DE10163426A1 - Pharmakologisch wirksame Inden-Derivate - Google Patents

Pharmakologisch wirksame Inden-Derivate

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DE10163426A1
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Peter Herter
Eleni Courzoulidou
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Inden-Derivate und deren Verwendung für pharmazeutische Zwecke, insbesondere zur Behandlung oder Prävention von mit einer erhöhten Zellproliferation assoziierten Krankheiten, z. B. Tumorerkrankungen. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Hemmung der durch das Ras Protein vermittelten Zelltransformation.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Inden-Derivate und deren Verwendung für pharmazeutische Zwecke, insbesondere zur Behandlung oder Prävention von mit einer erhöhten Zellproliferation assoziierten Krankheiten, z. B. Tumorerkrankungen. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Hemmung der durch das Ras Protein vermittelten Zelltransformation.
  • Die langfristige Gabe von nicht steroidalen Antiphlogistika (engl. NSAIDs für Non-Steroidal Anti Inflammatory Drugs) kann die Bildung und das Wachstum bösartiger Tumoren verzögern oder sogar verhindern (Giardiello, 1994; Luk, 1996). Das NSAID Sulindac wurde von Merck, Sharp & Dome ursprünglich als Indomethacin-Derivat entwickelt und aufgrund seiner entzündungshemmenden Wirkung in den 70er und 80er Jahren gegen rheumatoide Arthritis eingesetzt. (Reynolds et al., 1977; Green et al., 1977). In den frühen 80er Jahren wurde der allgemeine Zusammenhang zwischen verringertem Krebsrisiko und der langfristigen Einnahme von NSAIDs deutlich. Bald war klar, dass auch Sulindac das Risiko der Tumorbildung verringert, und auch, dass Sulindac sogar das Wachstum bereits gebildeter Tumoren verlangsamt (Belliveau et al., 1984). Mittlerweile gibt es zahlreiche klinische und wissenschaftliche Studien, die die Anti-Tumorwirkung von Sulindac ausführlich beschreiben (z. B. Winde et al., 1995). Das NSAID Sulindac wird derzeit zur Behandlung und zur Chemoprävention von Tumoren bei Patienten mit der vererbten Krebsprädisposition "Familiäre Adenomatöse Polyposis Coli" (FAP) klinisch eingesetzt (Pasricha et al., 1995; Winde et al., 1995).
  • Die entzündungshemmende Wirkung der NSAIDs beruht auf der Hemmung der beiden Schlüsselenzyme des Eikosanoid-Stoffwechsels, der Cyclooxygenasen (COX) 1 und 2 (Vane und Botting, 1996). Auch die proliferationshemmende Wirkung wurde lange Zeit so erklärt. Sulindac verringert die Konzentration der COX Metaboliten (z. B. der Prostaglandine), die die Proliferationsrate von Tumorzellen erhöhen (Rao et al., 1995; Qiao et al., 1995). Die COX Hemmung durch Sulindac-Sulfid führt zur Anreicherung von Arachidonsäure, die die Ceramid bildende Sphingomyelinase aktiviert. Die resultierende hohe intrazelluläre Ceramidkonzentration führt zur Aktivierung der Apoptose (Chan et al., 1998).
  • Allerdings kann die antiproliferative Wirkung von Sulindac nicht nur auf der Hemmung der COX Enzyme beruhen. Sulindac verursacht Apoptose in epithelialen Geweben und kultivierten Tumorzellen und hemmt die Tumorbildung auch unabhängig vom Eikosanoid-Metabolismus (Pasricha et al., 1995; Piazza et al., 1997a, b; Shiff et al., 1995). Auch Experimente mit der Min Maus, dem Tiermodell für FAP, zeigten, dass der Anti- Tumoreffekt von Sulindac unabhängig von der Prostaglandin-Biosynthese ist (Chiu et al., 1997). Eine wichtige COX unabhängige antiproliferative Wirkung ist die Hemmung eines Transkriptionsfaktors durch Sulindac (He et al., 1999). Außerdem hemmt Sulindac-Sulfid den Ras Signalweg.
  • Mehr als ein Drittel aller menschlichen Tumoren tragen Mutationen im Ras Gen (Bos, 1989). Damit ist das Ras Gen das in menschlichen Tumoren am häufigsten mutierte Onkogen. Die wichtige Rolle des Ras Gens bei der Krebsentstehung wurde auch durch zahlreiche Laborexperimente bestätigt: Beispielsweise lassen sich primäre Zellen durch Transfektion des mutierten Ras Gens transformieren (Land et al., 1983).
  • Sulindac-Sulfon hemmt das Wachstum von Tumoren mit Mutationen im Ras Gen stärker als das Wachstum von Tumoren mit dem Wildtyp Ras Gen (Thompson et al., 1997). Die Apoptose induzierende Wirkung von Sulindac auf kultivierte Zellen kann durch Transfektion mit mutiertem Ras Gen aufgehoben werden (Arber et al., 1997). Außerdem hemmt Sulindac-Sulfid die Fokusbildung von kultivierten Primärzellen, ausgelöst durch das mutierte Ras Gen zusammen mit einem jeweils anderen Proto-Onkogen (Herrmann et al., 1998). Dieser Effekt ist nicht auf die allgemeine Hemmung der Zellteilung oder auf einen generellen cytotoxischen Effekt von Sulindac-Sulfid zurückzuführen. Sulindac-Sulfid bindet an p21ras und hemmt so die Interaktion zwischen p21ras und seinem Effektorprotein Raf Kinase sowie die p21ras Aktivierung durch das Austauschprotein CDC25. Sulindac-Sulfid hemmt dosisabhängig die Ras aktivierte Genexpression und die Aktivität der Raf Kinase. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potential von Sulindac-Sulfid als eine Leitstruktur für die Entwicklung neuer Antitumor-therapeutika, die die Signalübertragung im Ras Signalweg inhibieren.
