-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-essigsäure (CL-304415, CAS-Regno: 31541-57-8) (b-8), 1,3-Dioxolan-2-ylmethoxyimino(phenyl)acetonitril (Oxabetrinil) (b-9), 4'-Chlor-2,2,2-trifluoracetophenon O-1,3-dioxolan-2-ylmethyloxim (Fluxofenim) (b-10), 4,6-Dichlor-2-phenylpyrimidin (Fenclorim) (b-11), Benzyl-2-chlor-4-trifluormethyl-1,3-thiazol-5-carboxylat (Flurazole) (b-12), 2-Dichlormethyl-2-methyl-1,3-dioxolan (MG-191) (b-13), N-(4-Methylphenyl)-N'-(1-methyl-1-phenylethyl)harnstoff (Dymron) (b-14), (2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure (2,4-D), (4-Chlorphenoxy)essigsäure, (R,S)-2-(4-Chlor-o-tolyloxy)propionsäure (Mecoprop), 4-(2,4-Dichlorphenoxy)buttersäure (2,4-DB), (4-Chlor-o-tolyloxy)essigsäure (MCPA), 4-(4-Chlor-o-tolyloxy)buttersäure, 4-(4-Chlorphenoxy)buttersäure, 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoesäure (Dicamba), 1-(Ethoxycarbonyl)ethyl 3,6-dichlor-2-methoxybenzoat (Lactidichlor) sowie deren Salze und Ester, vorzugsweise (C1-C8).
  • Bevorzugt sind weiterhin als Safener bekannte Verbindungen der Formel (IV) oder deren Salze, worin
    R30 Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl, Furanyl oder Thienyl, wobei jeder der letztgenannten 4 Reste unsubstituiert oder durch einen oder mehrere Substituenten aus der Gruppe Halogen, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen-(C1-C6)-alkoxy und (C1-C4)-Alkylthio und im Falle cyclischer Reste auch (C1-C4)-Alkyl und (C1-C4)-Haloalkyl substituiert ist,
    R31 Wasserstoff,
    R32 Halogen, Halogen-(C1-C4)-alkyl, Halogen-(C1-C4)-alkoxy, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkoxy, (C1-C4)-Alkylsulfonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl oder (C1-C4)-Alkylcarbonyl,
    vorzugsweise Halogen, (C1-C4)-Halogenalkyl, wie Trifluormethyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen-(C1-C4)-alkoxy, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl oder (C1-C4)-Alkylsulfonyl,
    R33 Wasserstoff,
    R34 Halogen, (C1-C4)-Alkyl, Halogen-(C1-C4)-alkyl, Halogen-(C1-C4)-alkoxy, (C3-C6)-Cycloalkyl, Phenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Cyano, (C1-C4)-Alkylthio, (C1-C4)-Alkylsulfinyl, (C1-C4)-Alkylsulfonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl oder (C1-C4)-Alkylcarbonyl,
    vorzugsweise Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Halogenalkyl, wie Trifluormethyl, Halogen-(C1-C4)-alkoxy, (C1-C4)-Alkoxy oder (C1-C4)-Alkylthio,
    n 0, 1 oder 2 und
    m 1 oder 2 bedeuten.
  • Besonders bevorzugt sind als Safener bekannte Verbindungen der Formel (IV), worin
    R30 = H3C-O-CH2-, R31 = R33 = H, R34 = 2-OMe ist (IV-1),
    R30 = H3C-O-CH2-, R31 = R33 = H, R34 = 2-OMe-5-Cl ist (IV-2),
    R30 = Cyclopropyl, R31 = R33 = H, R34 = 2-OMe ist (IV-3),
    R30 = Cyclopropyl, R31 = R33 = H, R34 = 2-OMe-5-Cl ist (IV-4),
    R30 = Cyclopropyl, R31 = R33 = H, R34 = 2-Me ist (IV-5),
    R30 = tert. Butyl, R31 = R33 = H, R34 = 2-OMe ist (IV-6).
  • Weiterhin bevorzugt sind als Safener bekannte Verbindungen der Formel (V), in der X3 CH;
    R35 Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C5-C6)-Cycloalkenyl, Phenyl oder 3- bis 6-gliedriges Heterocyclyl mit bis zu drei Heteroatomen aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, wobei die sechs letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Halogen, (C1-C6)-Alkoxy, (C1-C6)-Haloalkoxy, (C1-C2)-Alkylsulfinyl, (C1-C2)-Alkylsulfonyl, (C3-C6)-Cycloalkyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl, (C1-C4)-Alkylcarbonyl und Phenyl und im Falle cyclischer Reste auch (C1-C4)-Alkyl und (C1-C4)-Haloalkyl substituiert sind;
    R36 Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C2-C6)-Alkinyl, wobei die drei letztgenannten Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Halogen, Hydroxy, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkoxy und (C1-C4)-Alkylthio substituiert sind;
    R37 Halogen, (C1-C4)-Haloalkyl, (C1-C4)-Haloalkoxy, Nitro, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkoxy, (C1-C4)-Alkylsulfonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl oder (C1-C4)-Alkylcarbonyl;
    R38 Wasserstoff;
    R39 Halogen, Nitro, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Haloalkyl, (C1-C4)-Haloalkoxy, (C3-C6)-Cycloalkyl, Phenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Cyano, (C1-C4)-Alkylthio, (C1-C4)- Alkylsulfinyl, (C1-C4)-Alkylsulfonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl oder (C1-C4)-Alkylcarbonyl;
    n 0, 1 oder 2 und
    m 1 oder 2
    bedeuten.
  • Bevorzugte als Safener bekannte Verbindungen der Formel (VI) sind (S3-1), (S3-2), (S3-3), (S3-4) und (S3-5).
  • Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (VII) sind
    1-[4-(N-2-Methoxybenzoylsulfamoyl)phenyl]-3-methylharnstoff (VII-1),
    1-[4-(N-2-Methoxybenzoylsulfamoyl)phenyl]-3,3-dimethylharnstoff (VII-2),
    1-[4-(N-4,5-Dimethylbenzoylsulfamoyl)phenyl]-3-methylharnstoff (VII-3) und
    1-[4-(N-Naphthoylsulfamoyl)phenyl]-3,3-dimethylharnstoff (VII-4).
  • Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen der Formeln VIII-1 bis VIII-4
    Figure 00270001
    von denen wiederum die Verbindung VIII-3 (4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide) zur Verwendung als Mittel zur Toleranzerhöhung bei Pflanzen gegenüber abiotischen Stressoren ganz besonders bevorzugt ist.
