DE10131145A1

DE10131145A1 - Zusammensetzung zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen

Info

Publication number: DE10131145A1
Application number: DE10131145A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Lueke; Harald Petry; Oliver Ast; Ingo Wilke; Claudia Goldmann; Kerstin Wagner; Matthias Schnabelrauch
Original assignee: Jenapharm GmbH and Co KG
Current assignee: Innovent eV Technologieentwicklung
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: ES2275781T3; EP1270586B1; NO20022898D0; DE50208824D1; EP1270586A3; JP2003061693A; ATE346859T1; EP1270586A2; DE10131145B4; NO20022898L; US20030044961A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen auf Basis viraler Hüllproteine, die mit einem kationischen Polymer als Anker zur Bindung von Liganden, insbesondere zielzellspezifischen Liganden, assoziiert sind.

Description

Die Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen auf Basis viraler Strukturproteine, die mit einem kationischen Polymer als Anker zur Bindung von Liganden, insbesondere zielzellspezifischen Liganden assoziiert sind.

Die klinische Anwendbarkeit von gentherapeutischen Verfahren ist im Wesentlichen von der Effizienz, der Zielzellspezifität und der biologischen Sicherheit des verwendeten Transfersystems abhängig, mit dem die therapeutische DNA in die Zellen eingebracht wird. Alle bislang verfügbaren Transfersysteme weisen hinsichtlich dieser Eigenschaften wesentliche Probleme auf. Virale Transfersysteme bergen aufgrund der potenziellen Rekombinationsgefahr mit zellulären Sequenzen ein kaum kalkulierbares Sicherheitsrisiko. Adenoviren und adenoassoziierte Viren, die derzeit favorisierten Systeme zum Transport von therapeutischen Genen, machen aufgrund ihrer hohen Immunogenität bei den meisten Patienten eine mehrmalige in vivo Applikation unmöglich. Nicht-virale Systeme, wie Liposomen und DNA-kondensierende Moleküle vermeiden zwar diese Nachteile, zeigen dafür allerdings, ähnlich wie retrovirale Systeme, weitaus geringere Transfereffizienzen und Zielzellspezifitäten.

Um diese Probleme zu umgehen, wurde ein neuartiges Transfersystem auf der Basis von virus-ähnlichen Partikeln (VLP) entwickelt (WO 97/19174). Diese VLP können durch rekombinante Expression des Hauptstrukturproteins VP1 des humanen Polyomavirus JCV in Insektenzellen hergestellt werden. Grundlage dieses Systems ist die Eigenschaft der VP1-VLP DNA verpacken zu können und diese dann spezifisch in bestimmte Zellen einzuschleusen. Im Gegensatz zur VP1- Expression anderer Polyomaviren werden die VP1-VLPs in den Zellkulturüberstand sezerniert, aus dem sie durch zwei aufeinander folgende Zentrifugationsschritte in hoher Reinheit präpariert werden. VP1- VPLs können durch Entzug von Ca²⁺-Ionen unter reduzierenden Bedingungen in VP1 Pentamere dissoziiert und im Gegensatz zu VP1-VPLs anderer Polyomaviren anschließend wieder zu vollständigen VP1-VPLs reassoziiert werden. Die Verpackung der DNA erfolgt während dieses VP1 Reassoziationsprozesses unter definierten in vitro Bedingungen ohne das sich hierbei die morphologischen und biologischen Eigenschaften der VP1- VPL verändern. Die so verpackte DNA ist im Weiteren geschützt vor enzymatischen Abbau durch DNase I. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich neben der DNA auch niedermolekulare Substanzen in die VP1-VPLs verpacken lassen. Mit Hilfe der VP1-VLP wird die verpackte Fremd-DNA effizient und spezifisch in Zellen renalen und neuronalen Ursprungs eingeschleust und dort exprimiert. Dieser, im Gegensatz zu anderen Transfersystemen, sehr enge Zelltropismus der VP1-VLP entspricht dem des natürlichen JC-Virus und ist für die Anwendung als DNA Transfersystem sehr vorteilhaft.

