ES2275781T3 - Composicion para la transferencia especifica para celulas de sustancias activas. - Google Patents
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Abstract
Partícula similar a virus, que está constituida por varias moléculas de la proteína vírica VP1 del virus JC, asociada con un polímero catiónico.
Description
Composición para la transferencia, específica
para células, de sustancias activas.
El invento se refiere a nuevas composiciones
para la transferencia, específica para células, de sustancias
activas sobre la base de proteínas estructurales víricas, que están
asociadas con un polímero catiónico como ancla para la fijación de
ligandos, en particular de ligandos específicos para células
dianas.
La aplicabilidad clínica de procedimientos
terapéuticos génicos es dependiente en lo esencial de la eficiencia,
de la especificidad para células dianas y de la seguridad biológica
del sistema de transferencia que se utiliza, con el cual el ADN
terapéutico es incorporado en las células. Todos los sistemas de
transferencia, disponibles hasta ahora, presentan esenciales
problemas en lo que se refiere a estas propiedades. Los sistemas
víricos de transferencia albergan, a causa del potencial peligro de
recombinación con secuencias celulares, un riesgo de seguridad
apenas calculable. Los adenovirus y los virus asociados con ellos (=
adeno-asociados), que son los sistemas para el
transporte de genes terapéuticos, a los que se otorga actualmente la
preferencia, hacen imposible una aplicación in vivo en
múltiples veces, a causa de su alta inmunogenicidad en la mayor
parte de los pacientes. Los sistemas no víricos, tales como
liposomas y moléculas que se condensan con ADN, evitan ciertamente
estas desventajas, pero a cambio muestran no obstante, de una manera
similar a los sistemas retrovíricos, unas eficiencias de
transferencia y unas especificidades para células dianas que son
muchísimo menores.
Con el fin de orillar estos problemas, se
desarrolló un nuevo sistema de transferencia sobre la base de
partículas similares a virus (VLP, de virus like particles)
(documento de solicitud de patente internacional WO 97/191074).
Estas VLP's pueden ser producidas mediante expresión recombinante de
la proteína estructural principal VP1 del poliomavirus humano JCV
en células de insectos. El fundamento de este sistema es la
propiedad que tienen las VLP's de VP1 de poder empaquetar a un ADN
y hacer entrar a éste luego específicamente dentro de determinadas
células. Al contrario que la expresión de VP1 por otros
poliomavirus, las VLP's de VP1 son segregadas en el material
sobrenadante de un cultivo celular, a partir del cual se preparan
ellas con alta pureza mediante dos etapas de centrifugación que se
suceden consecutivamente. Las VLP's de VP1 pueden ser disociadas por
substracción de iones de Ca^{2+} en condiciones reductoras en
pentámeros de VP1 y, al contrario que las VLP's de VP1 de otros
poliomavirus se pueden reasociar a continuación de nuevo para dar
unas VLP's de VP1 completas. El empaquetamiento de los ADN se
efectúa durante este proceso de reasociación de VP1 en unas
condiciones in vitro definidas, sin modificar en este caso
las propiedades morfológicas y biológicas de las VLP's de VP1. El
ADN empaquetado de esta manera es protegido en lo sucesivo con
respecto de la descomposición enzimática mediante la DNasa I.
Además de esto, se pudo mostrar que, junto al ADN, también se pueden
empaquetar en las VLP's de VP1 otras sustancias de bajo peso
molecular. Con ayuda de las VLP's de VP1, el ADN ajeno empaquetado
es hecho entrar de una manera eficiente y específica en células de
origen renal y neuronal, y es expresado allí. Este tropismo
celular, muy estrecho, al contrario que en otros sistemas de
transferencia, de las VLP's de VP1 corresponde al del virus JC
natural y es muy ventajoso para la aplicación como sistema de
transferencia de ADN.
Junto a la seguridad biológica y a la eficiencia
de transferencia, la especificidad para células dianas de sistemas
de transferencia es uno de los criterios decisivos para el empleo
in vivo para el tratamiento terapéutico génico de
enfermedades. Muchos de los sistemas de transferencia, víricos y no
víricos, que están disponibles en el momento actual, presentan un
espectro muy amplio de células anfitrionas. Mediante una
modificación deliberada o el intercambio de proteínas de envoltura,
se intenta en este caso limitar el tropismo a determinadas células
o determinados tejidos. Estas modificaciones estructurales son, por
una parte, muy costosas y, además de esto, se desarrollan
frecuentemente a costa de la eficiencia de transferencia.
