DE10129332A1 - Sialinsäure-Derivate als Siglec-Inhibitoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität für das Rezeptormolekül. Vorzugsweise sind die bereitgestellten Siglec-Inhibitoren selektiv für ein gegebenes Siglec-Molekül. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zum Herstellen der Siglec-Inhibitoren und Verfahren zum Erhöhen der Bindungsselektivität für ein gegebenes Siglec-Molekül bereit. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Siglec-Inhibitoren enthalten. Weiterhin werden medizinische Indikationen der Siglec-Inhibitoren angegeben.

Description

• Die Erfindung betrifft Siglec-Inhibitoren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zum Erhöhen der Bindungsselektivität von Siglec-Inhibitoren und Angabe medizinischer Indikationen der bereitgestellten Siglec-Inhibitoren.
• Siglecs (Sialinsäure-bindende Ig-artige Lektine) sind Ig-Typ-Lektine, die durch eine N- terminale V-Set-Domäne gekennzeichnet sind, die die Sialinsäurebindung vermittelt. Auf die Ig-Domäne folgt eine unterschiedliche Anzahl von Ig-Domänen des C2-Sets. Ursprünglich wurde die Lektinfamilie auf Grund voneinander unabhängiger Studien des Sialoadhäsins (Siglec-1 CD 169), eines Makrophagen Lektin-artigen Adhäsionsmoleküls, und CD22 (Siglec-2), eines B-Zell-restringierten Mitgliedes der Ig- Superfamilie (IgSF), das eine wichtige Rolle bei der Regulierung der B-Zellaktivierung spielt, gefunden. Es wurde ferner gefunden, dass beide Moleküle die Zell-Zell- Interaktionen in vitro durch die Erkennung sialylierter Glykokonjugate vermitteln. Die Klonierung von Sialoadhäsin zeigte hohe Sequenzähnlichkeiten zu CD22 und führte zu dem Schluß, dass zwei weitere, hierzu in Bezug stehende IgSF-Proteine, das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG/Siglec-4) und CD33 (Siglec-3), deren Bindung an Sialinsäuren zuvor nicht bekannt war, ebenfalls Mitglieder der Siglec-Familie darstellen. Sechs weitere humane Siglec-Moleküle (Siglecs 5-10) wurden identifiziert und charakterisiert. Diese zuvor unbekannten Moleküle zeigen ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit zu CD33 in ihren extrazellulären und intrazellulären Domänen und werden kollektiv als "CD33 in Bezug stehende Siglecs" bezeichnet (1; Übersichtsartikel). Referenz (7) beschreibt die Klonierung und Charakterisierung von Siglec-11, das von humanen dendritischen Zellen exprimiert wird.
• Tabelle 1 gibt einen Überblick über das Vorkommen und die potentiellen Funktionen der bisher beschriebenen Siglecs.
  
  
• Wie der Tabelle zu entnehmen ist, sind Siglecs u. a. an der Reduktion der Immunantwort, der Aufrechterhaltung der Organisation von Myelin im Nervensystem und an der Hämatopoese beteiligt.
• Die durch Siglecs vermittelten Interaktionen können zweierlei Art sein. Zum einen können Signale in den Zellen, die das entsprechende Siglec exprimieren, durch Bindung der Siglec-Moleküle erzeugt werden (z. B. Dämpfung der B-Zell-abhängigen Immunantwort, Inhibition der zytotoxischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK- Zellen) durch Phosphorylierung von ITIM-Motiven), oder es können Signale bei der über der Siglec gebundenen Zelle erzeugt werden (z. B. Regulation des Neuritenwachstums von Neuronen durch Siglec-4a, [MAG)] (1, 2).
• Die Wirkung von Bindungspartnern der Siglecs kann dabei in zweierlei Art erfolgen (3). Zum einen können monovalente Substanzen die biologisch relevante Vernetzung der Siglec-Moleküle untereinander oder mit anderen Molekülen verhindern. Dies würde zu einer Erniedrigung des Signals führen. Zum anderen können polyvalente Substanzen das ausgelöste Signal verstärken. Somit ist eine Regulation in beide Richtungen möglich. Für diese Vorgänge sind geeignete spezifische Substanzen erforderlich.
• Sialinsäure ist eine generische Bezeichnung für eine große Familie von 9- Kohlenstoffatom-Zuckern, die sämtliche Derivate der Neuraminsäure (Neu) oder der Keto-desoxy-nonuloson-Säure (KDN) darstellen. Typischerweise befinden sich diese an den exponierten nicht-reduzierenden Enden der Oligosaccharidketten, die mit einer großen Anzahl von Proteinen und Lipiden verknüpft sind.
• Die Sialinsäure-Bindungsstelle der Siglecs liegt in der N-terminalen Domäne, die eine V-Set-Domäne ist, und die für Siglecs charakteristische Strukturmerkmale enthält. Durch Röntgenstrukturanalyse von Cokristallen des Siglec-1 (Sialoadhäsin) und 2,3- Sialyl-Laktose wurde die Lage der Bindungsstelle und die an der Bindung beteiligten Aminosäuren ermittelt (4). Die Beiträge der funktionellen Gruppen der Sialinsäure zu der Bindung wurden aus Hapten-Inhibitionsversuchen mit synthetischen Sialinsäure- Derivaten bestimmt (5, 6). Zusammenfassend haben diese Studien gezeigt, dass u. a. die Hydroxylgruppe am C-9 der Sialinsäure einen wesentlichen Beitrag als Wasserstoff-Donor in einer Wasserstoffbrücke zur Bindung leistet und durch eine Aminogruppe ersetzt werden kann (5).
• Um die von Siglecs vermittelten biologischen Funktionen zu regulieren, werden Bindungspartner benötigt, die mit hoher Affinität die Bindungsstellen besetzen.
• Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität bereitzustellen. Eine bevorzugte Aufgabe besteht darin, Siglec- Inhibitoren mit erhöhter Affinität bereitzustellen, die möglichst spezifisch an einzelne Siglec-Rezeptoren binden.
• Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Siglec-Inhibitoren mit der Formel:
  