Neben der biologischen Sicherheit und der Transfereffizienz ist die Zielzellspezifität von Transfersystemen eines der entscheidenden Kriterien für den in vivo Einsatz zur gentherapeutischen Behandlung von Erkrankungen. Viele der derzeit verfügbaren viralen und nicht-viralen Transfersysteme weisen ein sehr breites Wirtszellspektrum auf. Durch eine gezielte Veränderung oder den Austausch von Hüllproteinen wird hierbei versucht, den Tropismus auf bestimmte Zellen oder Gewebe zu beschränken. Diese Strukturveränderungen sind zum einen sehr aufwendig und gehen darüber hinaus häufig zu Lasten der Transfereffizienz.

Die Eignung der VP1-VLPs als zellspezifisches DNA Transport- und Transduktionssystem wurde in verschiedenen Zelllinien untersucht. Immunfluoreszenzuntersuchungen zeigten, dass die VP1-VLP ausschließlich an Zellen renalen und neuronalen Ursprungs binden und innerhalb kurzer Zeit internalisiert und in den Zellkern transportiert werden.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von VP1-VLP zur spezifischen Transduktion von Zellen renalen und neuronalen Ursprungs.

Ein weiterer Gegenstand der hier beschriebenen Erfindung ist eine Methode den Zelltropismus der VP1-VLP gezielt zu verändern, um auf diese Weise selektiv ganz bestimmte Zielzellen und Gewebe zu transduzieren. Dieses Prinzip ermöglicht einen flexiblen Einsatz der VP1-VLP als DNA Transfersystem bei der Behandlung von Erkrankungen, die auf bestimmte Zelltypen bzw. Gewebe beschränkt sind.

Vor diesem Hintergrund wurde überraschenderweise gefunden, dass sich die Zielzellspezifität durch Beladung der VP1-VLP mit kationischen Polymeren als Ankermolekül für zellspezifische Liganden gezielt verändern lässt. Daher können die VP1-VLP als zellspezifisches Transportsystem für therapeutische Nukleinsäuren oder Substanzen eingesetzt werden. Vor dem Hintergrund, dass das VP1 Protein rekombinant und getrennt von der therapeutischen DNA in großen Mengen und hoher Reinheit produziert wird und die DNA Verpackung nicht wie bei retroviralen, adeno-assoziierten oder adenoviralen Vektoren in Verpackungszelllinien erfolgt, lassen sich Kontaminationen mit viralen Nukleinsäuren und die potenzielle Gefahr der Entstehung infektiöser Viren aufgrund von Rekombinationsereignissen ausschließen. Da weiterhin die DNA Verpackung und die Beladung der VP1-VLP mit zellspezifischen Liganden unter definierten in vitro Bedingungen erfolgt, stellt das VP1-VLP DNA Transfersystem eine biologisch sichere Platformtechnologie dar, die die Vorteile viraler und nicht-viraler Systeme vereinigt, ohne allerdings deren Nachteile aufzuweisen.

Ein Gegenstand der Erfindung sind somit Konjugate virusähnlicher Partikel (VLP), die aus mehreren Molekülen des Virusproteins VP1 von JC-Virus aufgebaut sind, assoziiert mit einem kationischen Polymer, das als Anker zur Bindung weiterer Liganden dienen kann. Die erfindungsgemäßen VLP zeichnen sich insbesondere dadurch aus, dass sie frei von mit JCV assoziierten Nukleinsäuren sind. Derartige VLP, insbesondere VLP aus rekombinanten VP1-Molekülen, sind in WO 97/19174 beschrieben.

Das VP1 von JVC ist das Hauptstrukturprotein der Kapsidhülle von JCV, z. B. aus Wildtypstämmen oder mutagenisierten Stämmen von JCV. In einer besonderen Ausführungsform ist das VLP aus rekombinant hergestelltem VP1 aufgebaut. Daher umfasst der Begriff VP1 auch Proteine, die sich vom Wildtyp VP1 durch Mutationen, wie etwa Substitutionen, Insertionen oder/und Deletionen, unterscheiden. Zur Herstellung von rekombinanten VP1 verwendet man bevorzugt eine Nukleinsäure, welche die in SEQ. ID NO. 1 gezeigte oder eine dazu komplementäre Sequenz, eine dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Sequenz oder eine damit unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz umfasst, wobei man die Nukleinsäuresequenz oder einen diese Sequenz enthaltenden rekombinanten Vektor in eine geeignete Wirtszelle einbringt, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression der Nukleinsäuresequenz erfolgt und das Protein aus der Zelle oder dem Zellüberstand isoliert. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind vorzugsweise definiert gemäß Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, und umfassen einen Waschschritt von 30 min in 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 60°C und vorzugsweise 68°C.

