VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON WASSERLÖSLICHEN SACCHARIDKONJUGATEN UND SACCHARIDMIMETIKA DURCH DIELS-ALDER-REAKTION
Die vorliegende Erfindung betrifft -' ein Verfahren zur Herstellung von Substanzbibliotheken auf der Grundlage von natürlich vorkommenden Sacchariden und Saccharidmimetika.
Es ist bekannt, daß die Interaktionen zwischen Proteinen und natürlichen oder synthetischen Oligosacchariden hochspezifisch sind. An diesen Interaktionen sind im wesentlichen Wasserstoffbrückenbindungen, wechselseitig vorhandene Donoren und Acceptoren sowie hydrophobe Wechselwirkungen beteiligt. Die dabei erreichten Bindungskonstanten sind allerdings um mehrere Größenordnungen geringer als diejenigen, die bei Antigen-Antikörper Interaktionen gemessen werden. Um auf der Basis von Sacchariden eine Optimierung der genannten Wechselwirkungen durchführen zu können und alle Arten von Wechselwirkungen zuzulassen, müssen eine große Anzahl substituierter Saccharide und Saccharidmimetika ausprobiert werden und synthetisiert werden. Die Grundidee dabei ist die Entwicklung von wirkungsvollen Therapeutika auf Saccharidbasis. Ein großes Problem bei der Synthese von Saccharid(e) -enthaltenden Verbindungen ist allerdings die komplizierte mehrstufige Verfahrensdurchführung, die zusätzlich noch eine ausgeprägte Schutzgruppenchemie verlangt. Dies gilt insbesondere, wenn mehrere Saccharide in bzw. an eine Verbindung synthetisiert werden sollen oder Saccharid-Bibliotheken aufgebaut werden sollen. Es besteht deshalb der dringende Bedarf nach einem
Verfahren mit dem auf einfache Weise auch kompliziert aufgebaute Saccharid(e) -enthaltende Verbindungen synthetisiert werden können. Speziell ist daran gedacht mit dem Verfahren Saccharid-Cluster aufbauen zu können, die sich als Therapeutika eignen, weil sie mit Rezeptoren in bzw. auf Zellen oder Organen wechselwirken. Desweiteren sollen damit Saccharid-Bibliotheken und Saccharid-enthaltende Verbindungsbibliotheken aufgebaut werden. Ferner soll sich das Verfahren eignen, um Saccharide mit Peptiden, Nucleinsäuren und/oder Lipiden zu verknüpfen, wobei auch eine Verknüpfung der Polymere untereinander möglich sein soll.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem auch kompliziert aufgebaute Saccharid-Verbindungen oder Bibliotheken, wie vorstehend erwähnt, aufgebaut werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Von den Erfindern wurde ein Verfahren zur Synthese von Saccharid-Verbindungen entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist:
(a) Anknüpfung mindestens eines Saccharids an ein cyclisches oder acylisches Dien,
(b) Umsetzung des in Schritt (a) entstandenen Saccharid-enthaltenden Diens oder eines käuflich erhältlichen saccharidhaltigen Diens mit einem Dienophil mittels Diels-Alder-Reaktion.