  • Aufgrund seines breiten Wirkungsspektrums und seiner starken Nebenwirkungen ist Sulindac jedoch als generelles Krebsmedikament ungeeignet.
  • Sulindac und seine Metaboliten (siehe Abb. 1) unterscheiden sich in ihren biochemischen Wirkungen deutlich. Eine geringfügige Änderung der Molekülstruktur von Sulindac kann also zu einer sehr starken Änderung der Wirkungen führen. Damit könnte das Molekül als Modellstruktur bei der Suche nach neuen geeigneteren Therapeutika dienen. Das Ziel, neue und bessere Sulindac Derivate herzustellen, ist die Basis zahlreicher Publikationen und Patente (z. B. Thompson et al., 2000; Pamukcu & Piazza, 2000; Sperl, 2000). In diesen Publikationen sind die Synthese von Sulindac und verschiedener Derivate sowie deren Wirkungen auf die Zellteilung von Tumorzellen beschrieben. Außerdem wurden die Wirkungen dieser Substanzen auf verschiedene Signalwege, wie z. B. den p53- oder den Wnt- Signalweg, beschrieben. Eine Wirkung auf den Ras Signalweg ist bisher nur von Sulindac-Sulfid bekannt (Herrmann et al., 1998).
  • Sulindac und seine Metabolite wirken zwar auf mehrere unabhängige mitogene Signalwege und entfalten so ihren starken antiproliferativen Effekt. Ein entscheidender Nachteil von Sulindac ist jedoch die notwendige hohe Dosierung und die damit verbundenen Nebenwirkungen. Dies hat mehrere Ursachen: Sulindac ist sehr schlecht wasserlöslich, weshalb nur geringe Menges des oral aufgenommenen Sulindacs im Magen-Darm-Trakt resorbiert werden. Mehr als die Hälfte wird direkt unverändert über den Darm, ein weiterer signifikanter Anteil in glykosylierter Form über die Niere in den ersten 12 Stunden nach der Applikation ausgeschieden. Das Problem der geringen Bioverfügbarkeit kann nur teilweise durch direkte lokale Applikation der Substanz gelöst werden. Das Sulindac Molekül selbst ist physiologisch unwirksam (Duggan et al., 1977). Erst durch die reversible Reduktion zum Sulfid oder durch irreversible Oxidation zum Sulfon (Abb. 1) mittels Fremdstoff metabolisierender intrazellulärer Enzyme entstehen Moleküle mit biologischer Wirkung. In Gegenwart von Luftsauerstoff oxidiert Sulindac-Sulfid auch spontan zum Sulindac und Sulindac zum Sulfon. Sulfid und Sulfon zeigen deutliche Unterschiede in ihrem Wirkungsspektrum. Beide Moleküle wirken auf mehrere unterschiedliche Signalwege, wie beispielsweise Signalwege zur Regulation der Blutgerinnung (Sulfid), der Entzündung (Sulfid), der Zellteilung (Sulfid, Sulfon) oder der Apoptose (Sulfon). Beide Sulindac-Metaboliten zeigen nur geringe Affinitäten zu ihren Zielproteinen, wirken also erst bei hohen Konzentrationen. Die notwendige hohe Dosierung und das breite Wirkunsspektrum der Sulindac-Metabolite sind somit die Ursache für die starken Nebenwirkungen bei der Sulindac-Behandlung von Tumorpatienten.
  • Sulindac-Sulfid ist das erste kleine synthetische Molekül, das einen direkten hemmenden Einfluss auf das Proto-Onkoprotein p21ras und seine biochemischen und biologischen Eigenschaften ausübt. Nach einer Substanz mit hemmenden Wirkungen auf das Proto-Onkoprotein p21ras wird schon gesucht seit man dessen entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung erkannt hat (Sigal et al., 1987). Sulindac ist das einzige Pharmakon, das erfolgreich präventiv und therapeutisch bei Patienten mit erhöhtem erblichen Krebsrisiko eingesetzt wird. Wegen starker Nebenwirkungen im oberen Gastrointestinaltrakt und weiterer unspezifischer Wirkungen ist jedoch ein unkontrollierter Einsatz der Substanz in der Krebstherapie ohne Weiteres nicht möglich. Eine Substanz mit ähnlichen aber spezifischeren Wirkungen, und damit mit weniger und geringeren Nebenwirkungen, wäre ein Meilenstein auf der Suche nach einem neuen Krebsmedikament.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, eine neue Antitumor-wirksame Verbindung bereitzustellen, bei der die geschilderten Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt sind.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung einer neuen Verbindungsklasse ausgehend von 5-Fluor-2-methylinden-3-essigsäure, an die ein 5-Ring, vorzugsweise ein Heterozyklus, z. B. ein substituierter oder unsubstituierter Pyrrol-, ein Thiophen- oder Furanring oder ein 6-Ring über eine Methylenbrücke gekoppelt ist.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II):


    worin die Substituenten R1 bis R11 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig für Wasserstoff, Deuterium, Halogen, eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylgruppe, die gegebenenfalls über ein O-Atom, ein S-Atom oder eine Aminogruppe an das Grundgerüst gebunden ist, z. B. eine Alkoxygruppe wie Methoxy, eine Thioalkylgruppe wie Methylsulfid oder eine einfach oder zweifach mit
    Kohlenwasserstoffgruppen substituierte Aminogruppe wie Methylamino, Dimethylamino oder Ethylylamino, Nitro, Cyano, Carboxy, Sulfat, Hydroxy, Hydroxymethyl, Amino, Amidino, Guanidino oder Aminoacetat steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxyl, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt, und wobei gegebenenfalls zwei benachbarte Substituenten miteinander verbrückt sind, um ein gesättigtes oder ungesättigtes, gegebenenfalls heterocyclisches Ringsystem zu ergeben,
    der Substituent Z für Nitro, Cyano, Carboxy, Sulfat, Hydroxy, Hydroxymethyl, Methoxy, Amidino, Guanidino, Aminoacetat oder für einen Rest CO2R12 steht, wobei R12 eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt,
