DE102004030285B4

DE102004030285B4 - Gefrierkonservierung von Eiern und Embryonen von Fischen

Info

Publication number: DE102004030285B4
Application number: DE200410030285
Authority: DE
Inventors: Franz Lahnsteiner; Alois Glienke
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2024-06-24
Also published as: DE102004030285A1; WO2006000425A2; WO2006000425A3

Abstract

Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen umfassend folgende Schritte:
a) Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in einer ersten Gefrierschutzlösung, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird; die erste Gefrierschutzlösung enthaltend
(1) 200 mmol/l NaCl, 12 mmol/l KCl, 10 mmol/l CaCl₂, 2 mmol/l MgCl₂, 2 mmol/l MgSO₄ und 5 mmol/l Zitrat,
(2) eine interne Gefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, wobei die interne Gefrierschutzsubstanz in der ersten Gefrierschutzlösung als Gemisch aus Methanol 3 Gew.-% und Propandiol 5 Gew.-% vorliegt,
(3) 2,5 Gew.-% Glucose als externe Gefrierschutzsubstanz, die nicht in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, und
(4) eine Puffersubstanz,
b) Inkubieren der nach Schritt a) erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonen in einer zweiten Gefrierschutzlösung, die eine höhere Konzentration als die unter Schritt a) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt, wobei...

Description

Die kommerzielle Aufzucht von Fischen wird heutzutage im wesentlichen in Fischfarmen mit Hilfe der künstlichen Besamung von Fischeiern durchgeführt. Da jedoch die Qualität wie auch die Menge von Samen und Eiern von Fischen in solchen Zuchtbetrieben aufgrund äußerer Einflüsse stark schwankt und sich auch im Verlauf der Laichzeit und mit dem Alter der Fische verändert (Billard et al. 1971, Stoss 1983, Büyükhatipoglu & Holtz 1984), ist eine Sicherstellung einer gleichbleibenden Samenqualität wie auch die gleichmäßige Verfügbarkeit von Samen, Fischeiern und Fischembryonen zu jedem Zeitpunkt eines Produktionszyklus von äußerstem wirtschaftlichen Interesse.
Neben dem rein wirtschaftlichen Interesse bei der kommerziellen Aufzucht von Fischen besteht auch ein besonderes Interesse bei der Erhaltung anderer, nicht kommerziell genutzter Fischarten. Viele Fischarten zählen heute bereits zu gefährdeten Tierarten und sind in den „Roten Listen gefährdeter Tierarten" zu finden. In vielen Ländern werden heute bereits zahlreiche Schutzmaßnahmen durchgeführt, wie Revitalisierung der Gewässer, Schutz der natürlichen Ressourcen und Habitatmanagement mit möglichst geringem anthropogenem Einfluß. Diese Maßnahmen sind jedoch längerfristig. Stark gefährdete Arten und stark gefährdete autochthone Rassen können allerdings ausgestorben sein, bevor diese Maßnahmen greifen, da in solchen Populationen die Individuenzahl zu gering ist, um die natürliche Reproduktion in ausreichender genetischer Variabilität zu gewährleisten (Gilpin und Soule 1986). Daher ist auch hier die Anlage von Depots von Embryonen oder Eiern und Samen zur Konservierung von genetischem Material in genügend hoher Variabilität von hohem Interesse, um bei künstlichen Nachzucht- und Wiederbesatzmaßnahmen stabile Populationen zu erzielen. Ein Verfahren zur Konservierung von Embryonen oder Eiern besitzt daher eine besondere Bedeutung in der Erhaltung der Biodiversität.

In bisherigen Verfahren werden Samen und Rogen aus Fischen aufgrund ihrer mangelnden Haltbarkeit bei physiologischen Bedingungen jedoch üblicherweise direkt nach ihrer Gewinnung verarbeitet. Versuche zur Konservierung von Samen und Rogen von Fischen sind im Stand der Technik zwar bekannt, führten jedoch lediglich im Rahmen der Konservierung von Fischsamen zu Erfolgen, wie beispielsweise in der EP 1 223 805 B1 , in Lahnsteiner, F. [u.a.]: The cryopreservation of spermatozoa of the burbot, Lota lota (Gadidae, Telestei), Cryobiology, 2002, Vol. 45, S. 195-203, oder in Lahnsteiner, F. [u.a.]: Cryopreservation of semen of the grayling (Thymallus thymallus) and the Danube salmon (Hucho hucho), Aquaculture, 1996, Vol. 144, S. 265-274 beschrieben ist.

Versuche zur Konservierung von Fischeiern und Fischembryonen dagegen, insbesondere der Gefrierkonservierung von Fischeiern und Embryonen, sind jedoch kaum bekannt und mit Ausnahme von sehr grundlegenden Untersuchungen sind auf diesem Gebiet kaum Erfolge vorzuweisen. Die bisher veröffentlichten grundlegenden Studien untersuchen im wesentlichen die Permeabilität von Fischeiern sowie die Diffusion von Gefrierschutzsubstanzen in diese Systeme (z.B. Hagedorn, M., E. Hsu, F. W. Kleinhans, and D. E. Wildt 1997. New approaches for studying the permeability of fish embryos: Toward successful cryopreservation. Cryobiology. 34: 335-347; und Hagedorn, M., S.L. Lance, D. M. Fonseca, F.W. Kleinhans, D. Artimov, R. Fleischer, A.T.M.S. Hoque, and B.S. Pukanzhenthi 2002. "Altering the membranes of fish embryos with aquaporin-3: an essential step for cryopreservation", Biology of Reproduction 67:961-966).

In Robles, V. [u.a.]: Effect of a vitrification protocol on the lactate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase activities and the hatching rates of Zebrafish (Danio rerio) and Turbot (Scophthalmus maximus) embryos, Theriogenology, 2004, Vol. 61, S. 1367-1379, ist ein Verfahren zur Vitrifikation von Embryos des Steinbutt und des Zebrafisches beschrieben. Die Embryonen werden dazu nacheinander in 4 Lösungen inkubiert, welche steigende Konzentrationen an Gefrierschutzsubstanzen enthalten. Nach der Vitrifikation konnte kein Überleben festgestellt werden.

