DE10130041A1 - Verfahren der Verzögerung der Seneszenz in Zellen - Google Patents

Abstract

Die Seneszenz in Zellen tritt als Folge unterschiedlicher meist zufällig ablaufender molekularer Veränderungen ein. Vorgeschlagene Maßnahmen zur Verzögerung der Senszenz zielen auf die Beseitigung partieller Ursachen. DOLLAR A Aufgabe der Erfindung ist es, eine geeignete molekulare Basis zur Zusammenführung der unterschiedlichen Seneszenzfaktoren zu finden und eine ganzheitliche Verzögerung von Senszenz in Zellen zu bewirken. DOLLAR A Das neue Verfahren geht aus einem finalen Zuwachs an Sequenz-Polymorphie sequenzspezifischer der Marker durch einen Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung sequenzspezifischer Marker und/oder ausgwählter Kulturbedingungen sowie ausgewählter Heterochromatisierung sequenzspezifischer Marker gewünscht gestreckter Zellzykluszeit auf gewünscht viele Zellteilungen gelegt ist. DOLLAR A Das neue Verfahren erlaubt mannigfaltige Möglichkeiten zur ganzheitlichen Verzögerung der Seneszenz in Zellen und damit eine Erhöhung der Zeitspanne der Generationsabfolge.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verzögerung der Seneszens in Zellen unter Berücksichtigung mehrerer Einflußfaktoren.
• Bekannt ist durch Arbeiten von Hayflick (Hayflick und Moorhead, 1961, Exp. Cell Res. 25, 585; Hayflick, 1965, Exp. Cell Res. 37, 614; Hayflick 1970, Exp. Geront. 5, 291), daß somatische diploide Zellen, die nach einem mitotischen Zell-Zyklus proliferieren, nur eine begrenzte Replikationskapazität aufweisen. Nach einer Anzahl von Zellteilungen erlischt die Fähigkeit zu weiterer Vermehrung.
• Entstammen die Zellen einem älteren Spender, so ist deren Kapazität für Zellteilungen entsprechend dem Alter des Spenders reduziert. Das Potential einer Zelle zur Zellteilung verhält sich damit umgekehrt proportional zu dem in vivo-Alter des Zell-Spenders (Martin u. a.,1979, Lab, Invest. 23, 86).
• Begleitet wird die an Zellen in vitro zu beobachtende Seneszens von bestimmten morphologischen Veränderungen der Zelle, etwa dem Anwachsen des Zellvolumens, einer Vergrößerung und Fragmentierung des Zell-Nukleolus u. a.
• Bei in Geweben befindlichen Zellen erfolgen zeitlich analog zu diesem Alterungsprozeß bestimmte Abweichungen in der Zell-Anordnung u. a. (West, 1994, Arch. Derm. 130, 87).
• Parallellaufend zu den Veränderungen an Zellen in vitro und in Geweben werden auch beim Zell-Spender charakteristische altersbedingte Verformungen festgestellt, wie Verlust der Hautelastizität, Osteoporose u. a. sowie eine wachsende Neigung zur Krebsbildung.
• Personen mit Werner-Syndrom zeigen diese Erscheinungen bereits in einem frühen Lebensstadium (Salk u. a. 1981, Cytogenet. Cell. Genet. 30, 108; Martin 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 190, 161).
• Das Werner-Syndrom ist Ergebnis einer Mutation des Gens WRN, das ein Protein ähnlich der RecQ DNA-Helikase von E-coli (Yu u. a. 1996, Science, 272, 258) kodiert. Das dem menschlichen Gen WEN analoge Hefegen SGS 1 unterdrückt die Rekombination von r DNA (Christman u. a. 1988, Cell 55, 413) sowie die Rekombination anderer Genloci (Watt u. a. 1996, Genetics 144, 935).
• Nach Lombard und Guarantee (1996, Trends Genet. 12, 283) ist davon auszugehen, daß die Seneszens von eukaryotischen Zellen in vitro und die Alterungsvorgänge in eukaryotischen Organismen Erscheinungsformen eines einheitlichen genetischen Programms sind.
• Der nach diesem Programm in gealterten Zellen entstehende genetische Zustand ist gegenüber dem genetischen Zustand in jungen Zellen dominant, Zellfusionsuntersuchungen an Fibroblasten in vitro belegen das (Lumpkin u. a. 1986, Science 232,393). Mit zunehmender Seneszens verlängert sich bei einer Zelle in vitro die für eine mitotische Teilung erforderliche Zykluszeit. Dabei verlängern sich jedoch nicht alle Stationen des mitotischen Zell-Zyklus, vielmehr verlängert sich vorzugsweise die Zeit, in welcher sich die Zelle in der G1-Phase befindet.
• Eine Zelle verläßt diese Phase, wenn Signale dafür vorliegen, daß eventuell vorhandene DNA-Schäden repariert sind und die Zelle eine bestimmte Größe erreicht hat. Bei vielzelligen Organismen kommt der Einfluß von extrazellularen Signalen hinzu, die anzeigen, daß die äußeren Bedingungen für die Zellproliferation günstig sind.
• Der Zellzyklus wird in der G1-Phase dann angehalten, wenn die DNA beschädigt ist. So ist gewährleistet, daß keine fehlerhafte DNA repliziert wird. Über einen im einzelnen noch nicht bekannten Ablauf löst die DNA-Schädigung eine Erhöhung sowohl der Konzentration als auch der Aktivität des Genregulationsproteins p53 aus, was die Initiierung eines entsprechenden Inhibitorprogramms zur Folge hat (Spiering u. a. 1988, Exp. Cell Res, 179, 159). Nach Mutationen des p53-Gens, die eine defekte bzw. fehlende Transkription von p53 nach sich ziehen, wird die Replikation der beschädigten DNA nicht unterbunden, was dann zu einer hohen Mutationsrate im Genom führt. Dabei entstehen Zellen, die sich in Krebszellen verwandeln.
• Während somatische Säugerzellen in vitro eine begrenzte Lebenszeit besitzen, verfügen Krebszellen über ein weitgehend unbegrenztes Proliferationspotential (Shay u. a. 1991, Exp. Cell Res. 196, 33).
• Bei der Zellalterung spielen Carnosine und die dieses Protein kodierenden Gene eine Rolle. Sie schützen Kollagen u. a. Proteine vor Vernetzungen, die mit dem Alterungsprozeß einhergehen.
• Die WO 92/09298 beansprucht aus diesem Grunde zur Vorbeugung, Verzögerung bzw. Umkehr von Seneszensvorgängen in Zellen Kompositionen und deren Anwendung, die Carnosine und ähnliche Verbindungen enthalten.
• Seneszente Zellen zeigen gegenüber noch nicht gealterten, jungen Zellen eine veränderte Genexpression. Bei Fibroblasten wird an gealterten Zellen eine deutliche Zunahme der Expression von Stromelysin, dessen Bindungsmolekül ICAM u. a. beobachtet, gleichzeitig wird die Expression mitoseinduzierender Gene unterdrückt.
• Davon ausgehend beansprucht die WO 97/41242 den Schutz von DNA-Bereichen, die diese Programmänderungen anregen bzw. unterdrücken und die von ihnen expressierten Proteine, so Polynukleotide mit den Sequenzen des menschlichen Kollagenase-Gen-Promotors SEQ ID NO. 1, die eine gesteigerte Expression von Kollagenase in seneszenten Zellen veranlassen, Gastzellen für die Herstellung von cDNA mit diesen Sequenzen u. a.
• Die Ursachen der Zellseneszens sind in einer verminderten Expression von Proliferationsfaktoren zu suchen, aber auch eine erhöhte Produktion von Antiproliferationsfaktoren ist hierfür verantwortlich.
• Verfahren zur Erhöhung von Wachtumsfaktor sowie zur Inhibierung letzterer Faktoren schlägt die WO 96/05850 vor. Vorgesehen ist u. a. eine therapeutische Behandlung seneszenter Zellen mit Fibroblastwachstumsfaktor FGF u. a. Faktoren.
• Durch die WO 95/06415 geschützt sind cDNA und von ihr kodiertes Protein, das die DNA-Synthese in der Zelle inhibiert durch seine Fähigkeit, mit Cyclin oder einer cyclinabhängigen Kinase zu assoziieren und weitere hiergegen als Antogonisten wirkende Proteine.
• In den WO 96/13610 und WO 99/25878 wird zwischen jung-spezifischen Genen und alt-spezifischen Genen unterschieden, die zu seneszensspezifischen Genen zusammengefaßt werden. Beansprucht werden Verfahren zur Bestimmung und Isolierung solcher seneszensspezifischer Gene, Verfahren zur Bestimmung ihrer Sequenzfolgen, die Herstellung von cDNA mit diesen Sequenzfolgen, die sich hieraus ableitenden mRNA sowie die entsprechenden Proteine und die Behandlung seneszenter Zellen damit.
• Das Signalsystem der Zelle erkennt die mit der Alterung einhergehenden molekularen Veränderungen dann als eine DNA-Schädigung, wenn diese einen bestimmten Grenzbereich übersteigen. Als Folge hiervon wird der Zell-Zyklus bei Erreichen solcher molekularer Zustände in der G1-Phase angehalten.
• Harley u. a. beschreiben in 1990, Nature, 345, 458 bei Fibroblasten in vitro eine Abnahme der Länge von telomerer DNA proportional zur Anzahl der Zellteilungen.
• Die WO 95/13383 beansprucht, ausgehend von diesem Befund, ein Verfahren zur Erhöhung der Proliferations-Kapazität durch Kultivierung der Zellen in Gegenwart von oligonukleotiden Substraten für Telomerase unter solchen Bedingungen, daß das Substrat in die Zelle eindringt und eine Telomerenverlängerung bewirkt.
• Die WO 98/00537 sieht ein Verfahren vor, bei dem die Zelle zur Modulation der Telomerenlänge mit therapeutisch wirkenden Proteinen behandelt wird, die den absoluten Verlust von Telomeren bei der Zellteilung reduzieren.
• Nach beiden Verfahren sind leicht auch Bedingungen einstellbar, unter denen der bei der Zellteilung eintretende Telomerenverlust völlig ausgeglichen wird und Krebszellen entstehen.
• Weitere DNA-Veränderungen betreffen die bei gealterten Zellen zu beobachtende Bildung ringförmiger rDNA im Nukleolus. Bei Mutation des menschlichen Gens WRN bzw. bei Hefe des homoglogen Gens SGS1 erfolgt die Bildung ringförmiger rDNA bereits in einem frühen Lebensalter.
• Die WO 99/06543 beansprucht Verfahren und Agenzien, die das Vorhandensein ringförmiger DNA erkennen lassen und deren mit dem Zellalter zunehmende Bildung verhindern bzw. verzögern.
• Altersbedingte Sequenzveränderungen sind auch an mDNA zu beobachten (Cummings u. a. 1985, J. Mol. Biol. 185, 659). Es handelt sich um Sequenz-Erweiterungen und um Rearrangements.