  
  wobei
  X eine negativ geladene Gruppe, wie eine Carboxy-, Phosphat- oder Sulfat-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
  Y ein H-Atom, eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe, eine Hydroxy-Gruppe, ein Glykan, ein polymeres Trägermolekül, oder ein Derivat davon bedeutet;
  Z ausgewählt ist aus O, N, C und S;
  R1 ein H-Atom, eine Hydroxy-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet,
  R2 eine Hydroxy- oder Amino-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
  R3 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon bedeutet;
  R4 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon bedeutet;
  R5 eine substituierte oder unsubstituierte Amino-Gruppe bedeutet, wobei der Substituent ausgewählt wird aus
  einer substituierten oder unsubstituierten Formyl-, Alkanoyl-, Cycloalkanoyl-, Arylcarbonyl-, Heteroaryl-carbonyl-, Alkyl-, Aryl-, Cycloalkyl-, oder Heteroaryl-Gruppe, wobei diese Reste auch eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten können;
  wobei R4 als H-Akzeptor und R5 als H-Donor wirken;
  R6 ein H-Atom oder eine Alkyl-Gruppe, eine geladene Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
  R6' ein H-Atom oder eine Alkyl-Gruppe, eine geladene Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet, wobei wenigstens ein Substituent ausgewählt ist aus R6 und R6' eine hydrophobe Gruppe, vorzugsweise ein H-Atom oder eine Methyl-Gruppe; und
  R7 ein H-Atom oder ein beliebige Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des Siglec-Inhibitors, bedeutet.
• Nachfolgend werden einige Begriffe definiert, wie Sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung zu verstehen sind.
• Der Ausdruck "Siglec" umfaßt sämtliche Siglec-Moleküle. Zur Definition eines Siglec- Moleküls wird auf (8) verwiesen. Die Aminosäuresequenzen der Siglec-Moleküle Siglec-1 bis Siglec-10 sind beispielsweise den in (1, Tabelle 1) aufgeführten Referenzen zu entnehmen. Die Aminosäuresequenz von Siclec-11 ist (7) zu entnehmen. Die Aminosäuresequenzen der Siglec-Moleküle sind ferner erhältlich aus der öffentlich zugänglichen Datenbank Entrez (Internetadresse: www.ncbi.nlm.nih.gov./intrez). Die Siglec-Moleküle können hierbei in ihrer natürlichen Umgebung auf natürlich vorkommenden Zellen vorliegen oder in artifiziellen Umgebungen vorkommen.
• Der Ausdruck "Siglec-Inhibitor" bedeutet generell die Fähigkeit einer Verbindung ein Sialinsäure-Molekül, insbesondere den natürlichen Liganden, an der Bindung an das Siglec-Protein zu hemmen. Ein erfindungsgemäßer Siglec-Inhibitor kann abhängig von seiner Struktur ein gegebenes Siglec-Protein aktivieren oder inaktivieren. Vorzugsweise ist die Referenzverbindung der Sialinsäure Methyl-α-5'-N-acetylneuraminsäure. Vorzugsweise kann die Hemmung durch einen Hapten-Inhibitionstest bestimmt werden. Der Hapten-Inhibitionstest beruht hierbei darauf, dass Fc- Chimären, die aus N-terminalen Domänen von Siglecs und dem Fc-Teil des humanen IgG's bestehen, mit radioaktiv markierten Anti-Fc-Antikörpern komplexiert und mit verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden potenziellen Inhibitoren inkubiert werden, bevor geeignete Zielzellen, vorzugsweise humane Erythrozyten, hinzugegeben werden. Nach einer Inkubation übernacht bei 4°C werden die ungebundenen Komplexe durch Waschen der Zellen entfernt und die gebundene Radioaktivität bestimmt. Aus den so gewonnenen Daten werden die Konzentrationen ermittelt, die zu 50% Inhibition der Bindung führen (IC50-Werte) (5, 6). Besonders bevorzugt werden bei dem Hapten-Inhibitionsversuch 10 µl der Komplex-Lösung mit einer Aktivität von 10³ Bq ¹²⁵I mit dem gleichen Volumen einer Lösung der zu untersuchenden Substanz (dreifach konzentriert) gemischt und bei 4°C 1 Stunde inkubiert. Als nächstes erfolgt die Zugabe von 10 µl einer Suspension von Zielzellen, vorzugsweise 0,25 bis 0,5% humanen Erythrozyten, und eine Inkubation übernacht bei 4°C. Die ungebundene Radioaktivität wird entfernt durch fünfmaliges Waschen der Zellen mit 200 µl Waschpuffer, vorzugsweise Phospat-gepufferte Saline mit 0,1% (W/V) Rinderserumalbumin, und die Zell-gebundene Aktivität wird mittels γ-Zähler bestimmt. Als Kontrolle wird vorzugsweise die Bindung von Sialidase-behandelten Zellen und von unbehandelten Zellen ohne die zu untersuchende Substanz gemessen. Die Inhibition wird bestimmt, indem der Wert ohne Inhibitor gleich 0% und derjenige mit Sialidase-behandelten Zellen gleich 100% gesetzt wird.