Die Diels-Alder-Reaktion ist eine Reaktion, bei der ein Dien mit einem Olefin reagiert, wobei ein Übergangszustand durchlaufen wird, an dem 6π-Elektronen beteiligt sind. Dieser Übergangszustand verleiht den Diels-Alder-Reaktionen, im
Vergleich zu den üblichen organischen Reaktionen^- relativ niedrige Aktivierungsenergien, so daß diese Reaktionen bereits bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen ablaufen können. Diels-Alder-Reaktionen können durch hohen Druck beschleunigt werden. Gerade in den letzten Jahren sind eine Reihe von Katalysatoren bekannt geworden, die in der Lage sind, unter milden Bedingungen effektiv Diels-Alder Reaktionen zu katalysieren (K. Pindur et al., Chem Rev. 1993, 93, S. 741-761; Kündig et al., Angew: Chem. 1999, 111, S. 1298-1301) . Da Diels-Alder Reaktionen grundsätzlich reversibel sind, eignet sich dieser Reaktionstyp auch für die dynamische kombinatorische Chemie. Die Bildung von exo- und endo-Isomeren kann über die Temperatur und auch den Katalysator gesteuert werden. Hinsichtlich der Ausbeuten bietet die Diels-Alder Reaktion große Vorteile, da sie ohne weitere Nebenprodukte und mit nahezu quantitativer Ausbeute verläuft. Die Diels-Alder Reaktion wird daher von den Erfindern eingesetzt, um kompliziert aufgebaute Saccharid- Verbindungen und Bibliotheken aus Saccharid-enthaltenden Verbindungen bzw. Saccharid-Bibliotheken aufzubauen. Bei geschickter Substitution der beiden AusgangsVerbindungen (Dien und Dienophil) mit funktioneilen Gruppen oder Resten sind damit Moleküle zugänglich, die drei oder sogar vier unterschiedliche Reste enthalten können.
Erfindungsgemäß eignen sich als cyclische Dien-Komponente in Schritt (a) vorzugsweise Furan, Fulven, Furfural, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Pyrrol, 1,3-Ozazol, 1,2- Oxazol, Pyrazol, Thiophen und als acyclische Verbindungen 1,3-Diene (z.B. trans-trans Hexadien-2, 4-1, 6-diol) , welche mit funktionellen Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können. Die funktionellen Gruppen können ausgewählt sein aus beispielsweise Alkylketten (C2 - C20, bevorzugt Methyl, Ethyl, iso-Propyl, Tert.-Butyl usw.), OH, SH, Halogene, Aryl-
, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitro-, Carboxyamido-,.. Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure- oder A ino- Gruppen, die direkt oder über Alkylreste gebunden sind. Die Dien-Komponente kann aber auch Aminosäure-, Peptid- Substituenten, Lipid-Substituenten oder Oligonukleotid- bzw. Nukleinsäure-Substituenten tragen. An die Dien-Komponente lassen sich auch alle Arten pharmazeutischer Wirkstoffe, Markierungen, Farbstoffe oder Komplexe (z.B. Carboran, Ferrocen) koppeln.
Bevorzugte Dien-Komponenten sind: Bishydroxyalkylfurane, wie 2,3-Bishydroxymethylfuran, 3,4-Bishydroxymethylfuran, 2,5- Bishydroxymethylfuran, Hydroxymethylfurfural, α-GMF (α- Glycosylmethyl-furfural; bzw. mit z.B. NaBH reduzierter Aldehydfunktion) . Ebenso können natürlich auch deren Homologe mit Ethylτ oder Propylgruppe statt Methyl- eingesetzt werden. Die Dien-Komponenten sind käuflich erhältlich z.B. Fa. Aldrich (Furfural = Aldrich #27,886-6; Hydroxymethylfurfural = Aldrich #4,080-7; 3-Hydroxymethyl-furan = Aldrich #19,639- 8) oder Fa. Südzucker AG (α-GMF). Allgemein gilt, daß 2,5- disubstituierte Furane in Diels-Alder-Reaktionen eine geringere Reaktivität besitzen als 3, 4-disubstituierte. Diese abgestufte Reaktivität läßt sich synthetisch nutzen. Dabei ist von Vorteil, daß sich die Reaktivität von Hydroxymet ylgruppen in den einzelnen Positionen des Furans unterscheidet, so daß eine sequentielle Substitution möglich wird. Damit lassen sich sehr einfach verschiedene Saccharide in das Furan einführen (s. Fig. 1) . Cyclopentadien und seine substituierten S-bkömmlinge eignen sich ebenfalls sehr gut als Diene bei der Diels-Alder-Reaktion. Aldehyd-Derivate des Cyclopentadiens sind schon lange bekannt (Chem. Ber. 1964, 97, S. 2066) und können schrittweise in die HydroxymethylVerbindungen überführt werden, die nach der Imid.at-Methode mit Sacchariden umgesetzt werden und dann als
