DE102005022664A1

DE102005022664A1 - Tandem-Massenspektrometrie-Verfahren

Info

Publication number: DE102005022664A1
Application number: DE102005022664A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-05-18
Filing date: 2005-05-17
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2025-05-18
Also published as: DE102005022664B4; GB0510157D0; GB2414342A; US6924478B1; GB2414342B

Abstract

Vielfach geladene Probenionen werden in einer Ionenfalle eines Ionenfallen-Massenspektrometers gesammelt, z. B. in einem Fourier-Transform-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (FTICR-MS) oder in einer Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle. In der Ionenfalle werden nacheinander Fragmentierungen durch Elektroneneinfang (ECD) und Fragmentierungen durch Vibrationsanregung der innermolekularen Schwingungssysteme auf ein und dieselbe Gesamtheit von Ionen angewandt. Beim ersten Fragmentierungsprozess werden nicht alle Probenionen fragmentiert. Nach der Aufnahme eines Massenspektrums der Bruchstückionen aus dem ersten Fragmentierungsprozess werden die nicht fragmentierten Probenionen zum Schwingen angeregt, woraufhin wieder ein Teil von ihnen zerfällt, und die Bruchstückionen werden als zweites Massenspektrum gemessen. Somit wird dieselbe Gesamtheit von Ionen zwei Fragmentierungsprozessen unterzogen.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Strukturanalyse durch Tandem-Massenspektrometrie.
Mehrfach geladene Probenionen werden in einer Ionenfalle gesammelt und nacheinander zwei Fragmentierungsarten, beispielsweise durch Elektroneneinfang (ECD) und durch Vibrationsanregung der innermolekularen Schwingungssysteme, unterworfen, wobei ausgenutzt wird, dass bei Fragmentierungsprozessen nicht alle Probenionen fragmentiert werden. Nach der Aufnahme eines Massenspektrums der Bruchstückionen aus dem ersten Fragmentierungsprozess werden die nicht fragmentierten Probenionen zum Schwingen angeregt, woraufhin wieder ein Teil von ihnen zerfällt, und die Bruchstückionen werden als zweites Massenspektrum gemessen.
In der Massenspektrometrie werden Probenmoleküle ionisiert und die Ionen dann analysiert, um ihre ladungsbezogenen Massen (m/z) zu bestimmen. Die Ionen können durch verschiedene Ionisierungsmethoden erzeugt werden, einschließlich Elektronenstoß, Beschuss mit schnellen Atomen (FAB = fast atom bombardment), Elektrosprüh-Ionisierung (ESI) sowie Ionisation durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Die Analyse nach m/z erfolgt in Analysatoren, in denen die Ionen entweder eine Zeit lang eingefangen werden oder nach m/z gefiltert zum Ionendetektor fliegen. Bei den Analysatoren, die Ionen einfangen, spricht man von Ionenfallen, wie z. B. Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle (Paul-Falle), lineare Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle und Ionen-Zyklotron-Resonanz-Ionenfalle (ICR, Penning-Falle). In ihnen werden die Ionen durch eine Kombination aus magnetischen, elektrostatischen oder alternierenden elektromagnetischen Feldern eine Zeit lang, typischerweise 0,1 bis 10 Sekunden, räumlich begrenzt gespeichert. Bei den filternden Massenanalysatoren, wie z. B. Magnetsektor- oder Quadrupolanalysatoren, ist die Verweilzeit der Ionen kürzer, im Bereich von 1 bis 100 μs. Gleiches gilt für Flugzeitmassenspektrometer.
Tandem-Massenspektrometrie ist ein allgemeiner Begriff für solche Massenspektrometrie-Verfahren, bei denen Probenionen (Probenionen) mit gewünschten m/z-Werten zunächst selektiert und dann fragmentiert werden, wonach die resultierenden Bruchstückionen dann auf ihre m/z-Werte hin analysiert werden. Die Fragmentierung massenselektierter Ionen kann in einer speziellen Zelle zwischen zwei m/z-Analysatoren erfolgen. Diese Zelle ist in der Regel eine Hochfrequenz-Multipol-Zelle mit langen Polstäben, zwischen denen Quadrupol- oder Hexapol-Felder aufgespannt sind. Bei Ionenfallen-Massenspektrometern geschieht die Fragmentierung in der Falle selbst. Die Tandem-Massenspektrometrie kann deutlich mehr Informationen über die Struktur der Probemoleküle liefern als die einfache Massenspektrometrie.
Tandem-Massenspektrometrie ist ein allgemeiner Begriff für Massenspektrometrie-Verfahren, bei denen Probenionen (Probenionen) mit gewünschten m/z-Werten selektiert werden und im Massenspektrometer einmal (MS/MS oder MS²) oder mehrmals (MSⁿ) zerfallen, bevor die abschließende Massenanalyse erfolgt.
Zum Fragmentieren der Ionen im Massenspektrometer werden meist Stoßfragmentierung (CID) oder Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD) angewandt. Beide Verfahren regen Probenionen zu internen Schwingungen mit Energien oberhalb ihrer Zerfallschwelle an. Bei der Stoßfragmentierung wird die Anregung innermolekularer Schwingungssysteme (Vibrationsanregung; VE = vibrational excitation) durch Stöße der selektierten Probenionen mit neutralen Gasatomen oder Gasmolekülen, wie z. B. Helium, Argon oder Stickstoff erreicht. Die Stoßenergie wird dabei in innere Schwingungsenergie der Ionen umgewandelt. Alternativ lässt sich die innere Energie auch durch Absorption mehrere Infrarot-Photonen soweit erhöhen, dass eine Fragmentierung stattfindet. Dazu werden die Probenionen mit einem IR-Laser bestrahlt. Die Probenionen mit hoher innerer Energie zerfallen anschließend mindestens zum Teil in Fragmente (Infrarot-Multiphotonen-Zerfall, IRMPD), von denen eines oder mehrere elektrisch geladen sind. Die Masse und Menge der Bruchstückionen einer bestimmten Sorte liefern Informationen, die zur Beschreibung der Molekularstruktur der betreffenden Probe verwendet werden können.
Alle Methoden zur Vibrationsanregung (VE) haben bedeutende Nachteile. Erstens dominieren stets Fragmentierungswege niedriger Energie, was die Vielfalt gespaltener Bindungen begrenzt und somit die durch den Zerfall gewonnenen Informationen reduzieren kann. Leicht ablösbare Gruppen werden abgespalten, ohne dass die Informationen über ihren Ort erhalten bleiben. Dadurch sind sowohl Stoß- wie auch Infrarot-Fragmentierung bei großen Molekularmassen ineffektiv.