La idoneidad de las VLP's de VP1 como sistema de
transporte y transducción de ADN, específico para células, se
investigó en diferentes linajes celulares. Unas investigaciones por
inmunofluorescencia mostraron que las VLP's de VP1 se fijan
exclusivamente a células de origen renal y neuronal, y en el
transcurso de un breve periodo de tiempo son internalizadas y
transportadas dentro del núcleo celular.
Un objeto del invento es por consiguiente la
utilización de las VLP's de VP1 para la transducción específica de
células de origen renal y neuronal.
Un objeto adicional del invento que aquí se
describe, es un método de modificar deliberadamente el tropismo
celular de las VLP's de VP1, con el fin de transducir esta manera
selectivamente células dianas y tejidos enteramente
determinadas/os. Este principio hace posible un empleo flexible de
las VLP's de VP1 como sistema de transferencia de ADN en el caso
del tratamiento de enfermedades, que están limitadas a determinados
tipos de células y respectivamente tejidos.
Ante este antecedente, se encontró de una manera
sorprendente que la especificidad para células dianas se puede
modificar deliberadamente mediante carga de las VLP's de VP1 con
polímeros catiónicos como molécula de ancla para ligandos
específicos para células. Por lo tanto, las VLP's de VP1 se pueden
emplear como sistema de transporte, específico para células, de
ácidos nucleicos o sustancias de carácter terapéutico. Ante el
antecedente de que la proteína VP1 es producida de manera
recombinante y por separado del ADN terapéutico en grandes
cantidades y con alta pureza, y de que el empaquetamiento del ADN no
se efectúa en linajes de células empaquetadoras, como en los casos
de vectores retrovíricos, adeno-asociados o
adenovíricos, se pueden excluir contaminaciones con ácidos
nucleicos víricos y el peligro potencial de la génesis de virus
infecciosos a causa de sucesos de recombinación. Puesto que,
además, el empaquetamiento de ADN, y la carga de las VLP's de VP1
con ligandos específicos para células, se efectúan en unas
condiciones in vitro definidas, el sistema de transferencia
de ADN con las VLP's de VP1 constituye una tecnología de plataforma
biológicamente segura, que reúne las ventajas de los sistemas
víricos y de los sistemas no víricos, sin tener no obstante las
desventajas de éstos.
Un objeto del invento lo constituyen por
consiguiente conjugados de partículas similares a virus (VLP), que
están constituidas por varias moléculas de la proteína vírica VP1
del virus JC (JCV), asociadas con un polímero catiónico, que puede
servir como ancla para la fijación de otros ligandos adicionales.
Las VLP's conformes al invento se distinguen en particular por el
hecho de que están libres de ácidos nucleicos asociados con los
JCV. Tales VLP's, en particular las VLP's procedentes de moléculas
de VP1 recombinantes, se describen en el documento WO 97/19
174.
La VP1 del JCV es la proteína estructural
principal de la envoltura cápsida del JCV, p. ej. a partir de cepas
de tipo salvaje o cepas mutagenizadas de JCV. Una forma especial de
realización la VLP está constituida a base de una VP1 preparada por
vía recombinante. Por lo tanto, el concepto de VP1 abarca también
proteínas que se diferencian de una VP1 de tipo salvaje por
mutaciones, tales como por ejemplo sustituciones, inserciones o/y
deleciones. Para la preparación de una VP1 recombinante se utiliza
de manera preferida un ácido nucleico, que comprende la secuencia
mostrada en SEQ. ID. NO. 1 o una secuencia complementaria con ésta,
una secuencia correspondiente a esta secuencia dentro del marco de
la degeneración del código genético, o una secuencia que se híbrida
con ésta en condiciones rigurosas, incorporándose la secuencia de
ácido nucleico, o un vector recombinante que contiene esta
secuencia, en una célula anfitriona apropiada, cultivándose la
célula anfitriona en unas condiciones, en las que se efectúa una
expresión de la secuencia de ácido nucleico, y aislándose la
proteína a partir de la célula o del material sobrenadante de la
célula. Condiciones estrictas de hibridación son definidas de
manera preferida de acuerdo con Sambrook y colaboradores (1989)
Molecular Cloning A Laboratory Manual [Clonación molecular, un
manual de laboratorio], segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, y comprenden una etapa de lavado de 30 min en 0,1
x SSC, SDS al 0,5% a 60ºC y preferiblemente a 68ºC.