Janik, M. [u.a.]: Overcoming a permeability barrier by microinjecting cryoprotectants into Zebrafish embryos (Brachydanio rerio), Cryobiology, 2000, Vol. 41, S. 25-34 untersucht die Toxizität der Gefrierschutzsubstanzen DMSO und Propylenglykol auf Zebrafisch-Embryonen. Die Gefrierschutzsubstanzen werden per Mikroinjektion direkt in den Dotter eingebracht. Embryonen, die nach der Mikroinjektion einer Vitrifikation unterzogen wurden, waren nicht lebensfähig.

Im Wesentlichen sind heutzutage zwei Varianten der Konservierung von lebenden biologischen Proben bekannt: die klassische Gefrierkonservierung und die Vitrifikation.

Die klassische Gefrierkonservierung stellt ein Verfahren zum langsamen und kontrollierten Einfrieren von biologischen Proben dar. Dabei wird die Probe zumeist einem Dampf aus Flüssigstickstoff ausgesetzt und sehr langsamen Abkühlungsraten unterworfen.

Ansätze zur klassischen Gefrierkonservierung sind z.B. aus Hagedorn et al. (1998) und Hagedorn et al. (2002) bekannt.

Eine Anwendung der klassischen Gefrierkonservierungsverfahren für die Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen war bislang jedoch nicht erfolgreich.

Eine Alternativtechnik zu der oben beschriebenen Gefrierkonservierung von biologischen Proben stellt die bereits erwähnte sogenannte Vitrifikation dar. Bei der Vitrifikation werden den biologischen Proben zur Konservierung hohe Konzentrationen an Gefrierschutzsubstanzen zugegeben. Anschließend werden die Proben direkt in Flüssigstickstoff eingebracht, wodurch sehr hohe Einfrierraten erzielt werden. Dieses rasche Einfrieren hat zur Folge, dass in den Proben keine Veränderungen und insbesondere keine Eiskristallbildungen stattfinden können.

Vitrifikationsmethoden sind bisher jedoch lediglich für die Oozyten und Embryonen von Säugern bekannt und werden dort erfolgreich angewendet. In der WO 97/45010 A1 und der EP 1 326 492 B1 sind Verfahren zur Kryokonservierung von Geweben oder Organen mittels Vitrifikation beschrieben.

Eine Übertragung der für Oozyten und Embryonen von Säugern gefundenen Vitrifikationsbedingungen auf Fische war bislang jedoch nicht erfolgreich, da die physiologischen Vorrausetzungen bei Oozyten und Embryonen von Säugern gegenüber Fischen völlig unterschiedlich sind. Das Einfrieren von Fischeiern und Fischembryonen mittels der Vitrifikation stellt daher ein bislang ungelöstes Problem dar und die Problematik wird nur in wenigen Publikationen behandelt. (siehe z.B. Tian, YS, Chen, S.L., Yan, A.S., Ji, X.S., and Yu, G.C. (2003). Cryopreservation of the sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos by vitrification. Acta Zoologica Sinica 49: 843-850).

Ausgehend vom Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Konservierung von Eiern und/oder Embryonen von Fischen, das die gleichmäßige Verfügbarkeit von Fischeiern und/oder Fischembryonen zu jedem Zeitpunkt eines Produktionszyklus ermöglicht, anzugeben.

Die vorliegende Anmeldung offenbart eine isotonische Gefrierschutzlösung zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen enthaltend:

a) ein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalz;
b) eine interne Gefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren;
c) eine externe Gefrierschutzsubstanz, die nicht in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, und
d) eine Puffersubstanz.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen gemäß dem unabhängigen Anspruch 1.

Ebenfalls ist ein Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen umfassend folgende Schritte beschrieben:

a) Mikroinjektion von Fischeiern und/oder Fischembryonen mit der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird; und
b) Einfrieren der unter Schritt a) mikroinjizierten Fischeier und/oder Fischembryonen.

Ferner offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Auftauen von Fischeiern und/oder Fischembryonen, die nach einem der oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren wurden, umfassend den Schritt des Erwärmens der eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen 10-30 sec auf 30-40°C.

Ein Verfahren zum Revitalisieren von Fischeiern und/oder Fischembryonen, die nach dem vorhergenannten erfindungsgemäßen Verfahren aufgetaut wurden, umfasst das Einstellen der gewünschten Endkonzentration an internen und externen Gefrierschutzsubstanzen in den Fischeiern und/oder Fischembryonen und Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in einer isotonischen Lösung.

Die vorliegende Anmeldung offenbart weiterhin die Verwendung der Gefrierschutzlösung zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen.

Schließlich offenbart die vorliegende Anmeldung eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Kühlbox zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bestehend aus einer Kammer 1 mit Deckel 2 und einer über dem Boden angebrachten Überlaufvorrichtung 3, wobei die Kammer von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgeben ist und sich in der Kammer eine in vertikaler Richtung verstellbare Hebevorrichtung 6 befindet.

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben und werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung erläutert.

Beschreibung der Figuren

1. Vorrichtung zum Einbringen der Eier in die Verdünnerlösungen. 1 –äußeres Gefäß, 2 – inneres Gefäß mit durchbrochenem Boden aus Gitternetz, 3 – Handgriff, 4 – Fischeier und/oder Fischembryonen, 5 –isotonische Gefrierschutzlösung.

2. Vorrichtung zur Äquilibrierung von Fischeiern und -embryonen unter erhöhtem Druck. 1 – Druckkammer, 2 – Gefäß mit Eiern, 3 – Deckel der Druckkammer, 4 – Kolben mit Gewinde, 5 – Eier bzw. Embryonen, 6 –Manometer, 7 isotonische Gefrierschutzlösung. Der Druck wird durch manuelles Hineinschrauben des Kolbens erhöht.