    und der Substituent X für Sauerstoff, Schwefel, einen Rest CR13R14 oder NR15 steht, wobei R13, R14 und R15 jeweils unabhängig für Wasserstoff oder für eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenen falls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe, eine Alkylthiogruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen, steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt, oder Salze und Isomere davon.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind erhältlich durch Kondensation von 5-Fluor-2-methylinden-3-essigsäure mit entsprechenden Aldehyden. 5- Fluor-2-methylinden-3-essigsäure wird hierzu in 5 Stufen aus käuflichen Ausgangsmaterialien (siehe z. B. Roth und Kleemann, 1982) hergestellt und dient dann als CH-acide Ausgangskomponente für die Aldolkondensation mit unterschiedlichen Aldehyden. Als Lösungsmittel kann hierzu beispielsweise Methanol verwendet werden, das mit 2-3 äquimolaren Mengen an Natriummethylat und den entsprechenden Reaktionspartnern versetzt wird. Erhitzen des Reaktionsgemisches unter Rückfluss ergibt in hohen Ausbeuten die erfindungsgemäßen Alkylidenverbindungen. Es wurde gefunden, dass Alkalimetallsalze, z. B. Natriumsalze, dieser Verbindungen sehr gut wasserlöslich sind. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen die Stereochemie des bekannten Sulidac-Z-Isomers bezüglich der exocyclischen Doppelbindung auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht der Substituent Z für Carboxy (d. h. COOH oder COOM, worin M ein Kation, insbesondere ein Alkalimetall-Kation, wie Na, bedeutet).
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass der Substituent X in erfindungsgemäßen Verbindungen für Sauerstoff, Schwefel oder CR13R14 steht.
  • Darüber hinaus ist bevorzugt, dass R3 für Wasserstoff, Halogen, z. B. F, Cl, Br oder I, insbesondere F, eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe, z. B. Methyl oder halogeniertes Methyl, Hydroxy oder eine Alkoxygruppe, z. B. Methoxy, steht.
  • R7 bedeutet vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe, insbesondere Methyl oder Ethyl.
  • R1, R2, R4, R5, R6 und R11 sind vorzugsweise Wasserstoff. Die Substituenten R8, R9, R10, R13 und R14 am heterocyclischen 5-Ring bzw. am 6-Ring sind vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff, Alkyl, z. B. C1-5 Alkyl, wie Methyl oder Pentyl, substituiertem Alkyl, z. B. Hydroxymethyl oder Haloalkyl; Alkoxy, Aryloxy, Alkaryloxy oder Aralkyloxy, z. B. Methoxy oder Benzyloxy; Halogen, Cyano, Amino, ein- oder zweifach substituiertem Amino, z. B. Dimethylamino oder Ethylaminoh Hydroxy und Thioalkyl, z. B. Methylsulfid. Weiterhin können zwei Substituenten zusammen ein Ringsystem bilden, z. B. ein aromatisches oder heteroaromatisches System, wie etwa eine Indolgruppe.
  • Spezifische Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen sind Ind4, Ind7, Ind9, Ind11 und Ind12 (siehe Abb. 2) oder Salze davon. Weitere spezifische Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen sind die in Abb. 6 gezeigten Verbindungen oder Salze davon.
  • Die erfindungsgemäßen Substanzen können als Modulatoren des Ras Proteins eingesetzt werden, vorzugsweise als Inhibitoren des Ras Signalwegs, beispielsweise durch Hemmung der Wechselwirkung von Ras und seinem Effektor Raf Kinase. Die Verbindungen können somit als Inhibitoren der Zellproliferation, z. B. als Inhibitoren einer durch das Ras Protein vermittelten Zelltransformation, verwendet werden. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sogar eine Reversion einer Zelltransformation, z. B. der Ras Transformation, erfolgen kann. Desweiteren sind die Verbindungen als Stimulatoren von apoptotischen Prozessen geeignet.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine erfindungsgemäße Verbindung (einschließlich Isomeren oder Salzen davon) zusammen mit physiologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen enthält. Diese Zusammensetzung kann zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die mit einer Störung der Zellproliferation assoziiert sind, insbesondere zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer erhöhten Zellproliferation assoziiert sind, wie etwa entzündliche Prozesse oder Tumorerkrankungen. Besonders bevorzugt wird die Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von mit dem Ras Protein assoziierten Tumorerkrankungen. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die Verwendung der Verbindungen in Tumorerkrankungen, die mit dem Wnt Protein, dem APC Protein oder/und dem β-Catenin Protein assoziiert sind. Beispielsweise kann die Zusammensetzung bei Tumoren epithelialen Ursprungs (z. B. Tumoren des Pankreas, der Brust, des Dünn- und Dickdarms, der Haut, der Schleimhäute oder der Lunge) und nicht-epithelialen Ursprungs (z. B. Tumoren der Weichteile, des Bindegewebes oder des Gehirns) eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von flüssigen Präparaten, z. B. oralen Lösungen oder Suspensionen oder injizierbaren Lösungen, in Form von festen Präparaten, z. B. Tabletten, Kapseln, Dragees, Suppositorien, Pulvern etc. oder in Form von Emulsionen, z. B. Salben, Cremes, Lotionen etc. vorliegen. Die Zusammensetzung kann je nach Art der zu behandelnden Erkrankung auf einem geeigneten Weg verabreicht werden, z. B. oral, nasal, rektal, topisch, parenteral etc.