La VLP de acuerdo con el invento puede tener
además una o varias proteínas heterólogas adicionales en la
estructura de cápsida. Por tal concepto hay que entender que una
proteína heteróloga está anclada en la estructura de cápsida,
siendo accesible desde el exterior preferiblemente por lo menos una
parte de esta proteína. Como proteína heteróloga son apropiadas en
principio para esto todas las proteínas, que pueden ser incorporadas
en las estructura de cápsida y que no perjudican al autoensamble de
la VLP.
El polímero catiónico, que es asociado con la
VLP, es preferiblemente un polímero fisiológicamente compatible.
Ejemplos de apropiados polímeros catiónicos son poliaminas o/y
poliiminas, es decir polímeros, que contienen en una cantidad
suficiente funciones amino o/y imino, primarias, secundarias o
terciarias, con el fin de procurar una carga neta positiva del
polímero en condiciones fisiológicas. De manera favorable, la
relación de grupos catiónicos a grupos aniónicos es \geq 2:1, y
de manera especialmente preferida es \geq 5:1. De modo sumamente
preferido, el polímero catiónico está esencialmente libre de grupos
aniónicos. El peso molecular de los polímeros catiónicos está
situado preferiblemente en el intervalo de 10 a 750 kD, de manera
especialmente preferida en el intervalo de 25 a 100 kD.
Ejemplos específicos de polímeros catiónicos son
unos polímeros que se basan esencialmente en aminoácidos de
carácter básico, tales como por ejemplo una poli(lisina), en
particular una poli(L-lisina), etc. Otros
ejemplos específicos de apropiados polímeros catiónicos son
poli(alquileniminas), preferiblemente poli(alquilen
C_{2}-C_{4}-iminas), en
particular una poli(etilenimina) (PEI), dendrímeros de pAMAM
(poliamidoaminas) y dendrímeros fraccionados, así como un
poli(etilenglicol) modificado catiónicamente. Una
poli(etilenimina) es un polímero catiónico especialmente
preferido en el sentido del presente invento, puesto que no es
tóxica y presenta una alta densidad de cargas eléctricas positivas.
Una PEI está además en situación, después de su recepción en las
células, de producir una modificación de la estructura que es
dependiente del pH, que conduce a la desestabilización de
compartimientos celulares endosomales y lisosomales, y por
consiguiente facilita la liberación de sustancias activas, p. ej.
ácidos nucleicos, en el citoplasma. Este proceso es ayudado
mediante la pronunciada capacidad tamponadora de los grupos imino,
que después de una acidificación en los lisosomas son protonados y
entonces conducen a una rotura osmótica de la membrana de las
vesículas.
Dentro del marco de las presentes
investigaciones, se comprobó, por fin, que los policationes tienen
una alta afinidad para las VLP's de VP1. La relación preferida de
pesos de las VLP's de VP1 al polímero catiónico en los conjugados
conformes al invento se puede hacer variar dentro de amplios
intervalos. Así, se han manifestado como apropiadas unas relaciones
de pesos de 5:1 a 1:10, siendo especialmente preferidas unas
relaciones de pesos de 2:1 y 1:5, con el fin de hacer posible una
fijación óptima.