3. Kühlbox zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bestehend aus einer Kammer 1 mit Deckel 2 und einer über dem Boden angebrachten Überlaufvorrichtung 3 mit einem Überlaufventil; Die Kammer ist von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgeben; In der Kammer befindet sich eine in vertikaler Richtung verstellbare Hebevorrichtung 6, die optional einen Rost 7 zum Auflegen von Gefriergut besitzt und optional eine Fixierschraube 8 und eine Halterung für den Rost 9;

Wie bereits oben erwähnt offenbart die vorliegende Anmeldung eine isotonische Gefrierschutzlösung zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen sowie Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen. Das Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen umfasst folgende Arbeitsschritte: Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in einer isotonischen Gefrierschutzlösung, um eine Durchdringung mit Gefrierschutz zu erreichen, Einfrieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in flüssigem Stickstoff, sowie optional Lagerung in Flüssigstickstoff, Auftauen und/oder Revitalisierung der eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen.

Im Folgenden sollen die einzelnen Stadien des Verfahrens sowie der Gefrierschutzlösung und die in den abhängigen Ansprüchen beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert werden.

1. Isotonische Gefrierschutzlösung

Die Grundlage für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der isotonischen Gefrierschutzlösung zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen. Diese isotonische Gefrierschutzlösung enthält ein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalz, eine interne Gefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, eine externe Gefrierschutzsubstanz, die nicht in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, und eine Puffersubstanz.

Das Alkalimetallsalz wird aus Natrium- und Kaliumsalzen und das Erdalkalimetallsalz aus Magnesium- und Kalziumsalzen ausgewählt. Bevorzugt werden als Alkalimetallsalze NaCl und KCl und als Erdalkalimetallsalze CaCl₂ und MgSO₄ oder CaCl₂ und MgCl₂ verwendet.

Die Alkalimetallsalze bzw. die Erdalkalimetallsalze können in der isotonischen Gefrierschutzlösung jeweils in folgenden Konzentrationen vorliegen:
NaCl bevorzugt in einem Bereich von 100-200 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 oder 200 mmol/l;
KCl bevorzugt in einem Bereich von 2.5-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
MgSO₄ bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
MgCl₂ bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
CaCl₂ bevorzugt in einem Bereich von 2.5-10 mmol/l und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2.5, 5, 7.5 oder 10 mmol/l.

In der isotonischen Gefrierschutzlösung ist weiterhin eine Puffersubstanz enthalten. Diese Puffersubstanz wird bevorzugt ausgewählt aus einer der Substanzen HEPES, Tris und Triethanolamin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt die Puffersubstanz in der Gefrierschutzlösung in der folgenden Konzentration vor:
Tris im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 8-9, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 8-9, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 8-9.

HEPES im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-7, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-7, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 6-7.

Triethanolamin im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-8, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-8 und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 6-8.