Um diese Probleme zu überwinden, können diverse Fragmentierungsprozesse durch Reaktionen von Ionen mit Elektronen eingesetzt werden (Zubarev, Mass Spectrom. Rev. (2003) 22:57–77). Eine dieser Reaktionen ist der Zerfall durch Elektroneneinfang (ECD) (Zubarev, Kelleher und McLafferty J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3265–3266). Beim ECD-Verfahren zerfallen positive, vielfach geladene Ionen beim Einfangen niedrig energetischer (< 1 eV) Elektronen, die entweder durch einen Heizdraht oder durch eine Dispenser-Kathode erzeugt werden, wie in Zubarev et al. Anal. Chem. 2001, 73, 2998–3005 beschrieben. Beim Elektroneneinfang können mehr strukturell wichtige Brüche als bei der Stoß- oder Infrarot-Multiphotonen-Fragmentierung (IRMPD) entstehen. In Polypeptiden, für die die massenspektrometrische Analyse häufig genutzt wird, werden durch Elektroneinfang die N-C_α-Bindungen gespalten, während Stoß- und Infrarot-Multiphotonen-Anregung die Amid- oder C-N-Bindungen (Peptidbindungen) spaltet. Außerdem werden Disulfid-Bindungen innerhalb der Peptide, die bei Stoß- und Infrarot-Multiphotonen-Anregung in der Regel intakt bleiben, insbesondere beim Elektroneneinfang gebrochen. Und schließlich bleiben beim ECD-Verfahren einige leicht ablösbare Gruppen an den Bruchstücken angelagert, wodurch sich ihre Positionen bestimmen lassen. Dieses Merkmal ist besonders wichtig bei der Analyse von posttranslationalen Modifizierungen von Proteinen und Peptiden, wie z. B. Phosphorylierung, Glykosylierung, γ-Karboxylierung usw., da die Position und Identität der nach Verschiebungen angebundenen Gruppen direkt mit der biologischen Funktion der entsprechenden Peptide und Proteine im Organismus zusammenhängen.

Andere Arten von Fragmentierungsreaktionen zwischen Ionen und Elektronen bieten ebenfalls analytische Vorteile. Eine Erhöhung der Elektronenenergie auf 3–13 eV führt zum Zerfall durch Einfang heißer Elektronen (HECD), bei dem die Elektronen vor dem Einfangen angeregt werden. Die resultierenden Bruchstückionen zerfallen ein zweites Mal, sodass zwischen den Isomeren Leucin und Isoleucin unterschieden werden kann (siehe Kjeldsen, Budnik, Haselmann, Jensen, Zubarev, Chem. Phys. Lett. 2002, 356, 201–206). Beim Zerfall durch Elektronenablösung (EDD = electron detachment dissociation) gemäß Budnik, Haselmann und Zubarev (Chem. Phys. Lett. 2001, 342, 299–302) fragmentieren 20-eV-Elektronen doppelt negativ geladene Peptidionen, was zu einem analogen Fragmentierungsmuster führt wie ECD. EDD ist von Vorteil für azidische Peptide und Peptide mit azidischen Modifikationen, wie z. B. Sulfatierung.

Um die Darstellung des Protonentransfers zu und von den Bruchstücken zu vereinfachen, wurden die Kennzeichnungen „Strich" und „Punkt" eingeführt. Hierbei wird die Gegenwart eines ungepaarten Elektrons stets durch ein Radikal-Zeichen „·" gekennzeichnet, sodass z. B. die Spaltung einer homolytischen N-C_α-Bindung c·- und z·-Bruchstücke ergibt. Ein Protonentransfer zum Bruchstück wird durch „'" gekennzeichnet, sodass z. B. ein Protonentransfer zu c· die Sorte c' ergibt und ein Protonenverlust von z· zu z'-Bruchstücken führt.

Die kombinierte Verwendung von Fragmentierungen durch Reaktionen von Ionen und Elektronen mit Fragmentierungen durch VE-Verfahren liefert zusätzliche Informationen über die Aminosäurensequenz (siehe Horn, Zubarev und McLafferty, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 10313–10317). Erstens erzeugen Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen nicht nur mehr, sondern auch andere Spaltungstypen (z. B. ergibt die Spaltung einer N-C_α-Bindung c'_n- und z·_n-Ionen) als VE-Verfahren (hier ergibt die Spaltung einer C-N-Bindung b_n und y'_n-Ionen). Durch Vergleich der beiden Spaltungstypen lässt sich der Typ der Bruchstücke bestimmen. Beispielsweise ist der Massenunterschied zwischen den N-terminalen c'_n- und b_n-Ionen 17 Da, der Massenunterschied zwischen den C-terminalen y'- und z·-Ionen dagegen 16 Da. Zweitens sind die Bruchstellen oft komplementär. Zum Beispiel erfolgt die Spaltung beim VE-Verfahren vorzugsweise an der N-terminalen Seite des Prolin in der Kette, während diese Stelle beim ECD-Verfahren unberührt bleibt. Andererseits werden bei ECD vorzugsweise die vernetzenden S-S-Bindungen gespalten, während diese Bindungen bei den meisten VE-Versuchen intakt bleiben. Und schließlich führen Polypeptide mit posttranslationalen Modifikationen zu VE-typischen Verlusten, wodurch sich Gegenwart und Typ der Modifikation feststellen lassen. Gleichzeitig erlaubt ECD die Bestimmung der Modifikationsstellen (siehe Kjeldsen, Haselmann, Budnik, Sørensen und Zubarev, R. A. Anal. Chem. (2003), 2003, 75:2355–2361). Obwohl die Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen gleichzeitig mit VE-Verfahren verwendet werden können, ist der konsekutive Einsatz wegen des komplementären Charakters der Information weitaus günstiger (Tsybin, Witt, Baykut, Kjeldsen und Håkansson, Rapid. Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 1759–1768).