En una forma preferida de realización del
invento, por lo menos un ligando está fijado al polímero catiónico,
que está asociado con la VLP de VP1. El ligando puede ser
fundamentalmente una sustancia arbitraria, siempre y cuando que
pueda ser fijado al polímero catiónico, a través de interacciones
covalentes o/y no covalentes, directa o indirectamente. Por
ejemplo, el ligando puede ser un grupo específico para células
dianas, p. ej. un partícipe en la fijación para un receptor
superficial de células. Ejemplos apropiados de partícipes en la
fijación son ligandos naturales o compuestos sintéticos análogos a
éstos, pudiéndose emplear ligandos de alto peso molecular tales
como proteínas, p. ej. transferrina, anticuerpos o azúcares tales
como manosa, pero también ligandos sintéticos de bajo peso
molecular, p. ej. el motivo tripeptídico
R-G-D
(Arg-Gly-Asp). De manera
alternativa o adicional, se puede utilizar como ligando también un
grupo de marcación, p. ej. un grupo reconocible mediante apropiados
métodos de detección, tal como ilustrativamente un grupo de
marcación fluorescente o biotina. Además, el ligando puede ser
también un grupo efector, p. ej. un grupo citotóxico. Evidentemente,
se pueden emplear también combinaciones de varios ligandos, en
particular combinaciones de los ligandos que se han mencionado
precedentemente.
En una forma especial de realización, la VLP
puede contener en el interior de la estructura de cápsida una o
varias sustancias activas. Como sustancia activa se entiende en esta
memoria descriptiva cualquier molécula, que no esté presente
usualmente en el medio utilizado para el autoemsamble. Tales
sustancias activas comprenden p. ej. macromoléculas, tales como
ilustrativamente ácidos nucleicos, es decir ARN, ADN o ácidos
nucleicos modificados artificialmente, así como proteínas y otras
sustancias fisiológicamente activas, que pueden ser de tipo natural,
sintético o recombinante. Ejemplos de tales sustancias activas
fisiológicamente son p. ej. lípidos, fosfolípidos, péptidos,
medicamentos, toxinas, etc.
En otro aspecto, el invento se refiere a un
procedimiento para la preparación de conjugados a base de VLP's de
VP1 y de polímeros catiónicos, pudiendo ensamblarse para dar una
partícula varias moléculas de VP1 y añadiéndose, antes, durante o/y
después del ensamble, un polímero catiónico para la asociación con
la partícula. De manera preferida, el polímero catiónico es añadido
después del ensamble. De manera especialmente preferida, las VLP's,
en particular las VLP's recombinantes, son en primer lugar
purificadas, luego disociadas y a continuación reasociadas en
presencia de la sustancia activa. En el caso de que el conjugado
deba de contener además sustancias activas adicionales, el ensamble
se lleva a cabo preferiblemente en presencia de esta otra sustancia
adicional, que luego es hecha entrar en el interior de la envoltura
cápsida de la VLP.
De manera preferida la VLP se prepara de una
manera recombinante, incorporándose un ácido nucleico, que codifica
una proteína VP1, en una célula, cultivándose la célula transformada
en un medio en unas condiciones, en las que se efectúa una
expresión del ácido nucleico, y obteniéndose el producto de
expresión a partir de la célula o a partir del medio. El
aislamiento de la VP1 recombinante se efectúa, dependiendo del
sistema utilizado de anfitriona y vector, directamente a partir de
las células anfitrionas o/y a partir del material sobrenadante de
cultivo celular. La ventaja del procedimiento recombinante se
encuentra sobre todo en el hecho de que, de una manera sencilla, se
pueden obtener VLP's con alta pureza y en grandes cantidades. Como
sistema de expresión se ha acreditado en la práctica la utilización
de baculovirus en unión con células de insectos, p. ej. con el
linaje de células de insectos Sf 158.
Para la preparación de unas VLP's, que han
incorporado dentro de la estructura de cápsida una proteína
heteróloga, y respectivamente de unas VLP's, que en el interior de
la estructura de cápsida contienen una sustancia activa, se
modifica el anterior procedimiento de preparación, añadiendo en un
momento apropiado, es decir antes del ensamble de las VLP's, las
proteínas heterólogas o/y las sustancias activas en la cantidad y
respectivamente en la concentración que se desea, y a continuación
permitiendo el ensamble. De esta manera pueden resultar unas VLP's,
que han incorporado en la envoltura de cápsida una proteína
heteróloga o/y que contienen en el interior una sustancia activa
encerrada, p. ej. un ácido nucleico. La incorporación de
polipéptidos heterólogos en la envoltura de cápsida se puede
efectuar por ejemplo mediante coexpresión recombinante de los
respectivos polipéptidos, es decir del polipéptido de VP1 y del
polipéptido heterólogo en una apropiada célula anfitriona, p. ej.
una célula eucariótica. La incorporación de sustancias activas en el
interior de la envoltura de cápsida se puede efectuar p. ej. por
disociación de la envoltura de cápsida y subsiguiente reasociación
en presencia de la sustancia activa, o por choque osmótico de las
VLP's en presencia de la sustancia activa.
