CN104957130B - 一种金鱼卵低温保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种金鱼卵的低温保存的方法。本发明采用技术方案如下：取氯化钠、乙二醇、甘油、二甲基亚砜、壳聚糖和水配制而成的基础保护液加水分别稀释成25％、50％和75％3种基础保护液稀释液，将金鱼卵依次置于稀释液中进行平衡处理后，转入基础保护液处理10分钟；采用降温冷冻方法进行分步降温,逐步从20~24℃常温降到–4℃；按基础保护液和抗冻糖蛋白95：5的重量份比加入抗冻糖蛋白,搅拌均匀后静置6~8天；取出，采用阶梯分步升温方法进行复苏。采用本发明方法金鱼卵成活率和受精率高，有效解决了福州金鱼养殖过程精子与卵子不同步或数量上不匹配问题，提高了金鱼卵冷冻保存的存活率和金鱼的受精卵繁殖率。

Description

一种金鱼卵低温保存的方法
技术领域
本发明涉及鱼类卵子冷冻保存的技术领域。具体而言，涉及一种金鱼卵的低温保存的方法。
背景技术
福州金鱼养殖已有300多年，得益于福州独特的水质、气候以及众多养殖者的精心培育，福州金鱼以品种质量优良、色彩鲜艳、鱼体健壮著称，与北京金鱼、杭州金鱼共同入列中国金鱼三大流派。但是，福州金鱼养殖业的快速发展，导致养殖金鱼类近亲繁殖越加严重，不合理引种，遗传多样性锐减，个体小型化，种质退化严重，对环境和病害的防御能力下降，病害发生日趋严重，已造成巨大的经济损失。因此，研究如何保护和利用好现有的福州金鱼种质资源和遗传多样性，实现福州金鱼养殖业的稳定和可持续发展。
近年来，研究者对鱼类配子和胚胎低温保存进行了大量的探索，并已成功冻存了鱼类配子及少数鱼类胚胎，为解决鱼类品种的异地异时杂交育种、珍稀鱼类繁殖、物种遗传物质的长期保存提供了可能性。
福州金鱼养殖过程,在每年三、四月,金鱼产卵受精繁殖期,常遇到精子与卵子不同步或数量上不匹配,造成卵子与精子在水中受精不正常,受精卵繁殖力下降。这种现象的存在影响福州金鱼子一代的繁殖率和成活率。所以只要解决6～10天的短期低温冻存,调整卵子与精子的达到时间上同步,数量上匹配,达到正常受精和提高受精率的目的。为了解决以上问题,针对金鱼卵子具有体积大，双层卵膜，透水性差，含有大量卵黄物质等特点。福建师范大学生命科学学院对金鱼卵冷冻技术进行较深入研究，创新开发一种金鱼卵6～10天短期且―4℃低低温冷藏保存的方法，提高了金鱼卵冷冻保存的存活率和金鱼的受精卵繁殖率,有力地保护和利用好现有的福州金鱼种质资源和遗传多样性。
发明内容
为了解决福州金鱼卵的短期且低温保存，解决6～10天的冻存期,调整卵子与精子的达到时间上同步,数量上匹配,达到正常受精和提高受精率。针对金鱼卵子具有体积大，双层卵膜，透水性差，含有大量卵黄物质等特点,本发明的金鱼卵低温保存技术采用加入抗冻蛋白与化学抗冻剂混合的复合抗冻保护液,经过平衡、降温、静置、和复苏，创新开发一种金鱼卵6～10天短期且–4℃低温保存的方法，提高了金鱼卵存活率和受精率。
为实现本发明的目的而采用技术方案如下：
1、复合抗冻保护液配制
复合抗冻保护液由基础保护液和抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein]，简写AFGP)按照95：5的重量份比构成；
基础保护液重量份比为：
2、步骤
1)平衡：取基础保护液加水分别稀释成25％、50％和75％3种基础保护液稀释液。将金鱼卵依次置于25％、50％、75％的稀释液进行10分钟平衡处理后，转入基础保护液处理10分钟，使基础保护液渗透到金鱼卵内，平衡步骤结束转为降温步骤；
2)降温：采用降温冷冻方法进行分步降温,逐步从20～24℃常温降到–4℃；
所述的分步降温是指：第1步从20～24℃常温降到4℃,然后以每10分钟降1℃的速度进行缓慢降温,降到2℃停留20分钟，降到0℃停留20分钟；降到–2℃停留20分钟，降到–4℃停留20分钟；
3)静置：加入重量比5％抗冻糖蛋白(AFGP),搅拌均匀后放置于–4℃冰箱内,10分钟内进行上下搅拌1～2次,之后静置6～8天；
4)复苏：取出，采用阶梯分步升温方法进行复苏；
所述的分步升温是指：第1步从–4℃升到–2℃停留20分钟，升到0℃停留20分钟，升到2℃停留20分钟，升到4℃停留20分钟，然后在50～60分内升温到20～24℃，测定金鱼卵的成活率供使用。
采用本发明所述的方法与金鱼卵的其他–4℃冷藏保存方法,作一个对照实验.其结果如下表1:
表1金鱼卵的不同冷藏方法及时间的成活率和受精率
A.普通冰箱冷藏；B.普通加保鲜液冷藏；C本发明低温保存的方法
以上实验说明:本发明金鱼卵的低温保存的方法成活率和受精率高于其他两种金鱼卵的冷藏保存的方法,本发明的金鱼卵–4℃冷藏保存第10天，其中成活率最低68％，受精率最低达到66％。实验证明本发明金鱼卵的冷藏低温保存的方法是可行的，解决了福州金鱼养殖过程,在每年三、四月,金鱼产卵受精繁殖期,常遇到精子与卵子不同步或数量上不匹配,造成卵子与精子在水中受精不正常,受精卵繁殖力下降的问题，提高了金鱼卵冷冻保存的存活率和金鱼的受精卵繁殖率。
以上所述的二甲基亚砜(DMSO)、抗冻糖蛋白(AFGP)可以外购。
具体实施方式
实施例1
1、复合抗冻保护液配制
复合抗冻保护液由基础保护液和抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein]，简写AFGP)按照95：5的重量份比构成；
基础保护液重量份比为：
2、金鱼卵的低温保存方法具体步骤
1)平衡：分别取部分的基础保护液，加水稀释成25％、50％和75％3种基础保护液稀释液。将福州金鱼龙种品种的金鱼卵依次置于25％、50％、75％的稀释液中进行10分钟平衡处理后，转入基础保护液再处理10分钟，使基础保护液渗透到金鱼卵内，平衡步骤结束转为降温步骤；
2)降温：采用阶梯降温冷冻方法分步降温处理,第1步从20℃常温可以降到4℃,然后以每10分钟降1℃的速度进行缓慢降温,降到2℃停留20分钟；降到0℃停留20分钟；降到―2℃停留20分钟；降到―4℃停留20分钟；
3)静置：加入抗冻糖蛋白(AFGP),搅拌均匀后放置于–4℃冰箱内,10分钟内进行上下搅拌1-2次,根据卵子与精子受精的具体需要，静置6天；所述的加入抗冻糖蛋白，与复合抗冻保护液的重量比为5：95。
4)复苏：取出缓慢升温复苏,升到–2℃停留20分钟，升到0℃停留20分钟；升到2℃停留20分钟；升到4℃停留20分钟；然后在50分内升温到20℃，测定金鱼卵的成活率为74％，而后与福州金鱼龙种品种的精子进行受精，受精率为84％。达到提高了金鱼卵低温保存的存活率和金鱼的受精卵繁殖率目的。
实施例2
1、复合抗冻保护液配制
复合抗冻保护液由基础保护液和抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein]，简写AFGP)按照95：5的重量份比构成；
基础保护液重量份比为：
2、金鱼卵的低温保存方法具体步骤
1)平衡：分别取部分的基础保护液加水分别稀释成25％、50％和75％3种基础保护液稀释液。将福州金鱼文种品种的金鱼卵依次置于25％、50％、75％的稀释液中进行10分钟平衡处理，后转入基础保护液再处理10分钟，使基础保护液渗透到金鱼卵内，平衡步骤结束转为降温步骤；
2)降温：采用阶梯降温冷冻方法分步降温处理,第1步从24℃常温可以降到4℃,然后以每10分钟降1℃的速度进行缓慢降温,降到2℃停留20分钟；降到0℃停留20分钟；降到―2℃停留20分钟；降到―4℃停留20分钟；
3)静置：加入重量比5％抗冻糖蛋白(AFGP),搅拌均匀后放置于–4℃冰箱内,隔10分钟进行上下搅拌1-2次即可,根据卵子与精子受精的具体需要，静置8天；所述的加入抗冻糖蛋白，与复合抗冻保护液的重量比为5：95。
4)复苏：取出缓慢升温复苏,升到–2℃停留20分钟，升到0℃停留20分钟；升到2℃停留20分钟；升到4℃停留20分钟；然后在60分内升温到24℃，测定金鱼卵的成活率为71％，而后与福州金鱼龙种品种的精子进行受精，受精率为79％。达到提高了金鱼卵低温保存的存活率和金鱼的受精卵繁殖率。