• Die vorgeschlagenen Verfahren und erkannten Wege zur Beeinflussung der Seneszens von Zellen in vitro sind mannigfacher Natur, wie die Übersicht zum Stand der Technik zeigt, die jedoch weitgehend isoliert nebeneinander stehen.
• Die dabei genannten Mittel wirken in den meisten Fällen nicht nur verzögernd auf die Seneszens verursachenden genetischen Abläufe, sondern verändern diese auch grundlegend bzw. beinhalten das Potential für solche Veränderungen. Das genetische Programm der Zell-Alterung wird dabei teilweise ersetzt durch ein Programm der Zell-Immortalität. Hierbei verliert die Zelle wesentliche artspezifische Eigenschaften und wird zur Krebszelle.
• Der Stand der Technik ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Seneszens der Zelle auf die Alterung von einzelnen Gen-Aktivztäten focussiert ist. Die Zellalterung wird nicht genügend als komplexer Vorgang gesehen, bei dem unterschiedliche molekulare Abläufe miteinander wechselwirken.
• Weiter wird der Vorgang der Seneszens allein in Verbindung mit dem mitotischen Erbgang betrachtet. Beziehungen zur Meiose sind nicht gegeben.
• Nach dem Stand der Technik tritt in Zellen Seneszens als Folge unterschiedlicher, meist zufällig ablaufender molekularer Veränderungen ein. Die zur Verzögerung von Seneszens vorgeschlagenen Maßnahmen zielen jeweils auf die Beeinflussung speziell dieser partiellen Ursachen. Es fehlt eine geeignete molekulare Basis, um die einzelnen Seneszens-Faktoren zusammenzuführen und von hier aus effektivere Maßnahmen zur Verzögerung der Seneszens als einem ganzheitlichen Vorgang, der nicht zufällig, sondern gerichtet eintritt, zu entwickeln.
• Aufgabe der Erfindung ist es, eine solche geeignete molekulare Basis und damit komplexere sowie effektivere Maßnahmen zu finden, Seneszens in Zellen zu verzögern.
• Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Verzögerung der Seneszens in Zellen, die Zellen seneszensspezifische Marker aufweisend mit im Erbgang aus dem Ursprung der Zellen entstehender Sequenzierung, dadurch gekennzeichnet, daß ein den Eintritt von Seneszenz bestimmender gegenüber dem Ursprung der Zellen gerichteter finaler Zuwachs an Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker durch einen Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung seneszensspezifischer Marker und/oder ausgewählte Kulturbedingungen sowie ausgewählte Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker in gewünscht gestreckter Zellzykluszeit auf gewünscht viele Zellteilungen gelegt ist.
• Der Begriff "Seneszens" meint in diesem Zusammenhang den Verlust der Fähigkeit zur mitotischen oder meiotischen Zellteilung und/oder der Replikation und/oder der Rekombination bei gealterten Zellen. Auch bei Vorliegen äußerer Signale zur Proliferation sind seneszente Zellen nicht mehr in der Lage, derartige Vorgänge auszuführen. Dabei ist weiter gemeint, Seneszens bildet den Endpunkt von zellaren Entwicklungs-Abläufen.
• Eine "verzögerte Seneszens" meint, daß der Verlust der Fähigkeit, genannte Abläufe auszuführen, zeitlich hinausgeschoben ist und meint damit eine Zunahme der Lebensdauer der Zelle gegenüber einer vergleichbaren anderen Zelle. Insbesondere wird gemeint, daß der Verlust der Fähigkeit zur Zellteilung nicht aufgehoben ist. Aufhebung des Verlusts zur Zellteilung bedeutet Immortalisation einer Zelle und damit Entartung der Zelle zur Krebszelle.
• Der Begriff "Marker" kennzeichnet eine Sequenzierung, deren Weg durch die Zellgenerationen verfolgt wird.
• Der Begriff "seneszensspezifische Marker" meint unikale sowie mittel- und hochrepetitive Sequenzierungen in den Erbanlagen von Zellen, die sich gerichtet und schrittweise im Zuge der Zellteilungen verändern und meint weiter, daß diese Veränderungen sich bis zu einem Limit akkumulieren und bei Erreichen des Limits Zellseneszens eintritt.
• Der Begriff "Ursprung der Zellen" meint den Vorläufer der betrachteten Zellen.
• Der Begriff "Erbgang" meint die im Verlauf des mitotischen oder meiotischen Zellzyklus bzw. der Zellalterung vor sich gehenden molekularen Abläufe mit Auswirkung auf die Erbanlagen der Zelle.
• Der Begriff "Sequenz-Polymorphie" meint die molekularen Variationen der Sequenz eines seneszensspezifischen Markers, mit denen dieser in den im Erbgang entstehenden Zellen vorkommt.
• Die Sequenz-Polymorphie eines seneszensspezifischen Markers erhöht sich mit den am Marker im Erbgang vor sich gehenden gerichteten Sequenzveränderungen, das sind z. B. im Erbgang sich bildende amplifizierte Sequenzen. Die Sequenz- Polymorphie der seneszensspezifischen Marker nimmt von Zellteilung zu Zellteilung zu, wobei sich die Zuwächse im Erbgang addieren, bis die molekularen Abläufe, die zu der Sequenz-Polymorphie führen, z. B. wegen der zunehmenden Instabilität der entstehenden Strukturen, in eine Gleichgewichtslage gelangen. Das bedeutet, die Zellseneszens wird durch sich auf die Fortpflanzung der Zelle auswirkende molekulare Veränderungen der seneszensspezifischen Marker vorbereitet.
• Der Begriff "gerichteter Zuwachs an Sequenz-Polymorphie" meint, daß sich dem den Veränderungen der Sequenz-Polymorphie zu Grunde liegendem Zufallsgeschehen gerichtete Veränderung überlagert.
• Der Begriff "ausgewählte Kulturbedingungen" meint die besonderen Bedingungen, unter den die Zellen in vitro gehalten werden.
• Der Begriff "Heterochromatisierung" meint ein Anwachsen der kondensierten nicht oder nur schwer transkribierenden DNA-Bereiche der Zelle.
• Der Begriff "Zellzykluszeit" meint das Zeitintervall, in dem im Mittel ein Zellzyklus durchlaufen wird, d. h. ein Reproduktionszyklus der Zelle, bei dem die Zelle ihren Inhalt in etwa verdoppelt und sich dann in zwei Nachkommenzellen teilt.
• Eine zweckmäßige Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Lösung ist in den Unteransprüchen 2 bis 45 enthalten.
• Die Unteransprüche 2 bis 19 beinhalten dabei bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens zur Verzögerung der Seneszens in Zellen hinsichtlich des Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung seneszensspezifischer Marker.
• Der Ursprung der Zellen und die Zellen gehören nach dem vorgeschlagenen Verfahren zu Lebewesen aus dem Subregnum der Mycobionta, besonders der Klasse Ascomycetes oder Lebewesen aus dem Stamm der Chordata, besonders der Klasse Mammalia.
• Der Ursprung der Zellen und die Zellen aus der Klasse Mammalia sind vorzugsweise Stammzellen, wie embryonale Stammzellen oder gonodale oder hämatopoietische oder epidermische oder somatische oder neurale Stammzellen und ausdifferenzierte somatische Zellen.
• Der Ursprung der Zellen wird in einer Ausführungsform des Verfahrens durch Kultur einer Vorläuferzelle erhalten.
• Der Ursprung der Zellen ist in einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens eine befruchtete Eimutterzelle, speziell auch ein Gametenpaar, das eine befruchtete Eimutterzelle bildet, wobei die Gameten in einer weiteren Spezialform des Verfahrens nach dem Grad der genetischen Ähnlichkeit ausgesucht sind. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens ist der Spender des Ursprungs der Zellen ein Lebewesen aus der Klasse der Mycobionta oder aus dem Phylum der Chordata, bevorzugt aus der Klasse Mammalia.
• Der Erbgang, nach dem die Zellen aus dem Ursprung der Zellen entstehen, ist dabei von mitotischer oder meiotischer Art.
• Die seneszensspezifischen Marker mit im Erbgang bis zu einem Limit akkumulierendem gerichtetem finalem Zuwachs an Sequenz-Polymorphie, der in den Zellen Seneszens induziert, sind hochrepetive und/oder mittelrepetive Sequenzen und/ oder seneszensspezifische Gene. Die seneszensspezifischen Marker sind in Spezialfällen des Verfahrens amplifizierte und/oder polytäne und/oder rekombinante Sequenzen bzw. chromosale und/oder extrachromosale Sequenzen, wobei die extrachromosalen Sequenzen ARS-Elemente aufweisen.
• Die seneszensspezifischen Marker aus hochrepetiven Sequenzen sind Mikrosatelliten aus 5 bis 60 Basenpaaren und/oder Palindrome aus 10 bis 2000 Basenpaaren und/oder SAR-Elemente aus 250 bis 1500 Basenpaaren und/oder SINE-Sequenzen aus 100 bis 5000 Basenpaaren und/oder LINE-Sequenzen aus 5000 bis 7000 Basenpaaren und/oder telomere Wiederholungssequenzen. Die telomeren Wiederholungssequenzen sind vorzugsweise die Nukleotid-Folgen 5'-TT AGGG-3', 5'- TTAGGGTTA-3', 5'-TTAGGGTTAGGG-3' und 5'-TCGAGCACAGTT-3'.
• Die mittelrepetiven Sequenzen sind tandemrepetierte Gene für rRNA und/oder für Histone und/oder die V-Gensegmente der Immunglobuline und/oder T-Zell- Rezeptoren.
• Die seneszensspezifischen Gene bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind den Gruppen CDC, UTH, SGS, SIR und RAD zugehörig.
• Die seneszensspezifischen Gene von Zellen aus dem Stamm der Chordata, besonders der Klasse Mammalia, sind den seneszensspezifischen Genen der Hefe analog.
• In einer weiteren Ausführungsform sind die seneszensspezifischen Marker methylierte Sequenzen.
• Die methylierten Sequenzen sind vorzugsweise methylierte CpG-Nukleotidfolgen.
• Die Bestimmung eines Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung, der im Erbgang den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker auf gewünscht viele Zellteilungen legt, erfolgt durch die Schritte
  
• - Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl Zellteilungen an Testzellen verschiedenen Ursprungs der Zellen einer Art in einem Vollmedium bis zur Einstellung der Proliferation.
• - Auswahl eines Ursprungs der Zellen, aus dem im Erbgang Testzellen mit durchschnittlich höchster Anzahl an Zellteilungen und Auswahl eines Zellursprungs, aus dem im Erbgang Testzellen mit durchschnittlich niedrigster Anzahl an Zellteilungen bis zur Einstellung der Proliferation entstehen.
• - Bestimmung von Unterscheidungen bei chromosalen und extrachromosalen Sequenzen zwischen dem ausgewählten Ursprung der Zellen und den Zellen bis zur Einstellung der Proliferation in den beiden Reihen mit niedrigster bzw. höchster Anzahl an Zellteilungen bis zur Einstellung der Proliferation.
• - Ermittlung der im Erbgang erfolgenden Differenzierungen bei den so bestimmten Sequenzen.
• Die bei der Ausgestaltung der Unteransprüche 2 bis 19 verwendeten Begriffe meinen dabei folgendes:
  Der Begriff "hochrepetive Sequenzen" und der Begriff "mittelrepetive Sequenzen" reinen eine Einteilung der Sequenzen entsprechend dem Reassoziierungsverhalten nach Trennung einer diploiden DVA in Einzelstränge.
• Der Begriff "seneszensspezifische Gene" meint unikale Sequenzen, die das Alterungsverhalten von Zellen bestimmende Proteine kodieren.
• Der Ausdruck "amplifizierte Sequenzen" meint bei der Replikation mehrfach replizierte mittelrepetive DNA-Abschnitte.
• Der Ausdruck "polytäne Sequenzen" meint mehrfach replizierte längere DNA-Sequenzen, wobei der Replikation keine Zellteilung folgt.
• Der Ausdruck "rekombinante Sequenzen" meint durch Rekombinationsvorgänge entstandene Sequenzfolgen.
• Die Ausdrücke "chromosale Sequenzen" und "ertrachromosale Sequenzen" meinen Sequenzen, die im Chromosom angeordnet sind bzw. Sequenzen, die im Kern vorliegen, aber keinem Chromosom zuzuordnen sind und meist ringförmig angeordnet sind.
• Der Begriff "ARS-Elemente" meint Sequenzen, die einem DNA-Abschnitt die Fähigkeit zur Replikation verleihen.
• Der Ausdruck "Palindrome" bezeichnet eine Folge von Nukleotiden, die sich von rechts nach links so lesen läßt wie von links nach rechts und die in der DNA- Kette sowohl als normale komplementäre Folge als auch in Kreuzform mit aus der Helix herausragenden Zweigen auftreten kann.
• "SAR-Elemente" sind Nukleotid-Sequenzen, bestehend aus Adenin- und Thymin- Folgen, die den Boden einer Chromatin-Schleife an Proteine des inneren Kerngerüst heften und bevorzugt Bindestellen für das Enzym Topisomerate II sind. Der Begriff "SINE- und LINE-Elemente" meint DNA-Abschnitte zwischen Genloci. Der Begriff "telomere Wiederholungssequenzen" meint Sequenzen, die im Genom an verschiedener Stelle auftreten, gehäuft im subtelomeren Bereich von Chromosomen.
• Der Begriff "tandemrepetierte Gene" meint lange, im Chromosom hintereinander angeordnete sich wiederholende Gensequenzen.
• Der Begriff "methylierte Sequenzen" meint im Verlauf des Lebensprozesses einer Zelle methylierte Nukleotid-Folgen.
• Die weiteren Unteransprüche 20 bis 31 beinhalten bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens zur Verzögerung der Seneszens in Zellen durch ausgewählte Kulturbedingungen.
• Die bei dem vorgeschlagenen Verfahren angewendeten Kulturbedingungen, unter denen die Zellen geeigneterweise aufgezogen werden, sind ausgewählt hinsichtlich der umgebenden Atmosphäre, der Energie- und Stoffwechselträger, der eingesetzten Faktoren, der die Diffusion von Energie- und Stoffwechselträgern sowie der Faktoren unterstützenden Agenzien sowie der Temperatur.
• Die umgebende Atmosphäre besteht vorteilhaft zu 21 bis 7 Volumen% aus Sauerstoff und zu 0,03 bis 10 Volumen% aus Kohlendioxid.
• Der Druck der umgebenden Atmosphäre liegt, bezogen auf 0°C, zwischen mindestens 460 Torr und höchstens 1000 Torr.
• Die Kultur wird im Temperaturbereich zwischen 0°C und 40°C gehalten.
• Die Energie- und Stoffwechselträger der Kultur bestehen aus Fettsäuren, Proteinen, Zuckern, Alkoholen und Polyalkoholen, Vitaminen, Antioxydantien, Konservierungsmitteln, Lösevermittlern und Gemischen derselben.
• In jeweils besonderen Ausführungsformen werden der Kultur bestimmte Faktoren zugesetzt, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Carnosine, Anserine und Ophidine und/oder aus Wachstumsfaktoren, wie dem Blutblättchenwachstumsfaktor PDGF, dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF, dem Fibroblastenwachstumsfaktor FGF, dem Hepatozyten-Wachstumsfaktor HGF, dem Wachstumsfaktor IGF und/oder dem Tumor-Nekrosis-Faktor, Interferon β, Interferon γ oder Interleukin 1β und/oder aus der Gruppe der Steroide.
• In einer speziellen Form des Verfahrens ist der Faktor ein zur Verlängerung der Telomeren am Chromosomenende aktives Oligonukleotid-Substrat für Telomerase. In einem weiteren speziellen Verfahren ist der Faktor ein isoliertes WRN- Protein oder ein Derivat hiervon.
• Als die Diffusion von Energie- und Stoffwechselträgern sowie von Faktoren in die Zelle begünstigende Agenzien verwendet das Verfahren Natriumlaurylsulphat und/oder Ammoniumlauryloxid und/oder Ozon und/oder Laurylethoxylat und/oder Oktanol und/oder Ethanol.
• Die Faktoren kommen in der Kultur bzw. den Zellen durch Injektionen, Infusion, Elektroporation oder örtliche Applikation zur Anwendung.
• Die Faktoren zeigen in ihrer die Seneszens verzögernden Wirkung eine Abhängigkeit von der angewendeten Konzentration und der Behandlungsdauer. Einige der Faktoren können die zur Zellseneszens führenden Abläufe ausschalten und in der Zelle krebsartige Entwicklungen einleiten.
• Die Bestimmung von ausgewählten Kulturbedingungen, die den Zuwachs an Sequenz- Polymorphie im Erbgang in gewünscht gestreckter Zellzykluszeit auf gewünscht viele Zellteilungen legen, erfolgt durch die Schritte
  