Diene verfügbar sind. Carbonsäure-Derivate des Cyclopentadiens sind ebenfalls bekannt, wie Ester, A ide oder Nitrile (J. Chem. Soc. 1966, S. 1641) . Dabei sind Cyclopentadien-tetra-carbonsäureester auch aus den entsprechenden Cyclopentan-Vorstufen durch Dehydrierung darstellbar. Diese Vorstufen wiederum sind leicht aus den Diels-Alder-Addukten aus Cyclopentadien und Maleinsäureanhydrid zugänglich. Auch durch Cyclisierungsreaktionen von 1,3-Diäcarbonyl-Verbindungen können Cyclopentadiene hergestellt werden (J. Chem. Soc. 1952, S. 1127) . In der Natur vorkommende Iridoid-Glucoside wie Catapol und Aucubin (Liebigs Ann. Chem. 1990, S. 715) können als Vorstufen für ssacharid-substituierte Cyclopentadiene betrachtet werden (THL 1997, 38, S. 6433). Daneben können die genannten Glucoside auch als Dienophile bei der Generierung von Substanz-Bibliotheken zur Wirkstoffsuche verwendet werden.
Im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Saccharid mit einem Dien verknüpft, indem das Dien mit einer Imidat-Komponente umgesetzt wird, die mit einem Saccharid substituiert ist. Die Reaktionsbedingungen für diese Reaktion sind beispielsweise von R.R. Schmidt, in: Glycosciences, ed. H.J. Gabius, S. Gabius, S. 31-53 beschrieben worden. Die Verknüpfung des Saccharids mit der Dien-Komponente kann auch mittels anderer Reaktionen (z.B. mittels der bekannten Königs-Knorr-Reaktion) erfolgen. Der Begriff "Saccharid" umfaßt Saccharide jeglicher Art, insbesondere Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide (z.B. mono-, di- tri-, ulti- antennäre sowie dendritische Saccharide) in allen stereoisomeren und enantiomeren Formen. Diese können Pentosen oder Hexosen sein, welche in der L- oder D-Form vorliegen. Als Monosaccharide sind insbesondere Glucose, ganz besonders α- und ß- D-Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Arabinose,
Xylose, Fucose, Rhamnose, Digitoxose und Derivate davon bevorzugt. Als Disaccharide eignen sich insbesondere Saccharose, Maltose, Laktose oder Gentobiose, entweder 1,4- oder 1, 6-verknüpft, sowie Derivate davon. Als Saccharide gelten hier auch Zuckeralkohole, Polyole, Inosite und Derivate davon, ganz besonders cis-Inositol, epi-Inositol, allo-Inositol, myo-Inositol, muco-Inositol, chiro-Inositol, neo-Inositol, scyllo-Inositol, Pinpollitol, Streptamin, Quercitol, Chinasäure, Shikimisäure, Conduritol A bzw. B, Validatol und Quebrachitol, z.B. aus Galactinolen, sowohl aus pflanzlichen Quellen, wie Zuckerrüben (daraus erhältlich: Hydroxymethylfurfural; F.W. Lichtenthaler, Mod. Synth. Meth. 1993, 6, S. 273-376), als auch aus Milchprodukten, oder durch enzymatische Enantiomerentrennung gewonnene Verbindungen. Ferner sind erfindungsgemäß einsetzbare Saccharide Glycokonjugate. Diese können Konjugate von z.B. Sacchariden mit Peptiden, Lipiden, Säuren (—> Ester), Alkylresten ( >
Ether) , Heterozyklen oder anderen Kohlenhydraten sein. Ein Beispiel von Glycokonjugaten ist Z1-Z10, ein Gemisch von 10 Glykokonjugaten. Bei den Verbindungen Z1-Z10 handelt es sich um in der Natur vorkommende Glycopeptide, Glycoproteine und Lipopolysaccharide. Derivate der erwähnten Saccharide sind z.B. mit Schutzgruppen (z.B. Benzoyl-, Silyl-, Dirnethoxytrityl-) geschützte Saccharide und/oder mit funktionellen Gruppen, wie Amino-, Nitro-, Carboxy-, Carboxya ido-, Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Phosphonsäure-, Mono/Di/Trilalkylamidgruppen oder Halogenidgruppen, modifizierte Saccharide. Vorstehende Saccharide können natürlich vorkommen oder synthetisch hergestellt sein. Vorzugsweise weist das Imidat nur ein Saccharid auf, aber auch eine Anzahl von 2, 3, 4, 5 und 6 Saccharid-Komponenten ist denkbar, wenn das Imidat entsprechend ausgewählt ist. Die Saccharide können dabei gleich oder verschieden voneinander sein.