Beispiele bevorzugter Kombinationen der oben aufgeführten Alkali- und Erdalkalimetallsalze sowie von Puffern in der isotonischen Gefrierschutzlösung sind im folgenden in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Zusammensetzung der für die Gefrierkonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bevorzugten Alkali- und Erdalkalimetallsalze und Puffer. Alle Konzentrationen sind in mmol/l angegeben (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung).
Optional wird der isotonischen Gefrierschutzlösung NaHCO₃ als zusätzliches Salz zugegeben. Die Konzentration von NaHCO₃ in der isotonischen Gefrierschutzlösung beträgt vorzugsweise 2.5-15 mmol/l und liegt bevorzugt in einem Bereich von 5-15 mmol/l, vorzugsweise von 7.5-15 mmol/l oder besonders bevorzugt von 7.5-12,5 mmol/l. Besonders bevorzugt liegt die Konzentration von NaHCO₃ in einer Konzentration von 7.5, 8, 8.5 9, 9.5 oder 10 mmol/l, und noch bevorzugter in einer Konzentration von 10 mmol/l vor.
Die isotonische Gefrierschutzlösung enthält weiterhin eine interne Gefrierschutzsubstanz. Diese interne Gefrierschutzsubstanz ist vorzugsweise in der Lage, in die Eier zu diffundieren, um dort die Eiskristallbildung in den Fischeiern und/oder Fischembryonen zu verhindern. Geeignete Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Die interne Gefrierschutzsubstanz wird bevorzugt ausgewählt aus mindestens einer der Verbindungen Dimethylazetamid, Dimethylsulfoxid, Glyzerin, Methanol, Polyethylenglykol und/oder Propandiol.
Die interne Gefrierschutzsubstanz liegt in der isotonischen Gefrierschutzlösung bevorzugt in einer Konzentration von 1-40 Gew.-%, ebenfalls bevorzugt in einer Konzentration von 10-40 Gew.-%, und von 15-40 Gew.-%, 20-40 Gew.-%, 25-40 Gew.-%, 30-40 Gew.-% oder 35-40 Gew.-% vor, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 Gew.-% und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von 40 Gew.-%.
Die interne Gefrierschutzsubstanz kann in der isotonischen Gefrierschutzlösung auch als Gemisch der oben genannten Verbindungen vorliegen. In einer besonderen Ausführungsform liegt die interne Gefrierschutzsubstanz als Gemisch der Verbindungen Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glyzerin, oder Dimethylsulfoxid (DMSO) und Methanol, oder Methanol und Glyzerin vor. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Gemisch in folgenden Konzentrationen vor (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung):
Dimethylsulfoxid (DMSO) 10-20 Gew.-% + Glyzerin 5-10 Gew.-%;
Dimethylsulfoxid (DMSO) 10-20 Gew.-% + Methanol 5-10 Gew.-%; oder
Methanol 10-20 Gew.-% + Glyzerin 5-20 Gew.-%.
Beispiele besonders bevorzugter Konzentrationen der internen Gefrierschutzsubstanz in der isotonischen Gefrierschutzlösung sind im folgenden in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2: Interne Gefrierschutzsubstanzen, die zur Gefrierkonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen verwendet werden können (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung).
Die isotonische Gefrierschutzlösung enthält neben der internen Gefrierschutzsubstanz eine externe Gefrierschutzsubstanz. Diese externe Gefrierschutzsubstanz ist im Unterschied zu der internen Gefrierschutzsubstanz bevorzugt nicht in der Lage, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren. Die Aufgabe der externen Gefrierschutzsubstanz ist der Entzug von Wasser aus den Fischeiern und/oder Fischembryonen, was aufgrund des entstehenden osmotischen Gradienten zwischen den Fischeiern und/oder Fischembryonen und ihrer Umgebung ermöglicht wird. Die Reduktion von Zellwasser in den Fischeiern und/oder Fischembryonen verhindert die Eiskristallbildung und erleichtert damit das Einfrieren. Weiterhin verhindert der Entzug von Wasser ein Platzen der Zellen während des Schrittes des Einfrierens und ist damit essentiell für das Überleben der Fischeier und/oder Fischembryonen während des Einfrierens und bei der Lagerung im gefrorenen Zustand. Geeignete Substanzen sind dem Fachmann bekannt.
Die externe Gefrierschutzsubstanz wird vorzugsweise ausgewählt aus mindestens einer der Verbindungen Dextran, Glyzin, Maltose, Saccharose, Glukose, Galaktose und/oder Stärke.
In einer besonderen Ausführungsform liegt die externe Gefrierschutzsubstanz in der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentration von 2,5-10 Gew.-%, bevorzugt in einer Konzentration von 5-10 Gew.-% oder von 7,5-10 Gew.-% vor, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2,5, 5, 7,5 oder 10 Gew.-%.
Besonders bevorzugte Konzentrationen der externen Gefrierschutzsubstanz in der isotonischen Gefrierschutzlösung sind im folgenden in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: Externe Gefrierschutzsubstanzen, die zur Gefrierkonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen verwendet werden können (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung).
Die Konzentrationen von internen und externen Gefrierschutzsubstanzen und die Einfrierbedingungen unterliegen einer engen Wechselbeziehung, d.h. die Einfrierbedingungen sind von der Zusammensetzung der isotonischen Gefrierschutzlösung abhängig und umgekehrt.
Diese Wechselbeziehung beruht auf folgenden Grundlagen: Bei niedrigen Einfrierraten frieren Zellen langsamer, durch das langsame Einfrieren wird ihnen mehr Wasser entzogen. Das hier zugrundeliegende physikalische Prinzip beruht auf Kristallisationseffekten des Wassers. Beispielsweise führen hohe Konzentrationen von internen und externen Gefrierschutzen schon vor dem Einfrieren aufgrund von Osmose zu einem Wasserentzug aus den Zellen. Würden in diesem Fall zum Einfrieren zusätzlich geringe Einfrierraten verwendet, wird der Wasserentzug so hoch, dass dies für die Zellen tödlich sein kann. Bei hohen Konzentrationen von Gefrierschutzen werden daher bevorzugt hohe Einfrierraten verwendet und umgekehrt.
Besonders bevorzugt werden für die Gefrierkonservierung im klassischen Sinn die Gefrierschutzsubstanzen in geringeren Konzentrationen verwendet als für die Vitrifikation.
Der Begriff „Gefrierkonservierung" soll in der vorliegenden Beschreibung so verstanden werden, dass sowohl die klassische Gefrierkonservierung wie auch die Vitrifikation mit umfasst sind.
Die isotonische Gefrierschutzlösung besitzt daher in einer besonderen Ausführungsform ein Verhältnis von interner Gefrierschutzsubstanz zu externer Gefrierschutzsubstanz in der Gefrierschutzlösung von 10-40 Gew.-% : 5-10 Gew.-%.
Besonders bevorzugte Verhältnisse von interner Gefrierschutzsubstanz zu externer Gefrierschutzsubstanz in der Gefrierschutzlösung sind in den folgenden Tabellen 4 und 5 angegeben.
Tabelle 4. Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutrsubstanzen und Einfriertemperaturen für die Gefrierkonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutrlösung) (* = Dextran, Glyzin, Maltose, Sacharose, Glukose und/oder Stärke)
Tabelle 5. Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutzsubstanzen (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung) für die Vitrifikation von Fischeiern und/oder Fischembryonen. Die Einfriertemperatur liegt bei allen hier genannten internen und externen Gefrierschutzsubstanzen bei –196°C und wird durch Immersion in Flüssigstickstoff durchgeführt. (* = Dextran, Glyzin, Maltose, Sacharose, Glukose und/oder Stärke)