  • Die Dosierung hängt von der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung ab und kann beispielsweise im Bereich von 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht (Tagesdosis), besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 mg pro kg Körpergewicht (Tagesdosis) liegen. Die Verabreichung kann ein- oder mehrmals täglich oder in mehrtägigen Intervallen erfolgen.
  • Weiterhin kann man die erfindungsgemäße Verbindung auch in Kombination mit anderen Wirkstoffen, z. B. im Kombination mit anderen Antitumormitteln, wie etwa bekannten Cytostatika aus den chemischen Gruppen und Wirkungsklassen der Nukleotide oder Nukleotidanaloga (z. B. 5-Fluor-Uracil), der Steroide oder Steroidanaloga (z. B. Tamoxifen), der Substanzen, die die Cytoskelettbildung verhindern oder katalysieren (z. B. Taxol), der DNA-schädigenden Substanzen (z. B. Cis-Platin) oder/und der Wachstumsfaktorrezeptor blockierenden Proteine und Antikörper (z. B. Herceptin), verabreichen.
  • Die Erfindung soll nun durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden.
  • Es zeigen:
  • Abb. 1 Sulindac und seine physiologischen Hauptmetaboliten Sulindac-Sulfid und Sulindac-Sulfon. Reduktion und Oxidation können intrazellulär durch metabolisierende Enzyme erfolgen. Die Oxidation kann in Gegenwart von Luftsauerstoff auch spontan erfolgen.
  • Abb. 2 5 Beispiele für erfindungsgemäße Substanzen. Neben den gezeigten Verbindungen wurden auch noch die Natriumsalze der Substanzen Ind7 (Ind7a) und Ind11 (Ind11a) hergestellt.
  • Abb. 3 MDCK Zellen (obere Reihe), unbehandelte Ras transformierte MDCK-f3 Zellen (mittlere Reihe) und MDCK-f3 zellen nach Behandlung mit einer Substanz, die zur Reversion der Transformation führt (untere Reihe) wurden analysiert durch Immunfluoreszenzmarkierung von F-Actin (linke Spalte), E- Cadherin (mittlere Spalte) und F-Actin und E-Cadherin (rechte Spalte).
  • MDCK Zellen wachsen in einer epithelartigen Einzelzellschicht und exprimieren große Mengen des membrangebundenen Zelladhäsionsproteins E-Cadherin. Transformierte MDCK-f3 Zellen dagegen haben einen Fibroblasten ähnlichen Phänotyp ohne regelmäßige Zellkontakte und keine signifikante E-Cadherin-Expression. Behandlung mit einer Transformation revertierenden Substanz führt dazu, dass MDCK-f3 Zellen ihren Phänotyp zu nicht transformierten MDCK Zellen ändern, wobei die Menge des Membran gebundenen E-Cadherins ansteigt. Die Pfeilköpfe zeigen zwei exemplarische Zellkontakte mit E-Cadherin einer einzelnen behandelten MDCK-f3 Zelle.
  • Abb. 4 MDCK Zellen, unbehandelte Ras-transformierte MDCK-f3 Zellen und MDCK- f3 Zellen nach Behandlung mit einer Substanz, die zur Reversion der Transformation führt, in der rasterelektronenmikroskopischen Analyse. Deutlich erkennbar sind die morphologischen Unterschiede der beiden Zelltypen und die Reversion des transformierten Zelltyps durch die Behandlung.
  • Abb. 5 Die Verbindungen (I) und (II) können auch durch kombinatorische Methoden, z. B. Synthese an einen 2-Chlortritylchlorid-Harz und Variationen von Substituenten, z. B. R, R', R" bzw. deren Anzahl (beispielsweise n), der Gruppe Z und der Anzahl m der C-Atome synthetisiert werden.
  • Abb. 6 Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Substanzen.
    • Beispiele Beispiel 1 Synthese der Verbindungen (I) und (II) 1.1 Allgemeine Synthesevorschriften
  • Die Verbindungen (I) und (II) können durch Aldolkondensation von 5-Fluor- 2-methylinden-3-essigsäure mit entsprechenden Aldehyden synthetisiert werden. Als Lösungsmittel ist beispielweise Methanol geeignet, das mit einer 2,5 äquimolaren Menge an Natriummethylat und den entsprechenden Reaktionspartnern versetzt wird. Erhitzen des Reaktionsgemisches unter Rückfluss ergibt in hohen Ausbeuten die jeweiligen Alkylidenverbindungen (I) und (II).
  • Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Methoden der kombinatorischen Festphasenchemie hergestellt werden. Dabei kann man von festphasengebundenen, jeweils unterschiedlich substituierten 2-Alkylinden-3-essigsäure-Derivaten ausgehen und die Substituenten an Position 1 des Inden-Grundgerüsts durch Kondensation mit unterschiedlichen aromatischen Aldehyden variieren. Abb. 5 zeigt eine schematische Darstellung der Synthesestrategie unter Verwendung eines 2- Chlortritylchlorid-Harzes.
  • Es wurden beispielsweise die in Abb. 2 und Abb. 6 dargestellten Verbindungen synthetisiert.