Ein Nachteil der aktuellen Tandem-Massenspektrometrie, bei der sowohl Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen als auch VE-Verfahren in Kombination mit Separationsverfahren verwendet werden sollen, besteht darin, dass der konsekutive Einsatz dieser Reaktionen mindestens zweimal so viel Analysezeit in Anspruch nimmt wie das schnellste dieser Verfahren. Diese Analysezeit ist bei der Analyse von Proben niedriger Konzentration beson ders kritisch, wie z. B. im Fall der Massenspektrometrie von biologischen Proben, bei der die Probemenge oft begrenzt ist. Bei Proben geringer Konzentration müssen die Probenionen entweder länger (einige Sekunden) in der Falle gesammelt oder viele einzelne MS/MS-Spektren integriert werden. In beiden Fällen kann der Zeitverlust durch den konsekutiven Einsatz von Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen und VE-Verfahren mehrere Sekunden ausmachen. Dies beschränkt stark den analytischen Nutzen der Tandem-Massenspektrometrie, wenn diese mit Trennverfahren wie Flüssigchromatographie (HPLC) oder Kapillarelektrophorese (CE) kombiniert wird, bei denen das vollständige Signal einer einzelnen Verbindung oft nur kurze Zeit andauert und einige Sekunden nicht überschreitet. Daher wurde der gleichzeitige Einsatz von VE und Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen in Kombination mit HPLC und CE bereits gezeigt, der konsekutive Einsatz dieser Fragmentierungsverfahren in Kombination mit Trennverfahren aufgrund der beschränkten Analysezeit jedoch noch nicht erreicht, wenn auch als sehr vorteilhaft erachtet, z. B. von Kjeldsen, Haselmann, Budnik, Sørensen und Zubarev, Anal. Chem. 2003, 75, 2355–2361.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verkürzung der Analysezeit (bzw. Erhöhung der Empfindlichkeit bei festgelegter Analysezeit) bei der Tandem-Massenspektrometrie mit Ionenfallen zur Verfügung, wobei zwei Fragmentierungsarten nacheinander auf dieselbe Gesamtheit von Probenionen angewendet werden. Diese Fragmentierungsarten können Reaktionen der Probenionen mit Elektronen oder Verfahren zur Vibrationsanregung (VE) sein; wichtig ist dabei die getrennte Spektrenaufnahme der Bruchstückionen aus beiden Fragmentierungsarten. Im Allgemeinen bleiben bei jedem Fragmentierungsverfahren größere Menge an unfragmentierten Probenionen übrig. Der positive Effekt wird somit durch Verwendung derselben Gesamtheit von Probenionen für den unabhängigen und aufeinander folgenden Einsatz beider Verfahren zur Fragmentierung erreicht.

Die Erfindung wendet also zunächst eines der beiden Fragmentierungsarten mit anschließender Analyse der m/z-Werte der Bruchstückionen an, wobei jedoch diejenigen Probenionen, die keine Fragmentierung erlitten haben, in der Ionenfalle verbleiben. Bei der Analyse der Bruchstückionen werden diese in der Regel aus der Ionenfalle entfernt; ist das nicht der Fall, so ist eine aktive Entfernung anzuschließen. Die nicht fragmentierten Probenionen werden dann der zweiten Fragmentierungsart unterzogen, anschließend werden die m/z-Werte der neu entstandenen Bruchstücke analysiert. Somit werden für jede Gesamtheit von Probenionen, die sich in der Ionenfalle angesammelt haben, zwei unabhängige Fragmentionen-Massenspektren aufgezeichnet, jeweils eine für jedes der angewandten Fragmentierungsverfahren, wodurch die Gesamtanalysezeit um das Zeitintervall verkürzt wird, das der Ansammlung von Probenionen in der Falle bei der zweiten Fragmentierungsreaktion entfällt. Dadurch kann eine Zeitverkürzung von nahezu 50 % erreicht werden. Alternativ lässt sich bei festgelegter Gesamtanalysezeit die Sammlungszeit der Probenionen verdoppeln, was zu einem Anstieg der Empfindlichkeit um den Faktor zwei oder höher führen dürfte.

Die während des gesamten Analyseverfahrens anfallenden Probenionen können in einem begrenzten Bereich vor der Ionenfalle gesammelt werden, beispielsweise in einer linearen Quadrupol- oder Hexapol-Ionenfalle. Sie können dann nach der Leerung der Ionenfalle in diese eingeschleust werden.