Insbesondere wenn die Fischeier und/oder Fischembryonen sensibel gegenüber Abkühlung reagieren und ein hohes Temperaturoptimum aufweisen, z.B. bei Warmwasserfischarten, können Substanzen zugegeben werden, die das Eindringen des Gefrierschutzes erleichtern sowie die Zellphysiologie und den Stoffwechsel stabilisieren. Solche Substanzen sind beispielsweise die Energiesubstrate Oxalazetat, Pyruvat, Zitrat, Isozitrat, und Phosphoenolpyruvat. Zur Membranstabilisierung dienen beispielsweise Verbindungen wie Phosphatidylcholin, Cholin und Lysolecithin. Weitere geeignete Substanzen sind dem Fachmann bekannt.
Zusätzlich zu den bereits genannten internen und externen Gefrierschutzsubstanzen kann die isotonische Gefrierschutzlösung daher als Energiesubstrate mindestens eine weitere Verbindung enthalten ausgewählt aus mindestens einer der Verbindungen Oxalazetat, Pyruvat, Zitrat, Isozitrat und/oder Phosphoenolpyruvat.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform liegt die weitere Verbindung in der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentration von 1-10 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentration von 2-8 mmol/l oder von 4-6 mmol/l vor, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 4, 5 oder 6 mmol/l. Am stärksten bevorzugt liegt die weitere Verbindung in der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentration von 5 mmol/l vor.
Zusätzlich zu den bereits aufgeführten möglichen Bestandteilen der isotonischen Gefrierschutzlösung kann die isotonische Gefrierschutzlösung, insbesondere zur Membranstabilisierung, ebenfalls mindestens eine weitere Verbindung enthalten ausgewählt aus mindestens einer der Verbindungen Phosphatidylcholin, Cholin und Lysolecithin.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform liegt diese weitere Verbindung in der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentration von 0,1 Gew-%, 0,25 Gew-%, 0,5 Gew-%, 1 Gew-% vor.
2. Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in der isotonischen Gefrierschutzlösung
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Fischeier und/oder Fischembryonen in mehreren der oben beschriebenen isotonischen Gefrierschutzlösungen inkubiert, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit diesen Gefrierschutzlösungen erreicht wird.
In diesem Zusammenhang ist für die Gefrierkonservierung der Fischeier und/oder Fischembryonen das Verhältnis von Fischeiern und/oder Fischembryonen zu der isotonischen Gefrierschutzlösung von besonderer Bedeutung, um eine Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit der internen Gefrierschutzsubstanz zu gewährleisten. Das Verhältnis von isotonischer Gefrierschutzlösung zu Fischei und/oder Fischembryo beträgt vorzugsweise 1-2 g Fischei- und/oder Fischembryogewebe pro 5 ml der isotonischen Gefrierschutzlösung. Da die Fischeier und/oder Fischembryonen empfindliche Objekte darstellen, werden sie mit speziellen Netzeinsätzen, die beispielhaft in 1 dargestellt sind, in die isotonische Gefrierschutzlösung eingebracht. Diese Netzeinsätze werden auch dazu verwendet, um die Fischeier und/oder Fischembryonen von einer isotonischen Gefrierschutzlösung in eine andere isotonische Gefrierschutzlösung zu überführen.
In weiteren Schritten werden die nach dem ersten Schritt erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonen in drei weiteren Gefrierschutzlösungen inkubiert, die eine höhere Konzentration, insbesondere an internen Gefrierschutzsubstanzen, als die im ersten Schritt verwendete Gefrierschutzlösung besitzen.
Besonders vorteilhaft zur erfolgreichen Gefrierkonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen ist dabei, eine homogene Durchdringung (Permeation) der Fischeier und/oder Fischembryonen mit der internen Gefrierschutzsubstanz zu erzielen.
Um diese homogene Durchdringung zu erreichen werden die Fischeier und/oder Fischembryonen gemäß den Schritten a) bis d) des Anspruches 1 in einer Serie von isotonischen Gefrierschutzlösungen inkubiert, die die internen Gefrierschutzsubstanzen in aufsteigenden Konzentrationen enthalten.
Das physikalische Umfeld für Verringerung der Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutzsubstanzen kann bei der Inkubation variiert werden. Bevorzugt findet das Inkubieren bei einem Druck zwischen 250 bar und Normaldruck, bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einen Zeitraum von 5 bis 20 min statt. Entsprechend der Empfindlichkeit der Fischeier und/oder Fischembryonen wird die Inkubation besonders bevorzugt auf folgende Weise variiert. Diese Modifikationen beruhen auf der Kenntnis, dass die Vitalfunktionen der Eier und Embryonen umso weniger beeinflusst werden, je geringer die Temperatur und der ausgeübte Druck sind. Die sogenannte "ultraslow equilibration" wird bei Normaldruck, –4°C (supercooling) und Inkubationszeiten von 20 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, und für sehr empfindliche Eier und Embryonen eingesetzt. Die sogenannte „slow equilibration" wird bei Normaldruck, 4°C und Inkubationszeiten von 15 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, die sogenannte „low speed equilibration" bei 15-20°C, Normaldruck und Inkubationszeiten von 10 min je Konzentrationsgradient durchgeführt. Die sogenannte „high speed equlibration" wird bei erhöhtem Druck von 250-500 bar in Druckkammern, 15-20°C und Inkubationszeiten von 5 min je Konzentrationsgradient durchgeführt. Der Aufbau einer Druckkammer ist beispielhaft in 2 dargestellt.
Bei Fischeiern und/oder Fischembryonen mit extrem undurchlässiger Eischale und Zellmembran können die Fischeier und/oder Fischembryonen vor der Inkubation in der Gefrierschutzlösung mit biologischen Detergentien permeabilisiert werden. Dies stellt eine Sonderform der Permeabilisierung für Eier und Embryonen mit sehr undurchlässiger Eischale und Zellmembran dar.
Geeignete Detergenzien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Detergenzien für die Permeabilisierung werden ausgewählt aus 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-2-hydroxypropansulfonat (CHAPSO), Glykocholsäure, Dodecyltrimethylammoniumbromid oder (p-tert-Octylphenoxy)polyethoxyethanol (Triton^® X-100).
Bevorzugt liegen die Detergenzien zur Permeabilisierung in der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentration von 0,001-0,01 Gew.-% vor, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,004-0,006 Gew.-% und noch bevorzugter in einer Konzentration von 0,005 Gew.-%.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Inkubation der Fischeier in der Gefrierschutzlösung im Stadium der Quellung und Wasserhärtung. Dabei werden die Fischeier bevorzugt befruchtet und anschließend, wie in der Aquakultur üblich, zur Quellung und Schalenaushärtung in Wasser inkubiert. Wird dem Wasser die isotonische Gefrierschutzlösung zugegeben, kann die interne Gefrierschutzsubstanz aufgrund der Quellung passiv in den perivitellinen Spalt und von dort in das Innere des Eis gelangen. Alternativ können die Eier direkt in die isotonische Gefrierschutzlösung gebracht werden. Dieses Verfahren wird bevorzugt für Eier von Süßwasserfischen angewendet, die >20% ihres Gesamtgewichts an Wasser aufnehmen.