• - Auswahl eines Ursprungs der Zellen, aus dem im Vergleich mit anderen Ursprüngen von Zellen einer Art im Erbgang Zellen mit durchschnittlich niedriger Anzahl an Zellteilungen bis zum Einstellen der Proliferation entstehen.
• - Behandlung von Testzellen, die aus dem Ursprung der Zellen entstehen, bis zum Einstellen der Proliferation unter ausgewählten Kulturbedingungen.
• - Vergleich der behandelten Testzellen mit Kontrollzellen, die unter Standard-Kulturbedingungen aus dem ausgewählten Ursprung der Zellen gezogen sind, hinsichtlich der Zahl an Zellzyklen und deren Zykluszeit bis zur Einstellung der Proliferation.
• - Bestimmung von Unterscheidungen bei chromosalen und extrachromosalen Sequenzen zwischen dem ausgewählten Ursprung der Zellen und den Zellen bei Einstellung der Proliferation.
• - Ermittlung der im Erbgang erfolgten Differenzierungen der so bestimmten Sequenzen.
• Im Ergebnis des Verfahrens erweisen sich die vorgenannten Kulturbedingungen als vorteihaft geeignet, die Seneszens von Zellen zu verzögern.
• Die weiteren Unteransprüche 32 bis 38 beinhalten bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens zur Verzögerung der Seneszens in Zellen durch ausgewählte Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker.
• Geeignet hierfür sind Verfahren, bei denen die Heterochromatisierung durch ausgewählte Sequenz-Gruppierungen in chromosaler DNA reduziert ist, wie durch dort befindliche DNase-I-hypersensitive Stellen. Das können Promotoren und/oder Enhancer und/oder Locus-Control-Regionen sein. Die Sequenz-Gruppierungen wirken einer Kondensierung von DNA-Sequenzen entgegen.
• Geeigneterweise sind den Sequenz-Gruppierungen Sequenzen des Polyoma-Virus oder des Simian-Virus 40 vor- oder nachgeschaltet. Als vorteilhaft erweisen sich weiter nicht methylierte CpG-Inseln in der Sequenz-Gruppierung. Um Demethylierung zu erreichen, erfolgen Gaben von Stereoid-Hormonen, wie Estrogenen und/oder Cortisol und/oder Progesteron und/oder Glucocorticoiden und/oder Retinsäure und/oder Testosteron und/oder Thyroxin.
• Dabei bezeichnet der Begriff "DNase-I-hypersensitive Stellen" stark aufgelockerte Sequenzbereiche der DNA. DNA abbauende Enzyme greifen an ihnen bevorzugt an und schneiden hier die DNA.
• Der Begriff "Promotor" bezeichnet Erkennungssequenzen, die RNA-Polymerase an den Gen-Anfang geleitet.
• Der Begriff "Enhancer" bezeichnet DNA-Sequenzen, die durch Auflockerung der Chromatin-Struktur die Transkriptionsaktivität von Genen steigern und dabei über größere Distanzen Wirkung entwickeln.
• "Locus-Control-Regionen" sind DNA-Bereiche, die über noch größere molekulare Distanzen die DNA-Struktur auflockern.
• Die Unteransprüche 39 bis 48 beinhalten Ausgestaltungen des Verfahrens, bei dem der Spender des Ursprungs der Zellen ausgewählt ist.
• Bei einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens wird von einem gezüchteten Zellursprung mit ausgewählter seneszensspezifischer Sequenzierung ausgegangen, um den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie im Verlauf des Erbgang gewünscht gering zu halten.
• Dazu werden einen Zellursprung bildende Gameten in einer Anwendungsform des Verfahrens nach dem Grad der Heterozygotie am Genort seneszensspezifischer Marker ausgewählt, der zwischen 0,0 und 0,30, vorzugsweise zwischen 0,0 und 0,15 liegt. Die Genorte mit seneszensspezifischer Sequenzierung sind bei den Zellen der Spezies Sacharomyces cerevisiae ausgewählt aus den Genen bzw. Gengruppen SGS, UTH, SIR, RAD sowie den Genen für rRNA und bei den Zellen aus dem Phylum der Cordata aus den zu dieser Spezies analogen Genorten sowie den Genen für Histone und/oder den V-Gensegmenten der Immunglobuline und/oder T-Zellen- Rezeptoren ausgewählt.
• In einem weiteren speziellen Verfahren wird ein transgener Zellursprung mit ausgewählten Sequenzierungen bestimmt, der den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie bei seneszensspezifischen Markern im Erbgang gewünscht gering hält, gekennzeichnet durch die Schritte
  