Die oben beschriebenen und weitere Vorteile der Erfindung werden durch nachfolgend erläuterte Zeichnungen veranschaulicht:
1 ist ein Diagramm eines Fourier-Transform-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometers (FTICR-MS) gemäß vorliegender Erfindung.
2 zeigt das Ablaufdiagramm in einer Ionen-Zyklotron-Resonanz-Ionenfalle gemäß vorliegender Erfindung.
3 zeigt ein Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometer zum Erzeugen von Elektroneneinfang-Reaktionen, das mit einer linearen Multipol-Ionenfalle zur zwischenzeitlichen Sammlung der Ionen ausgestattet ist.
4 zeigt ein experimentell erzeugtes FTICR-Massenspektrum mit den Elektroneneinfang-Bruchstückionen doppelt protonierter Moleküle der Substanz P.
5 zeigt ein experimentell erzeugtes FTICR-Massenspektrum mit den Bruchstückionen der doppelt protonierter Moleküle der Substanz P nach Infrarot-Bestrahlung (IRMPD), wobei die doppelt protonierten Moleküle bei vorhergehenden Elektroneneinfang-Prozessen übrig geblieben sind.
Die vorliegende Erfindung zur Verkürzung der Analysezeit oder Erhöhung der Empfindlichkeit bei festgelegter Analysezeit in der Tandem-Massenspektrometrie besteht aus mehreren Schritten. Diese umfassen die Bereitstellung von positiven oder negativen Probenionen in einer Ionenfalle. Die Ionenfalle kann eine magnetisch oder eine mit Hochfrequenzspannungen betriebene Falle sein. Dann wird beispielsweise in der Ionenfalle ein Elektronenstrahl mit ausreichend geringer kinetischer Energie (z. B. unter etwa 20 eV) erzeugt, um Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen zu erreichen, wobei zumindest ein Teil der Ionen, aber nicht alle von ihnen, in Bruchstücke zerfallen. Die Fragmente werden dann anhand ihrer ladungsbezogenen Massen m/z analysiert. Dabei werden sie in der Regel auch aus der Ionenfalle entfernt. Anschließend werden die nicht zerfallenen Probenionen zum Schwingen der molekülinternen Schwingungssysteme angeregt, so dass auch sie größtenteils in Bruchstücke zerfallen. Die geladenen Bruchstücke werden dann auf ihre ladungsbezogenen Massen m/z hin analysiert, was eine separate Aufzeichnung der beiden Fragmentionen-Massenspektren für dieselbe Gesamtheit der Probenionen ermöglicht.
Die Ionenfalle kann eine Penning-Falle mit starkem Magnetfeld, eine dreidimensionale Paul-Falle, eine lineare Paul-Falle mit Multipolstäben, eine Kingdon-Falle oder eine beliebige andere elektromagnetische Falle sein, in der sowohl die Bedingungen für effiziente Reaktionen der Probenionen mit Elektronen wie auch Vibrationsanregungen erzeugt werden können.
Die Einrichtungen zur Erzeugung der Elektronen können sich außerhalb oder innerhalb der Ionenfalle befinden, wie z. B. Einrichtungen für thermische Emission von einer heißen Kathode, für Feldemission, Sekundärelektronenemission oder Photoemission. Die Photoemission von Elektronen kann von einer Oberfläche oder von Gasphasenmolekülen ausgehen. Es können elektrische oder magnetische Felder oder Kombinationen davon zur Unterstützung der Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen verwendet werden. Es können Puffergase zur Dämpfung der Bewegung von Elektronen und Ionen (der Proben- wie auch der Bruchstückionen) verwendet werden.
Zur Analyse der Bruchstückionen auf ihre m/z-Werte hin können verschiedene Prinzipien genutzt werden, wie beispielsweise eine Fourier-Transform-Analyse ihrer Bewegungsfrequenzen innerhalb der Ionenfalle, ein m/z-selektiver Auswurf von Ionen aus der Falle oder ein nicht selektiver Auswurf der Ionen aus der Falle auf einen anderen m/z-Analysator (z. B. einen Flugzeitanalysator). Die Vibrationsanregung der Ionen kann auf Kollisionen mit gasförmigen Neutralteilchen, auf Infrarot-Multiphotonen-Zerfall (IRMPD) oder auf Kollisionen mit einer Fläche basieren.
Die Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen führen zumindest teilweise zum Zerfall in Bruchstückionen. Der Zerfall durch Elektronenablösung (EDD) basiert auf folgender Reaktion der Ionen mit Elektronen: [M – nH]^n– + e– → [M – nH]^(n–1)-· + 2e– → Fragmentierung wobei die benötigten mehrfach deprotonierten Moleküle [M – nH]^n– (n ≥ 2), bevorzugt durch Elektrosprüh-Ionisierung bereitgestellt werden können. (Das Probenion muss mindestens zwei negative Elementarladungen besitzen, um nach Auswurf eines Elektrons mindestens ein geladenes Bruchstück zu erhalten, weil bei jedem Auswurf eines Elektrons die negative Ladung um eine Einheitsladung abnimmt). Der Querschnitt der Elektronenablösung erreicht messbare Werte erst über 10 eV und ist bei etwa 20 eV maximal, sodass die kinetische Energie der Elektronen (oder eines wesentlichen Teils davon) vorzugsweise zwischen 10 und 20 eV, besser noch zwischen 17 und 20 eV liegen sollte.
Der Zerfall durch Elektroneneinfang (ECD) basiert auf folgender Ionen-Elektronen-Reaktion: [M + nH]ⁿ⁺ + e– → Fragmentierung wobei die vielfach protonierten Moleküle [M + nH]ⁿ⁺ (n ≥ 2), wiederum bevorzugt durch Elektrosprüh-Ionisierung bereitgestellt werden können. (Das Probenion muss auch hier mindestens zwei Ladungen tragen, jedoch hier positive Ladungen, um nach Einfang eines Elektrons mindestens ein geladenes Bruchstück zu behalten). Der Querschnitt des Elektroneneinfangs nimmt mit der Elektronenenergie rasch ab, sodass die kinetische Energie der Elektronen (oder eines wesentlichen Teils davon) zur effektiven Reaktion vorzugsweise unter etwa 1 eV, besser noch unter etwa 0,5 eV und noch besser bei etwa 0,2 eV oder darunter liegen sollte. Der Querschnitt des Elektroneneinfangs ist ferner quadratisch abhängig vom Ionenladungszustand, was bedeutet, dass der Einfang durch doppelt geladene Ionen viermal effizienter ist als durch einfach geladene Ionen. Daher fangen die geringer geladenen Bruchstücke, die aus den Probenionen entstehen, Elektronen mit sehr geringer Rate im Vergleich zu den Probenionen ein.
Beim Zerfall durch Einfang heißer Elektronen (HECD) sollte die Energie der Elektronen im Bereich von 3 bis 13 eV, vorzugsweise bei 11 eV liegen. Die heißen Elektronen werden hier direkt eingefangen und erzeugen gleichzeitig eine Elektronenanregung. Die überschüssige Energie wird beim HECD-Verfahren typischerweise in sekundären Fragmentierungsreaktionen freigesetzt, wie z. B. Verluste von H· und größeren Radikalengruppen nahe der primären Bruchstelle.