Das erfindungsgemäße VLP kann weiterhin ein oder mehrere zusätzliche heterologe Proteine in der Kapsidstruktur aufweisen. Darunter ist zu verstehen, dass ein heterologes Protein in der Kapsidstruktur verankert ist, wobei bevorzugt mindestens ein Teil dieses Proteins von außen zugänglich ist. Als heterologes Protein eignen sich hierfür prinzipiell alle Proteine, die in die Kapsidstruktur inkorporiert werden können und die Selbstassemblierung des VLP nicht beeinträchtigen.

Das kationische Polymer, das mit dem VLP assoziiert wird, ist vorzugsweise ein physiologisch kompatibles Polymer. Beispiele für geeignete kationische Polymere sind Polyamine oder/und Polyimine, d. h. Polymere die primäre, sekundäre oder tertiäre Amino- oder/und Iminofunktionen in ausreichender Menge enthalten, um für eine positive Nettoladung des Polymers bei physiologischen Bedingungen zu sorgen. Günstigerweise trägt das Verhältnis kationischer Gruppen zu anionischen Gruppen ≥ 2 : 1 besonders bevorzugt ≥ 5 : 1. Am meisten bevorzugt ist das kationische Polymer im Wesentlichen frei von anionischen Gruppen. Das Molekulargewicht der kationischen Polymere liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 750 kD, besonders bevorzugt im Bereich von 25 bis 100 kD.

Spezifische Beispiele für kationische Polymere sind auf im Wesentlichen basischen Aminosäuren basierende Polymere, wie etwa Polylysin, insbesondere Poly-L-Lysin etc. Weitere spezifische Beispiele für geeignete kationische Polymere sind Polyalkylenimine, vorzugsweise Poly-C₂-C₄ Alkylenimine, insbesondere Polyethylenimin (PEI), pMAMAM (Polyamindoamin)-Dendrimere und fraktionierte Dendrimere sowie kationisch modifiziertes Polyethylenglykol. Polyethylenimin ist ein besonders bevorzugtes kationisches Polymer im Sinne der vorliegenden Erfindung, da es nicht toxisch ist und eine hohe Dichte an positiven Ladungen aufweist. PEI ist weiterhin dazu in der Lage, nach Aufnahme in die Zellen eine pH-abhängige Strukturveränderung zu bewirken, die zur Destabilisierung von endosomalen und lysosomalen Zellkompatimenten führt und somit die Freisetzung von Wirkstoffen, z. B. Nukleinsäuren, in das Zytoplasma erleichtert. Dieser Prozess wird durch die ausgeprägte Pufferkapazität der Iminogruppen unterstützt, die nach Azidifizierung in den Lysosomen protoniert werden und dann zu einer osmotischen Ruptur der Vesikelmembran führen.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde nun festgestellt, das Polykationen eine hohe Affinität zu VP1-VLP aufweisen. Das bevorzugte Gewichtsverhältnis von VP1-VLP zu kationischem Polymer in den erfindungsgemäßen Konjugaten kann in breiten Bereichen variiert werden. So haben sich Gewichtsverhältnisse von 5 : 1 bis 1 : 10 als geeignet erwiesen, wobei Gewichtsverhältnisse von 2 : 1 und 1 : 5 besonders bevorzugt sind, um eine optimale Bindung zu ermöglichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein Ligand an das kationische Polymer, das mit dem VP1-VLP assoziiert ist, gebunden. Der Ligand kann grundsätzlich eine beliebige Substanz sein, sofern er über kovalente oder/und nicht-kovalente Wechselwirkungen direkt oder indirekt an das kationische Polymer gebunden werden kann. Beispielsweise kann der Ligand eine zielzellspezifische Gruppe sein, z. B. ein Bindungspartner für einen Zelloberflächenrezeptor. Geeignete Beispiele für Bindungspartner sind natürliche Liganden oder synthetische Analoga davon, wobei hochmolekulare Liganden wie Proteine, z. B. Transferrin, Antikörper oder Zucker wie Mannose, aber auch niedermolekulare synthetische Liganden, z. B. das Tripeptid-Motiv R-G-D (Arg-Gly-Asp), eingesetzt werden können. Alternativ oder zusätzlich kann als Ligand auch eine Markierungsgruppe, z. B. eine durch geeignete Nachweismethoden erkennbare Gruppe, wie etwa eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe oder Biotin, verwendet werden. Weiterhin kann der Ligand auch eine Effektorgruppe, z. B. eine cytotoxische Gruppe, sein. Selbstverständlich können auch Kombinationen mehrerer Liganden, insbesondere Kombination der zuvor genannten Liganden, eingesetzt werden.