Los conjugados conformes al invento, a base de
una VLP y de un polímero catiónico se pueden emplear para
finalidades diagnósticas y terapéuticas, p. ej. para el diagnóstico
y el tratamiento de enfermedades, que están asociadas con una
infección por el virus JC, tales como ilustrativamente la PML
(leucoencefalopatía multifocal progresiva).
En una forma adicional de realización, se pueden
utilizar las VLP's como vehículos de transporte, en particular para
el transporte de sustancias activas hacia una célula diana y
preferiblemente dentro de la célula diana. Por fijación de un
ligando al polímero catiónico asociado con la VLP, se modifica en
este caso la especificidad para células dianas de una manera
significativa en comparación con las VLP's sin modificar.
De esta manera se puede garantizar la
especificidad de la interacción con las células dianas previstas y
se puede adaptar, dependiendo de la utilización, a un gran número
de tipos de células. Un ejemplo de una utilización tal es el
transporte orientado hacia una diana de ácidos nucleicos antisentido
de TNF-\alpha (factor alfa de necrosis de
tumores) junto a oligodendrocitos en el caso de una esclerosis
múltiple, puesto que es conocido que, en el caso de esta
enfermedad, una expresión de TNF-\alpha en el
empuje conduce a la desmielinización. Otro ejemplo es la
utilización de las VLP's como sistemas transportadores para ácidos
nucleicos en la terapia génica.
Mediante la entrada del gen de timidina cinasa
de herpesvirus se inicia el mecanismo de suicidio de la célula. El
trasporte orientado hacia una diana del gen de Tk (timidina cinasa)
en células transformadas neoplásicamente, tales como p. ej. células
de la hiperplasia benigna de próstata, conduce, después de una
administración adicional de un compuesto análogo a nucleósidos (p.
ej. aciclovir o ganciclovir), a la terminación de la replicación y
como consecuencia a la muerte de las células transducidas.
El invento se explica ahora con mayor detalle
mediante los siguientes Ejemplos así como las Figuras y los
protocolos de secuencias, que se adjuntan.
Muestran:
Figura
1
30 \mug de VLP's de VP1 se incubaron durante
24 horas, en cada caso con 5 x 10^{4} células. La detección de la
VP1 se efectuó después de una fijación de las células con un suero
inmunológico específico para VP1 y de una subsiguiente incubación
con un mAk (anticuerpo monoclonal) anti-conejo
acoplado con FITC, mediante métodos de microscopía
fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Para la determinación de la eficiencia de
transducción de VLP's de VP1 se empaquetó, en 1,25 \mug de VLP's
de VP1, 1 \mug de un ADN del plásmido reportero
pGL3-C. En cada caso 5 x 10^{4} células se
incubaron con los complejos de las VLP's durante 24 horas, a
continuación se lavaron y se cultivaron durante 24 horas
adicionales. A continuación de esto, se determinó por medios
luminométricos la actividad de luciferasa en los materiales lisados
celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Para la determinación de la capacidad de
fijación de una PEI a las VLP's de VP1, se utilizó
PEI-biotina como material conjugado detectable.