Bevorzugte Saccharid-substituierte Imidat-Komponenten sind Tri-O-Benzoyl-fucoseimidat oder Tetra-O-Benzoyl- galactoseimidat. Die Saccharid-substituierten Imidat- Komponenten werden beispielsweise gemäß H. Paulsen et al., 1992, Liebigs Ann. Chem. 747-750 hergestellt.
Um in Schritt (a) ein vollständig mit Sacchariden modifiziertes Dien zu erhalten, kann die vorbeschriebene Reaktion des Diens mit dem Saccharid-substituierten Imidat mehrfach hintereinander stattfinden (s. Beispiel 1) oder das Imidat wird im Überschuß zugesetzt, wobei dann nach der Reaktion ein- und mehrfach Saccharid-modifiziertes Dien voneinander getrennt werden sollten, um im nachfolgenden Schritt (b) zu einheitlichen Produkten zu kommen. Die in Schritt (a) aus den vorstehend als bevorzugt genannten Dienen und Saccharid-substituierten Imidaten herstellbaren Verbindungen sind beispielsweise 3, 4-Bis- (fucosyl-oxymethyl)- furan, 3, 4-Bis- (galactosyl-oxymethyl) -furan, 3- Fucosyloxymethyl-4-galactosyloxymethylfuran, 2, 5-Bis- galactosyloxymethyl-furan, 2,5-Bis-fucosyloxymethyl-furan, 2- Fucosyloxymethyl-5-galactosyloxymethylfuran und Alkohole, abgeleitet von Furan-2, 5-di-ß-propionsäure oder- abgeleitet von Furan-2,5-di-essigsäure. Falls die Verbindunger Schutzgruppen enthalten (vorzugsweise: Benzoylschutzgruppe) können diese z.B. mit Natriummethanolatlösung gemäii Standardverfahren abgespalten werden.
In Schritt (b) eignen sich als Dienophil€ Maleinsäure (anhydrid) -Derivate, Fumarsäure (anhydrid) - Derivate, Maleinimid-Derivate (bevorzugt: N-substituierte. Maleinimid) , Acrylsäure-Derivate, Acetylen-Derivate, Butindicarbonsäure bzw. dessen Derivate oder Enolether. Untej Derivaten sind dabei jene, die nach Substitution de:
genannten Verbindungen Alkylketten (C2 - C2o) , _-_-OH, SH, Halogenen, Aryl-, Carboxy-, Carbonyl-, Nitro-, Carboxyamido-, Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Amino-, Phosphonsäure- oder Mono/Di/Trialkyla id-Gruppen tragen. Desweiteren kann die Dienophil-Komponente mit Sacchariden gemäß der vorstehenden Definition substituiert sein. Die Dienophil-Komponente kann aber auch Aminosäure-, Peptid-Substituenten, Lipid-Substituenten oder Oligonukleotid- bzw. Nukleinsäure-Substituenten tragen. An die Dienophil-Komponente lassen sich auch alle Arten pharmazeutischer Wirkstoffe, Markierungen, Farbstoffe oder Komplexe koppeln. Bevorzugte Dienophile sind Tris- (2- Maleini idoethyDamin (TMEA), • N-Phenyl, N-Ethyl, Maleini idolysin oder Conduritol.