  • Besonders bevorzugte Verbindungen zur Verwendung als Mittel zur Toleranzerhöhung bei Pflanzen gegenüber abiotischen Stressoren sind solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe von als Safener bekannten Verbindungen bestehend aus den Verbindungen der Formeln I-1 (Mefenpyr-diethyl), I-9 (Isoxadifen-ethyl), II-1 (Chloquintocet-mexyl), b-11 (Fenclorim), b-14 (Dymron), und VIII-3 (4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide, ganz besonders bevorzugt sind die Verbindungen I-1 und VIII-3).
  • Die zuvor identifzierten/genannten unter Umständen bereits als Safener bekannten Verbindungen können auch in gentechnisch veränderten Pflanzen eingesetzt werden.
  • Die gentechnisch veränderten (auch transgen genannt) Pflanzen zeichnen sich in der Regel durch besondere vorteilhafte Eigenschaften aus, beispielsweise durch Resistenzen gegenüber bestimmten Pestiziden, vor allem bestimmten Herbiziden, Resistenzen gegenüber Pflanzenkrankheiten oder Erregern von Pflanzenkrankheiten wie bestimmten Insekten oder Mikroorganismen wie Pilzen, Bakterien oder Viren. Andere besondere Eigenschaften betreffen z.B. das Erntegut hinsichtlich Menge, Qualität, Lagerfähigkeit, Zusammensetzung und spezieller Inhaltsstoffe. So sind transgene Pflanzen mit erhöhtem Stärkegehalt oder veränderter Qualität der Stärke oder solche mit anderer Fettsäurezusammensetzung des Ernteguts bekannt.
  • Bevorzugt ist die Anwendung der identifizierten/genannten als Safener bekannten Verbindungen oder deren Salze in wirtschaftlich bedeutenden transgenen Kulturen von Nutz-und Zierpflanzen, z.B. von Getreide wie Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Hirse, Reis und Mais oder auch Kulturen von Zuckerrübe, Baumwolle, Soja, Raps, Kartoffel, Tomate, Erbse und anderen Gemüsesorten, besonders bevorzugt in Kulturen von Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Raps, Zuckerrübe und Soja, ganz besonders bevorzugt in Kulturen von Mais, Weizen, Reis, Raps, Zuckerrübe und Soja.
  • Daneben können auch transgene Pflanzen mit mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierten Substanzen wie auch der bereits als Safener bekannten Moleküle behandelt werden, deren Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren bereits durch gentechnische Maßnahmen erhöht worden ist, so dass eine synergistische Wirkung der endogen kodierten Toleranz und der exogen applizierten toleranzsteigernden Wirkung beobachtet wird.
  • Herkömmliche Wege zur Herstellung neuer Pflanzen, die im Vergleich zu bisher vorkommenden Pflanzen modifizierte Eigenschaften aufweisen, bestehen beispielsweise in klassischen Züchtungsverfahren und der Erzeugung von Mutanten. Alternativ können neue Pflanzen mit veränderten Eigenschaften mit Hilfe gentechnischer Verfahren erzeugt werden (siehe z.B. EP-A-0221044, EP-A-0131624). Beschrieben wurden beispielsweise in mehreren Fällen
    • – gentechnische Veränderungen von Kulturpflanzen zwecks Modifikation der in den Pflanzen synthetisierten Stärke (z.B. WO 92/11376, WO 92/14827, WO 91/19806),
    • – transgene Kulturpflanzen, welche gegen bestimmte Herbizide vom Typ Glufosinate (vgl. z.B. EP-A-0242236, EP-A-242246) oder Glyphosate (WO 92/00377) oder der Sulfonylharnstoffe (EP-A-0257993, US-A-5013659) resistent sind,
    • – transgene Kulturpflanzen, beispielsweise Baumwolle, mit der Fähigkeit Bacillus thuringiensis-Toxine (Bt-Toxine) zu produzieren, welche die Pflanzen gegen bestimmte Schädlinge resistent machen (EP-A-0142924, EP-A-0193259).
    • – transgene Kulturpflanzen mit modifizierter Fettsäurezusammensetzung (WO 91/13972).
  • Zahlreiche molekularbiologische Techniken, mit denen neue transgene Pflanzen mit veränderten Eigenschaften hergestellt werden können, sind im Prinzip bekannt; siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; oder Winnacker "Gene und Klone", VCH Weinheim 2. Auflage 1996 oder Christou, "Trends in Plant Science" 1 (1996) 423–431).
  • Für derartige gentechnische Manipulationen können Nucleinsäuremoleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe der obengenannten Standardverfahren können z.B. Basenaustausche vorgenommen, Teilsequenzen entfernt oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
  • Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität eines Genprodukts kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression mindestens einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressionseffektes oder die Expression mindestens eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte des obengenannten Genprodukts spaltet.
  • Hierzu können zum einen DNA-Moleküle verwendet werden, die die gesamte codierende Sequenz eines Genprodukts einschließlich eventuell vorhandener flankierender Sequenzen umfassen, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den codiereden Sequenzen eines Genprodukts aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind.
  • Bei der Expression von Nucleinsäuremolekülen in Pflanzen kann das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein. Um aber die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, kann z.B. die codierende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in einem bestimmten Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219–3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846–850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95–106).
  • Die transgenen Pflanzenzellen können nach bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h., sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen.
  • So sind transgene Pflanzen erhältlich, die veränderte Eigenschaften durch Überexpression, Suppression oder Inhibierung homologer (= natürlicher) Gene oder Gensequenzen oder Expression heterologer (= fremder) Gene oder Gensequenzen aufweisen.
  • Vorzugsweise können die mit Hilfe der DNA-Microarrays identifizierten oder aber als Safener bekannten Moleküle in transgenen Kulturen eingesetzt werden, welche gegen Herbizide aus der Gruppe der Sulfonylharnstoffe, Glufosinate-ammonium oder Glyphosate-isopropylammonium und analoge Wirkstoffe resistent sind und/oder auf der Basis gentechnischer Veränderung eine endogene Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren aufweisen.
  • Bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe in transgenen Kulturen treten neben den in anderen Kulturen zu beobachtenden Wirkungen gegenüber Schadpflanzen oftmals Wirkungen auf, die für die Applikation in der jeweiligen transgenen Kultur spezifisch sind, beispielsweise ein verändertes oder speziell erweitertes Unkrautspektrum, das bekämpft werden kann, veränderte Aufwandmengen, die für die Applikation eingesetzt werden können, vorzugsweise gute Kombinierbarkeit mit den Herbiziden, gegenüber denen die transgene Kultur resistent ist, sowie Beeinflussung von Wuchs und Ertrag der transgenen Kulturpflanzen.
  • Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der mit DNA-Microarrays identifizierten Verbindungen bzw. von bereits als Safener bekannten Verbindungen zur Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren in transgenen Kulturpflanzen, bevorzugt mit dem Ziel der Ertragssteigerung.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden einer die Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren bei Pflanzen erhöhenden Verbindung, wobei die Steigerung der Transkription bzw. Expression einzelner oder mehrerer, pflanzenendogener Gene wie beispielsweise Genen codierend für Proteine aus der Gruppe der Cytrochrom-Oxidasen, wie der Cytochromoxidase P450, Glycosyltransferasen, Uricasen, wie der Uricase II (E.C.17.3.3), Peptidasen, verschiedener Membranproteine, Amidohydrolasen, sowie verschiedener allgemeiner Stressproteine, als Indiz für die Induktion bewertet wird.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist im besonderen ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die die Transkription der für pflanzenendogene Enzyme der Stresstoleranz kodierenden Gene induzieren, dadurch gekennzeichnet, dass:
    • a) Testpflanzen einem oder mehreren abiotischen Stressoren ausgesetzt werden,
    • b) Kontrollpflanzen, unter ansonsten gleichen Bedingungen wie Testpflanzen unter a), zusätzlich mit einer zu testenden Verbindung in Kontakt gebracht werden, sei es in Form gebeizten Saatgutmaterials, oder der Besprühung zu einem bestimmten Entwicklungszeitpunkt oder durch Wurzelaufnahme,
    • c) RNA aus den Test- und Kontrollpflanzen extrahiert wird,
    • d) die RNA entweder direkt radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert wird, oder aber die RNA unter gleichzeitiger enzymatischer Umschreibung in die korrespondierende cDNA radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert wird, oder aber die erhaltene, nicht markierte cDNA enzymatisch in eine korrespondierende radioaktive oder nicht-radioaktive markierte cRNA umgeschrieben wird,
    • e) ein pflanzliche DNA-Sequenzen enthaltender DNA-Microarray mit den gemäß Schritt d) erhaltenen Substanzen hybridisiert wird,
    • f) Expressionsprofile der Gene für die Expression der verschiedener Stressproteine vergleichend für die gemäß a) und b) getesteten Pflanzen erstellt werden,
    • g) eine Quantifizierung der gemäß f) gemessenen Expressionsunterschiede erfolgt,
    • h) eine abschließende Systematisierung der gemäß g) zugeordneten Expressionsprofile durch Cluster-Analyse erfolgt.
  • Im Fall des zuvor genannten Schritts d) ist die enzymatische Umschreibung der erhaltenen cDNA in eine cRNA als bevorzugter Verfahrensschritt anzusehen, da hierdurch eine nochmalige Amplifikation der Hybridisierungsprobe erreicht werden kann. Ebenso bevorzugt ist die Markierung mittels nicht radioaktiver Nukleotide, besonders bevorzugt die Markierung mittels biotinyliertem UTP und/oder CTP, wobei der Nachweis im Anschluss an die erfolgte Hybridisierungsreaktion durch Bindung von Streptavidin-Phycoerythrin als Fluorophor and die biotinylierte cRNA erfolgt. Ein Nachweis der spezifischen Phycoerythrin-Fluoreszenz, die als Grundlage für die Quantifizierung der gemessenen Expressionsunterschiede dient, erfolgt im Anschluss an die Hybridisierung mit Hilfe eines Laser-Scanners.
  • Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren unter Einhalten der zuvor genannten Verfahrensabläufe a) – h), wobei im Fall der beabsichtigten Steigerung bei Hitzestress die Gene für die Expression der Cytrochrom-Oxidasen, wie der Cytochromoxidase P450, Glycosyltransferasen, Uricasen, wie der Uricase II (E.C.17.3.3), Peptidasen, verschiedener Membranproteine, Amidohydrolasen bei hitzegestressten und nicht hitzegestressten Pflanzen verglichen wird, bevorzugt der Gene die für die Expression der „N-carbamyl-L-amino acid Amidohydrolase" (Zm.11840.1.A1_at), der „Serine Carboxypeptidase (Zm.18994.2.A1_a_at), der Uricase II (E.C.1.7.3.3) und der Glycosyltransferase (Zm.12587.1.S1_s_at), ganz besonders bevorzugt der Gene für die Expression der „N-carbamyl-L-amino acid Amidohydrolase" (Zm.11840.1.A1_at) und der „Serine Carboxypeptidase (Zm.18994.2.A1_a_at) (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) und wobei die Genexpression gegenüber einer hitzegestressten Kontrollpflanze bei Behandlung mit beispielsweise um den Faktor 1.5 oder mehr, vorzugsweise um den Faktor 1.5 bis 30, bevorzugt 1.5 bis 20, besonders bevorzugt 1.5 bis 10, ganz besonders bevorzugt 1.5 bis 5, erhöht ist, wobei die Steigerung der geänderten Expressionsprofile der einzelnen Gene unabhängig voneinander in den unterschiedlichen zuvor benannten Größenbereichen liegen kann.
  • Ebenfalls bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren unter Einhalten der zuvor genannten Verfahrensabläufe a) – h), wobei im Fall der beabsichtigten Steigerung bei Trockenstress beispielsweise die Gene für die Expression des Late Embryogenesis Abundant Proteinen, wie den Dehydrinen, des Universal Stress Proteins (Zm.818.1.A1_at), Non-symbiotic hemoglobin (Zm.485.1.A1_at), des Proteins mit der Adressierung „Zm.818.2.A1_a_at" (Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) und des Proteins mit der Adressierung „Zm.18682.1.A1_s_at" (Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) bei durch Trockenheit gestressten und nicht Trockenheit gestressten Pflanzen verglichen wird, bevorzugt die Gene für die Expression des Universal Stress Proteins (Zm.818.1.A1_at), Non-symbiotic hemoglobin (Zm.485.1.A1_at), des Proteins mit der Adressierung „Zm.818.2.A1_a_at" (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) und des Proteins mit der Adressierung „Zm.18682.1.A1_s_at" (Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) und wobei die Genexpression gegenüber einer durch Trockenheit gestressten Kontrollpflanze bei Behandlung mit beispielsweise um den Faktor 1.5 oder mehr, vorzugsweise um den Faktor 1.5 bis 30, bevorzugt 1.5 bis 20, besonders bevorzugt 1.5 bis 10, ganz besonders bevorzugt 1.5 bis 8, erhöht ist, wobei die Steigerung der geänderten Expressionsprofile der einzelnen Gene unabhängig voneinander in den unterschiedlichen zuvor benannten Größenbereichen liegen kann.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter die Verwendung bestimmter DNA-Microarrays, die auf der Basis genetischer Informationen aus Pflanzen, bevorzugt genetischer Information aus Nutzpflanzen, besonders bevorzugt aus Nutzpflanzen wie beispielsweise aus Mais, Getreide, wie Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis und Soja, bevorzugt aus Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Reis und Soja, besonders bevorzugt aus Gerste, Mais, Weizen, Reis und Soja, ganz besonders bevorzugt aus Mais, Weizen und Soja zur Auffindung von geänderten Genexpressionsmustern benutzt werden. Dabei werden die relativen Veränderungen der Genmuster für Gene verschiedener Stressproteine in mit den zu testenden Verbindungen behandelten Pflanzen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollpflanzen unter ansonsten identischen Stressbedingungen betrachtet.
  • Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung der Promotoren der beschriebenen Indikatorgene in Verbindung mit speziellen Reportergenen (z.B. GUS, GFP, Luciferase etc) zum Auffinden von Substanzen mit positiver Wirkung auf die abiotische Stresstoleranz in Kulturpflanzen. Dabei werden transgene Testpflanzen erzeugt, welche die erwähnten Promoter-Reportergen-Konstrukte enthalten. Wirkstoffe welche die abiotische Stresstoleranz von Pflanzen nach dem beschriebenen Mechanismus erhöhen, induzieren die Expression des Reportergens und können mit Hilfe eines kolorimetrischen, fluorimetrischen oder sonstigen Assays identifiziet werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der beschriebenen Indikatorgene zur Steigerung der abiotischen Stresstoleranz in transgenen Kulturpflanzen. Dabei werden die Gene mit einem geeigneten Promoter, welcher die gewünschte Stärke und Spezifität besitzt fusioniert und die Konstrukte in monocotyle oder dicotyle Kulturpflanzen transformiert. Die erzeugten transgenen Pflanzen zeichnen sich durch eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Stress, z.B. Kälte, Hitze, Trockenheit etc. aus.
  • Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der Verbindungen die mit Hilfe des DNA-Microarrays unter Betrachtung der Expressionsprofile der Gene der identifiziert wurden und/oder bereits als Safener bekannter Verbindungen, die im Falle von abiotischen Stressbedingungen, wie beispielsweise gegenüber auf diese Pflanze einwirkenden abiotischem Stressoren, wie Temperatur (Kälte, Frost oder Hitze), Wasser (Trockenheit oder Dürre), oder die chemische Belastung (Mangel oder Überschuss an Mineralsalzen, Schwermetalle, gasförmige Noxen) positiv, d.h. expressionssteigernd hinsichtlich ihrer induktiven Wirkung auf einzelne oder mehren Gene der pflanzendogenen Abwehrmechanismen wirken, wie beispielsweise im Fall von Hitzestress auf Cytrochrom-Oxidasen, wie der Cytochromoxidase P450, auf Glycosyltransferasen, auf Uricasen, wie der Uricase II (E.C.17.3.3), auf Peptidasen, auf verschiedener Membranprotein, auf Amidohydrolasen und/oder verschiedene Stressproteine und/oder beispielsweise im Fall von Trockenstress positiv, d.h. expressionssteigernd hinsichtlich ihrer induktiven Wirkung auf einzelne oder mehrere Gene der universeller Stressproteine, Nonsymbiotic hemoglobin (Zm.485.1.A1_at), des Proteins mit der Adressierung „Zm.818.2.A1_a_at" (Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) und des Proteins mit der Adressierung „Zm.18682.1.A1_s_at" (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)) identifiziert wurden, als Wirkstoffe zur Steigerung der Stresstoleranz bei Nutzpflanzen.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von mit Hilfe des DNA-Microarrays identifizierten Substanzen wie auch der bereits als Safener bekannten Moleküle zur Toleranzerhöhung gegenüber abiotischen Stressoren in verschiedenen Kulturpflanzen, wie Mais, Getreide, wie Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis und Soja, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Reis und Soja, besonders bevorzugt Mais, Weizen, Reis und Soja, ganz besonders bevorzugt Mais, Weizen und Soja.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung von Verbindungen, die mit Hilfe des DNA-Microarrays unter Betrachtung der Expressionsprofile der Gene identifiziert wurden und/oder bereits als Safener bekannter Verbindungen, die in Pflanzen, direkt oder indirekt, wie beispielsweise durch eine Signaltransduktionskette, zur Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren, wie beispielsweise Temperatur (wie Kälte, Frost oder Hitze), Wasser (wie Trockenheit, Dürre oder Anoxia), oder die chemische Belastung (wie Mangel oder Überschuss an Mineralsalzen. Schwermetallen, gasförmigen Noxen) beitragen, zur Ertragssteigerung, zur Verlängerung der der Vegetationsperiode, zur Ermöglichung einer früheren Aussaat, zur Steigerung der Qualität, oder zur Verwendung im Rahmen der Züchtung unter Verwendung ansonsten weniger vitaler Inzucht-Linien.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Ertragssteigerung in Nutzpflanzenkulturen, zur Verlängerung der der Vegetationsperiode, zur Ermöglichung einer früheren Aussaat, zur Steigerung der Qualität, oder zur Verwendung im Rahmen der Züchtung unter Verwendung ansonsten weniger vitaler Inzucht-Linien dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanzen durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenapplikation mit einem oder mehreren Verbindungen, die mit Hilfe des DNA-Microarrays identifiziert wurden, und/oder bereits als Safener bekannten Verbindung behandelt werden.
  • Bevorzugt sind hierbei solche Verbindungen, die in ihrer Verwendung als sogenannte Safener bereits im Pflanzenschutz bekannt sind, wie beispielsweise, Safener bekannten Verbindungen bestehend aus den Verbindungen der Formeln I-1 (Mefenpyr-diethyl), I-9 (Isoxadifen-ethyl), II-1 (Chloquintocet-mexyl), b-11 (Fenclorim), b-14 (Dymron), VIII-3 (4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide), ganz besonders bevorzugt sind die Verbindungen I-1 und VIII-3 (4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide)).
  • Durch Applikation der zuvor genannten Verbindungen können Nutzpflanzen effektiv gegenüber den Auswirkungen abiotischer Stressoren geschützt werden, was sich z.B. auch in höheren Erträgen niederschlägt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren Erhöhung der Toleranz von Nutzpflanzen in Nutzpflanzenkulturen gegenüber abiotischen Stressoren durch Applikation der mit Hilfe des DNA-Microarrays unter Betrachtung der Expressionsprofile der Gene der identifizierten Verbindungen und/oder bereits als Safener bekannter Verbindungen.
    •
  • Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung im einzelnen.