Zu den Ionen, die zur Analyse gemäß vorliegender Erfindung geeignet sind, zählen viele verschiedene Klassen von Chemikalien, die ionisiert werden können, um vielfach geladene Ionen zu erhalten, wie z. B. Polymere, Kohlenhydrate und Biopolymere, insbesondere Proteine und Peptide einschließlich modifizierter Proteine und Peptide.
In dieser Erfindung wird, im Gegensatz zum Stand der Technik, die Aufzeichnung von Tandem-Massenspektren mit zwei verschiedenen Verfahren zur Fragmentierung ein und derselben Gesamtheit ermöglicht, indem die nicht fragmentierten Probenionen aus der ersten Reaktion in der zweiten Reaktion zerfallen.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Tatsache, dass die höchste Fragmentierungsausbeute durch Fragmentierungsreaktionen erreicht wird, einschließlich durch Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen, bei denen ein Teil (in der Regel 10–30 %) der Probenionen nicht fragmentieren. Insbesondere beim ECD-Verfahren bleiben die Strukturen der unfragmentierten Ionen intakt, da die Energie der Elektronen beim ECD-Verfahren zu gering ist, um Elektronen- oder Schwingungsfreiheitsgrade in solchen Ionen anzuregen, die keine Elektronen eingefangen haben. Obwohl sich bei Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen, bei denen höhere Elektronenenergien als bei ECD verwendet werden, die sekundäre Struktur unfragmentierter Ionen durch inelastische Kollisionen mit Elektronen ändern kann, bleibt auch hier zumindest die primäre Struktur dieser Ionen erhalten, sodass die VE-Fragmentierung dieser Ionen repräsentative Strukturinformationen liefert.
Diese Erfindung nutzt auch die Fähigkeit von Ionenfallen-Massenspektrometern, dass zur m/z-Analyse ein Bereich von m/z-Werten der gewünschten Ionen selektiert werden kann, während Ionen mit m/z-Werten außerhalb dieses Bereichs für weitere Reaktionen in der Falle bleiben können. Besonders vorteilhaft sind dabei Tandem-Massenspektrometer mit der Fähigkeit, Probenionen in einem Speicher anzusammeln, während eine zuvor angesammelte Gesamtheit von Ionen fragmentiert und auf m/z-Werte analysiert wird. Dieser Speicher kann zu einer nachfolgenden schnellen Füllung der Ionenfalle für das nächste Paar von Spektrennahmen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung erreicht ihr Ziel dadurch, dass für die zweite Fragmentierung, hier beispielsweise die VE-Fragmentierung, derjenige Teil der Probenionen verwendet wird, der bei den Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen nicht zerfallen ist. Die umgekehrte Reihenfolge, d. h. zuerst VE-Fragmentierung und anschließend Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen, ist ebenfalls möglich, jedoch etwas weniger vorteilhaft, da die Vibrationsanregung schwieriger zu steuern ist als Reaktionen der Probenionen mit den Elektronen.
Beispiel 1: 1 zeigt als erstes Ausführungsbeispiel ein schematisches Diagramm eines Fourier-Transform-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometers. Das Massenspektrometer besteht aus einer Elektrosprüh-Ionenquelle (1). Die Elektrosprüh-Ionenquelle hat einen Eingang in das Vakuumsystem des Massenspektrometers in Form einer Einlasskapillarenöffnung (2). In der Sprühkammer (3) durch Elektrosprühen aus der Sprühnadel (4) gebildete Ionen gelangen durch die stark ansaugende Öffnung (2) in die Einlasskapillare (5). Nach der Kapillare (5) durchlaufen die Ionen den ersten Abstreifer (6), dann den zweiten Abstreifer (7) und treten in eine lineare Hochfrequenz-Multipol-Ionenfalle ein, die zum Ansammeln von Ionen (8) genutzt wird. Hier werden die Ionen radial vom HF-Multipol (8) und axial von den reflektierenden Potenzialen des zweiten Abstreifers (6) und der Extraktionselektrode (9) eingefangen. Ionen können in dieser linearen Multipol-Ionenfalle angesammelt und dann zu einer vordefinierten Zeit durch Polaritätsänderung der Extraktionselektrode (9) extrahiert und später durch die Ionentransferoptik (10) in die Ionen-Zyklotron-Resonanzfalle (ICR) (11) geleitet werden, die in einem durch einen supraleitenden Magneten (12) erzeugten starken Magnetfeld platziert ist. Die Ionentransferoptik (10) kann eine elektrostatische Ionenlinse mit Deflektorsystem oder ein anderes Multipol-Ionenführungssystem sein. Das gesamte System befindet sich in einem differenziell gepumpten Vakuumgehäuse (13), das eine graduelle Drucksenkung vom Atmosphärendruck in der Ionenquelle (1) bis auf etwa 10^–10 Millibar am Ultrahochvakuum-Teil (14) im Magneten ermöglicht, wo die ICR-Falle (11) platziert ist. 1 zeigt nur die Pumpenverbindungen (15) des Vakuumgehäuses und nicht die Pumpen. Eine Datenstation (16) steuert das gesamte Fourier-Transform-ICR-Spektrometersystem.
Positive Ionen, die kontinuierlich von der Elektrosprühquelle (1) erzeugt werden, sammeln sich in der linearen HF-Multipol-Falle (8). Zu Beginn jedes Analysezyklus ist das positive Potenzial der Extraktionselektrode (9) so hoch, dass die Ionen diese Elektrode nicht passieren können und im Multipol (8) gefangen bleiben. Die Dauer dieser Ansammlungsperiode richtet sich nach dem Ionenstrom (je höher der Strom, desto kürzer die Periode) und der gewünschten Anzahl angesammelter Ionen. Das Potenzial der Extraktionselektrode (9) wird soweit auf einen negativen Wert gesenkt, dass die eingefangenen Ionen die Extraktionselektrode (9) und die Ionentransferoptik (10) passieren und die ICR-Falle (11) erreichen. Die Ionen werden in der ICR-Falle (11) durch eines der herkömmlichen Verfahren eingefangen, wie z. B. Sidekick, Gated Trapping oder gasunterstütztes Einfangen. Direkt nach dem Einfangen der Ionen in der ICR-Falle (11) wird die Polarität des Potenzials der Extraktionselektrode (11) wieder so eingestellt, dass die Ionen blockiert werden, um eine neue Speicherperiode zu beginnen. Das Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) der Probenionen für den Zerfall wird entweder während der Ansammlungsperiode im Speicher-Multipol (8) oder während des Ionentransfers in der Ionentransferoptik (10) oder nach dem Ioneneinfang in der ICR-Falle (11) gewählt. Anschließend erzeugt die Elektronenquelle (17) einen Elektronenstrahl (18) geeigneter Energie, der die ICR-Falle (11) passiert und mit den eingefangenen Ionen interagiert, woraufhin eine Anzahl von Ionen durch ECD zerfällt. Nach einer Periode, die für eine effiziente Ionen-Elektronen-Reaktion lang genug ist, jedoch nicht dafür ausreicht, dass alle Probenionen zerfallen, wird die Zyklotron-Bewegung der Ionen in der ICR-Falle angeregt, sodass ausreichend hohe Umlaufbahnen erreicht werden. Die Anregungsfrequenzen werden so gewählt, dass die Ionen, deren m/z-Werte den m/z-Werten der Probenionen genau oder annähernd entsprechen, unangeregt bleiben. Dies geschieht durch eines der herkömmlichen Verfahren zur selektiven Ionen-Zyklotron-Umlaufbahn-Anregung, wie z. B. Stored Waveform Inverse Fourier Transform (SWIFT), maßgeschneiderte Sweepverfahren oder andere. Anschließend werden die Frequenzen der Ionenbewegung durch induzierte Bildströme nachgewiesen, wie dies bei der FTICR- Massenspektrometrie üblich ist. Das Spektrum nachgewiesener Frequenzen wird im Computerspeicher des Datensystems (16) gespeichert. Nach den Frequenzmessungen können die Bruchstückionen aus der ICR-Falle (11) ausgeworfen werden, indem dasselbe oder ein anderes Zyklotron-Umlaufbahn-Anregungsverfahren angewandt wird. Nun sendet der IR-Laser (19) eine Zeit lang einen Photonenstrahl (20) aus, der das IR-Fenster (21) passiert und intensiv genug ist, um einen Infrarot-Multiphoton-Zerfall (IRMPD) der Ionen zu erzeugen, die in der ICR-Falle nach der Bestrahlung mit Elektronen intakt geblieben sind (Probenionen). Es folgt eine weitere Zyklotron-Umlaufbahn-Anregung und anschließend der Frequenznachweis. Dann wird ein Frequenzspektrum erfasst und im Computerspeicher der Datenstation (16) abgelegt. Nach Erstellung von zwei aufeinanderfolgenden Tandem-Massenspektren derselben Gesamtheit von Probenionen initiiert die Datenstation (16) den „Quenchpuls", der die restlichen Ionen aus der ICR-Falle (11) treibt, und startet einen weiteren Zyklus von Messungen durch Verringerung des Potenzials an der Extraktionselektrode (9). Da sich die Ionen während beider Fragmentierungsereignisse kontinuierlich in der Multipol-Falle (8) angesammelt haben, wurden keine Probenionen verschwendet und kann die Analyse mit höherer Empfindlichkeit durchgeführt werden als nach dem Stand der Technik, bei dem für zwei Fragmentierungsversuche zwei Ansammlungsperioden erforderlich sind.
Die in dieser Abbildung dargestellte Elektronenquelle (17) ist eine Hohlkathode, durch deren Öffnung der Laserstrahl hindurchgelangen kann. Es kann jedoch jede Versuchsanordnung verwendet werden, bei der die Ionen in der ICR-Falle Elektronen und Photonen ausgesetzt werden können. Eines der anderen Verfahren ist der Einsatz einer axialen Elektronenquelle und eines leicht schräg durch die Achse verlaufenden Laserstrahls. Eine weitere mögliche Anordnung wäre eine außeraxiale Elektronenquelle und ein axialer Laserstrahl.
2 zeigt einen Querschnitt durch die ICR-Falle in mehreren Einzeldarstellungen, um die Vorgänge innerhalb der Falle näher zu beschreiben: Mehrfach geladene Ionen (z. B. mehrfach protonierte Polypeptid-Ionen) werden in einer Elektrosprühquelle erzeugt, in eine ICR-Falle eingeschleust und darin eingefangen. Die eingefangenen Ionen (22) sind in der schematischen Querschnittsansicht in 2a dargestellt. Die Querschnittsansicht der ICR-Falle zeigt die Anregungselektroden der ICR-Falle (23) und (24) sowie die Nachweisplatten (25) und (26). Die Ionen werden dann einem Elektronenstrahl (18) ausgesetzt, um Zerfall durch Elektroneneinfang (ECD) zu erreichen (2b), sodass ein Teil der Ionen zu Bruchstückionen zerfällt. Nach diesem Prozess besteht die Gesamtheit der Ionen (27), die in der Mitte der ICR-Falle abgebildet sind, aus einer Mischung der Zerfallsprodukte und der nicht zerfallenen Probenionen (29). Zu diesem Zeitpunkt werden die Produkt-Ionen einer selektiven Breitbandanregung unterzogen, indem eine spezielle Anregungsroutine angewandt wird, die keinen Einfluss auf die unfragmentierten Probenionen hat (2c). Die Bruchstückionen (28) des ECD-Verfahrens werden von den übrigen Probenionen (29) getrennt und folgen dem Zyklotronanregungspfad (30). Sobald der Anregungspuls stoppt (2d), zirkulieren die angeregten Produkt-Ionen in größeren Umlaufbahnen (31). Der Nachweis dieser Ionen (28) erfolgt durch Erfassung, Verstärkung, Aufzeichnung und Analyse der durch diese Ionen in den Nachweisplatten (25, 26) erzeugten Bildströme. Die nicht zerfallenen Probenionen (29) zirkulieren in nicht angeregten Zyklotron-Umlaufbahnen. Die nachgewiesenen Produkt-Ionen werden nun mit derselben gewählten Breitbandanregung weiter angeregt, um einen Auswurf aus der ICR-Falle (2e) zu erreichen. Somit hat der Prozess zur Eliminierung der nachgewiesenen Produkt-Ionen keinen Einfluss auf die verbleibenden Probenionen (29), die weiter auf sehr kleinen Umlaufbahnen nahe dem Mittelpunkt der Falle (2f) zirkulieren. Im nächsten Verfahrensschritt (2g) werden die verbleibenden Probenionen dem Infrarot-Laserstrahl (17) ausgesetzt. Bei dieser Bestrahlung erfolgt eine Multiphotonen-Absorption und die Ionen fragmentieren durch IRMPD. Die Gesamtheit (33), bestehend aus den IR-zerfallenen Ionen und den restlichen unfragmentierten Probenionen, wird einer nicht selektiven Breitbandanregung (34) unterzogen und anhand der Bildströme, die sie in den Nachweisplatten (25 und 26) erzeugen, nachgewiesen (2h und 2i), während sie auf den angeregten Bahnen (35) kreisen. Zuletzt werden die nachgewiesenen Ionen durch Quenching der ICR-Falle eliminiert, indem an eine der Fangelektroden (nicht abgebildet) ein Gleichspannungsimpuls angelegt wird. Nach dem Auswurf der Ionen (2k) können neue Probenionen in die ICR-Falle eingeführt werden.