Die Dien- als auch die Dienophil-Komponente können einzeln oder beide auch aromatische oder heterozyklische Reste enthalten. Diese können ausgewählt sein aus: Phenyl-, Thienyl-, Thiophenyl-, Furyl-, Furanyl-, Pyrany.l-, Pyrrolyl-, Irαidazolyl-, Pyrazolyl-, Pyridyl-, Pyrazinyl-, Pyri idinyl-, Pyrazinyl-, Pyridazinyl-, Thiazolyl-, Oxazolyl-, Indolyl-, Furazannyl-, Pyrrolinyl-, Imidazolinyl-, Pyrazolinyl-, Thiazolinyl-, Triazolyl-, Tetrazolyl-Gruppe, sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können, ein Rest bestehend aus carbocyclischen kondensierten Ringen, beispielsweise die Naphthylgruppe oder die Phenanthrenylgruppe, ein Rest" bestehend aus kondensierten heterocyclischen Ringen, beispielsweise Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzot iazolyl, Naphtho[2,3- b] thienyl, Thianthrenyl, Isobenzofuranyl, Chromenyl, Xanthenyl, Phenoxathionyl, Indolizinyl, Isoindolyl, 3H- Indolyl, Indolyl, Indazolyl, Purinyl, Chinolizinyl, Isochinolyl, Chinolyl, Phthalzinyl, Naphthyridinyl, Chinoxalinyl, Chinazolinyl, Chinolinyl, Pteridinyl,
Carbazolyl, ß-Carbolinyl, Cinnolinyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, Indolinyl, Isoindolinyl, Imidazopyridyl, Imidazopyridmidinyl oder auch die kondensierten polycyclischen Systeme bestehend aus heterocyclischen Monozyklen, wie beispielsweise vorstehend definiert, wie beispielsweise Thionaphthenyl, Furo[2,3- b.pyrrol oder Thieno[2, 3-b] furan, und insbesondere die Phenyl-, Furylgruppen, wie 2-Furyl, Imidazolyl, wie 2- Imidazolyl, Pyridyl, wie 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Pyri idinyl, wie Pyridmid-2-yl, Thiazolyl, wie Thiazol-2-yl, Thiazolinyl, wie Thiazolin-2-yl, Triazolyl, wie Triazolyl-2- yl, Tetrazolyl, wie Tetrazol-2-yl, Benzimidazolyl, wie Benzimidazol-2-yl, Benzothiazolyl, Benzothiazol-2-yl, Purinyl, wie Purin-7-yl, oder Chinolyl, wie 4-Chinolyl.
Die Diels-Alder-Reaktion ist ein Standardverfahren der organischen Chemie und die Reaktionsbedingungen sind einem Fachmann wohl bekannt bzw. können in einschlägigen Lehrbüchern nachgeschaut werden. Im Rahmen dejj vorliegenden Erfindung wird die Diels-Alder-Reaktion vorzugsweise in beliebigen Lösungsmitteln zwischen 20°C und 100°C durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind Wasser oder Alkohole, wie Methanol oder Ethanol. Die Bildung von exo- und endo-Verbindungen, wie sie bei diesem Typ von Diels-Alder- Reaktionen beobachtet werden, kann durch die experimentellen Bedingungen gesteuert werden und vergrößert die Zahl der zu erhaltenden Verbindungen um den Faktor zwei. Diese Variation der experimentellen Bedingungen liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns .
Alle Diels-Alder-Reaktionen sind Gleichgewichtsreaktionen, bei denen in Abhängigkeit von der Temperatur auch immer auch die Komponenten zugegen sind und somit anderweitig aus dem Gleichgewicht heraus mit anderen Partnern abreagieren können.