Para esto, en un ensayo ELISA se fijaron 100 \mug de VP1 por cada
cavidad, a continuación se incubaron con diferentes concentraciones
de PEI-biotina, y los complejos se cuantificaron
fotométricamente a 490 nm con estreptavidina - HRP (peroxidasa de
rábano). La relación de VLP/PEI de 1:3,4 se determinó como relación
óptima de fijación. El valor de corte (del inglés cut off) de la
medición es caracterizado por la línea de trazos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
La determinación de la capacidad de fijación de
PEI-transferrina a las VLP's de VP1 se realizó en un
ensayo ELISA. Para esto, se fijaron 100 \mug de VP1 por cada
cavidad, a continuación se incubaron con diferentes concentraciones
de una PEI-transferrina, y los complejos se
cuantificaron fotométricamente a 490 nm con un anticuerpo
anti-transferrina conjugado con una HRP. La
relación VLP/PEI de 1:5 fue determinada como relación óptima de
fijación. El valor de corte de la medición es caracterizado por la
línea de trazos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
3 \mug de complejos de VLP's de VP1 y de
PEI/transferrina se incubaron durante 24 horas en cada caso con 5 x
10^{4} células. La detección de la VP1 se efectuó después de una
fijación de las células con un suero inmunológico específico para
VP1 y de una incubación subsiguiente con un mAk
anti-conejo, acoplado con FITC (isotiocianato de
fluoresceína), mediante métodos de microscopía fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
Para la determinación de la eficiencia de
transducción de complejos de VLP's de VP1 y de
PEI-transferrina, en 1,25 \mug de VLP's de VP1 se
empaquetó 1 \mug de un ADN del plásmido reportero
pGL3-C. A continuación, las VLP's se cargaron con
1,9 \mug de PEI-transferrina. En cada caso 5 x
10^{4} células se incubaron con los complejos de VLP's durante 24
horas, a continuación se lavaron y se cultivaron durante 24 horas
adicionales. A continuación de esto, se determinó por medios
luminométricos la actividad de luciferasa (en unidades relativas de
luz [URL]) en los materiales lisados celulares. Como testigo se
utilizaron para la transducción de las células, junto a los
complejos de VLP's, también VLP's no cargadas así como
ADN/PEI-transferrina.
Se observó que las VLP's de JCV presentan un
tropismo específico para células de origen renal y neuronal. Para
los ensayos de transducción, se purificaron las VLP's de JCV
procedentes del material sobrenadante de un linaje de células de
insectos (SF 158), que habían sido infectadas con baculovirus
recombinantes para VP1. Para el empaquetamiento de los ADN se
disociaron 50 \mug de VLP's de VP1 purificadas en un volumen total
de 100 \mul en Tris-HCl 10 mM, de pH 7,5, EGTA 10
mM, NaCl 150 mM y DTT 5 mM. Con el fin de empaquetar los ADN,
pentámeros de VP1 se dializaron, en presencia de los plásmidos que
se habían de empaquetar, frente a un tampón que contenía Ca^{2+},
con el fin de diluir al agente formador de complejos EGTA y al
agente reductor DTT, y aportar al mismo tiempo iones de Ca^{2+}.
La formación de las VLP's de JCV se pudo comprobar mediante
microscopía electrónica. Con el fin de eliminar el ADN de plásmido,
que había sido fijado a la superficie de las VLP's de VP1, se llevó
a cabo una digestión con DNasa I. Por cada tanda de reacción se
aportaron 10 U de DNasa I (de Pharmacia Biotech, Freiburg), se
ajustó una concentración final de Tris-HCl 10 mM, pH
7,5 y MgCl_{2} 6 mM, y se incubó a 37ºC durante 1 hora.
Con estas VLP's de JCV se pudieron transducir
específicamente células de origen neuronal (tales como p. ej.
células SVG) y de origen renal (tales como p. ej. células
COS-7). Para esto, se incubaron en cada caso 5 x
10^{4} células durante una noche a 37ºC con las VLP's de VP1 que
contenían ADN. La eficiencia de transducción se determinó mediante
el gen reportero de luciferasa. En células de origen neuronal y
renal se midieron en estos ensayos unas altas eficiencias de
transducción. Por el contrario, no se observó ninguna actividad de
luciferasa en fibroblastos, linfocitos T, células dendríticas,
condorcitos, células procedentes de la próstata o de carcinomas de
mama, que asimismo se habían incubado con las VLP's de JCV.
Puesto que el grado de polimerización de la PEI
y la densidad de acoplamiento de los ligandos tiene repercusiones
sobre la distribución de cargas eléctricas en la molécula, dos
diferentes preparaciones de PEI (polímero de 25 kD de
SIGMA/Aldrich, Deisenhofen, Alemania) se investigaron en un ensayo
ELISA en lo que se refiere a sus propiedades de fijación a las
VLP's de VP1.