• Der Ausdruck "Derivat" bedeutet generell in Bezug auf die Reste X, Y, R1-R4, dass die in Neuraminsäure vorkommende Gruppe durch eine bioisostere Gruppe ersetzt wird, die im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität aufweist. Das Konzept der Bioisosterie ist dem Fachmann bekannt.
• Der Ausdruck "eine substituierte Formyl-, Alkanoyl-, Cycloalkanoyl-, Aryl-carbonyl-, Heteroaryl-carbonyl-, Alkyl-, Cycloalkyl- oder Heteroaryl-Gruppe" bedeutet, dass die betreffenden Gruppen Substituenten aufweisen, die die biologische Eigenschaften im wesentlichen unverändert belassen. Hierzu gehören beispielsweise Niederalkyl- Substituenten wie beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-Gruppen.
• Erfindungsgemäß bedeutet X eine negativ geladene Gruppe. Diese negativ geladene Gruppe bildet mutmaßlich eine Salzbrücke mit einem Arginin-Rest des Siglec- Rezeptors. Der natürlich vorkommende Substituent ist eine Carboxy-Gruppe. Geeignete Derivate davon sind beispielsweise eine Phosphat- oder Sulfat-Gruppe. Ferner werden Phosphonat- und Sulfonat-Gruppen in Betracht gezogen. Weitere geeignete Derivate sind eine Carboxymethylen- oder eine Carboxyethylen-Gruppe.
• Erfindungsgemäß bedeutet Y ein H-Atom, eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe, eine Hydroxy- Gruppe, ein Glykan, ein polymeres Trägermolekül, oder ein Derivat davon. Der natürlich vorkommende Substituent ist eine Hydroxy-Gruppe. Geeignete Derivate der Hydroxy-Gruppe sind hierbei eine Amino- oder Thiogruppe. Geeignete Glykane sind hierbei Hexosen, Hexosamine und/oder Pentosen oder Derivate davon, vorzugsweise Glucose oder Galaktose oder Derivate davon. Ferner geeignete Glykane sind Oligo- und Polysouharide, wobei die Oligo- und Polysouharide aus einem Monomer oder verschiedenen Monomeren (gemischte Zucker) aufgebaut sein können. Als polymere Trägermoleküle sind hierbei Trägermoleküle geeignet, die die pharmakologischen Eigenschaften, wie längere Verweilzeit, verbessern. Polymere Trägermoleküle mit mehreren gebundenen Siglec-Inhibitor-Liganden ermöglichen die Quervernetzung und somit die Aktivierung der Siglec-Rezeptormoleküle. Die Verwendung solcher polymeren Trägermoleküle ermöglicht daher eine Feinregulierung.
• Die Trägermoleküle enthalten vorzugsweise einen Core und unterschiedliche Mengen erfindungsgemäßer Substanzen, die über geeignete Spacer daran gebunden sind. Die gewünschte pharmakologische Wirkung läßt sich über die Zusammensetzung der Polymere umfassend Core und erfindungsgemäße Substanzen steuern. Vorzugsweise sind die Polymere (Core) Dendrimere, Polyacrylamid oder Polylaktid. Die erfindungsgemäßen Substanzen können z. B. entweder chemisch oder enzymatisch an die Polymere gekoppelt werden.
• Erfindungsgemäß bedeutet Z ein Atom ausgewählt aus O, N, C oder S.
• Erfindungsgemäß bedeutet R1 ein H-Atom, eine Hydroxy-Gruppe, oder ein Derivat davon. Geeignete Derivate der Hydroxy-Gruppe sind hierbei eine Amino- oder Thio- Gruppe, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
• Erfindungsgemäß bedeutet R2 eine Hydroxy- oder Amino-Gruppe, oder ein Derivat davon. Der natürlich vorkommende Substituent ist eine Amino-acetyl-Gruppe. Geeignete Derivate sind beispielsweise solche, bei denen die Amino-Gruppe mit einer Acetyl-, Propionyl-, Butyl- oder Pentyl-Gruppe substituiert ist. Die Alkanoyl-Gruppe kann hierbei ferner durch ein oder mehrere Halogen-Atome substituiert sein. Weitere geeignete Derivate sind (Referenz 5; Verbindungen 4 bis 12) zu entnehmen. Die Modifikation an Position R2 kann zu einer Erhöhung der Spezifität des Siglec- Inhibitors für ein gegebenes Siglec-Molekül beitragen.
• Erfindungsgemäß bedeutet R3 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon. Geeignete Derivate sind hierbei beispielsweise eine Amino- oder Thio-Gruppe, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
• Erfindungsgemäß bedeutet R4 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon. Geeignete Derivate sind hierbei Gruppen, die als H-Akzeptor wirken. Beispielhafte Derivate sind hierbei eine Amino- oder Thio-Gruppe, die gegebenenfalls substituiert sein kann, wobei die H-Akzeptor-Eigenschaft erhalten bleibt.
• Erfindungsgemäß bedeuten R6 und R6' unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine Alkyl-Gruppe, eine geladene Gruppe, oder ein Derivat davon, wobei wenigstens ein Substituent ausgewählt aus R6 und R6' eine hydrophobe Gruppe, vorzugsweise ein H-Atom oder eine Methyl-Gruppe, ist. Geeignete Derivate sind Niederalkyl-Substituenten wie eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl-Gruppe. Geeignete geladene Gruppen sind beispielsweise Carboxy-, Sulfat- oder Phosphat-Gruppen.