In einer besonderen Ausführungsform kann das VLP im Inneren der Kapsidstruktur eine oder mehrere Wirksubstanzen enthalten. Unter Wirksubstanz wird in dieser Beschreibung jedes Molekül verstanden, welches in dem bei der Selbstassemblierung verwendeten Medium nicht üblicherweise vorhanden ist. Solche Wirksubstanzen umfassen z. B. Makromoleküle, wie etwa Nukleinsäuren, d. h. RNA, DNA oder artifizielle modifizierte Nukleinsäuren, sowie Proteine und andere physiologisch aktive Stoffe, die natürlicher, synthetischer oder rekombinanter Art sein können. Beispiele für derartige physiologisch aktive Stoffe sind z. B. Lipide, Phospholipide, Peptide, Arzneimittel, Toxine etc.

In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus VP1-VLP und kationischen Polymeren, wobei mehrere VP1-Moleküle zu einem Partikel assemblieren und vor, während oder/und nach der Assemblierung ein kationisches Polymer zur Assoziierung an das Partikel zugesetzt wird. Vorzugsweise wird das kationische Polymer nach der Assemblierung zugesetzt. Besonders bevorzugt werden die VLP, insbesondere die rekombinanten VLP zuerst gereinigt, dann dissoziiert und anschließend in Gegenwart der Wirksubstanz reassoziiert. Im Falle, dass das Konjugat noch zusätzliche Wirksubstanzen enthalten soll, führt man die Assemblierung vorzugsweise in Gegenwart dieser weiteren Substanz durch, die dann im Inneren der Kapsidhülle des VLP eingeschlossen wird.

Bevorzugt wird das VLP auf rekombinante Weise hergestellt, wobei man eine für ein VP1-Protein kodierende Nukleinsäure in eine Zelle einbringt, die transformierte Zelle in einem Medium unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression der Nukleinsäure erfolgt, und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder aus dem Medium gewinnt. Die Isolierung des rekombinanten VP1 erfolgt in Abhängigkeit des verwendeten Wirt/Vektorsystems direkt aus den Wirtszellen oder/und dem Zellkulturüberstand. Der Vorteil des rekombinanten Verfahrens liegt vor allem darin, dass auf einfache Weise VLP in hoher Reinheit und in großen Mengen gewonnen werden können. Als Expressionssystem hat sich in der Praxis die Verwendung von Baculoviren in Verbindung mit Insektenzellen, z. B. mit der Insektenzelllinie Sf 158, bewährt.

Zur Herstellung von VPL, die innerhalb der Kapsidstruktur ein heterologes Protein inkorporiert haben, bzw. von VPL, die im Inneren der Kapsidstruktur eine Wirksubstanz enthalten, modifiziert man das obige Herstellungsverfahren, indem man zu einem geeigneten Zeitpunkt, d. h. vor der Assemblierung der VLP die heterologen Proteine oder/und Wirksubstanzen in der gewünschten Menge bzw. Konzentration zusetzt und anschließend die Assemblierung zulässt. Auf diese Weise können VLP entstehen, welche heterologes Protein in der Kapsidhülle inkorporiert haben oder/und im Inneren eine eingeschlossene Wirksubstanz, z. B. eine Nukleinsäure enthalten. Die Inkorporation von heterologen Polypeptiden in der Kapsidhülle kann beispielsweise durch rekombinante Koexpression der jeweiligen Polypeptide, d. h. des VP1-Plypeptids und des heterologen Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle, z. B. einer eukaryontischen Zelle erfolgen. Die Inkorporation von Wirksubstanzen in das Innere der Kapsidhülle kann z. B. durch Dissoziation der Kapsidhülle und anschließende Reassoziation in Gegenwart der Wirksubstanz oder durch osmotischen Schock der VLP in Gegenwart der Wirksubstanz erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Konjugate aus VLP und kationischen Polymer können für diagnostische und therapeutische Zwecke eingesetzt werden, z. B. zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Infektion durch den JC-Virus assoziiert sind, wie etwa PML.