In einem alternativen Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen kann die Gefrierschutzlösung in die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt über eine Mikroinjektion so in die Fischeier und/oder Fischembryonen eingebracht werden, dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit der erfindungsgemäßen isotonischen Gefrierschutzlösung erreicht wird.
Diese Alternative ist insbesondere für Fischeier und/oder Fischembryonen mit extrem undurchlässiger Eischale und Zellmembran geeignet. Die Gefrierschutzlösung wird dabei in die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt mittels Mikrospritzen entsprechend den gewünschten und in Tabelle 1 dargestellten Endkonzentrationen injiziert. Dieses Verfahren kann bevorzugt für Arten mit großen Eiern, und noch stärker bevorzugt bei Salmoniden, angewandt werden.
Bevorzugt wird das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren für Meeresfische und Süßwasserfische der Ordnung Teleoster eingesetzt.
3. Einfrieren der inkubierten Fischeier und/oder Fischembryonen
Im Anschluß an das oben dargestellte erfindungsgemäße Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen werden in einem anschließenden Schritt die mit der isotonischen Gefrierschutzlösung injizierten und/oder inkubierten Fischeier und/oder Fischembryonen eingefroren.
Zum Einfrieren werden die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt in Gefäße verpackt und in diesen Gefäßen eingefroren. Dabei stehen bevorzugt die folgenden zwei Verfahren zur Auswahl.
Einerseits kann das Einfrieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in der isotonischen Gefrierschutzlösung erfolgen. Die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebende isotonische Gefrierschutzlösung wird dabei vor dem Einfrieren nicht entfernt. Zum Einfrieren der Fischeier und/oder Fischembryonen werden handelsübliche 0,5-1,2 ml Pailletten verwendet. Alternativ können die Fischeier und/oder Fischembryonen in Pellets eingefroren werden.
Um das Gesamtvolumen des Einfriergutes zu verringern und in den Fischeiern und/oder Fischembryonen homogenere Einfrierraten zu erzielen, kann andererseits die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebende isotonische Gefrierschutzlösung vor dem Einfrieren entfernt werden, d.h. die Fischeier und/oder Fischembryonen werden im „trockenen" Zustand eingefroren. Zum Einfrieren können die Fischeier und/oder Fischembryonen, bevorzugt in den in 1 beschriebenen Netzeinsätzen, direkt in den Stickstoffdampf bzw. in den Flüssigstickstoff eingebracht werden. Dieses Einfrierverfahren wird bevorzugt für wasserreiche Embryonen und für große Fischeier und/oder Fischembryonen eingesetzt.
Das Einfrieren der Eier und Embryonen findet erfindungsgemäß durch direkte Immersion in Flüssigstickstoff statt. Das Einfrieren im Dampf von Flüssigstickstoff wird per Definition als „klassische Gefrierkonservierung" bezeichnet, die Immersion in Flüssigstickstoff, die mit sehr hohen Einfrierraten verbunden ist, als „Vitrifikation".
Das für die vorliegende Erfindung eingesetzte offene System ist schematisch in 3 dargestellt.
Bevorzugt besteht das System aus einer Kühlbox zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen, die eine Kammer 1 mit Deckel 2 und eine über dem Boden angebrachte Überlaufvorrichtung 3 besitzt, wobei die Kammer 1 von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgeben ist und sich in der Kammer 1 eine in vertikaler Richtung verstellbare Hebevorrichtung 6 befindet. Bevorzugt besitzt die Hebevorrichtung 6 einen Rost 7 zum Auflegen von Gefriergut.
Noch bevorzugter ist die Kühlbox dickwandig isoliert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betragen die Innendimensionen dieser Kühlbox 37 × 28 × 43 cm (Länge × Breite × Höhe). 4 cm über dem Boden besitzt diese Kiste vorzugsweise ein Überlaufrohr mit einem Überlaufventil. Bis zu diesem Überlaufrohr kann die Kühlbox mit Flüssigstickstoff befüllt werden. Die in der Kammer 1 angebrachte in vertikaler Richtung verstellbare Hebevorrichtung 6 kann bevorzugt stufenlos in vertikaler Richtung justiert werden. Unterschiedliche Abstände der verstellbaren Hebevorrichtung 6 und des optional auf dem Rost 7 aufgebrachten Gefriergutes vom Flüssigstickstoffspiegel bedingen verschiedene Einfriertemperaturen und damit unterschiedliche Einfrierraten. Zusätzlich kann der Rost 7 mechanisch mit einer Geschwindigkeit von 2-10 mm/min abgesenkt werden, um spezifische Einfrierraten festzulegen. Zur Vitrifikation wird das Einfriergut vorzugsweise direkt in Flüssigstickstoff eingebracht. Für die klassische Gefrierkonservierung wird das Einfriergut dagegen vorzugsweise über dem Flüssigstickstoffspiegel im Dampf des Flüssigstickstoffs gehalten. Für die Lagerung des Stickstoffs können die gängigen, einem Fachmann bekannten Stickstofflagerungsbehälter verwendet werden.
Haben die Fischeier und/oder Fischembryonen die bevorzugte Einfriertemperatur erreicht, ist der Einfriervorgang abgeschlossen.
Nach Abschluß der Einfrierphase können die eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen in Kühlmitteln oder Kühlvorrichtungen gelagert werden. Besonders bevorzugtes Kühlmittel für die Lagerung ist flüssiger Stickstoff. Als Kühlvorrichtung können alle im Stand der Technik bekannten Kühlvorrichtungen eingesetzt werden.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung konservierte und eingefrorene Fischeier sind nahezu unbegrenzt stabil. Theoretisch wird heute mit einer Abnahme der Vitalität bei einer Lagerung im Bereich von Millionen von Jahren spekuliert.
4. Auftauen
Nach Abschluß des Einfriervorganges und optional nach einer Lagerung in einem Kühlmittel oder einer Kühlvorrichtung können die eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen wieder aufgetaut werden.
Das Auftauen findet vorzugsweise für 10-30 sec bei 30-40°C statt und kann dabei vorzugsweise nach folgenden Verfahren erfolgen.
Fischeier und/oder Fischembryonen, die zusammen mit der isotonischen Gefrierschutzlösung in Pailletten eingefroren wurden, werden vorzugsweise dadurch aufgetaut, dass die Pailletten, enthaltend die Fischeier und/oder Fischembryonen, vorzugsweise für 10-30 sec in einem 30-40°C warmen Wasserbad erwärmt werden.
Fischeier und/oder Fischembryonen, die in Netzeinsätzen unter Entfernung des sie umgebenden isotonischen Gefrierschutzmittels eingefroren wurden, werden bevorzugt in der entsprechenden isotonischen Gefrierschutzlösung aufgetaut, in der sie vor dem Einfrieren inkubiert wurden. Bevorzugt werden die Fischeier und/oder Fischembryonen dabei zunächst in die isotonische Gefrierschutzlösung gegeben. Anschließend wird die isotonische Gefrierschutzlösung vorzugsweise für 10-30 sec auf 30-40°C erwärmt.
5. Entfernen der externen und internen Gefrierschutzsubstanzen aus den aufgetauten Fischeiern und/oder Fischembryonen
Nach dem Auftauen der Fischeier und/oder Fischembryonen werden in einem optionalen weiteren Schritt die externen und die internen Gefrierschutzsubstanzen aus den Fischeiern und/oder Fischembryonen entfernt. Das möglichst vollständige Entfernen der Gefrierschutzsubstanzen stellt einen wichtigen Vorgang dar, um die Lebensfähigkeit der aufgetauten Fischeier und/oder Fischembryonen zu optimieren, da die Gefrierschutzsubstanzen auf die Fischeier und/oder Fischembryonen bei Langzeitexposition im aufgetauten Zustand toxisch wirken können.