• Erfindungsgemäß bedeutet R7 ein H-Atom oder ein beliebige Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des Siglec- Inhibitors. Gruppen zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften können polymere Trägermoleküle sein. Der gesamte Siglec-Inhibitor sollte vorzugsweise eine solche Hydrophilie aufweisen, die zu einer gleichmäßigen Verteilung des Inhibitors in einer hydrophilen und hydrophoben Phase führt.
• Ferner wird die kovalente oder nicht-kovalente Bindung der erfindungsgemäßen Siglec-Inhibitoren an natürliche Glykokonjugate und Glykoproteine in Betracht gezogen.
• Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch die Einführung von hydrophoben Substituenten an der Amino-Gruppe der 9-Amino-9-desoxy-Sialinsäure, insbesondere Neuraminsäure, Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität relativ zur Referenzverbindung 5'-Acetyl-Neuraminsäure erhalten wurden. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen werden Siglec-Inhibitoren bereitgestellt, die spezifisch an bestimmte Siglec- Proteine binden und diese inhibieren.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Alkanoylgruppe ausgewählt aus einer Ethanoyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl-, Octanoyl-, Nonanoyl- und Dekanoyl-Gruppe, vorzugsweise Hexanoyl. Erfindungsgemäß werden ebenfalls verzweigte Alkanoyl-Gruppen in Betracht gezogen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Cycloalkanoyl-Gruppe, ausgewählt aus einer C₃- bis C₆-Cycloalkanoyl-Gruppe, vorzugsweise Cyclohexanoyl.
• In einer ferner bevorzugten Ausführungsform ist die Aryl-carbonyl-Gruppe ausgewählt aus einer C₄- bis C₁₅-Aryl-carbonyl-Gruppe, vorzugsweise aus einer Benzoyl-Gruppe, Naphthoyl-Gruppe, Anthracen-carbonyl-Gruppe, wobei dieser Rest maßgeblich an der Selektivität beteiligt ist. Hiermit läßt sich durch geeignete Auswahl die Selektivität steuern.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Heteroaryl-carbonyl-Gruppe ausgewählt aus einer Pyridyl-carbonyl-Gruppe, Chinaldin-carbonyl und Thiophenyl- carbonyl-Gruppe.
• In einer weiteren Ausführungsform ist die Alkyl-Gruppe ausgewählt aus einer C₁- bis C₂₀ Alkyl-Gruppe, vorzugsweise einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexyl-Gruppe.
• Erfindungsgemäß werden ferner verzweigte Alkylgruppen in Betracht gezogen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Cycloalkyl-Gruppe ausgewählt aus einer C₃-C₆-Alkyl-Gruppe.
• In einer ferner bevorzugten Ausführungsform ist die Aryl-Gruppe ausgewählt aus einer Phenyl-, Naphthyl-, Biphenyl- und Anthracen-Gruppe. Erfindungsgemäß kann die Aryl-Gruppe sowohl aus kondensierten als auch aus nicht-kondensierten Aryl- Gruppen ausgewählt werden.
• Ferner bevorzugt ist die Heteroaryl-Gruppe ausgewählt aus einer Pyridyl-, Chinaldin- und Thiophenyl-Gruppe.
• Die Heteroaryl-Gruppe umfaßt erfindungsgemäß sowohl kondensierte als auch nicht- kondensierte heteroaromatische Systeme, die dem Fachmann bekannt sind.
• Eine besonders bevorzugte Verbindung ist Methyl-α-9-N-(naphthyl-2-carbonyl)-amino- 9-desoxy-Neu5Ac. Dieses Sialinsäure-Derivat bindet ungefähr 12fach stärker an Siglec-1 als die Referenzverbindung 2-Alpha-methyl-5-N-acetyl-neuraminsäure, noch stärker an Siglec-4a (ca. 236fach stärker).
• Ferner besonders bevorzugt ist Methyl-α-9-N-(biphenyl-4-carbonyl)-amino-9-desoxy- Neu5Ac. Diese Verbindung bindet ungefähr 150fach stärker an Siglec-2 als die Referenzverbindung 2-Alpha-methyl-5-N-acetyl-neuraminsäure.
• Weiterhin besonders bevorzugt ist Methyl-α-9-N-benzoyl-amino-9-desoxy-Neu5Ac. Diese Verbindung bindet ungefähr 704fach stärker an Siglec-4a (MAG) als die Referenzverbindung 2-Alpha-methyl-5-N-acetyl-neuraminsäure.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Siglec-Inhibitor bereitgestellt, wobei
  X eine Carboxy-Gruppe bedeutet, die in axialer Position vorliegen sollte;
  Y ein H-Atom, eine O-Methyl-, O-Benzyl-Gruppe oder ein Derivat einer Hydroxy-Gruppe bedeutet;
  Z ein O-Atom bedeutet;
  R1 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet;
  R2 eine Aminoacetyl-Gruppe bedeutet;
  R3 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet;
  R4 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet,
  R6 ein H-Atom bedeutet;
  R6' ein H-Atom bedeutet; und
  R7 ein H-Atom bedeutet.
• Die angegebenen Substituenten stimmen hierbei mit Ausnahme von Y mit den natürlich vorkommenden Substituenten der Sialinsäure überein.
• Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen von Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität für ein Siglec-Molekül bereit, das die Schritte umfasst:
  