In einer weiteren Ausführungsform kann man die VLP als Transportvehikel verwenden, insbesondere zum Transport von Wirkstoffen zu einer Zielzelle und vorzugsweise in die Zielzelle. Durch Bindung eines Liganden an das mit dem VLP assoziierten kationischen Polymer wird dabei die Zielzellspezifität gegenüber unmodifizierten VLP signifikant verändert.

Auf diese Weise kann die Spezifität der Interaktion mit den vorgesehenen Zielzellen gewährleistet und in Abhängigkeit von der Anwendung auf eine Vielzahl an Zelltypen angepasst werden. Ein Beispiel für eine derartige Verwendung ist der zielgerichtete Transport von TNF-α Antisense- Nukleinsäuren an Oligodendrozyten bei Multipler Sklerose, da bekannt ist, dass bei dieser Erkrankung eine TNF-α Expression im Schub zur Demyelinisierung führt. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung ist die Verwendung von VLP als Transportersystem für Nukleinsäuren in der Gentherapie.

Durch die Einschleusung des Thymidinkinase-Gens von Herpesviren wird der Selbstmordmechanismus der Zelle initiiert. Der zielgerichtete Transport des Tk-Gens (Thymidinkinase) in neoplastisch transformierte Zellen, wie z. B. Zellen der Benignen Prostata Hyperplasie, führt nach zusätzlicher Gabe eines Nukleosidanaloga (z. B. Acyclovir oder Gancyclovir) zur Termination der Replikation und in Folge zum Tod der transduzierten Zellen.

Die Erfindung wird nunmehr weiter erläutert durch die nachfolgenden Beispiele sowie die beigefügten Figuren und Sequenzprotokolle.

Es zeigen

Fig. 1 VP1-spezifische Immunfluoreszenz zum Nachweis von VP1- VLP in SVG und COS-7 Zellen
30 µg VP1-VLP wurden mit jeweils 5 × 10⁴ Zellen für 24 Stunden inkubiert. Der Nachweis des VP1 erfolgte nach Fixierung der Zellen mit einem VP1- spezifischen Immunserum und einer anschließenden Inkubation mit einem FITC-gekoppelten anti-Kanninchen mAk durch fluoreszenzmikroskopische Methoden.

Fig. 2 Messung der Transduktionseffizienz von VP1-VLP in Zellen renalen und neuronalen Ursprungs
Zur Bestimmung der Transduktionseffizienz von VP1-VLP wurden 1,25 µg VP1-VLP 1 µg DNA des Reporterplasmids pGL3-C verpackt. Jeweils 5 × 10⁴ Zellen wurden mit den VLP Komplexen für 24 Stunden inkubiert, anschließend gewaschen und für weitere 24 Stunden kultiviert. Im Anschluß daran wurde die Luziferase Aktivität in den Zelllysaten luminometrisch bestimmt.

Fig. 3 Bestimmung der Bindungsfähigkeit von Polyethylenimin (PEI) an VP1-VLP
Zur Bestimmung der Bindungsfähigkeit von PEI an VP1-VLP wurde PEI- Biotin als detektierbares Konjugat verwendet. Dazu wurden in einem ELISA Test 100 µg VP1 pro Kavität gebunden, anschließend mit unterschiedlichen Konzentrationen PEI-Biotin inkubiert und die Komplexe mit Streptavidin HRP photometrisch bei 490 nm quantifiziert. Das VLP/PEI Verhältnis von 1 : 3,4 wurde als optimales Bindungsverhältnis ermittelt. Der Cut off-Wert der Messung ist durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet.