  • Beispiel 1
  • Nachweis der Wirkung von Safenern auf Pflanzen, die gezielten Trockenstressbedingungen ausgesetzt waren, durch Gene Expression Profiling (GEP):
  • Abiotischer Stressor = Trockenstress
  • Mais-Samen der Sorte Lorenzo wurden mit der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide gebeizt.
  • Dazu wurden 10 g Samen mit 20 mg Wirkstoff gelöst in 2 ml Methylenchlorid unter leichtem Schütteln inkubiert, bis das Lösungsmittel abgedampft war (ca. 30 min.). Die Samen der Kontrollgruppe wurden lediglich mit Lösungsmittel gebeizt. Anschließend wurden die behandelten Samen in Töpfe mit Erde (Durchmesser: 10 cm, je 10 Samen pro Topf) ausgelegt und die Maiskeimlinge für 10 Tage in einer Klimakammer unter definierten Licht-, Feuchtigkeits- und Temperaturbedingungen [Weißlicht, Langtag (16 h hell, 8 h dunkel), 70 % Luftfeuchtigkeit, 24°C] angezogen. Es wurden je 2 × 10 Töpfe für die Kontrollgruppen und für den Trockenstress-Versuch verwendet. Während der Anzucht wurden die Pflanzen alle 2 Tage durch Anstauen von unten in einer Wanne für 20 min. bewässert. 10 Tage nach Auskeimen der Samen wurden die Maispflanzen dem Trockenstress ausgesetzt. Dazu wurden die Pflanzen der Kontrollgruppe 1 (ohne Wirkstoff-Beizung) und der Testgruppe (mit Wirkstoff-Beizung) nur noch alle 7 Tage wie oben beschrieben gewässert. Bei den Pflanzen der Kontrollgruppe 2 (ohne Wirkstoff-Beizung) und der Testgruppe 2 (mit Wirkstoff-Beizung) wurde das normale Bewässerungsschema beibehalten. Nach 3 Wochen Trockenstress-Bedingungen wurde der Versuch wie folgt ausgewertet. Die oberirdischen Pflanzenteile wurden abgeschnitten und über Nacht bei 50°C getrocknet. Am nächsten Tag wurde die Blattmasse pro Topf (Trockenmasse) in [g] bestimmt.
  • Die Messwerte wurden über die jeweils 10 Töpfe der Pflanzengruppe gemittelt. Die in der Tab. 1 angegebenen Zahlenwerte sind Relativwerte in [%] bezogen auf die Messergebnisse der Kontrollgruppe 2 (ohne Wirkstoff-Beizung, normales Bewässerungsschema).
    Figure 00390001
    Tabelle 1: Trockenstress-Versuch mit Maispflanzen ohne und mit Wirkstoff-Beizung
    • S = Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide),
    • T = Trockenstress
  • Die durchschnittliche Trockenmasse war bei Pflanzen aus ungebeizten und aus gebeizten Samen ohne Stressbedingungen gleich (Kontrollgruppe 2, Testgruppe 2).
  • Die Pflanzen aus der Gruppe mit Beizung mit der Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide) zeigten im Durchschnitt einen kompakteren Habitus als die Pflanzen der Kontrollgruppe, der sich aber nicht auf die Trockenmasse auswirkte. Unter Trockenstress war die durchschnittliche Blattmasse (Trockenmasse) der Safener-gebeizten Pflanzen gegenüber den ungebeizten Kontrollpflanzen jedoch signifikant erhöht (Kontrollgruppe 1, Testgruppe 1).
  • Beispiel 2
  • Abiotischer Stressor = Hitzestress
  • Mais-Samen der Sorte Lorenzo wurden wie in Beispiel 1 mit der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide gebeizt bzw. nur mit Lösungsmittel ohne Wirkstoff behandelt. Die Anzucht der Keimlinge erfolgte für 10 Tage in der Klimakammer unter definierten Bedingungen ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Für den Hitzestress-Versuch wurden 2 × 10 Töpfe mit Maispflanzen verwendet. Die Kontrollgruppe bestand aus ungebeizten Pflanzen (Lösungsmittel), die Testgruppe aus Safener-gebeizten Pflanzen.
  • Zur Applizierung der Hitzestress-Bedingungen wurden beide Pflanzengruppen für 2 Tage in einen Klimaschrank bei 45°C, Weißlicht, Langtag (16 h hell, 8 h dunkel) und 70 % Luftfeuchtigkeit gestellt. Um eine Austrocknung durch die hohe Temperatur zu vermeiden, wurden die Pflanzen 1 × pro Tag durch Anstauen von unten in einer Wanne bewässert. Nach dem Hitzestress konnte beobachtet werden, dass – besonders in der Kontrollgruppe – die Sprosse vieler Pflanzen umgeknickt waren und die Blätter flach auf dem Boden lagen.
  • Der Versuch wurde nach folgenden Kriterien quantitativ ausgewertet.
  • Nach der Hitze-Behandlung wurden die umgeknickten Pflanzen ausgezählt und das Ergebnis pro Topf bewertet:
    < 20 % der aufgelaufenen Pflanzen umgeknickt: schwache Schädigung O
    20–50 % der aufgelaufenen Pflanzen umgeknickt: mittlere Schädigung
    Figure 00400001

    > 50 % der aufgelaufenen Pflanzen umgeknickt: starke Schädigung •
  • Anschließend wurden alle Pflanzen für 2 Wochen unter Standard-Bedingungen weiter kultiviert. Dann wurde der Längenzuwachs der Einzelpflanzen gemessen und die Überlebensrate der Pflanzen pro Topf bestimmt:
    > 50 % Überlebensrate: schwache Schädigung O
    20–50 % Überlebensrate: mittlere Schädigung
    Figure 00410001

    < 20 % Überlebensrate: starke Schädigung •
  • Die Ergebnisse der Versuchsauwertung sind in Tab.2 zusammengefasst.
  • Die ungebeizten Kontrollpflanzen wurden durch den Hitzestress stark geschädigt. Auffallend waren insbesondere das Umknicken der Sprosse bei den meisten Pflanzen, sowie die geringe Überlebensrate. Die Safener-gebeizten Testpflanzen zeichneten sich besonders durch ein wesentlich besseres „Standing" aus. In der Endbonitur wurde zwar auch bei diesen Pflanzen die Schädigung durch den starken Hitzestress deutlich, die Überlebensrate war aber signifikant höher als in der Kontrollgruppe.