• a) Einführen eines Substituenten ausgewählt aus den erfindungsgemäßen Resten in die Position R5 von Neuraminsäure oder Derivaten davon;
• b) Bestimmen der Affinität des Produktes nach a) für ein Siglec-Molekül;
• c) Auswählen der Produkte mit erhöhter Affinität;
• d) gegebenenfalls weiteres Substituieren des ausgewählten Produktes nach c) in von Position R5 verschiedenen Positionen, vorzugsweise in Position R2.
• Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität für ein Siglec-Molekül durch Einführen eines hydrophoben Substituenten in Position R5 der Neuraminsäure oder Derivaten davon erhalten werden können. Das Bestimmen der Affinität des Produktes für ein gegebenes Siglec-Molekül kann hierbei durch einen Bindungsassay oder einen Hapten-Inhibitons-Assay erfolgen. Die Bedingungen für den Hapten-Inhibitions-Assay sind hierbei wie vorstehend ausgeführt, vorzugsweise wie in (5, 6) angegeben. Die Affinität der ausgewählten Produkte für ein gegebenes Siglec- Molekül kann weiter erhöht werden durch Einführen von Substituenten in von Position R5 verschiedenen Positionen, vorzugsweise Position R2. Geeignete Substituenten für R2 sind hierbei die für R5 angebenen Substituenten.
• Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen der Bindungsselektivität von Siglec-Inhibitoren bereit, das den Schritt des Einführens eines Substituenten ausgewählt aus den Resten für R5 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in Position R5 von Neuraminsäure oder Derivaten davon umfasst.
• Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ist dem Fachmann grundsätzlich auf Grund seines allgemeinen Fachwissens möglich. Bevorzugt dient als Ausgangsprodukt 5-N-Acetyl-neuraminsäure, aus der zunächst in einer mehrstufigen Reaktionssequenz die entsprechende Alkyl-, Aryl-, Alkyl-alpha-O- bzw. alpha-S-Glykoside hergestellt werden.
• Der nächste Schritt besteht in einem Austausch der Hydroxylgruppe an C9 (R5 gemäß der vorliegenden Erfindung) des entsprechenden O- bzw. S-Glykosids der 5-N- Acetyl-Neuraminsäure durch eine Aminogruppe. Diese Transformation läßt sich über die entsprechende 9-O-Tosyl-Verbindung durchführen. Vorzugsweise kann diese Reaktion unter Verwendung einer modifizierten Mitsunobu-Reaktion durchgeführt werden. Die so erhaltenen Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-alpha-O- bzw. alpha-S-Glycoside der 9-Amino-9-desoxy-5-N-acetyl-neuraminsäure liefern schließlich die entsprechenden Alkyl-, Aryl-, Alkyl-alpha-O- bzw. alpha-S-Glycoside der 5-N-acetyl-9-(biphenyl-4- carbonyl)-amino-9-desoxy-neuraminsäure und ähnliche Substanzen mit variierendem Acylrest an der C-9 (R5 gemäß der vorliegenden Erfindung) ständigen Aminogruppe. Die Durchführung dieser Verknüpfung von Säurefunktion mit Aminogruppe kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung des entsprechenden Säurechlorids bzw. Anhydrids oder mit Hilfe der Carbodiimid- Methode oder über das Verfahren der entsprechenden, beispielsweise mit Nitrophenol, Pentafluorphenol, etc. aktivierten Säurefunktion.
• Die vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend wenigstens einen erfindungsgemäßen Siglec-Inhibitor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bereit. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die therapeutisch verwendbaren Siglec-Inhibitoren möglichst selektiv für ein Siglec- Molekül. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt. Hierunter fallen ebenfalls geeignete Verdünnungsmittel. Zur Verabreichung ist generell jede Art der Verabreichung, z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intradermal, oral oder topisch geeignet. Die orale Verabreichung ist hierbei bevorzugt.
• Die zu verabreichende Menge an Arzneistoff kann routinemäßig durch den Arzt bestimmt werden.
• Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Siglec-Inhibitoren zur Behandlung von Siglec-vermittelten Erkrankungen, vorzugsweise Erkrankungen des Immunsystems, bereit. Siglec-2 ist an der Regulation der B-Zell- abhängigen Immunantwort beteiligt. Die vorliegende Erfindung gibt somit die Verwendung der Siglec-Inhibitoren zur Regulation der B-Zell-abhängigen Immunantwort an. Hierbei werden erfindungsgemäß u. a. Allergien, Autoimmunerkrankungen und chronische Entzündungen als Ziel einer Siglec-Inhibitor-Behandlung angegeben.