Fig. 4 Bestimmung der Bindungsfähigkeit von Polyethylenimin an VP1-VLP
Zur Bestimmung der Bindungsfähigkeit von PEI-Transferrin an VP1-VLP erfolgte in einem ELISA Test. Dazu wurden 100 µg VP1 pro Kavität gebunden, anschließend mit unterschiedlichen Konzentrationen PEI- Transferrin inkubiert und die Komplexe mit einem anti-Transferrin HRP konjugierten Antikörper photometrisch bei 490 nm quantifiziert. Das VLP/PEI Verhältnis von 1 : 1,5 wurde als optimales Bindungsverhältnis ermittelt. Der Cut off-Wert der Messung ist durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet.

Fig. 5 VP1 spezifische Immunfluoreszenz zum Nachweis von VP1- VLP und VP1-VLP PEI/Transferrin Komplexen in HeLa, DU-145 und BM1604 Zellen
3 µg der VP1-VLP PEI/Transferrin Komplexe wurden mit jeweils 5 × 10⁴ Zellen für 24 Stunden inkubiert. Der Nachweis des VP1 erfolgte nach Fixierung der Zellen mit einem VP1 spezifischen Immunserum und einer anschließenden Inkubation mit einem FITC gekoppelten anti-Kaninchen mAk durch fluoreszenzmikroskopische Methoden.

Fig. 6 Messung der Transduktionseffizienz von VP1-VLP/PEI- Transferrin Komplexen in verschiedenen Zelllinien
Zur Bestimmung der Transduktioneffizienz von VP1-VLP/PEI-Transferrin Komplexen wurden in 1,25 µg VP1-VLP 1 µg DNA des Reporterplasmids pGL3-C verpackt. Anschließend wurden die VLP mit 1,9 µg PEI-Transferrin beladen. Jeweils 5 × 10⁴ Zellen wurden mit den VLP Komplexen für 24 Stunden inkubiert, anschließend gewaschen und für weitere 24 Stunden kultiviert. Im Anschluss daran wurde die Luziferase Aktivität in den Zelllysaten luminometrisch bestimmt. Als Kontrolle wurden neben den VLP Komplexen auch unbeladene VLP sowie DNA/PEI-Transferrin zur Transduktion der Zellen verwendet.

Beispiele Beispiel 1 Spezifische Transduktion von Zellen neuronalen und renalen Ursprungs mittels JCV-VLP

Es wurde beobachtet, dass die JCV-VLP einen spezifischen Tropismus für Zellen renalen und neuronalen Ursprungs aufweisen. Für die Transduktionsversuche wurden die JCV-VLP aus dem Überstand einer Insektenzelllinie (SF158), die mit VP1-rekombinanten Bakuloviren infiziert waren, gereinigt. Für die Verpackung der DNA wurden 50 µg gereinigte VP1-VLP in einem Gesamtvolumen von 10 µl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EGTA, 150 mM NaCl und 5 mM DTT dissoziiert. Um die DNA zu verpacken wurden VP1-Pentamere in Gegenwart der zu verpackenden Plasmide gegen einen Ca²⁺-haltigen Puffer dialysiert, um den Komplexbildner EGTA und das reduzierende Agens DTT zu verdünnen und gleichzeitig Ca²⁺-Ionen zuzuführen. Die Bildung der JCV-VLP konnte elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden. Um Plasmid-DNA zu entfernen, die an der Oberfläche der VP1-VLP gebunden war, wurde ein DNasel-Verdau durchgeführt. Je Reaktionsansatz wurden 10 U DNasel (Pharmacia Biotech, Freiburg) zugeführt, eine Endkonzentration von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 6 mM MgCl₂ eingestellt und eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Mit diesen JCV-VLP konnten spezifisch Zellen neuronalen Ursprungs (wie z. B. SVG Zellen) und renalen Ursprungs (wie z. B. COS-7 Zellen) transduziert werden. Dazu wurden jeweils 5 × 10⁴ Zellen über Nacht bei 37°C mit den DNA-enthaltenden VP1-VLPs inkubiert. Die Transduktionseffizienz wurde mittels des Reportergens Luziferase bestimmt. In Zellen neuronalen und renalen Ursprungs wurden in diesen Versuchen hohe Transduktionseffizienzen gemessen. Dagegen wurde in Fribroblasten, T-Lymphozyten, Dentritischen Zellen, Chondrozyten, Zellen aus der Prostata oder aus Mammakarzinomen, die ebenfalls mit den JCV- VLP inkubiert wurden keine Luziferase Aktivitäten beobachtet.