    • 1.2 Syntheseprotokoll am Beispiel von (6-Fluor-3-furan-3-ylmethylen-2- methyl-3H-inden)-essigsäure (Ind12)
  • 1 mmol (205 mg) 5-Fluor-2-methylinden-3-essigsäure wird in 10 ml Methanol (trocken) gelöst und mit 2,5 Äquivalenten Natriummethylat versetzt. Zu dieser Lösung wird dann 1,05 mmol (100,8 mg) 3-Furaldehyd gegeben. Dann wird die farblose Lösung unter Argon bis zum Rückfluss erhitzt und die Reaktion mit Hilfe der HPLC (RP-18, Methanol/0.05 Ammoniumformiat (pH 5)) kontrolliert. Die Kondensationsverbindung zeigt charakteristische Retentionszeiten und entsprechende UV-Spektren (Tab. 1). Nach wenigen Minuten färbt sich die Lösung gelb und nach einer weiteren halben Stunde beginnt eine gelbe Verbindung auszufallen. Nach 4 h Rückfluss ist die Reaktion vollständig. Danach wird die Lösung abgekühlt, mit HCl neutralisiert und in Ether gefällt. Die abfiltrierten Kristalle werden in Methanol gelöst und erneut in Ether gefällt. Man erhält so 200 mg (Ausbeute 70%) eines gelben Pulvers. Das 1H-NMR zeigt im Verhältnis von 1 : 17 zwei isomere Kondensationsprodukte, wobei das Hauptisomer die Stereochemie des bekannten Sulindacs (Z-Isomer) aufweisen sollte. Mit Hilfe des 1H-NMR und 13C-NMR lassen sich eindeutig alle Strukturelemente der Verbindung Ind12 zuordnen.
    • 1.3 (3-Furan-3-ylmethylen-2,6-methyl-3H-inden)-essigsäure
  • Polymergebundene (2,6-Dimethyl-3H-inden-1-yl)-essigsäure, 50 mg (54 µmol) an 2-Chlortritylchlorid-Harz (Novablochem, Beladung 1,08 mmol/g) wird in 0,5 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Man versetzt mit 81 mg (540 µmol) 1,8- Diazabicyclo[5,4,0]-undec-7-en und schüttelt für 1,5 h bei 60°C. Zu der Suspension werden 52 mg (540 µmol) Furan-3-carbaldehyd gegeben und 24 h bei 60°C geschüttelt. Man filtriert und wäscht dreimal mit je 6 ml Dimethylformamid, Methanol, Dichlormethan, Methanol und Dichlormethan. Zur Abspaltung wird das Harz dreimal mit je 1 ml, für einmal 10 min und zweimal 1 min mit 2%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan versetzt und die Lösung filtriert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Es werden 8,0 mg eines gelbfarbenen Feststoffs erhalten (53% der theoretischen Ausbeute). Die Struktur der Substanz wurde mittels NMR bestätigt: 1H NMR (400.13 MHz, CDCl3): δ = 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.64 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.81 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 3.59 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.14 (s, 3H).
    • 1.4 (6-chlor-2-methyl-3-thiophen-3-ylmethylen-3H-inden)-essigsäure
  • Polymergebundene (6-Chlor-2-methyl-3H-inden)-essigsäure, 60 mg (54 µmol) an 2-Chlortritylchlorid-Harz (Novablochem, Beladung 1,08 mmol/g) wird in 0,8 ml trockenem Toluol suspendiert und 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Man versetzt mit 81 mg (540 µmol) 1,8- Diazabicyclo[5,4,0]-undec-7-en und schüttelt für 30 min bei 60°C. Zu der Suspension werden 61 mg (540 µmol) Thiophen-3-carbaldehyd gegeben und 48 h bei 60°C geschüttelt. Man filtriert und wäscht dreimal mit je 6 ml Dimethylformamid, Methanol, Dichlormethan, Methanol und Dichlormethan. Zur Abspaltung wird das Harz dreimal mit je 1 ml, für einmal 10 min und zweimal 1 min mit 2%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan versetzt und die Lösung filtriert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Es werden 13,2 mg eines gelbfarbenen Feststoffs erhalten (78% der theoretischen Ausbeute). Die Struktur der Substanz wurde mittels NMR bestätigt: 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.41-7.43 (m, 2H), 7.38-7.40 (m, 1 H), 7.22 (m, 1H), 7.14 (m, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.90 (m, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.17 (s, 3H).
    • Beispiel 2 Charakterisierung der Verbindungen 2.1 Physikalisch-chemische Charakterisierung
  • Die getesteten Substanzen sind in organischen Lösungsmitteln (DMSO, CHCl3, Ethanol) bis zu Konzentrationen ≥ 1 M und in wässrigen Pufferlösungen bis mindestens 500 µM löslich. Alle Substanzen sind bei Raumtemperatur in fester Form mindestens 6 Monate und in wässrigen Puffern bei pH 7,5 mindestens 24 Stunden stabil.
  • Die Substanzen zeigen charakteristische spektroskopische Eigenschaften (Tabelle 1).

  • Tabelle 1 zeigt die UV/Vis spektroskopischen Eigenschaften ausgewählter Verbindungen. Die Substanzen wurden in einer Konzentration von 50 µM bei Raumtemperatur in PBS gelöst und ein Spektrum von 190 nm bis 800 nm aufgenommen. Die Wellenlängen der dabei festgestellten Adsporptionsmaxima sind angegeben. Bei diesen Wellenlängen wurden dann die Extinktionskoeffizienten anhand der Steigung von Eichgeraden über den Konzentrationsbereich von 5 µM bis 100 µM der Substanzen ermittelt.