    Figure 00410002
    Tabelle 2: Trockenstress-Versuch mit Maispflanzen ohne und mit Wirkstoff-Beizung
    • S = Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide),
    • H = Hitzestress
  • Beispiel 3
  • Abiotischer Stressor = Kältestress (Gewächshaus)
  • Mais-Samen der Sorte Lorenzo wurden in 10 cm Töpfen in Erde mit je 10 Samen pro Topf ausgesät. Alle Versuchsgruppen bestanden aus jeweils 4 Töpfen. Die ausgesäten Samen der Testgruppen 1 und 2 wurden im Vorauflauf mit 50 bzw. 100 [g a.i./ha] der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide gespritzt. Die Samen der Kontrollgruppe blieben unbehandelt. Die Pflanzen wurden unter kontrollierten Bedingungen in der Klimakammer [Weißlicht (Langtag: 16 h hell, 8 h dunkel), 22°C Tagestemperatur, 14°C Nachttemperatur, 60 % Luftfeuchtigkeit] angezogen.
  • Nach der Keimung, wenn die Pflanzen eine Höhe von ca. 1 cm erreicht hatten, wurden 2 Töpfe aus jeder Gruppe für 6 h in einer anderen Klimakammer unter Kältestress-Bedingungen bei –2° C inkubiert. Anschließend wurden diese Pflanzen wieder zu den anderen in die erste Klimakammer gestellt.
  • Nach weiteren 24 h unter Standard-Bedingungen wurde der Versuch ausgewertet. Es konnte beobachtet werden, dass der Kältestress Chlorosen an den Blattspitzen der Keimlinge der unbehandelten Kontrollgruppe hervorrief. Diese Symptome waren an den Safener-behandelten Pflanzen gar nicht oder nur sehr eingeschränkt zu beobachten.
  • Alle Pflanzen der Testgruppen und der Kontrollgruppe, die ausschließlich unter Standard-Bedingungen ohne Kältestress gehalten wurden, zeigten keinerlei Schadsymptome.
  • Zur quantitativen Auswertung des Versuchs wurden die Pflanzen mit Aufhellungen an den Blattspitzen ausgezählt. Die Gesamtzahl der Pflanzen pro Versuchsgruppe und Kältestress-Behandlung war 20 verteilt auf je 2 Töpfe.
  • Die Ergebnisse der Versuchsauswertung sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • Figure 00430001
    Tabelle 3: Kältestress-Versuch (Gewächshaus) mit Maispflanzen ohne und mit Wirkstoff-Behandlung mit der Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide) im Vorauflauf. Alle Pflanzen waren Kältestress-Behandlung ausgesetzt. Die Gesamtzahl de Pflanzen pro Gruppe betrug 20.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Wirkstoff-Behandlung mit der Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide) die durch Kältestress entstehenden Schadsymptome deutlich reduzieren kann, bzw. in der höheren Dosierung das Auftreten dieser Symptome gänzlich verhindert.
  • Beispiel 4
  • Abiotischer Stressor = Kältestress (Freiland)
  • Mais-Samen (Dent Corn) wurden mit 0,003 mg und 0,03 mg der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide pro g Samen gebeizt und auf je 34 m2 großen Testparzellen ausgesät. Eine Kontrollparzelle enthielt ungebeiztes Saatgut. Ca. 8 Tage nach Auflaufen der Saat waren die Keimlinge im Einblatt-Stadium und waren für 5 Tage den folgenden Temperatur-Bedingungen ausgesetzt:
    Figure 00440001
  • Nach dieser Kälteperiode wurden die Versuchsparzellen bonitiert. Dabei wurden alle Pflanzen einzeln bewertet und Pflanzen mit mindestens 20 % Kältesymptomen bezogen auf die gesamte Blattfläche (Verbrennungen und/oder Chlorosen) als geschädigt bewertet.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. In der Kontrollparzelle ohne Safener-Beizung zeigten alle Pflanzen (100 %) die beschriebenen Kältesymptome. In den Testparzellen mit Safener-Beizung waren die Kälteschäden signifikant reduziert.
  • Hier konnten nur noch bei ca. 12 % der Pflanzen Schadsymptome beobachtet werden. Die maximale Frostschutzwirkung wurde im Größenbereich der in der Tabelle angegebenen Wirkstoff-Beizungsmengen erzielt.
    Figure 00440002
    Tabelle 4: Kältestress-Versuch (Freiland) mit Maispflanzen ohne und mit Wirkstoff-Beizung mit der Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide)
    • *: Anteil der Pflanzen mit Kälteschaden > 20 % bezogen auf die Gesamtzahl der Pflanzen in der Testparzelle
  • Beispiel 5
  • Charakterisierung von Genen, die von Safenern unter abiotischen Stressbedingungen induziert werden, durch Gene Expression Profiling (GEP):
  • Mais-Samen der Sorte Lorenzo wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit der Verbindung VIII-3 (= 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide) bzw. mit Lösungsmittel gebeizt. Die Pflanzen wurden für 10 Tage in einer Klimakammer angezogen (Bedingungen: siehe Beispiel 1). Anschließend wurden die Pflanzen den folgenden Stress-Bedingungen ausgesetzt:
    • (1) Hitzestress: 6 h bei 45°C
    • (2) Trockenstress: 7 Tage ohne Bewässerung, 24°C
  • Die Kontrollpflanzen der jeweiligen Experimentgruppe wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Standard-Bedingungen (Temperatur, Bewässerung) gehalten.
  • Nach der Stressbehandlung wurden die Blätter der gestressten Pflanzen sowie der ungestressten Kontrollpflanzen geerntet, in Flüssig-Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei –80°C gelagert. Alle Versuche wurden in Replikaten mit je 2 Töpfen durchgeführt.