Die Entfernung der Gefrierschutzsubstanzen erfolgt bevorzugt durch stufenweise Verringerung der Konzentrationen der externen und der internen Gefrierschutzsubstanzen aus den Fischeiern und/oder Fischembryonen ähnlich zu jenem erfindungsgemäßen Verfahren, das zur Inkubation der Fischeier und/oder Fischembryonen in den externen und der internen Gefrierschutzsubstanzen angewendet wurde.
Die Fischeier und/oder Fischembryonen werden dazu zunächst nacheinander in mindestens einer isotonischen Gefrierschutzlösung, bevorzugt in einer Serie von isotonischen Gefrierschutzlösungen inkubiert, die die internen und externen Gefrierschutzsubstanzen in absteigenden Konzentrationen enthalten. Beginnend mit der höchsten Konzentration wird zunächst die Konzentration der externen Gefrierschutzsubstanz in Intervallen bevorzugt von 2,5 Gew.-% bis auf etwa 0 Gew.-% verringert. Anschließend wird die Konzentration der internen Gefrierschutzsubstanz in der isotonischen Gefrierschutzlösung in Intervallen bevorzugt von 5 Gew.-% bis auf etwa 0 Gew.-% verringert.
Das physikalische Umfeld für Verringerung der Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutzsubstanzen kann bei der Inkubation variiert werden. Bevorzugt findet das Inkubieren bei einem Druck zwischen Normaldruck und partiellem Vakuum bei 0,1-1 mbar, bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einen Zeitraum von 5 bis 20 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigung statt. Entsprechend der Empfindlichkeit der Fischeier und/oder Fischembryonen wird das physikalische Umfeld besonders bevorzugt auf folgende Weise variiert. Die sogenannte "ultraslow cryoprotectant removal method" wird bei Normaldruck, –4°C (supercooling) und Inkubationszeiten von 20 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, und für sehr empfindliche Eier und Embryonen angewandt. Die sogenannte „slow cryoprotectant removal method" wird bei Normaldruck, 4°C und Inkubationszeiten von 15 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, die sogenannte „low speed cryoprotectant removal method" bei 15-20°C, Normaldruck und Inkubationszeiten von 10 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, und die sogenannte „high speed penetration" bei partiellem Vakuum von 0,1 bis 1 mbar in Wasserstrahlvakuumpumpen.
6. Revitalisierung
Durch die Gefrierkonservierung können an Fischeiern und/oder Fischembryonen Schädigungen morphologischer, physiologischer und metabolischer Natur entstehen. Da Fischeier und/oder Embryonen multipotente noch nicht ausdifferenzierte Zellen oder Zellverbände darstellen, können die Verletzungen in der Regel gut kompensiert werden. Um die Ausbeute lebensfähiger Fischeier und/oder Fischembryonen zu erhöhen und um ein Absterben in späteren Entwicklungsstadien zu verhindern, können optional nach dem Auftauen der Fischeier und/oder Fischembryonen Revitalisierungstechniken angewendet werden. Dabei werden die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt nach dem Auftauen und dem Entfernen der Gefrierschutzsubstanzen nicht sofort in Süßwasser bzw. Meerwasser in den Erbrütungseinheiten von Fischzuchten weitererbrütet, sondern in einem speziellen Verfahren revitalisiert. Dazu werden sie in einer isotonischen Revitalisierungslösung inkubiert. Die isotonische Revitalisierungslösung enthält bevorzugt ein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalz und eine Puffersubstanz.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Alkalimetallsalz aus Natrium- und Kaliumsalzen und das Erdalkalimetallsalz aus Magnesium- und Kalziumsalzen ausgewählt. Bevorzugt werden als Alkalimetallsalze NaCl und KCl und als Erdalkalimetallsalze CaCl₂ und MgSO₄ oder CaCl₂ und MgCl₂ verwendet.
Die Alkalimetallsalze bzw. die Erdalkalimetallsalze können in der isotonischen Revitalisierungslösung jeweils in folgenden Konzentrationen vorliegen:
NaCl bevorzugt in einem Bereich von 100-200 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 oder 200 mmol/l;
KCl bevorzugt in einem Bereich von 2.5-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
MgSO₄ bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
MgCl₂ bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l;
CaCl₂ bevorzugt in einem Bereich von 2.5-10 mmol/l und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2.5, 5, 7.5 oder 10 mmol/l.
In der isotonischen Lösung ist weiterhin eine Puffersubstanz enthalten. Diese Puffersubstanz wird bevorzugt ausgewählt aus einer der Substanzen HEPES, Tris und Triethanolamin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt die Puffersubstanz in der isotonischen Revitalisierungslösung in der folgenden Konzentration vor:
Tris im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 8-9, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 8-9, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 8-9.
HEPES im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-7, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-7, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 6-7.
Triethanolamin im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-8, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-8 und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH 6-8.
Beispiele bevorzugter Kombinationen der oben aufgeführten Alkali- und Erdalkalimetallsalze sowie von Puffern in der isotonischen Revitalisierungslösung sind im folgenden in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6: Zusammensetzung der isotonischen Revitalisierungslösung für die Revitalisierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen. Alle Konzentrationen sind in mmol/l angegeben (Endkonzentrationen in der isotonischen Revitalisierungslösung).
Die Inkubationstemperatur beim Revitalisieren ist bevorzugt das dem Eityp entsprechende Temperaturoptimum. Das Temperaturoptimum ist bei den jeweiligen Arten unterschiedlich und unterscheidet sich von Spezies zu Spezies. Bei Kaltwasserarten liegt das Temperaturoptimum beispielsweise bei 4-15°C, bei Warmwasserarten bei >15-30°C.
Bei Kaltwasserarten erfolgt die Inkubation 48 h lang, bei Warmwasserarten 24 h. Eine Belüftung des Inkubationsmediums mittels gängiger Luftpumpen und Ausströmer ist notwendig, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Fischeier und/oder Fischembryonen zu gewährleisten. Die Inkubationsdichte beträgt 1-2 g Ei- bzw. Embryogewebe pro 5 ml isotonischer Revitalisierungslösung. Bei Fischarten, deren Eier eine sehr kurze Embryonalzeit haben und die demzufolge eine hohe Stoffwechselrate aufweisen, können bei der Revitalisierung Energiesubstrate zugegeben werden. Bevorzugt werden die Energiesubstrate ausgewählt aus Oxalazetat, Pyruvat und/oder Zitrat. Die Energiesubstrate werden vorzugsweise in einer Konzentration von 1-10 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentration von 2-8 mmol/l oder von 4-6 mmol/l eingesetzt, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 4, 5 oder 6 mmol/l. Am stärksten bevorzugt wird das Energiesubstrat in einer Konzentration von 5 mmol/l eingesetzt.
Nach der Inkubation der Fischeier und/oder Fischembryonen in der isotonischen Revitalisierungslösung ist das Revitalisierungsverfahren abgeschlossen. Die Fischeier und/oder Fischembryonen können anschließend in den Erbrütungseinheiten von Fischzuchten in Süßwasser oder Meerwasser weitergebrütet werden. Alternativ können die Fischeier und/oder Fischembryonen jeder beliebigen anderen Verwendung zugeführt werden.