    • 2.2 Biochemische Eigenschaften
  • Der Einfluss der Substanzen auf mehrere biochemische Parameter des Proteins p21ras wurde gemessen. Alle Substanzen haben bis zu einer Konzentration von 150 µM keinen Einfluss auf die intrinisische GTPase Aktivität des p21ras Proteins. Die Substanzen zeigen außerdem bis zu einer Konzentration von 500 µM keine Wirkung auf den spontanen Austausch von p21ras gebundenen Nukleotiden. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass die Wirkungen auf die unspezifische Proteindenaturierung zurückzuführen sind. Ind9 aktiviert die GAP katalysierte GTPase Reaktion, während Ind11 diese inhibiert. Ind11 hemmt die Bindung des Ras Effektors Raf Kinase an p21ras (Tabelle 2). Tabelle 2 Die biochemischen Effekte von Sulindac, Sulindac Sulfid und von vier Inden-Derivaten (IND3, IND9, IND11a, IND12)

    a Es werden mikromolare Konzentrationen gezeigt, bei denen die halbmaximale Hemmung der COX Aktivität erhalten wurde (erste Reihe) oder eine halbmaximale Hemmung (-) bzw. eine halbmaximale Aktivierung (+) der GAP-katalysierten p21ras GTPase gemessen wurde (zweite Reihe). In der dritten Reihe sind mikromolare Konzentrationen gezeigt, bei denen eine halbmaximale Hemmung (-) der P21ras/Raf Interaktion gemessen wurde.
    b Die Daten für Sulindac und Sulindac Sulfid wurden aus neueren Publikationen entnommen (Hermann et al., 1998; Jung et al., 2000).
    c Die vier Verbindungen IND3, IND9, IND11a und IND12 wurden ausgewählt, da sie die Proliferation von H-Ras transformierten MDCK-f3 Zellen bei niedrigeren Konzentrationen hemmten als die Proliferation von untransformierten Zellen.
  • Tabelle 2 zeigt die biochemischen Effekte der vier Substanzen, die alle die Proliferation von Ras-transformierten MDCK-Ras Zellen bei geringeren Konzentrationen hemmen als die Proliferation von nicht transformierten Zellen (siehe Tabelle 3). Angegeben sind die mikromolaren Konzentrationen, die zur halbmaximalen Hemmung (-) bzw. Aktivierung (+) der betreffenden Aktivität oder Reaktion führen. Die COX Aktivität wurde in Samenbläschen aus Schaf gemessen (Jung et al., 2000). Die Werte für Sulindac Sulfid stammen aus Hermann et al. (1998) und Jung et al. (2000). Sulindac und Sulindac Sulfon haben keine Wirkung auf COX und Ras. Interessant ist, dass die Substanzen Ind9 und Ind12 bei geringeren Konzentrationen als Sulindac Sulfid die COX Aktivität inhibieren und Ind11a und Ind12 bei geringeren Konzentrationen als Sulindac Sulfid auf p21ras wirken.
    • 2.3 Cytotoxische und zellbiologische Wirkungen
  • Der Einfluss der neuen Substanzen auf Zellteilung und -wachstum wurde quantifiziert in einem kolorimetrischen Proliferationsassay mit 3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) als Indikator für die Anzahl lebender Zellen (Denizot und Lang, 1986). Dazu wurde die Teilungsrate verschiedener Zelllinien in Konzentrationsabhängigkeit der Substanzen gemessen (Tabelle 3).
  • Die Zellen wurden in 96-Loch-Platten kultiviert. Die Substanzen wurden als 1000fach konzentrierte Stammlösung in Endkonzentrationen von 10 nM bis 1 mM zugegeben. Nach 24 h wurde die Hälfte des Mediums abgenommen und durch serumfreies Medium ersetzt, das 5 mg/ml MTT enthielt. Nach weiteren 3 h wurden die Zellen lysiert durch Zugabe einer Mischung von 2- Butanol/2-Propanol/1 M HCl (16/8/1 v/v/v). Dann wurde die Absorption bei 540 nm in einem Mikroplatten-Leser gemessen.
  • Die gemessene Absorption wurde in Prozent der Absorption in Abwesenheit der Substanz umgerechnet, und die Daten gegen die Substanzkonzentration aufgetragen. Der jeweilige IC50 Wert (Substanzkonzentration, bei der die Anzahl der lebenden Zellen auf 50% gesunken ist) wurde dann aus der grafischen Auftragung bestimmt. Die dabei gemessenen wirksamen Konzentrationen liegen in ähnlichen Größenordnungen, wie die wirksamen Konzentrationen der Sulindac Metaboliten.
  • Von allen in Tabelle 3 getesteten Substanzen wirkt Ind7a bei den geringsten Konzentrationen.

  • Tabelle 3 zeigt die Hemmung des Zellwachstums durch die jeweiligen Substanzen MTT Assay. Angegeben sind die mikromolaren Konzentrationen, die zu 50% Wachstumshemmung der jeweiligen Zelllinie führen. Außer Ind4 und Ind7 zeigen alle getesteten Substanzen die Hemmung der beiden Tumorzelllinien SW 480 und MDCK-Ras bei geringeren Konzentrationen als Sulindac. Interessant ist außerdem, dass die Substanzen Ind9, Ind11a und Ind12 bei geringeren Konzentrationen (fett gedruckt) die Vermehrung von Ras transformierten Zellen (MDCK-Ras) inhibieren als die Vermehrung der entsprechenden nicht transformierten Zelllinie (MDCK). Dies lässt auf eine hemmende Wirkung dieser drei Substanzen auf den Ras Signalweg schließen.
    • Beispiel 3 Hemmung der Zelltransformation 3.1 Zellsysteme zur Messung von biologischen Wirkungen
  • Zahlreiche kultivierte Säugerzelllinien verändern durch stabile Transfektion mit einem oder zwei Proto-Onkogenen ihre morphologischen oder biochemischen Eigenschaften. Diese Zelllinien sind als Modell zur qualitativen und quantitativen Messung von Wirkungen von Substanzen geeignet, die tumorrelevante Signalwege beeinflussen.