  • Die Herstellung der markierten RNA-Sonden für die DNA-Chip-Hybridisierung erfolgte nach den Protokollen (Expression Analysis, Technical Manual) der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA). Aus je 500 mg der geernteten Blätter wurde zunächst Gesamt-RNA isoliert. Je 10 μg Gesamt-RNA wurden für die Erst- und Zweitstrang cDNA-Synthese verwendet. Die cDNA wurde mit T7-Polymerase amplifiziert und dabei gleichzeitig mit Biotin-UTP markiert. Je 20 μg dieser biotinylierten cDNA wurden für die Hybridiserung des Mais Genom-Arrays von der Firma Affymetrix eingesetzt. Dieser DNA-Microarray enthält DNA-Sequenzen, die in ihrer Gesamtheit 13339 Gene repräsentieren. Anschließend wurden die DNA-Microarrays in der Affymetrix Fluidics Station gewaschen, mit Streptavidin/Phycoerythrin (Molecular Probes, P/N S-866) gefärbt und mit dem zugehörigen Agilent Laser Scanner (Agilent Gene Array Scanner) gescannt. Die erhaltenen Fluoreszendaten wurden mit der Software Microarray Suite 5 von Affymetrix analysiert. Nach erfolgter Qualitätskontrolle wurden alle DNA-Chip-Analysen in einer Datenbank gespeichert. Zur Ermittlung von relativen Expressionswerten (Induktions-, Repressionsfaktoren) wurden die absoluten Expressionswerte der Gene aus den jeweiligen Stressexperimenten mit den Werten der jeweiligen Kontrollversuche (d.h., ohne abiotischen Stress und Beizung lediglich mit Lösungsmittel) verglichen und dabei die von der Affymetrix-Software vorgegebenen Signifikanz Kriterien zu Grunde gelegt. Die daraus erhaltenen je 4 Expressionswerte pro Gen wurden durch Medianberechnung gemittelt. Diese Mediane sind als Induktionsfaktoren in den Ergebnistabellen angegeben. Ähnlichkeitsvergleiche von Expressionsprofilen verschiedener Experimente und Cluster-Analysen wurden mit der Software „Genedata Expressionist" von Genedata (Genedata, Maulbeerstr. 46, CH-4016 Basel, Switzerland) durchgeführt.
  • Bei der Analyse der Expressionsprofile wurde speziell nach Genen gesucht, die durch die Testsubstanzen nur in Verbindung mit abiotischem Stress induziert werden, nicht aber durch die Substanzen oder durch Stress alleine. Solche Gene können als Indikatoren für zusätzliche Anti-Stress-Wirkungen der Substanzen angesehen werden, die über die bereits bekannte Safener-Wirkung hinausgehen. Die Ergebnisse der Analysen sind in den folgenden Tabellen aufgeführt.
  • Die Induktionsmuster der beschriebenen Indikatorgene erlauben das gezielte Auffinden von Wirkstoffen zur Steigerung der abiotischen Stresstoleranz in Kulturpflanzen.
    • a) Unter Hitzestressbedingungen, d.h. die getesteten (mit 2mg a.i./g Samen 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide gebeizten) Maispflanzen wurden 7 Tage nach Keimung für 6 Stunden einer Temperatur von 45°C ausgesetzt.
  • Eine Durchsicht der induzierten Gengruppen ergab das folgende in Tabelle 5 dargestellte Muster Tabelle 5
    Figure 00470001
  • Der jeweiligen Probe Set No. entspricht:
    Zm.11840.1.A1_at: Putative N-carbamyl-L-amino acid amidohydrolase
    Zm.4274.1.S1_at: Cytochrome P450
    Zm.3040.1.S1_at Uricase II (E.C.1.7.3.3); Nodule specific uricase
    Zm12587.1.S1.s_at: Glycosyltransferase
    Zm18994.2.A1_a_at: Putative Serine Transferase
    Zm.13498.1.S1_at: Membrane Protein
    • Kondition A: Hitzestress (6 Stunden, 45°C)
    • Kondition B: 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide (VIII-3) gebeizter Samen/KEIN Hitzestress
    • Kondition C: 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide (VIII-3) gebeizter Samen + Hitzestress (6 Stunden, 45°C)
  • Somit wurde selbst bei leichter Grundinduktion der analysierten Genaktivitäten in allen Fällen eine deutliche Steigerung der Genexpression beobachtet, die bei den hier genannten Genen im Bereich von 1.5 bis 2.35 liegt (Expression unter Kondition C/Expression unter Kondition A). Wurde die getestete Verbindung VIII-3 alleinig, d.h. ohne Hitzestress geprüft, so lagen die gemessenen Expressionslevel im Bereich des durch Hitzestress induzierten Bereichs, oder unterhalb oder leicht oberhalb des durch Hitzestress induzierten Bereichs.
  • Die aus der Tabelle 5 abgeleiteten Induktionsmuster, die direkt durch die erhaltenen Expressionswerte dargestellt werden, zeigen charakteristische Induktionen durch Einwirkung der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide, wobei die Wirkung auf das Putative N-Carbamyl-L-Amino acid Amidohydrolase [Zm.11840.1.A1_at] und auf das Putative Serine Carboxypeptidase [Zm18994.2.A1-at] am stärksten ausgeprägt ist.
    • b) Unter Trockenstressbedingungen, d.h. die getesteten (mit 2mg a.i./g Samen 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide gebeizten) Maispflanzen wurden 7 Tage nach Keimung für 7 Stunden einer Temperatur von 45°C ausgesetzt.
  • Eine Durchsicht der induzierten Gengruppen ergab das folgende, in Tabelle 6 dargestellte, Muster Tabelle 6
    Figure 00490001
  • Der jeweiligen Probe Set No. entspricht:
    Zm.818.1.A1_at Universal Stress Protein
    Zm.3633.4.A1_at Wound Induced Protein (Fragment)
    Zm.18273.1.S1_at Regulatory Protein-Like
    Zm.13229.1.S1_at NBS-LRR Type Disease Resistance Protein O2 (Fragment)
    Zm.12035.1.A1_at Similar to AT3G10120
    Zm.485.1.A1_at Non-Symbiotic Hemoglobin (HBT) (ZEAMP GLB1)
    Zm.818.2.A1_at Expressed Protein
    Zm.10097.1.A1_at Expressed Protein
    Zm.18682.1.A1_at Unknown Protein
    • Kondition A: Trockenstress (7 Tage, 24°C)
    • Kondition B: 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide (VIII-3) gebeizter Samen/KEIN Trockenstress
    • Kondition C: 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide (VIII-3) gebeizter Samen + Trockenstress (7 Tage, 24°C)
  • Somit wurde selbst bei leichter Grundinduktion der analysierten Genaktivitäten in allen Fällen eine deutliche Steigerung der Genexpression beobachtet, die bei den hier genannten Genen im Bereich von 1.75 bis 8.0 liegt (Expression unter Kondition C/Expression unter Kondition A). Wurde die getestete Verbindung VIII-3 alleinig, d.h. ohne Trockenstress geprüft, so lagen die gemessenen Expressionslevel im Bereich des durch Trockenstress induzierten Bereichs, in einzelnen Fällen sogar unterhalb der Expression ungestresster Pflanzen (bei Werten < 1.0)
  • Die aus der Tabelle 6 abgeleiteten Induktionsmuster, die direkt durch die erhaltenen Expressionswerte dargestellt werden, zeigen charakteristische Induktionen in Gegenwart der Verbindung 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl) benzolsulfonamide, wobei die Wirkung auf das Universal Stress Protein [Zm.818.1.A1_at] und Non-Symbiotic Hemoglobin (HBT) (ZEAMP GLB1) [Zm.485.1.A1_at] am stärksten ausgeprägt ist.