Beispiel 2 Charakterisierung der PEI-VLP Bindungseigenschaften

Da der Polymerisationsgrad des PEI und die Kopplungsdichte der Liganden Auswirkungen auf die Ladungsverteilung im Molekül hat, wurden zwei verschiedene PEI Präparationen (25 kD Polymer von SIGMA/Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) in einem ELISA Test hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften an die VP1-VLP untersucht.

Dazu wurde zunächst Biotin als gut detektierbare Gruppe kovalent an Polyethylenimin in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 gekoppelt. Die Bindungsfähigkeiten des PEI-Biotin an die VP1-VLPs wurde bestimmt, indem 100 ng VP1-VLP pro Kavität einer 96 well ELISA Platte gebunden wurde, dieses mit PEI-Biotin in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und die Bindung mit einem Meerrettich-Peroxidase HPR) konjugierten Streptavidin Konjugat photometrisch quantifiziert wurde. Dabei ergab sich ein optimales VP1-VLP/PEI-Biotin Bindungsverhältnis (w/w) von 1 : 3,4 (Fig. 3).

Analoge Versuche wurden mit dem PEI-Transferrin (Q-Biogene, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Dazu wurden wiederum 100 ng VP1-VLPs pro Kavität auf einer ELISA Platte gebunden, mit verschiedenen Konzentrationen von PEI-Transferrin inkubiert und die Bindung anschließend mit einem monoklonalen anti-Transferrin Antikörper quantitativ nachgewiesen. Dabei ergab sich ein optimales VP1-VLP/PEI-Transferrin Bindungsverhältnis (w/w) von 1 : 1,5 (Fig. 4).

Beispiel 3 Zellbindungstest mit JCV VP1-VLP PEI-Transferrin

In Zellbindungstests wurde die Bindung, die Internalisierung und der Kerntransport der VP1-VLP/PEI-Transferrin Komplexe nachgewiesen. Die Beladung der VP1-VLP erfolgt in einem einfachen in vitro System. Dazu wurde ein VP1-VLP/PEI-Transferrin Gewichtsverhältnis von 1 : 1,5 eingestellt. Die Bindung erfolgte während einer 30 minütigen Inkubation bei 37°C. Die Zellbindungstests wurden an den Zelllinien HeLa (Scherer et al., J. Exp. Medicine 97 (1953), 6951, DU145, BM1604 und BPH-1 (Mitchell et al., BJU International 85 (2000), 932) durchgeführt, die den Transferrin- Rezeptor exprimieren. Dazu wurden jeweils 5 × 10⁴ Zellen mit 3 µg VP1-VLP PEI/Transferrin für 24 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen fixiert und das VP1 Protein mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen (Fig. 5). Bei allen vier Zelllinien war nach der Inkubation eine deutliche Bindung von VP1-VLP PEI/Transferrin an die Zellmembran zu erkennen. Bei den HeLa Zellen war bereits 2 Stunden nach Inkubation mit VP1-VLP PEI/Transferrin eine deutliche Anreicherung von VP1 an der Kernmembran erkennbar. In Kontrollexperimenten, die ohne vorherige PEI-Transferrin Behandlung durchgeführt wurden, konnte bei keiner der untersuchten Zelllinien eine Bindung von VP1-VLP an die Zellmembran beobachtet werden.

Beispiel 4

Transduktion verschiedener Zellen mit VP1-VLP PEI- Transferrin

Die Transduktionseffizienz von VP1-VLP PEI/Transferrin wurde durch den Expressionsnachweis des Reportergens Luziferase bestimmt. Dazu wurde 1 µg des Plasmids pGL3-C (Promega) in 1,25 µg VP1-VLP verpackt. Anschließend wurden die VP1-VLPs mit PEI-Transferrin, wie in Beispiel 2 beschrieben, beladen. Die Inkubation der VP1-VLP PEI-Transferrin Komplexe mit den Zelllinien HeLa, DU145, BM1604 und BPH-1 erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben für 24 Stunden. Danach wurde das Medium gewechselt und die Zellen für weitere 24 Stunden kultiviert. Der quantitative Nachweis der Luziferase Expression erfolgte luminometrisch mittels eines kommerziell erhältlichen Systems (Promega).