• Siglec-4a weist eine Neuriten-wachstumshemmende Wirkung auf. Die erfindungsgemäßen Siglec-Inhibitoren sind somit zur Aufhebung der Neuriten- wachstumshemmenden Wirkung von Siglec-4a geeignet und besitzen daher die Fähigkeit zur Verbesserung der Regenerationsfähigkeit verletzter Nerven, beispielsweise bei der Behandlung von Querschnittslähmung. Siglec-7 ist beispielsweise an der Regulation der cytotoxischen Aktivität von NK-Zellen beteiligt. Die erfindungsgemäßen Sialinsäure-Derivate sind daher geeignet zur Regulation der cytotoxischen Aktivität dieser Zellen. Beispielsweise behandelbare Erkrankungen sind in diesem Zusammenhang Krebserkrankungen, sowie Viruserkrankungen, insbesondere AIDS.
• Es gibt Hinweise für die Beteiligung von weiteren Siglecs an der Steuerung des Immunsystems; vgl. Tabelle 1. Die erfindungsgemäßen Siglecs-Inhibitoren sind daher ebenfalls zur Steuerung des Immunsystems geeignet.
• Nachfolgend werden Beispiele beschrieben, die die Erfindung erläutern, jedoch nicht einschränken sollen. Dem Fachmann erschließen sich bei Ausführung der Erfindung weitere Anwendungen, die ebenfalls erfindungsgemäß in Betracht gezogen werden.
Material und Methoden Sythese von Siglec-Inhibitoren
• Als Beispiel für die Herstellung der oben angegebenen, an der Aminogruppe der Methyl-α-5-N-acetyl-9-amino-9-desoxy-neuraminsäure acylierten Substanzen ist hier die Synthese der Methyl-α-5-N-acetyl-9-N-(Biphenyl-4-carbonyl)-amino-9-desoxy- neuraminsäure (3) beschrieben.
Methyl-α-5-N-acetyl-9-azido-9-desoxy-neuraminsäure (1)
• a) Aus Methyl-α-5-N-acetyl-9-O-tosyl-neuraminsäure-methylester nach Literatur bekannter Methode über das entsprechende 9-Azid und Verseifung der Estergruppe.
• b) Direkt aus bekannter Methyl-α-N-acetyl-neuraminsäure durch eine auf der Mitsunobu-Reaktion basierenden Umsetzung.
• Eine Lösung des Triethyl-ammonium-salzes der Methyl-α-5-N-acetyl-neuraminsäure (0,1 g) in trockenem Pyridin (0,4 ml) und N,N-Dimethyl-formamid (DMF) (1 ml) engt man in Vacuo ein und dampft mit getrocknetem DMF 1-2 mal nach (A). Tetramethylguanidin (0,19 g) wird in einer Mischung von trockenem Pyridin (0,25 ml) und DMF (1 ml) gelöst, die Lösung in Vacuo eingeengt und mit trockenem DMF 1-2 mal nachgedampft (B). Man löst A in DMF (0,8 ml), gibt die Lösung zu B und fügt 98-100prozentige Ameisensäure (0,13 ml) hinzu. Die Lösung aus A + B wird zu einer Mischung von Triphenylphosphin (0,17 g) und Diisopropylazodicarboxylat (0,125 ml) in getrocknetem Tetrahydrofuran (1,2 ml) gegeben, die vorher bei 0°C ca 15 Minuten gestanden war. Nach ca. 24 Stunden bei 0°C → 20°C ist die Reaktion beendet, und man gibt noch ca. 0,5 ml Methanol zu. Die Lösung wird in Vacuo eingedampft, mit Ethylacetat/H₂O oder Methylenchlorid/H₂O ausgeschüttelt und an Kieselgel (Flash- Verfahren) chromatographiert.
  Elution: zuerst Methanol/Etylacetat/Essigsäure (20%) 1/6/1, dann 1/4/1.
  Ausbeute: 70-80% der Theorie.
Methyl-α-5-N-acetyl-9-amino-9-desoxy-neuraminsäure (2)
• Die 9-Azidoverbindung (1) wird mit Palladiumoxid in H₂O bei Normaldruck hydriert.
  Ausbeute: 95%.
Methyl-α-5-N-acetyl-9-N-(Biphenyl-4-carbonyl)-amino-9-desoxy-neuraminsäure (3)
• Umsetzung von Biphenyl-4-carbonsäure (0,4 g) mit 4-Nitrophenol (0,28 g) in Ethylacetat liefert in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid (0,416 g) bei RT dementsprechenden Biphenyl (4)-carbonsäure-4-nitrophenylester, der aus Ethylacetat/Diethylester/Hexan kristallisiert.
• Methyl-α-5-N-acetyl-9-amino-9-desoxy-neuraminsäure (2) (30 mg) gelöst in getrocknetem DMF (0,6 ml) reagieren in Gegenwart von Triethylamin (12,9 ml) glatt mit dem oben genannten Nitrophenylester (39 mg) bei RT. Die Reinigung erfolgt durch Chromatographie an Kieselgel (Flash-Methode).
  Elution: zunächst Methanol/Ethylacetat/Essigsäure (20%) 1/6/1, dann 1/5/1, zum Schluß 1/4/1.
  Ausbeute an (3): 93%:
  Hochaufgelöste NMR-Spektroskopie und FAB-MS beweisen die Struktur der Syntheseprodukte.
• Hapten-Inhibitionsassay
• Der Hapten-Inhibitionsassay wird unter den in (5, 6) angegebenen Bedingungen durchgeführt. Resultate
  