Claims

Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen umfassend folgende Schritte: a) Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in einer ersten Gefrierschutzlösung, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird; die erste Gefrierschutzlösung enthaltend (1) 200 mmol/l NaCl, 12 mmol/l KCl, 10 mmol/l CaCl₂, 2 mmol/l MgCl₂, 2 mmol/l MgSO₄ und 5 mmol/l Zitrat, (2) eine interne Gefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, wobei die interne Gefrierschutzsubstanz in der ersten Gefrierschutzlösung als Gemisch aus Methanol 3 Gew.-% und Propandiol 5 Gew.-% vorliegt, (3) 2,5 Gew.-% Glucose als externe Gefrierschutzsubstanz, die nicht in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, und (4) eine Puffersubstanz, b) Inkubieren der nach Schritt a) erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonen in einer zweiten Gefrierschutzlösung, die eine höhere Konzentration als die unter Schritt a) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt, wobei die interne Gefrierschutzsubstanz in der zweiten Gefrierschutzlösung als Gemisch aus Methanol 6 Gew.-% und Propandiol 10 Gew.-% vorliegt; c) Inkubieren der nach Schritt b) erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonen in einer dritten Gefrierschutzlösung, die eine höhere Konzentration als die unter Schritt b) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt, wobei die interne Gefrierschutzsubstanz in der dritten Gefrierschutzlösung als Gemisch aus Methanol 9,75 Gew.-% und Propandiol 15 Gew.-% vorliegt; d) Inkubieren der nach Schritt c) erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonen in einer vierten Gefrierschutzlösung, die eine höhere Konzentration als die unter Schritt c) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt, wobei die interne Gefrierschutzsubstanz in der vierten Gefrierschutzlösung als Gemisch aus Methanol 13 Gew.-% und Propandiol 20 Gew.-% vorliegt; e) Verpacken der unter Schritt d) inkubierten Fischeier und/oder Fischembryonen in 0,5 bis 1,2 ml Pailletten; und f) Einfrieren der unter Schritt d) inkubierten Fischeier und/oder Fischembryonen in flüssigem Stickstoff.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischeier und/oder Fischembryonen vor dem Inkubieren in der Gefrierschutzlösung mit mindestens einem Detergenz permeabilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz ausgewählt wird aus (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-2-hydroxypropansulfonat (CHAPSO), Glykocholsäure, Dodecyltrimethylammoniumbromid und (p-tert-Octylphenoxy)polyethoxyethanol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischeier im Stadium der Quellung und Wasserhärtung in die Gefrierschutzlösung gegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren bei einem Druck zwischen 250 bar und Normaldruck, bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einen Zeitraum von 5 bis 20 min jeweils in den Schritten a) bis d) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren bei Normaldruck, –4°C und über einen Zeitraum von mindestens 20 min jeweils im Schritt a) bis d) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren bei Normaldruck, 4°C und über einen Zeitraum von mindestens 15 min jeweils im Schritt a) bis d) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren bei Normaldruck, 15-20°C und über einen Zeitraum von mindestens 10 min jeweils im Schritt a) bis d) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren bei 250-500 bar in einer Druckkammer, bei 15-20°C und über einen Zeitraum von mindestens 5 min jeweils im Schritt a) bis d) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einfrieren die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebende Gefrierschutzlösung entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einfrieren die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebende Gefrierschutzlösung nicht entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen in Flüssigstickstoff gelagert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationsdichte 1-2 g Fischei und/oder Fischembryogewebe pro 5 ml isotonischer Gefrierschutzlösung beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischeier und/oder Fischembryonen von Süßwasserfischen oder Meerwasserfischen stammen.