• - Gewinnung von Donoren mit ausgewählten seneszensspezifischen Markern und deren Verknüpfung mit einem Vektor zu rekombinanten DNA-Sequenzen,
• - deren Einschleusung in einen Zellursprung oder die Zellen eines Spenders des Zellursprungs mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Markern.
• - Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl an Zellteilungen von Testzellen, die aus dem transgenen Ursprung der Zellen gewonnen sind im Vergleich zu dem analogen unbehandelten Ursprung der Zellen und
• - Bestimmung von Unterscheidungen bei chromosalen und extrachromosalen seneszensspezifischen Markern zwischen Testzellen aus dem Ursprung der Zellen mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Markern und Testzellen aus dem transgenen Ursprung der Zellen jeweils bis zur Einstellung der Proliferation.
• - Ermittlung der im Erbgang erfolgenden Differenzierungen der Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker.
• Die gesuchten Donoren besitzen seneszensspezifische Marker, wie Palindrome, SAR-Elemente, LINE- sowie SINE Sequenzen, methylierte Sequenzen, telomere Wiederholungssequenzen, amplifizierte sowie polytäne Sequenzen, die Chromatinstruktur auflockernde Sequenz-Gruppierungen und seneszensspezifische Gene oder Allele dieser Gene.
• Vektoren für das Einschleusen dieser Donoren sind bei Zellen aus dem Subregnum der Mycobionta, besonders der Klasse der Ascomycetes YEp-Vektoren und/oder YAC-Vektoren und bei Zellen aus dem Phylum der Chordata, besonders der Klasse Mammalia, Vektoren aus den Klassen der Papova-Viren, der Retroviren, der Adenoviren, der Vacciniaviren und/oder der Liposomen.
• Der ausgesuchte Vektor kann durch Transfektion, Lipofektion, Injektion oder Elektroporation in den Zellursprung oder die Eizelle oder eine embryonale Stammzelle des Spenders des Zellursprungs eingeschleust werden.
• In einem speziellen Anwendungsfall weist die Ausstattung des Ursprungs der Zellen hinsichtlich des ausgewählten seneszensspezifischen Markers ein Defizit aus.
• Der gewünschte Zellursprung mit ausgewählter seneszensspezifischer Sequenzierung wird in einer weiteren Form des Verfahrens durch Behandlung des Spenders des Zellursprungs mit den für die Zelle in vitro ausgewählten Kulturbedingungen erhalten.
• Dabei bezeichnet der Begriff "Heterozygotie", daß ein Gen in unterschiedlichen Allelen vorliegt.
• Der Begriff "Donor" bezeichnet DNA-Fragmente, die in Vektoren eingebaut werden. Der Begriff "YEp-Vektoren" bezeichnet autonom replizierende Plasmide in Hefezellen.
• Der Begriff "YAC-Vektoren" bezeichnet künstliche Hefechromosomen, die Telomer- und Centromer-Sequenzen eines natürlichen Hefechromosoms tragen.
• Weitere Ziele, Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahren können den nachfolgenden Beschreibungen eines Vergleichsbeispiels 1 und eines Beispiels 2 zur Erfindung entnommen werden.
Beispiel 1 1.1 Ausgewählter Ursprung der Zellen und Standardbedingungen bei Untersuchung der Zellen
• Für Untersuchungen an Zellen aus der Klasse Ascomycetes wird ein Zellstamm der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae verwendet, deren Zellen sich asymetrisch teilen. Bei jeder Zellteilung dieser Hefeart entsteht neben einer größeren Mutterzelle eine kleinere Tochterzelle (Hartwell u. a., 1977, J. Cell Biol. 75, 4222; Kennedy u. a., 1994, J. Cell Biol. 127, 1985). Bei Beobachtung des Vorgangs unter dem Mikroskop und Entfernen der bei jeder Zellteilung entstehenden Tochterzellen mittels Mikromanipulation gelingt es, die von den Mutterzellen bis zum Einstellen der Proliferation vollzogene Anzahl an Zellteilungen zu bestimmen. Mit dem Beenden der Zellteilung erreichen die beobachteten Mutterzellen den Zustand der Zellseneszens (Mortimer u. a., 1959, Nature, 183, 1751; Müller u. a. 1980 Aging Dev. 12, 47).
• Die an verschiedenen Zellstämmen beobachtete Anzahl an Zellteilungen bis zum Erreichen der Zellseneszens differiert erheblich (Egilmez u. a. 1989, J. Bakteriol. 171, 37), ebenso die zugehörigen D₅₀-Werte. Die zur Beobachtung herangezogenen Mutterzellen werden aus einer in Kulturmedium angesetzten Zellkolonie gewonnen.
• Dabei wird im einzelnen wie folgt vorgegangen:
  Das verwendete Kulturmedium ist ein Vollmedium, bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Dextrose in wässriger Lösung, die Medium-Temperatur beträgt 30°C mit Luft als Atmosphäre.
• Drei Stunden nach dem Ansetzen der Kultur werden die bis dahin durch Zellteilung entstandenen kleineren Tochterzellen mittels Zeiss-Mikromanipulator aus der Kultur entfernt. Die isolierten Tochterzellen bilden als Mutterzellen die Grundlage der weiteren Beobachtungen.
• In folgenden Mikromanipulationsschritten werden die jeweils bei Zellteilung aus diesen Mutterzellen entstehenden kleineren Tochterzellen entfernt, bis die Mutterzellen ihre Proliferations-Tätigkeit einstellen.
• Die mittlere Anzahl der hierfür notwendigen Mikromanipulations-Schritte charakterisiert die Anzahl der Zellteilungen bis zum Erreichen der Zellseneszens der beobachteten Zellkultur.
• Um einen gesicherten Wert für die mittlere Anzahl der Zellteilungen bis zum Erreichen der Zellseneszens zu erhalten, wird vom gleichen Zellstamm eine größere Anzahl von Kulturen angesetzt und auf dem beschriebenen Wege untersucht. Für den zu Vergleichszwecken verwendeten Zellstamm von Saccharomyces cerevisiae wird bei Vermessen von 100 angesetzten Kulturen eine mittlere Anzahl von 44 Zellteilungen bis zum Erreichen der Zellseneszens gefunden und ein mittlerer D₅₀-Wert von 21 Zellteilungen. Die Untersuchungen von Zellen der Klasse Mammalia erfolgen an diploiden Human-Fibroblast-Kulturen. Als Medium dient DMEM-Basalmedium mit 10% (v/v) fötalem Kalberserum und 2 mM L-Glutamin. Kultiviert wird bei 37°C in einer 5% (v/v) CO₂ enthaltenden wassergesättigten Luftatmosphäre. Das Kulturmedium wird täglich erneuert. Die Bestimmung der Zahl lebender und toter Zellen erfolgt durch Zellzählung nach dem Trypanblau-Ausschlußtest. Bei Behandlung eines Teils der Kultur mit Trypanblaulösung, 0,5% (w/v) Trypanblau und 0,9% (w/v) NaCl in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst nehmen nur tote Zellen den Farbstoff auf und sind tiefblau gefärbt, während vitale Zellen im mikroskopischen Bild hell erscheinen. Die Zellzahl wird durch Auszählung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt, wobei mindestens 4 Großquadrate ausgezählt werden. Die Anzahl der Zellen pro Volumen berechnet sich nach der Formel
  
  
  