Beispiel 2: Das Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie kann auch in einem Massenspektrometer mit dreidimensionaler Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle nach Wolfgang Paul stattfinden. Ähnlich wie bei dem Verfahren, das bei der Fourier-Transform-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometrie angewandt wird, können mehrfach geladene Probenionen durch Elektrosprühen erzeugt werden und sich, bevor sie zur Analyse in die Falle geleitet werden, in einer linearen Hochfrequenz-Multipol-Falle sammeln. 3 zeigt ein solches System mit Elektrosprüh-Ionenquelle (1), Vakuum-Einlassöffnung (2) und Elektrosprüh-Kapillare (5). Die Probe wird durch eine Sprühnadel (4) in die Sprühkammer (5) gesprüht. Die Probenionen gelangen durch die Elektrosprüh-Kapillare (5) und zwei Abstreifer (6) und (7) in die lineare Hochfrequenz-Multipol-Falle (8), wo sie sich sammeln. Die Extraktionselektrode (9) hat eine positive Spannung, um positive Ionen in der linearen Multipol-Falle (8) einzufangen. Nach einer gewünschten Sammlungszeit werden die Ionen durch die Ionentransferoptik in die Paul-Falle (36) geleitet. Die Ionentransferoptik umfasst in diesem speziellen Beispiel eine Multipol-Ionenführung (37), an deren Ende sich Linsenelektroden (38) und (39) befinden. 3 zeigt auch eine schematische Zeichnung der Paul-Falle (36), in der der Querschnitt der Ringelektrode (40) und der Endkappen (41) und (42) dargestellt ist. Ionen passieren die Linsen (38) und (39) und gelangen in die Paul-Falle (36). Für die Massenanalyse werden die Ionen durch ein besonderes Ionenfallen-Scanverfahren, z. B. durch ein massenselektives Hochfrequenz-Scanverfahren, durch eine Öffnung aus der Falle ausgeworfen und, gegebenenfalls durch eine Wandlung durch eine Konversionsdynode (43), auf einem Ionendetektor (44) gemessen. Das Massenspektrometer wird von der Datenstation (47) gesteuert. Elektronen werden durch Aktivierung eines oder aller Filamente (45) erzeugt und in die Falle injiziert. In der Ringelektrode (40) platzierte Magnete (46) helfen dabei, die Elektronen in die Falle zu leiten.
In dem Verfahren mit Paul-Falle werden die Ionen in der Elektrosprühquelle (1) erzeugt und sammeln sich im Hexapol-Stabsystem (8). Die angesammelten Ionen werden dann durch Potenzialumkehr an der Extraktionselektrode (9) in die Paul-Falle (36) injiziert. Die in der Paul-Falle (36) gefangenen Ionen werden dann den durch die Heizdrähte (45) erzeugten Elektronen geeigneter Energie ausgesetzt. Diese Elektronen interagieren mit den eingefangenen Ionen. Nach einer Periode, die für eine effiziente Reaktion der Ionen mit den Elektronen lang genug ist, jedoch nicht dafür ausreicht, dass alle Probenionen fragmentieren, werden die Bruchstückionen in der Paul-Falle (36) zum Nachweis massenselektiv ausgeworfen, nicht jedoch die verbleibenden unfragmentierten Probenionen. Das Spektrum nachgewiesener Ionen wird im Computerspeicher des Datensystems (47) gespeichert. Anschließend sendet der IR-Laser (19) eine Zeit lang einen Photonenstrahl (20) aus, der das IR-Fenster (21) passiert und intensiv genug ist, um einen Infrarot-Multiphoton-Zerfall (IRMPD) derjenigen Probenionen zu erzeugen, die in der Paul-Falle (36) nach der Bestrahlung mit Elektronen intakt geblieben sind. Ein weiterer Auswurf und Nachweis führt zum IRMPD-Massenspektrum der Probenionen, das ebenfalls im Computerspeicher der Datenstation (47) gespeichert wird. Nach Erstellung von zwei aufeinanderfolgenden Tandem-Massenspektren derselben Gesamtheit von Probenionen initiiert die Datenstation (47) einen Impuls, der die restlichen Ionen aus der Paul-Falle (36) treibt, und startet einen weiteren Zyklus von Messungen durch Verringerung des Potenzials an der Extraktionselektrode (9). Da sich die Ionen während beider Fragmentierungsereignisse kontinuierlich in der Multipol-Falle (8) angesammelt haben, wurden keine Probenionen verschwendet; es kann somit die Analyse mit höherer Empfindlichkeit durchgeführt werden als es der Stand der Technik nahe legt, bei dem für zwei Fragmentierungsversuche zwei Sammelperioden erforderlich sind.
4 zeigt das FTICR-Massenspektrum doppelt geladener positiver Ionen der Substanz P, nach 50 ms ECD mit selektiver Anregung der Zyklotron-Frequenzen aller Ionen außer den Probenionen erfasst. Das doppelt protonierte Molekül [M + 2H]²⁺ hat ein Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) von 674. Aufgrund parasitärer Seitenbandanregung wird noch ein schwaches Signal der unfragmentierten Probenionen nachgewiesen.
5 zeigt das FTICR-Massenspektrum nach Infrarot-Multiphoton-Zerfall (IRMPD) der doppelt protonierten Moleküle von Substanz P, für die während der 50 ms langen Interaktion (4) mit den Elektronen keine Fragmentierung durch Elektroneneinfang (ECD) stattgefunden hat. Das Spektrum wurde mit einer Breitbandanregung von Zyklotron-Frequenzen aller Ionen erfasst.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können zwei unterschiedliche Fragmentierungsmethoden, insbesondere ein Zerfall durch Elektroneneinfang und ein Zerfall durch Vibrationsanregung, nacheinander auf dieselbe Gesamtheit von Ionen in der ICR-Falle angewandt werden. Dieses Verfahren wird vorteilhaft so angewandt, dass zuerst die Fragmentierung primärer Ionen durch Elektroneneinfang erfolgt. Nach der Zyklotron-Anregung und dem Nachweis der ECD-Bruchstückionen werden die übrigen, nicht zerfallenen primären Ionen zum Schwingen angeregt, z. B. mittels Infrarot-Laserstrahl. Die fragmentierten Ionen des zweiten Schritts werden ebenfalls angeregt und nachgewiesen. Doch die Reihenfolge dieser beiden Schritte lässt sich auch umkehren, d. h. die primären Ionen können zuerst zum Schwingen angeregt werden, womit ein Teil von ihnen fragmentiert wird. Die Bruchstückionen können angeregt und nachgewiesen werden, ohne die übrigen, nicht zerfallenen primären Ionen anzuregen. Die nicht zerfallenen Ionen können nun einem Elektronenstrahl ausgesetzt werden und durch Elektroneneinfang zerfallen. Die Produkte des Zerfalls durch Elektroneneinfang werden dann ebenfalls angeregt und nachgewiesen.
Der Zerfall von Ionen durch Elektroneneinfang geschieht normalerweise durch Interaktion mit freien Elektronen. Vielfach positiv geladene Ionen (wie bei vielfach protonierten Spezies) können jedoch auch mit negativen Ionen oder mit hoch angeregten Neutralteilchen interagieren, wobei ein Elektron von dem vielfach geladenen positiven Ion „eingefangen" wird. Dieser Prozess kann auch zu einer ECD-ähnlichen Fragmentierung des positiven Ions führen. Somit können nicht nur freie Elektronen für das ECD-Verfahren verwendet werden, sondern auch angelagerte Elektronen.