  
  
  
  
  
• Der IC50-Wert ist die Siglec-Inhibitor-Konzentration, die im Hapten-Inhibitionsassay zu 50% Inhibition der Bindung führt. Der rIP-Wert jedes Sialinsäure-Derivates wurde bestimmt durch Quotientenbildung des IC50-Wertes der Vergleichsverbindung 5-N- acetyl-neuraminsäure und des IC50-Wertes der zu untersuchenden Verbindung. Sialinsäure-Derivate mit einem rIP-Wert von > 1,0 binden daher besser als die Referenzverbindung und ein rIP-Wert von < 1 zeigt, dass die Verbindung schlechter an den Rezeptor bindet als die Referenzverbindung. n. d. bedeutet, dass die Bestimmung nicht durchgeführt wurde. Referenzen 1) Crocker et al., Immunology 102 (2001), 1-14
  2) Crocker et al., (2000) The siglec family of I-type lectins in Carbohydrates in Chemistry and Biology, Vol. 4, B. Ernst et al., Herausgeber, Wiley-VCH, p. 579-595
  3) Kelm, S. (2001), Ligands for siglecs. In Mammalian Carbohydrate Recognition Systems, P. R. Crocker, Herausgeber (Berlin, Springer), S. 153-176
  4) May et al., Mol. Cell 1 (1998), 719-728
  5) Kelm et al., Eur. J. Biochem. 255 (1998), 663-672
  6) Strenge et al., Eur. J. Biochem. 258 (1998), 677-685
  7) Li, N. et al., Cloning and Characterization of Siglec-11, a novel sialic acid binding member of the Ig Superfamily from human dendritic cells; J. Biol. Chemistry 2001 (im Druck)
  8) Crocker et al., Glycobiology 8 (1998), v.