• In Abhängigkeit vom Zellwachstum wird eine Kultur jeweils im Verhältnis 1 : 2 bzw. 1 : 4 bzw. 1 : 8 gesplittet.
• Die Anzahl der Zellverdopplungen wird anhand des Wachstums der Zellenanzahl in den Subkulturen bestimmt.
• Nach 55 Zellteilungen beginnt die Zellverdoppelung vom proportionalen Verlauf der logarithmischen Wachstumsphase abzuweichen, nach 60 Zellteilungen stirbt die Kultur ab.
• Ein transgener Ursprung der Zellen wird erhalten durch Einschleusen von ausgewählten DNA- oder cDNA-Sequenzen in den Spender des Zellursprungs bzw. die Gameten, die zum Zellursprung führen.
• Die ausgewählten Sequenzen werden durch Zerschneiden von DNA mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen in DNA-Fragmente und deren Auftrennung in Fraktionen durch Gelelektrophorese oder Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation bzw. durch Revertase von mRNA zu doppelsträngiger cDNA gewonnen. Die ausgewählten Sequenzen werden mittels PCR kloniert.
• Zum Einbau in Zellen von Saccharomyces cerevisiae werden die Sequenzen-Donore im YEp-Vektor oder YAC-Vektor eingebaut, der als Marker das leu 2-Gen für die Synthese von Leucin trägt. Bei Mammalia wird ein die ausgewählte Sequenz tragender Vektor in die Keimbahn des Cenoms eingebaut. (Gassen/Schimpf, 1999, Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag).
1.2 Im Erbgang der Zellen erfolgende gerichtete Veränderung der Polymorphie von DNA-Sequenzen
• Im Erbgang verändern sich die DNA-Sequenzierungen von Zellen in unterschiedlicher Weise. Die überwiegend eintretenden erblichen Veränderungen sind statistisch über die Sequenzen verteilte Mutationen. Ihre Anzahl ist über viele Generationen von Zellen hinweg der Zeit direkt portional.
• Ein Teil von ihnen, z. B. durch Nukleotid-Veränderungen eintretende Genmutationen, sind auch in bereits seneszenten Zellen festzustellen. Sie erhöhen die Sequenz-Polymorphie der betreffenden DNA-Sequenz auch nach Eintritt der Zelle in das Stadium der Seneszens und bewirken ungerichtete Veränderungen des Erbguts.
• Andere Veränderungen erfolgen dagegen gerichtet und sind an den Ablauf des mitotischen bzw. meiotischen Erbgangs gebunden. Sie betreffen jeweils bestimmte Sequenzen und führen zu Zellen im Stadium der Seneszens bzw. der Ausdifferenzierung. Folgende solcher gerichteten Abläufe sind bekannt:
  Begrenzt auf verschiedene Tier- und Pflanzenarten finden sich polytäne Chromosomen in Zellen, die eine hohe Transkriptions-Aktivität aufweisen. Sie entstehen, wenn auf die Phase der DNA-Replikation keine Mitose folgt. Die Chromatiden trennen sich nicht, sondern bleiben eng gepaart nebeneinander, das über mehrere Replikationsrunden hinweg. Dabei nehmen nicht alle DNA-Sequenzen an der Replikation gleichmäßig teil. Heterochromatische Bereiche mit hochrepetiven Sequenzen, wie die Centromer- und Telomer-Bereiche, werden nicht in vollem Umfang repliziert. Ihr Anteil an der Sequenzierung der Zelle wird im Erbgang geringer, während der Anteil bestimmte anderer, z. B. transkribierender Sequenzierungen anwächst, bis die Zelle nach 10 bis 12 Replikationsrunden die Replikation einstellt.
• Polytäne Chromosomen kommen z. B. in Zellen der Speicheldrüsen von Insektenlarven als Begleiterscheinung der Zelldifferenzierung vor.
• In Zellen, die eine hohe Transkriptions-Aktivität aufweisen und sich nach der Replikation mitotisch teilen, werden bestimmte mittelrepetive Sequenzen während eines Zellzyklus mehrfach repliziert. Die zunächst entstehenden instabilen Strukturen lagern bei Rekombinationsvorgängen zu langen, sich wiederholenden Folgen dieser Sequenzen um bzw. schnüren sich teilweise vom Chromosom unter Bildung ringförmiger extrachromosaler DNA ab. (Warner, 1989, Micro Rev. 53, 256; Kim u. a. 1987, Cell 57, 975).
• Die Bildung extrachromosaler ringförmiger DNA und deren weitere Amplifizierung im Erbgang ist bei allen Eukaryoten festzustellen und Teil eines allgemeinen Seneszens-Mechanismus. (Holm 1982, Cell 29, 585; Sweeney und Zakian 1989, Genetics. 122, 749). Die WO 99/06543 gibt ein Verfahren zur Identifizierung solcher ringförmigen DNA an.
• Im Erbgang erhöht sich aber nicht allein die Menge mittelrepetiver extrachromosaler Sequenzen, auch die Anzahl chromosal gebundener mittelrepetiver Sequenzen nimmt zu.
• Während bei allen Arten rDNA-Amplifizierungen beobachtet werden, amplifizieren weitere Sequenzen in artspezifischer Weise.
• Hochrepetive Sequenzen, deren Anteil an der Sequenzierung der Zelle im Verlauf des mitotischen Erbgangs bei allen Eukoryoten kontinuierlich abnimmt, sind die telomeren Wiederholungssequenzen (Harley u. a. 1990 Nature, 345, 458; Greider u. a. 1996 Ann. Rev. Biochem. 65, 37; Zakian u. a. 1995, Science, 270, 1601). Ursache der Telomerenverkürzung ist, daß bei der von Primern vermittelten diskontinuierlich erfolgenden DNA-Replikation eukaryotischer Chromosomen die Sequenz unrepliziert bleibt, an der die Synthese des letzten RNA-Primers stattfindet.
• Reifende Geschlechtszellen, Embryonalzellen, Tumorzellen und die Zellen schnell proliferierender eukaryotischer Einzeller produzieren das Enzym Telomerase, das den Verlust von telomeren Sequenzen bei der Zellteilung ausgleicht.
• Über den Verlust von Telomer-Silencer in alten Hefezellen berichten Kim u. a. in 1996, Biochim. Biophys. Res. Commun. 219, 370; über das Telomer-Silencing in jungen Hefezellen u. a. Gottschling in 1990 Cell, 63, 751.
• Eine im mitotischen sowie meiotischen Erbgang erfolgende Sequenzveränderung betrifft die Methylierung des Cystins, vor allem des Cystins in den CpG-Inseln vor Proteine kodierenden Genen. Eine starke Methylierung von CpG-Inseln führt zu einer höheren Bindung von Histon 1 an die betreffenden Chromatin-Abschnitte und damit einer dichteren Sequenz-Packung an solche Loci mit der Folge, daß dort liegende Gene verstummen und nicht mehr transkribiert werden. Allerdings finden sich solche Sequenzveränderungen nur bei einem Teil der eukaryotischen Zellen.
• Nicht beobachtet wird die Methylierung z. B. bei Hefen sowie bei Drosophila.
• Die an den mitotischen bzw. meiotischen Erbgans gebundenen Sequenz-Veränderungen haben jeweils einen gerichteten Verlauf, bei dem das Zufallsgeschehen von einem gesteuerten Programm überlagert ist, dessen zeitliches Ende mit dem Einstellen der Proliferation von Zellen bzw. der Art zusammenfällt.
• Gemeinsam ist ihnen zum einen die Zunahme der Sequenz-Polymorphie gegenüber der Sequenzierung im Ursprung der Zellen und zum anderen, daß sie vorzugsweise die höher kondensierten Bereiche der Zell-Sequenzierung betreffen und deren Anwachsen im Erbgang gegenüber dem Anteil an transkribierender euchromatischer DNA.
• Die Analyse der sich im Erbgang verändernden Sequenzen, damit die Bestimmung der Zunahme an Sequenz-Polymorphie gegenüber dem Ursprung der Zellen und die Bestimmung des Anteils höher kondensierter Bereiche der Zell-Sequenzierung, erfolgen nach den von Gassen-Schrimpf, 1999, Gentechnische Methoden, Spektrum- Verlag angegebenen Verfahren.
1.3 Ausgesuchte Kulturbedingungen
• Ausgesucht werden Kulturbedingungen, von denen bekannt ist, daß sie die in Beispiel 1.2 dargestellten allen Eukaryoten gemeinsamen bzw. zell- und artspezifischen gerichteten molekularen Abläufe im Erbgang beeinflussen.
• Hierzu gehören das Nahrungsangebot, die umgebende Temperatur und Atmosphäre sowie zusätzliche Angebote, die der Kultur zugegeben werden.
• Dazu zählen bei Kulturen von Saccharomyces cerevisiae die Zugabe von Proteinen der CDC-Gengruppe, der SGS-Gengruppe (Gangloff, 1994, Mol. Cell Biol. 14, 8391) sowie der SIR-Gengruppe (WO 95/05459). Bei Kulturen von Zellen aus der Klasse Mammalia rechnen hierzu die Zugabe von Proteinen, die auch bei Kulturen von Saccharomyces cerevisiae die in Beispiel 1.2 genannten molekularen Abläufe beeinflussen, wie Proteine der Gene WRN (Yu, 1996, Science, 272, 258), BLM (Ellis, 1995, Cell 83, 655) RECQL (Puranam u. a. 1994, J. Biol. Chem. 269, 29838), der früh exprimierenden Gene wie c-Fos und c-Jun, von Genen der GC- Gruppe (WO 99/25878), von Wachstumsfaktoren, wie EGF (WO 96/05850), IGF, PDGF, FGF u. a., den Proteinen der Ras-vermittelten Signalwege, von Carnosin und Abkömmlingen des Carnosins (WO 92/09298), Proteinen von Oncogen, von Oligonukleotiden (PCT 93/23572, WO 95/13383) sowie Oligonukleotiden in Kombination mit Proteinen (WO 98/00537). Beeinflußt werden die in Beispiel 1.2 genannten molekularen Abläufe auch durch Zugabe von Inhibitoren der Zell-Teilung, wie beispielsweise von Interleukin 1a (Montesano u. a. 1985, J. Cell. Physiol. 122, 424; Maciag u. a. 1990 Science, 249, 1570), Tumor necrosisfaktor (Shimada u. a. 1990, J. Cell. Physiol. 142, 31), γ-Interferon (Friesel u. a. 1987, J. Cell. Biol. 104, 689), Protein von Genen der SDI-Gruppe (WO 95/06415) sowie Gaben von Steroid-Hormonen.
• Die beim Erbgang der Zellen gerichtet erfolgenden molekularen Veränderungen laufen nicht isoliert nebeneinander ab, sondern sind in vielfacher Weise komplex verkoppelt. Das ist bei der Auswahl von Kulturbedingungen zu berücksichtigen, die mit der Zielstellung erfolgen, in den Zellen die Ausbildung von Seneszens zu verzögern.
• Die Variationsbreite der sich zur Auswahl stellenden Kulturbedingungen ist hierbei außerordentlich groß.
• Beispiel 2
• Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Verzögerung der Seneszens in Zellen wird das im Verlauf des Erbgangs in den Zellen erfolgende Eintreten von Seneszens durch eine bei den Zellteilungsschritten gering bleibende Veränderung der Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker verzögert. Eine gewünscht verzögert erfolgende Veränderung der Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker, die sich bei Verwendung ausgewählter Kulturbedingungen sowie einem Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung der seneszensspezifischen Marker einstellt, ist durch reduzierte Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker zu erreichen.
• Der Grad an Heterochromatisierung von Sequenzen im Erbgang ist durch Anfärbetechniken nachweisbar und gut zu bestimmen.
• Die in Tabelle 1 dargestellten Beispiele zeigen Wege auf, wie durch Veränderung von Kulturbedingungen bei Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die unter Standard-Bedingungen eine mittlere Anzahl D₅₀ von 21 Zellteilungen und 44 Zellteilungen bis zum Stadium der Seneszens erreichen bzw. in Tabelle 2 bei diploiden Human-Fibroblast-Zellen mit einem D₅₀-Wert von 25 Zellteilungen und Erreichen der Seneszens nach 60 Zellteilungen, zusammen mit einer Verzögerung der Heterochromatisierung amplifizierter rDNA-Sequenzen eine Verzögerung des Eintretens von Seneszens erzielt wird.
• Beispiel 2.1 zeigt, daß eine Verlängerung der Gesamtlebensdauer einer Kultur gegenüber der Standardkultur auch bei reduzierter Zellteilungsanzahl bis zum Einstellen der Proliferation durch eine Verlängerung der Zeitspanne der Generationenabfolge zu erreichen ist.
• Die erfindungsgemäße Lösung erlaubt vielgestaltige Möglichkeiten zur Verzögerung der Seneszens in Zellen unter Ausnutzung komplexer Maßnahmen.
  