Claims (1)

1.一种金鱼卵低温保存的方法，其特征是：
1）复合抗冻保护液配制
复合抗冻保护液由基础保护液和抗冻糖蛋白按照95：5的重量份比构成；
所述的基础保护液重量份比为：
氯化钠 6.5～8.2
乙二醇 5～6.5
甘油 10～12
二甲基亚砜 5.5～6.2
壳聚糖 2～2.8
水 60～65
2）步骤
①平衡：取基础保护液加水分别稀释成25％、50％和75％3种基础保护液稀释液，将金鱼卵依次置于25％、50％、75％的稀释液进行10分钟平衡处理后，转入基础保护液平衡处理10分钟；
②降温：采用阶梯降温冷冻方法分步降温处理,逐步从20～24℃常温降到–4℃；
③静置：加入重量比5%抗冻糖蛋白,搅拌均匀后放置于–4℃冰箱内, 10分钟内进行上下搅拌1～2次,之后静置 6～8天；
④复苏：取出，采用阶梯分步升温方法进行复苏；
所述的分步降温是指：第1步从20～24℃常温降到4℃, 然后以每10分钟降1℃的速度进行缓慢降温, 降到2℃停留20分钟，降到0℃停留20分钟; 降到–2℃停留20分钟，降到–4℃停留20分钟；
所述的分步升温是指：第1步从–4℃升到–2℃停留20分钟，升到0℃停留20分钟，升到2℃停留20分钟，升到4℃停留20分钟，然后在50～60分内升温到20～24℃。
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