  • MDCK Nierenzellen des Hundes sind eine immortalisierte, epitheliale Zelllinie. Die Zellen sind rundlich und wachsen in Einzelzellschicht, mit regelmäßigen Zell-Zellkontakten, ausgebildet durch das Zelladhäsionsprotein E-Cadherin. Durch stabile Transfektion mit dem onkogenen H-ras Gen verliegen die Zellen ihren epithelialen Charakter (Behrens et al., 1989). Sie sind spindelförmig und wachsen unpolarisiert übereinander ohne Zell-Zellkontakte, die Menge des Membran gebundenen E-Cadherins ist deutlich verringert. Diese Unterschiede lassen sich als Parameter nutzen zur Messung von Wirkungen von Substanzen auf die Transformation, ausgelöst durch das H-ras Gen.
  • C57MG Zellen sind epitheliale Brustdrüsenzellen der Maus. Analog zu den MDCK Zellen verändern die Zellen ihre Morphologie und ihr Wachstumsverhalten nach Transformation mit einem transformierenden Onkogen (Shimizu et al., 1997). Zur Messung von Wirkungen auf den tumorrelevanten Wnt/APC/β-Catenin Signalweg, können Wnt-transfizierte C57MG Zellen verwendet werden.
  • Ein weiteres Beispiel für ein geeignetes Zellsystem zur Messung von Wirkungen auf die Zelltransformation sind primäre Fibroblasten des Rattenembryos. Nach Transformation mit den Onkogenen Ras und Myc bilden diese Zellen Mikrotumoren (sogenannte Foci), deren Anzahl ein Maß ist für das Ausmaß der Transformation. Bilden sich nach Transfektion unter Behandlung mit einer Substanz weniger Foci als bei den unbehandelten Zellen aus, so kann auf eine transformationshemmende Wirkung geschlossen werden.

    • 3.2 Protokoll des Assays
  • Zellen der betreffenden Zelllinie werden in 96-Loch-Mikrotiterplatten kultiviert. Die zu testende Substanz wird direkt ins Medium gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 8 h werden die betreffenden Parameter analysiert. Zur besseren Sichtbarmachung der zellulären Morphologie können die Zellen mit einem Antikörper gegen F-Actin vor der lichtmikroskopischen Analyse immunmarkiert werden (Abb. 3). Zellkontakte können durch Immunmarkierung von E-Cadherin sichtbar gemacht werden. Die jeweiligen gebundenen primären Antikörper werden mit sekundären Antikörpern detektiert, die an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind.
  • Um die im Verlaufe der Rücktransformation auftretenden feinstrukturellen Veränderungen der Zelloberfläche darzustellen und zu bewerten, müssen die Zellen mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) untersucht werden. Die Zellen werden auf Thermanox-Objektträgern kultiviert und mit Glutaraldehyd fixiert. Die Zellen werden dann entwässert in einer steigenden Alkoholreihe und in einer Kritisch-Punkt-Trocknungsanlage mit CO2 als Intermedium getrocknet. Um bei der Betrachtung im Elektronenmikroskop Aufladungs-Artefakte zu vermeiden, werden die Zellen zuvor mit einer leitenden, 5 nm dicken Goldschicht bedampft. Die so behandelten Zellen werden mit einem REM (Hitachi-S800) analysiert. Die Zelloberflächenmorphologie wird bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV und einem Arbeitsabstand von 10 mm mit dem Signal der Sekundärelektronen abgebildet.
    • 3.4 Ergebnisse für Ind12
  • Der Übergang in eine Tumorzelle (Transformation) durch das onkogene Ras- Gen wird durch Ind12 aufgehoben. In Gegenwart von 100 µM Ind12 ändern Ras transformierte MDCK Zellen (MDCK-Ras) ihre Morphologie und ähneln untransformierten Zellen. Die Menge des Zelladhäsionsproteins Cadherin, die durch die Transformation deutlich verringert wird, steigt wieder an. Damit korreliert die zunehmende Anzahl von mikroskopisch sichtbaren Zell-Zellkontakten nach Ind12 Behandlung. Das Onkoprotein β- Catenin, das in proliferierenden und Ras transformierenden Zellen diffus im Cytoplasma und vor allem im Kern lokalisiert, findet sich nach Ind12 Behandlung ausschließlich an der inneren Seite der Zellmembran, wo es auch in normalen, nicht proliferierenden Zellen lokalisiert ist. Die Reversion der Ras Transformation durch Ind12 ist auf eine direkte Wirkung auf den Ras Signalweg zurückzuführen. Die Aktivität des Ras Effektors Raf Kinase ist nach Behandlung der Zellen mit Ind12 deutlich verringert. Außerdem ist die gemessene Menge an phosphorylierter und damit aktivierter MAP Kinase geringer in Ind12 behandelten Zellen als in unbehandelten Zellen.
  • Anhand verschiedener Parameter (Morphologie, DNA Fragmentierung, Markerenzyme) konnte gezeigt werden, dass Ind12 auch Apoptose von bestimmten Tumorzellen verursachen kann. Der stärkste Apoptose induzierende Effekt konnte bei Tumorzellen der Maus beobachtet werden, die mit dem Onkogen Wnt transformiert worden war. Dieser Zelltyp gilt als Zellmodell für menschliche Tumoren mit Mutationen im APC Gen oder im β- Catenin-Gen.