  
  
  

Claims (48)

1. Verfahren zur Verzögerung der Seneszens in Zellen, die Zellen seneszensspezifische Marker aufweisend mit im Erbgang aus dem Ursprung der Zellen entstehender Sequenzierung, dadurch gekennzeichnet, daß ein den Eintritt von Seneszens bestimmender gegenüber dem Ursprung der Zellen gerichteter finaler Zuwachs an Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker durch einen Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung seneszensspezifischer Marker und/oder ausgewählte Kulturbedingungen sowie ausgewählte Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker in gewünscht gestreckter Zellzykluszeit auf gewünscht viele Zellteilungen gelegt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Ursprung der Zellen und die Zellen vorzugsweise zum Subregnum der Mycobionta, besonders der Klasse der Ascomycetes oder zum Stamm der Chordata, besonders der Klasse Mammalia gehören.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, bei dem der Ursprung der Zellen und die Zellen aus der Klasse der Mammalia vorzugsweise Stammzellen, wie embryonale oder gonodale oder hämatopoietische oder epidermische oder somatische oder neurale Stammzellen oder ausdifferenzierte somatische Zellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, bei dem der Ursprung der Zellen durch Kultur einer Vorläuferzelle erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, bei dem der Ursprung der Zellen eine befruchtete Eimutterzelle ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, bei dem der Ursprung der Zellen ein Gametenpaar ist, das eine befruchtete Eimutterzelle bildet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, bei dem die Gameten nach dem Grad der genetischen Ähnlichkeit ausgesucht sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 7, bei dem der Spender des Ursprung der Zellen ein Lebewesen aus der Klasse der Mycobionta oder dem Phylum der Chordata, bevorzugt der Klasse Mammalia ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Erbgang mitotisch oder meiotisch ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 und 9, bei dem die seneszensspezifischen Marker mit im Erbgang gerichtetem finalem Zuwachs an Sequenz-Polymorphie hochrepetive und/oder mittelrepetive Sequenzen und/oder seneszensspezifische Gene sind.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, bei dem die seneszensspezifischen Marker amplifizierte und/oder polytäne und/oder rekombinante Sequenzen sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 10 und 11, bei dem die seneszensspezifischen Marker chromosale und/oder extrachromosale Sequenzen sind, die ARS-Elemente aufweisen.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 10 und 11, bei dem die hochrepetiven Sequenzen Mikrosatellitensequenzen aus 5 bis 60 Basenpaaren und/oder Palindrome aus 10 bis 2000 Basenpaaren und/oder SAR-Elemente aus 250 bis 15000 Basenpaaren und/oder SINE-Sequenzen mit 100 bis 5000 Basenpaaren und/oder LINE- Sequenzen mit 5000 bis 70000 Basenpaaren und/oder telomere Wiederholungssequenzen sind.

14. Verfahren nach Anspruch 1 und 13, bei dem die telomeren Wiederholungssequenzen vorzugsweise aus den Nukleotid-Folgen 5'-TTAGGG-3', 5'-TTAGGGTTA-3', 5'-TTAGGGTTAGGG-3' und 5'-TCGAGCACAGTT-3' bestehen.

15. Verfahren nach Anspruch 1, 10 und 11, bei dem die mittelrepetiven Sequenzen tandemrepetierte Gene für rRNA und/oder für Histone und/oder V-Gensegmente der Immunglobuline und/oder T-Zellen-Rezeptoren sind.

16. Verfahren nach Anspruch 1 und 10 bis 12, bei dem die seneszensspezifischen Gene von Zellen der liefe Saccharomyces cerevisiae den Gruppen CDC, UTH, SGS, SIR, RAD zugehörig sind und die seneszensspezifischen Gene von Zellen aus dem Stamm der Chordata, besonders der Klasse Mammalia, den seneszensspezifischen Genen der Hefe Saccharomyces cerevisiae analog sind.

17. Verfahren nach Anspruch 1 und 10 bis 16, bei dem seneszensspezifische Marker methylierte Sequenzen sind.

18. Verfahren nach Anspruch 1, 10 und 17, bei dem die Nukleotidfolge CpG methyliert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1 und 10 zur Bestimmung eines Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung seneszensspezifischer Marker, der im Erbgang den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie seneszensspezifischer Marker auf gewünscht viele Zellteilungen legt durch die Schritte

- Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl Zellteilungen an Testzellen verschiedenen Ursprungs der Zellen einer Art in einem Vollmedium bis zur Einstellung der Proliferation.

- Auswahl eines Ursprungs der Zellen, aus dem im Erbgang Testzellen mit durchschnittlich höchster Anzahl an Zellteilungen und Auswahl eines Zellursprung, aus dem im Erbgang Testzellen mit durchschnittlich niedrigster Anzahl an Zellteilungen bis zur Einstellung der Proliferation entstehen.

- Bestimmung von Unterscheidungen bei chromosalen und extrachromosalen Sequenzen zwischen dem ausgewählten Ursprung der Zellen und den Zellen bei Einstellung der Proliferation in den beiden Reihen mit niedrigster bzw. höchster Anzahl an Zellteilungen bis zur Einstellung der Proliferation.

20. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ausgewählten Kulturbedingungen ausgesucht sind hinsichtlich der umgebenden Atmosphäre, der Energie- und Stoffwechselträger, angewendeten Faktoren, Agenzien, welche die Diffusion der Energie- und Stoffwechselträger sowie der Faktoren in Zellen begünstigen und der Temperatur.

21. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem die umgebende Atmosphäre zu 21 bis 7 Volumen% aus Sauerstoff besteht.

22. Verfahren nach 1 und 20, bei dem die umgebende Atmosphäre zu 0.03 bis 10 Volumen% aus Kohlendioxid besteht.

23. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem der Druck der umgebenden Atmosphäre, bezogen auf 0°C, mindestens 460 Torr und höchstens 1000 Torr beträgt.

24. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem die Temperatur im Bereich zwischen 0° und 40°C liegt.

25. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem Energie- und Stoffwechselträger aus Fettsäuren, Proteinen, Zuckern, Alkoholen und Polyalkoholen, Vitaminen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Lösevermittlern und Gemischen derselben bestehen.

26. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem die Faktoren aus der Gruppe der Carnosine, Anserine und Ophidine und/oder den Wachstumsfaktoren, wie Blutblättchenwachstumsfaktor PDGF, dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF, dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF, dem Hepatozyten-Wachstumsfaktor HGF, dem Wachstumsfaktor IGF und/oder dem Tumor-Nekrosis-Faktor, Interferons β, Interferon γ sowie Interleukin 1β und/oder der Cruppe der Steroide ausgewählt sind.

27. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, bei dem der ausgewählte Faktor ein zur Verlängerung der Telomeren am Chromosomenende aktives Oligonukleotid-Substrat für Telomerase ist.

28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, bei dem der Faktor ein isoliertes WRN- Protein oder ein Derivat hiervon ist.

29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, bei dem die Diffusion von Energie- und Stoffwechselträgern sowie von Faktoren in die Zelle begünstigende Agenzien Natriumlaurylsulfat und/oder Ammoniumlauryloxid und/oder Ozon und/oder Laurylethoxylate und/oder Oktanol und/oder Propylenglykol und/oder Ethanol sind.

30. Verfahren nach Anspruch 1, 20 und 26 bis 28, bei dem die Faktoren durch Injektion, Infusion, Elektroporation oder örtliche Applikation zur Anwendung kommen.

31. Verfahren nach Anspruch 1 und 20 zur Bestimmung von ausgewählten Kulturbedingungen, die den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie im Erbgang in gewünscht gestreckter Zellzykluszeit auf gewünscht viele Zellteilungen legen durch die Schritte

- Auswahl eines Ursprungs der Zellen, aus dem im Vergleich mit anderen Ursprüngen von Zellen im Erbgang Zellen mit durchschnittlich niedriger Anzahl an Zellteilungen bis zum Einstellen der Proliferation entstehen.

- Behandlung von Testzellen, die aus dem ausgewählten Ursprung der Zellen entstehen bis zum Einstellen der Proliferation unter ausgewählten Kulturbedingungen.

- Vergleich der behandelten Testzellen mit Kontrollzellen, die unter Standard-Kulturbedingungen aus dem ausgewählten Ursprung der Zellen gezogen sind, hinsichtlich der Anzahl an Zellteilungen und deren Zykluszeit bis zum Einstellen der Proliferation.

- Bestimmung von Unterscheidungen bei chromosalen und extrachromosalen Sequenzen zwischen dem ausgewählten Ursprung der Zellen und den Zellen bei Einstellung der Proliferation.

- Ermittlung der im Erbgang erfolgten Differenzierungen der bestimmten Sequenzen.

32. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein durch einen Ursprung der Zellen mit ausgewählter Sequenzierung der seneszensspezifischen Marker und/oder ausgewählter Kulturbedingungen gewünscht hoher gerichteter finaler Zuwachs an Sequenz-Polymorphie durch Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker bei Zellteilung gewünscht gering beeinflußt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Heterochromatisierung seneszensspezifischer Marker durch ausgewählte Sequenz-Gruppierungen reduziert ist.

33. Verfahren nach Anspruch 1 und 32, bei dem die Sequenz-Gruppierungen DNase-I-hypersensitive Stellen sind.

34. Verfahren nach Anspruch 1 und 32, bei dem die Sequenz-Gruppierungen Promotoren und/oder Enhancer und/oder Locus-Control-Regionen sind.

35. Verfahren nach Anspruch 1 und 32, bei denen den Sequenz-Gruppierungen Sequenzen des Polyoma-Virus oder des Simian-Virus 40 vor- oder nachgeschaltet sind.

36. Verfahren nach Anspruch 1, 32 und 35, bei dem die Sequenz-Gruppierungen nicht methylierte CpG-Inseln aufweisen.

37. Verfahren nach Anspruch 1, 32 und 36, bei dem methylierte Sequenz- Gruppierungen durch Gaben von Stereoid-Hormon demethyliert sind.

38. Verfahren nach Anspruch 1, 32 und 37, bei dem das Stereoid-Hormon Estrogen und/oder Cortisol und/oder Progesteron und/oder Glucocorticoide und/oder Retinsäure und/oder Testosteron und/oder Thyroxin sind.

39. Verfahren nach Anspruch 1 und S. bei dem der Spender des Ursprung der Zellen ausgewählt ist.

40. Verfahren nach Anspruch 1 und 39, bei dem der Grad der Heterozygotie am Genort der sequenzspezifischen Marker zwischen 0,0 und 0,30; vorzugsweise zwischen 0,0 und 0,15 liegt.

41. Verfahren nach Anspruch 1, 39 und 40, bei dem die Genorte der seneszensspezifischen Marker bei der Spezies Saccharomyces cerevisiae aus den Genen bzw. Gengruppen CDC, SGS, UTH, Sir und RAD sowie den Genen für rRNA ausgewählt sind.

42. Verfahren nach Anspruch 1, 39 bis 41, bei dem die Genorte der seneszensspezifischen Marker bei den Zellen aus dem Phylum der Chordata aus den zu der Spezies Saccharomyces cerevisiae analogen Genorten ausgewählt sind und/ oder den Genorten für Histone und/oder den V-Gensegmenten für Immunglobuline und/oder T-Zellen-Rezeptoren ausgewählt sind.

43. Verfahren nach Anspruch 1 und 39 zur Auswahl eines Spenders für den Ursprungs der Zellen mit ausgewählten Sequenzierungen, die seneszensspezifische Marker mit im Erbgang bis zu einem Limit akkumulierendem und in den Zellen Seneszens induzierendem Zuwachs an Sequenz-Polymorphie aufweisen und dabei den Zuwachs an Sequenz-Polymorphie im Erbgang gewünscht gering halten, gekennzeichnet durch die Schritte

- Gewinnung von Donoren mit ausgewählten seneszensspezifischen Markern und deren Verknüpfung mit einem Vektor zu rekombinanten Sequenzen.

- Gewinnung eines Ursprungs der Zellen mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Marker,

- Einschleusung der rekombinanten Sequenzen in den Ursprung der Zellen mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Markern und Bildung eines transgenen Ursprungs der Zellen.

- Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl Zellteilungen von Testzellen, gewonnen aus dem transgenen Ursprung der Zellen im Vergleich zu Testzellen aus dem Ursprung der Zellen mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Marker,

- Bestimmung von Unterschieden bei chromosalen und extrachromosalen seneszensspezifischen Markern zwischen Testzellen aus dem Ursprung der Zellen mit bekannter Ausstattung an seneszensspezifischen Markern und Testzellen aus dem transgenen Ursprung der Zellen jeweils bis zur Einstellung der Proliferation.

- Ermittlung der im Erbgang erfolgenden Differenzierungen der Sequenzen seneszensspezifischer Marker.

44. Verfahren nach Anspruch 1 und 43, bei dem die gesuchten Donoren Palindrome, SAR-Elemente, LINE- sowie SINE-Sequenzen, methylierte Sequenzen, telomere Wiederholungssequenzen, amplifizierte sowie polytäne Sequenzen, die Chromatinstruktur auflockernde Sequenz-Gruppierungen und/oder seneszensspezifische Gene oder Allele dieser Gene aufweisen.

45. Verfahren nach Anspruch 1 und 43, bei dem die Vektoren für Zellen aus dem Subregnum der Mycobionta, besonders der Klasse der Accomycetes, YEp-Vetoren und/oder YAC-Vektoren sind und für Zellen aus dem Phylum der Chordata, besonders der Klasse Mammalia, Vektoren aus den Klassen der Papova-Viren, der Retroviren, der Adeno-Viren, der Vaccimia-Viren und der Liposomen sind.

46. Verfahren nach Anspruch 1 und 43 zum Einbringen eines oder mehrerer Marker in die Sequenzierung des Ursprungs der Zellen durch die Schritte

- Einsetzen des oder der Marker in ein Konstrukt und

- Einführung des Konstrukts in den Ursprung der Zellen durch Transfektion oder Lipofektion, Injektion, ballistischen Beschuß, viralen Vektor bzw. Elektroporation.

47. Verfahren nach Anspruch 1 und 43, bei dem die bekannte Ausstattung des Ursprungs der Zellen den ausgewählten seneszensspezifischen Marker nicht aufweist.

48. Verfahren nach Anspruch 1, 20 und 43, bei dem der Spender, von dem der Ursprung der Zellen gewonnen wird, mit den für die Zelle in vitro ausgewählten Kulturbedingungen behandelt wird.