Para esto, primeramente la biotina, como grupo
bien detectable, se acopló covalentamente a una
poli(etilenimina) en una relación molar de 1:1. La capacidad
de fijación de la PEI-biotina a las VLP's de VP1 se
determinó, fijando 100 ng de VLP's de VP1 por cada cavidad de una
placa para ELISA de 96 pocillos, ésta se incubó con
PEI-biotina en diferentes concentraciones y se
cuantificó fotométricamente la fijación con un conjugado de
estreptavidina conjugada con una peroxidasa de rábano (HPR). En tal
caso se estableció una relación óptima de fijación de VLP's de
VP1/PEI-biotina (p/p = peso/peso) de 1:3,4 (Figura
3).
Se llevaron a cabo ensayos análogos con la
PEI-transferrina (Q-Biogene,
Heidelberg, Alemania). Para esto, se fijaron de nuevo 100 ng de
VLP's de VP1 por cada cavidad en una placa para ELISA, se incubaron
con diferentes concentraciones de PEI-transferrina,
y a continuación se detectó cuantitativamente la fijación con un
anticuerpo anti-transferrina monoclonal. En este
caso se estableció una relación óptima de fijación de VLP de
VP1/PEI-transferrina (p/p) de 1:1,5 (Figura 4).
En ensayos de fijación a células se detectaron
la fijación, la internalización y el transporte a los núcleos de
los complejos de VLP's de VP1 y de PEI-transferrina.
La carga de las VLP's de VP1 se efectúa en un sencillo sistema
in vitro. Para esto se ajusta una relación de pesos de VLP's
de VP1/PEI-transferrina de 1:1,5. La fijación se
efectuó mediante una incubación durante 30 minutos a 37ºC. Los
ensayos de fijación a células se llevaron a cabo en los linajes
celulares HeLa (Scherer y colaboradores, J. Exp. Medicine 97 (1953),
695), DU145, BM1604 y BPH-1 (Mitchell y
colaboradores, BJU International 85 (2000), 932), que expresan el
receptor de transferrina. Para esto se incubaron en cada caso 5 x
10^{4} células con 3 \mug de VLP's de VP1 - PEI/transferrina
durante 24 horas. Después de esto las células se fijaron y la
proteína VP1 se detectó mediante inmunofluorescencia (Figura 5). En
el caso de los cuatro linajes celulares se podía reconocer después
de la incubación una manifiesta fijación de VLP's de VP1 -
PEI/transferrina a la membrana celular. En el caso de las células
HeLa, ya después de 2 horas era reconocible, después de la
incubación con VLP's de VP1 - PEI/transferrina, un manifiesto
enriquecimiento de VP1 junto a la membrana nuclear. En experimentos
testigos, que se habían llevado a cabo sin previo tratamiento con
PEI-transferrina, no se pudo observar en ninguno de
los linajes celulares investigados ninguna fijación de VLP's de VP1
a la membrana celular.
La eficiencia de transducción de VLP's de VP1 -
PEI/transferrina se determinó mediante la detección de la expresión
del gen reportero de luciferasa. Para esto, 1 \mug del plásmido
pGL3-C (de Promega) se empaquetó en 1,25 \mug de
VLP's de VP1. A continuación, las VLP's de VP1 se cargaron con
PEI-transferrina, tal como se ha descrito en el
Ejemplo 2. La incubación de los complejos de VLP's de VP1 y de
PEI-transferrina con los linajes celulares HeLa,
DU145, BM1604 y BPH-1 se efectuó tal como se
describe en el Ejemplo 3 durante 24 horas. Después de esto se
cambió el medio y las células se incubaron durante 24 horas
adicionales. La detección cuantitativa de la expresión de
luciferasa se efectuó por medios luminométricos mediante un sistema
obtenible comercialmente (de Promega).