Claims

Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie, bestehend aus folgenden Schritten: a) Sammeln von Probenionen in einer Ionenfalle; b) Anwenden einer ersten Fragmentierungsart, womit ein Teil der Probenionen zu Bruchstückionen fragmentiert; c) Aufnahme eines Massenspektrums der Bruchstückionen der ersten Fragmentierungsart, wobei die nicht fragmentierten Probenionen in der Ionenfalle gehalten werden; d) Anwenden einer zweiten Fragmentierungsart auf die nicht fragmentierten Probenionen, und e) Aufnahme eines Massenspektrums der Bruchstückionen der zweiten Fragmentierungsart.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Fragmentierungsarten auf Reaktionen der Probenionen mit Elektronen beruht, also entweder auf Elektroneneinfang (ECD), auf einem Einfang heißer Elektronen (HECD), auf Elektronenablösung (EDD), auf einem Transfer von Elektronen von negativen Ionen zu positiven Probenionen (ETD) oder auf einem Transfer von Elektronen von hoch angeregten Neutralteilchen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Fragmentierungsarten auf der Anregung innermolekularer Schwingungssysteme beruht, entweder durch Stöße von Ionen mit Neutralteilchen, Stöße von Ionen mit höher energetischen Elektronen oder durch Absorption von Photonen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Licht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Fragmentierungsart eine Reaktion der Probenionen mit Elektronen, und die zweite Fragmentierungsart eine Fragmentierung durch Vibrationsanregung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Messung der Bruchstückionen der ersten Fragmentierungsart alle restlichen Bruchstückionen aus der Ionenfalle entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mehrfach geladene Probenionen mit gewünschter ladungsbezogener Masse selektiert werden, bevor die erste Fragmentierungsart angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mehrfach geladene Probenionen durch Elektrosprüh-Ionisierung bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenionen eine positive Polarität haben, dass freie Elektronen für die Reaktionen mit den Probenionen verwendet werden, und dass die Energie mindestens eines Teils der Elektronen entweder unter 3 eV liegt, um Zerfall durch Elektroneneinfang zu ermöglichen, oder im Bereich von 10 eV bis 20 eV liegt, um Fragmentierung durch Einfang heißer Elektronen zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen eine negative Polarität haben, dass freie Elektronen für die Reaktionen mit den Probenionen verwendet werden, und dass die Energie mindestens eines Teils der Elektronen im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 eV liegt, um Fragmentierung durch Elektronenablösung zu erreichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Gasdruck in der Ionenfalle während der Anwendung der Fragmentierungen erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenfalle eine dreidimensionale Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle, eine lineare Hochfrequenz-Multipol-Ionenfalle oder eine Ionen-Zyklotron-Resonanz-Ionenfalle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Probenionen in einem räumlich begrenzten Bereich sammeln, bevor sie in die Ionenfalle geleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der räumlich begrenzte Bereich eine dreidimensionale Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle, eine lineare Hochfrequenz-Multipol-Ionenfalle oder eine Ionen-Zyklotron-Resonanz-Ionenfalle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der räumlich begrenzte Bereich zur Selektion der Probenionen in einem gewünschten Bereich von m/z-Werten verwendet wird.