    • Beispiel 4 Ergebnisse für weitere Substanzen
  • Die Ergebnisse für weitere getestete Substanzen sind in den Tabellen 5 und 6 dargestellt. Tabelle 5



    Tabelle 6



  • Vorteile der neuen Substanzen
  • Gegenüber Sulindac haben die neuen Substanzen mehrere Vorteile: Bessere Löslichkeit und höhrere Stabilität in wässrigen Lösungen, keine spontane Reduktion oder Oxidation und vor allem die geringere Wirkungskonzentration. Publikationen Arber et al., Gastroenterology 113 (1998), 1892-1900;
    Behrens et al., J. Cell Biol. 108 (1989), 2435-2447;
    Belliveau und Graham, Dis. Col. Rect. 27 (1984), 53-54;
    Bos, Cancer Res. 49 (1989), 4682-4689;
    Chan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 681-686;
    Chiu et al., Cancer Res. 57 (1997), 4267-4273;
    Duggan et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 201 (1977), 8-13;
    Giardiello, Cancer Metast. Rev. 13 (1994), 279-283;
    Green et al., Lancet 1 (1977), 804;
    He et al., Cell 99 (1999), 335-345;
    Herrmann et al., Oncogene 17 (1998), 1969-1776;
    Jung et al., Pharm. Pharmacol. Commun. 6 (2000), 217-221;
    Land et al., Nature 304 (1983), 596-602;
    Luk, Journal Suisse des Medicine 126 (1996), 801-812;
    Pamukcu und Piazza, United States Patent 6,046,199 (2000);
    Pasricha et al., Gastroenterology 109 (1995), 994-998;
    Piazza et al., Cancer Res. 57 (1997a), 2909-2915;
    Piazza et al., Cancer Res. 57 (1997b), 2452-2459;
    Qiao et al., Biochimica et Biophysica Acta 1258 (1995), 215-223;
    Rao et al., Cancer Res. 55 (1995), 1464-1472;
    Reynolds et al., Curr. Med. Res. & Opin. 4 (1977), 485-491;
    Roth und Kleemann, in: Arzneistoffsynthese, Thieme Verlag 1982, 73-74;
    Shiff et al., J. Clin. Invest. 96 (1995), 491-503;
    Shimizu et al., Cell Growth Differ. 8 (1997), 1349-1358;
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    Thompson et al., Cancer Res. 57 (1997), 267-271;
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    Winde et al., Dis. Col. Rect. 38 (1995), 813-83.

Claims (20)

1. Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II):


worin die Substituenten R1 bis R11 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig für Wasserstoff, Deuterium, Halogen, eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylgruppe, die gegebenenfalls über ein O-Atom, ein S-Atom oder eine Aminogruppe an das Grundgerüst gebunden ist, z. B. eine Alkoxygruppe wie Methoxy, eine Thioalkylgruppe wie Methylsulfid oder eine einfach oder zweifach mit Kohlenwasserstoffgruppen substituierte Aminogruppe wie Methylamino, Dimethylamino oder Ethylylamino, Nitro, Cyano, Carboxy, Sulfat, Hydroxy, Hydroxymethyl, Amino, Amidino, Guanidino oder Aminoacetat steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxyl, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt, und wobei gegebenenfalls zwei benachbarte Substituenten miteinander verbrückt sind, um ein gesättigtes oder ungesättigtes, gegebenenfalls heterocyclisches Ringsystem zu ergeben,
der Substituent Z für Nitro, Cyano, Carboxy, Sulfat, Hydroxy, Hydroxymethyl, Methoxy, Amidino, Guanidino, Aminoacetat oder für einen Rest CO2R12 steht, wobei R12 eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt,
und der Substituent X für Sauerstoff, Schwefel, einen Rest CR13R14 oder NR15 steht, wobei R13, R14 und R15 jeweils unabhängig für Wasserstoff oder für eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe, eine Alkylthiogruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen, steht, wobei die Substitution vorzugsweise durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus Halogen, Amino, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy erfolgt, oder Salze und Isomere davon.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Z für Carboxyl steht.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass X für Sauerstoff oder Schwefel oder CR13R14 steht.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R3 für Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Alkoxygruppe steht.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ausgewählt aus den in Abb. 2 und Abb. 6 dargestellten Verbindungen oder Salzen und Isomeren davon.
6. Verwendung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Modulatoren des Ras Proteins.
7. Verwendung nach Anspruch 6 als Inhibitoren der Wechselwirkung von Ras und Raf Kinase.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7 als Inhibitoren der Zellproliferation.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 als Inhibitoren einer durch Ras vermittelten Zelltransformation.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 als Stimulatoren der Apoptose oder als Mittel zur Rücktransformation von Tumorzellen.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit physiologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen enthält.
12. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Störung der Zellproliferation assoziiert sind.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Prävention oder Behandlung von Tumorerkrankungen oder von entzündlichen Erkrankungen.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Prävention oder Behandlung von einer mit dem einer Ras Protein assoziierten Tumorerkrankung.
15. Verwendung nach Anspruch 13 zur Prävention oder Behandlung von einer mit dem Wnt Protein, dem APC Protein oder/und dem β- Catenin Protein assoziierten Tumorerkrankung.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man den Wirkstoff in einer Dosierung von 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man den Wirkstoff in Kombination mit anderen Antitumormitteln verabreicht.
18. Verwendung der Zelllinie MDCK (epitheliale Nierenzellen des Hundes) oder/und der Zelllinie C57MG (epitheliale Brustdrüsenzellen der Maus) als Testsysteme zum Nachweis der biologischen Wirksamkeit von Testsubstanzen.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zum Nachweis der Antitumorwirksamkeit von Testsubstanzen, wobei die Zelllinien mit einem Onkogen, insbesondere dem ras- oder dem wnt-Onkogen transfiziert sind.
20. Verwendung nach Anspruch 19, umfassend die Bestimmung eines oder mehrerer Messparameter ausgewählt aus (i) Morphologie, (ii) Apoptose oder/und (iii) Anzahl lebender Zellen.
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