Los resultados de la medición de la luciferasa
demuestran expresivamente que las células, que no son transducibles
mediante VLP's de VP1 sin modificar, son transducidas eficientemente
después de una carga precedente de las VLP's con
PEI-transferrina (Figura 6). Además de esto, los
datos de actividad de luciferasa muestran que la transducción con
complejos de VLP's de VP1 y de PEI-transferrina es
más eficiente que la utilización de habituales ADN fijados a
PEI-transferrina. En estas investigaciones se pudo
mostrar inequívocamente que ciertos polímeros catiónicos son
utilizables para el anclaje de ligandos sobre las VLP's de VP1, que
el estrecho tropismo hacia células dianas de las VLP's de VP1 se
puede modificar mediante ligandos específicos para células, y que la
eficiencia de transducción y expresión se aumenta manifiestamente
frente a una PEI utilizada habitualmente.
<110> Jenapharm GmbH & Co. KG
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composición para la
transferencia, específica para células, de sustancias activas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 24684PEP_DR_deut.
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<140>
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<141>
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<150> DE 101 31
145.1-41
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<151>
2001-06-28
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<160> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 1121
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> JCV
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (39)..(1100)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 354
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<212> PRT
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<213> JCV
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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Claims (24)
1. Partícula similar a virus, que está
constituida por varias moléculas de la proteína vírica VP1 del
virus JC, asociada con un polímero catiónico.
2. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizada porque
está constituida por una VP1 recombinante.
3. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizada porque
la VP1 es codificada por un ácido nucleico, que
comprende
- (a)
- la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 1,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético, o/y
- (c)
- una secuencia complementaria con las secuencias de (a) o/y (b), una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas.
4. Partícula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3,
caracterizada porque
el polímero catiónico es una poliamina o
poliimina.
5. Partícula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizada porque
el polímero catiónico es un polímero que se basa
en aminoácidos, en particular es una poli(lisina).
6. Partícula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizada porque
el polímero catiónico es una
poli(alquilenimina), en particular una
poli(etilenimina) (PEI)
7. Partícula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6,
caracterizada porque
por lo menos un ligando está fijado al polímero
catiónico.
8. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizada porque
el ligando comprende un grupo específico para
células dianas, en particular un partícipe en la fijación para un
receptor superficial de células.
9. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizada porque
el ligando comprende un grupo de marcación.
10. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizada porque
el ligando comprende un grupo efector.
11. Partícula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10,
caracterizada porque
contiene en el interior de la estructura de
cápsida por lo menos una sustancia activa.
12. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 11,
caracterizada porque
la sustancia activa está seleccionada entre
ácidos nucleicos, proteínas y sustancias fisiológicamente
activas.
13. Partícula de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12,
caracterizada porque
la sustancia activa ha sido empaquetada mediante
un ciclo de disociación y reasociación en las VLP's de VP1.
14. Procedimiento para la producción de
partículas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13,
caracterizado porque
- (a)
- varias moléculas de VP1 se ensamblan para formar una partícula y
- (b)
- antes, durante o/y después del ensamble, se añade un polímero catiónico para la asociación con la partícula.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14,
caracterizado porque
el polímero catiónico se añade después del
ensamble.
16. Procedimiento de acuerdo con una de
las reivindicaciones 14 ó 15,
caracterizado porque
el ensamble se lleva a cabo en presencia de una
sustancia adicional, siendo encerrada la sustancia en el interior
de la envoltura de cápsida.
17. Agente de diagnóstico, que comprende
una partícula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a
13.
18. Agente terapéutico, que comprende una
partícula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13.
19. Utilización de una partícula de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación
de un vehículo de transporte.
20. Utilización de una partícula de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, para la producción
de un agente destinado al transporte de sustancias activas hacía una
célula diana, preferiblemente dentro de una célula diana.
21. Utilización de acuerdo con la
reivindicación 20,
caracterizada porque
la célula diana es de origen neuronal o
renal.
22. Utilización de acuerdo con la
reivindicación 20 ó 21,
caracterizada porque
la sustancia activa es un ácido nucleico.
23. Utilización de una partícula de cuerdo
con una de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un
agente destinado a la transducción específica de células.
24. Utilización de acuerdo con la
reivindicación 23,
caracterizada porque
la célula es de origen neuronal o renal.
25 Utilización de acuerdo con la
reivindicación 23 o 24 para la preparación de un agente destinado a
la terapia génica.
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