Die Ergebnisse der Luziferase Messung demonstrieren eindrucksvoll, dass die Zellen die mittels unmodifizierter VP1-VLP nicht transduzierbar sind, nach vorheriger Beladung der VLP mit PEI-Transferrin effizient transduziert werden (Fig. 6). Darüber hinaus zeigen die Luziferase Aktivitätsdaten, dass die Transduktion mit VP1-VLP/PEI-Transferrin Komplexen effizienter ist als die Verwendung herkömmlicher gebundener DNA an PEI-Transferrin. In diesen Untersuchungen konnte eindeutig gezeigt werden, dass kationische Polymere zur Verankerung von Liganden auf den VP1-VLP verwendbar sind, der enge Zielzelltropismus der VP1-VLP mittels zellspezifischer Liganden verändert werden kann und dass die Transduktions- und Expressionseffizienz gegenüber herkömmlich verwendetem PEI deutlich erhöht ist.
SEQENZPROTOKOLL

Claims

1. Virusähnliches Partikel, das aus mehreren Molekülen des Virusprotein VP1 von JC-Virus aufgebaut ist, assoziiert mit einem kationischen Polymer.

2. Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus rekombinantem VP1 aufgebaut ist.

3. Partikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das VP1 kodiert ist von einer Nukleinsäure, welche

a) die SEQ. ID NO. 1 gezeigte oder die dazu komplementäre Nukleotidsequenz,

b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder/und

c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfasst.

4. Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ein Polyamin oder Polyimin ist.

5. Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ein auf Aminosäuren basierendes Polymer, insbesondere ein Polylysin ist.

6. Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ein Polyalkylenimin, insbesondere ein Polyethylenimin (PEI) ist.

7. Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Ligand an das kationische Polymer gebunden ist.

8. Partikel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand eine zielzellspezifische Gruppe, insbesondere einen Bindungspartner für einen Zelloberflächenrezeptor umfasst.

9. Partikel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand eine Markierungsgruppe umfasst.

10. Partikel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand eine Effektorgruppe umfasst.

11. Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es im Inneren der Kapsidstruktur mindestens eine Wirksubstanz enthält.

12. Partikel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren, Proteinen und physiologisch aktiven Stoffen.

13. Partikel nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz durch einen Dissoziations/Reassoziationszyklus in die VP1-VLP verpackt worden ist.

14. Verfahren zur Herstellung von Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) mehrere VP1 Moleküle zu einem Partikel assembliert und

b) vor, während oder/und nach der Assemblierung ein kationisches Polymer zur Assoziierung an das Partikel zusetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer nach der Assemblierung zugesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Assemblierung in Gegenwart einer weiteren Substanz durchführt, wobei die Substanz im Inneren der Kapsidhülle eingeschlossen wird.

17. Verwendung eines Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als diagnostisches Mittel.

18. Verwendung eines Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als therapeutisches Mittel.

19. Verwendung eines Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als Transportvehikel.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, zum Transport von Wirkstoffen zu einer Zielzelle, vorzugsweise in eine Zielzelle.

21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine Nukleinsäure ist.

22. Verwendung nach Anspruch 20 zur spezifischen Transduktion von Zellen.

23. Verwendung nach Anspruch 21 zur Gentherapie.

24. Verwendung von Virus-ähnlichen Partikeln, die aus mehreren Molekülen des Virusproteins VP1 von JCV aufgebaut sind, zur spezifischen Transduktion von Zellen neuronalen oder renalen Ursprungs.

25. Verwendung von Virus-ähnlichen Partikeln, die aus mehreren Molekülen des Virusproteins VP1 von JCV aufgebaut sind, zum spezifischen Transport von Wirkstoffen zu einer Zelle neuronalen oder renalen Ursprungs.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine Nukleinsäure ist.

27. Verwendung nach Anspruch 26 zur Gentherapie.