Claims (17)

  1. Verfahren zum Auffinden einer die Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren bei Pflanzen erhöhenden Verbindung, wobei die Steigerung der Transkription bzw. Expression einzelner oder mehrerer, pflanzenendogener Gene, als Indiz für die Induktion bewertet wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die pflanzenendogenen Gene ausgewählt sind aus der Gruppe von Genen codierend für Proteine aus der Gruppe der Cytrochrom-Oxidasen, Glycosyltransferasen, Uricasen, Peptidasen, verschiedener Membranproteine, Amidohydrolasen, Late Embryogenesis Abundant Proteinen, sowie verschiedener allgemeiner Stressproteine.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass: a) Testpflanzen einem oder mehreren abiotischen Stressoren ausgesetzt werden, b) Kontrollpflanzen, unter ansonsten gleichen Bedingungen wie Testpflanzen unter a), zusätzlich mit einer zu testenden Verbindung in Kontakt gebracht werden, sei es in Form gebeizten Saatgutmaterials oder der Besprühung zu einem bestimmten Entwicklungszeitpunkt oder durch Wurzelaufnahme, c) RNA aus den Test- und Kontrollpflanzen extrahiert wird, d) die RNA entweder direkt radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert wird, oder aber die RNA unter gleichzeitiger enzymatischer Umschreibung in die korrespondierende cDNA radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert wird, oder aber die erhaltene, nicht markierte cDNA enzymatisch in eine korrespondierende radioaktive oder nicht-radioaktive markierte cRNA umgeschrieben wird, e) ein pflanzliche DNA-Sequenzen enthaltender DNA-Microarray mit den gemäß Schritt d) erhaltenen Substanzen hybridisiert wird, f) Expressionsprofile der Gene für die Expression der verschiedener Stressproteine vergleichend für die gemäß a) und b) getesteten Pflanzen erstellt werden, g) eine Quantifizierung der gemäß f) gemessenen Expressionsunterschiede erfolgt, h) eine abschließende Systematisierung der gemäß g) zugeordneten Expressionsprofile durch Cluster-Analyse erfolgt.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei im Fall der beabsichtigten Steigerung der Toleranz bei Hitzestress die Expression der Gene der Cytrochrom-Oxidasen, wie der Cytochromoxidase P450, Glycosyltransferasen, Uricasen, Peptidasen, verschiedener Membranproteine, Amidohydrolasen bei hitzegestressten und nicht hitzegestressten Pflanzen verglichen wird
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Expression der Gene, der N-carbamyl-L-amino acid Amidohydrolase, der Serine Carboxypeptidase, der Uricase II (E.C.1.7.3.3) und der Glycosyltransferase bei hitzegestressten und nicht hitzegestressten Pflanzen verglichen wird.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 und 5, wobei das Expressionsprofil eines oder mehrerer der benannten Gene um den Faktor 1.5 bis 30, bevorzugt 1.5 bis 20, besonders bevorzugt 1.5 bis 10, ganz besonders bevorzugt 1.5 bis 5 erhöht ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei im Fall der beabsichtigten Steigerung der Toleranz bei Trockenstress die Expression der der Late Embryogenesis Abundant Proteine, des Universal Stress Proteins, des Non-symbiotic hemoglobin (Zm.485.1.A1_at), des Proteins mit der Adressierung „Zm.818.2.A1_a_at" (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix) und des Proteins mit der Adressierung „Zm.18682.1.A1_s_at" (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix) bei durch Trockenheit gestressten und nicht durch Trockenheit gestressten Pflanzen verglichen wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Expression der Gene des Universal Stress Proteins (Zm.818.1.A1_at), Non-symbiotic hemoglobin (Zm.485.1.A1_at), des Proteins mit der Adressierung „Zm.818.2.A1_a_at" (Signatur gemäß Affimetrix Mais Genom-Array) und des Proteins mit der Adressierung „Zm.18682.1.A1_s_at" (Signatur gemäß Mais Genom-Array der Firma Affymetrix) bei durch Trockenheit gestressten und nicht Trockenheit gestressten Pflanzen verglichen wird.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Expressionsprofil eines oder mehrerer der benannten Gene um den Faktor 1.5 bis 30, bevorzugt 1.5 bis 20, besonders bevorzugt 1.5 bis 10, ganz besonders bevorzugt 1.5 bis 8 erhöht ist.
  10. Verwendung einer oder mehrerer mit Hilfe eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 identifizierten Verbindungen und/oder bereits als Safener bekannten Verbindungen, zur Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischen Stressoren zur Ertragssteigerung, zur Verlängerung der der Vegetationsperiode, zur Ermöglichung einer früheren Aussaat, zur Steigerung der Qualität, oder zur Verwendung im Rahmen der Züchtung unter Verwendung ansonsten weniger vitaler Inzucht-Linien.
  11. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 10, die in ihrer Verwendung als Safener bereits im Pflanzenschutz bekannt sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mefenpyr-diethyl, Isoxadifen-ethyl, Chloquintocetmexyl, Fenclorim, Dymron, und 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide.
  12. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 11, die in ihrer Verwendung als Safener bereits im Pflanzenschutz bekannt sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mefenpyr-diethyl und 4-Cyclopropylaminocarbonyl-N-(2-methoxybenzoyl)benzolsulfonamide.
  13. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, zur Toleranzerhöhung gegenüber abiotischen Stressoren in den Kulturpflanzen Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Soja, Sonnenblume, Raps und Zuckerrübe.
  14. Verfahren zur Ertragssteigerung in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanzen durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenapplikation mit einem oder mehreren Verbindungen die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 identifiziert wurden und/oder bereits als Safener im Pflanzenschutz bekannten Verbindungen behandelt werden.
  15. Verfahren zur Verlängerung der Vegetationsperiode in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanzen durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenapplikation mit einem oder mehreren Verbindungen die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 identifiziert wurden und/oder bereits als Safener im Pflanzenschutz bekannten Verbindungen behandelt werden.
  16. Verfahren zur Ermöglichung einer früheren Aussaat in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanzen durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenapplikation mit einem oder mehreren Verbindungen die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 identifiziert wurden und/oder bereits als Safener im Pflanzenschutz bekannten Verbindungen behandelt werden.
  17. Verfahren zur Qualitätssteigerung in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanzen durch Saatgut-Beizung, durch Blattspritzung oder durch Bodenapplikation mit einem oder mehreren Verbindungen die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 identifiziert wurden und/oder bereits als Safener im Pflanzenschutz bekannten Verbindungen behandelt werden.
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