Claims (21)

1. Siglec-Inhibitor mit der Formel:


wobei
X eine negativ geladene Gruppe, wie eine Carboxy-, Phosphat- oder Sulfat-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
Y ein H-Atom, eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe, eine Hydroxy-Gruppe, ein Glykan, ein polymeres Trägermolekül, oder ein Derivat davon bedeutet;
Z ausgewählt ist aus O, N, C und S;
R1 ein H-Atom, eine Hydroxy-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
R2 eine Hydroxy- oder Amino-Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
R3 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon bedeutet;
R4 eine Hydroxy-Gruppe oder ein Derivat davon bedeutet;
R5 eine substituierte oder unsubstituierte Amino-Gruppe bedeutet, wobei der Substituent ausgewählt wird aus
einer substituierten oder unsubstituierten Formyl-, Alkanoyl-, Cycloalkanoyl-, Arylcarbonyl-, Heteroaryl-carbonyl-, Alkyl-, Aryl-, Cycloalkyl-, oder Heteroaryl-Gruppe,
wobei diese Reste auch eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten können;
wobei R4 als H-Akzeptor und R5 als H-Donor wirken;
R6 ein H-Atom oder eine Alkyl-Gruppe, eine geladene Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet;
R6' ein H-Atom oder eine Alkyl-Gruppe, eine geladene Gruppe, oder ein Derivat davon bedeutet, wobei wenigstens ein Substituent ausgewählt aus R6 und R6' eine hydrophobe Gruppe, vorzugsweise ein H-Atom oder eine Methyl-Gruppe, ist; und
R7 ein H-Atom oder ein beliebige Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des Siglec-Inhibitors, bedeutet.

2. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Alkanoyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer Ethanoyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl-, Oktanoyl-, Nonanoyl- und Dekanoyl-Gruppe, vorzugsweise Hexanoyl.

3. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Cycloalkanoyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer C3 bis C6 Cycloalkanoyl-Gruppe, vorzugsweise Cyclohexanoyl.

4. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Aryl-carbonyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer C4 bis C15 Aryl-carbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- Gruppe, Naphthoyl-Gruppe oder Anthracen-carbonyl-Gruppe.

5. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Heteroaryl-carbonyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer Pyridyl-carbonyl-, Chinaldin-carbonyl- und Thiophenyl- carbonyl-Gruppe.

6. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Alkyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer C1-C20 Alkyl-Gruppe, vorzugsweise einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexyl-Gruppe.

7. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Cycloalkyl-Gruppe ausgewählt ist aus einer C3-C6 Cycloalkyl-Gruppe.

8. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Aryl-Gruppe ausgewählt ist aus einer Phenyl-, Naphthyl-, Anthracen-Gruppe.

9. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei die Heteroaryl-Gruppe ausgewählt ist aus einer Pyridyl- und Thiophenyl-Gruppe.

10. Siglec-Inhibitor gemäß Anspruch 1, wobei
X eine Carboxy-Gruppe bedeutet, die in axialer Position vorliegen sollte;
Y ein H-Atom, eine O-Methyl-, O-Benzyl-Gruppe oder ein Derivat einer Hydroxy-Gruppe bedeutet;
Z ein O-Atom bedeutet;
R1 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet;
R2 eine Aminoacetyl-Gruppe. bedeutet;
R3 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet;
R4 eine Hydroxy-Gruppe bedeutet;
R6 ein H-Atom bedeutet;
R6' ein H-Atom bedeutet; und
R7 ein H-Atom bedeutet.

11. Verfahren zum Erhöhen der Bindungsselektivität von Siglec-Inhibitoren umfassend das Einführen eines Substituenten ausgewählt aus den Resten für R5 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in Position R5 von Neuraminsäure oder Derivaten davon.

12. Verfahren zum Herstellen von Siglec-Inhibitoren mit erhöhter Affinität für ein Siglec-Molekül umfassend:

a) Einführen eines Substituenten ausgewählt aus den Resten für R5 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in Position R5 von Neuraminsäure oder Derivaten davon;

b) Bestimmen der Affinität des Produktes nach a) für ein Siglec-Molekül;

c) Auswählen der Produkte mit erhöhter Affinität;

d) gegebenenfalls weiteres Substituieren des ausgewählten Produktes nach c) in von Position R5 verschiedenen Positionen, vorzugsweise in Position R2.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Siglec-Inhibitor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmakologisch verträglichen Träger.

14. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Behandlung von Siglec-vermittelten Erkrankungen.

15. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Regulation der B-Zell-abhängigen Immunantwort.

16. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß Anspruch 15 zur Behandlung von Allergien, Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungen.

17. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verbesserung der Regenerationsfähigkeit verletzter Nerven.

18. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß Anspruch 17 zur Behandlung von Querschnittslähmung und Multipler Sklerose.

19. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Regulation der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen.

20. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß Anspruch 19 zur Behandlung von Krebserkrankungen.

21. Verwendung eines Siglec-Inhibitors gemäß Anspruch 19 zur Behandlung von Viruserkrankungen.