Damit eignet sich das vorstehend beschriebene System_-auch zur kontrollierten Freisetzung der Dienophil-Komponente, bei gleichzeitiger Verankerung der Dien-Komponente an einem Polymerträger oder umgekehrt. Trägt das Dienophil z.B. ein Peptid oder ein Therapeutikum so steht damit ein System zur Verfügung, das für die kontrollierte und steuerbare Freisetzung von Arzneimitteln von einer Festphase genutzt werden kann. In Erweiterung vorstehend beschriebener Reaktionen steht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Möglichkeit der Verknüpfung von Peptiden mit Sacchariden, von Peptiden mit Nukleinsäuren, von Sacchariden mit Nukleinsäuren und der jeweiligen Komponente mit sich selbst zur Verfügung, sofern die eine Komponente mit einem Dien und die andere mit einem Dienophil verbunden wäre. Die entstandenen Diels-Alder Addukte können selbst noch abgewandelt werden, z.B. durch Ringöffnung des Anhydridringes oder auch durch Hydrierung der Doppelbindung oder durch Additionsreaktionen an diese Doppelbindung.
Das Oxa-bicycloheptan-Ringsystem kann unter sauren Bedingungen zu einem Cyclohexan-Ringsyste geöffnet werden. Dabei ist eine Spaltung des Diels-Alder Addukts in die Komponenten nicht mehr möglich und es entsteht ein neuer Strukturtyp, ein Inositolderivat, das sicher andere pharmakologische Eigenschaften aufweist, da es nicht mehr die Rigidität des Bicyclus besitzt.
Um größere Cluster oder Bibliotheken aufzubauen, müssen die Schritte a) und/oder b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mehrmals hintereinander durchgeführt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Schritt a) natürlich wegfallen, wenn von einem Saccharid-substituierter Dien bereits ausgegangen wird.
Nachfolgend sollen einige wichtige bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung hervorgehoben werden, wobei diese nicht als Beschränkung des breiten Verfahrenskonzepts auszulegen sind.
In der Diels-Alder-Reaktion (Schema 1) wird ein Dien 1 mit einem Dienophil 2 zur Reaktion gebracht.
Schema 1
Das Dien 1 (hier: Furan mit den Substituenten Ri. bis R4) wird dabei in wässriger Lösung direkt mit dem Dienophil 2 (hier: Maleini id mit dem Substituenten R5) zur Reaktion gebracht. Dabei entsteht ein Produktgemich aus endo- und exo-Diels- Alder-Produkt 3. Die Zusammensetzung des Produktgemisches kann gesteuert werden. Zudem ist es möglich, endo- und exo- Verbindung chromatographisch voneinander zu trennen. (Bedeutung von Ri bis R4 und R5: Es können ein oder mehrere Substituenten und in allen denkbaren Kombinationen eingebaut werden. Zur Definition der Reste: siehe vorstehend)
Im folgenden werden daher zunächst einige Darstellungsmöglichkeiten von Dienen (vom Typ 1, Schema 1) und deren Saccharidkonjugation, dann der Dienophile (vom Typ 2) und schließlich die Diels-Alder Reaktion beschrieben.
Darstellung der Diene (bevorzugt Fürande ivate)
Dem erfindungsgemäßen Konzept entsprechend werden saccharidmodifizierte Furanderivate hergestellt. Geeignete Verbindungen sind daher Furanderivate, die eine Hydroxygruppe enthalten (direkt oder durch Spacer vom Ring entfernt) , welche die kovalente, glycosidische Verknüpfung mit einem Saccharidmolekül erlaubt (z.B. Ri = CH2-OH) . Die Synthesemöglichkeiten hierfür sind zahlreich und zumeist literaturbekannt.
Stellvertretend für die leichte Zugänglichkeit der benötigten Furanderivate und die Leistungsfähigkeit der Synthesewege sind die folgenden Reaktionsschemata (Fig. 5(a) - (f) ) angeführt.
Neben den hier vorgestellten Synthesewegen gibt es noch andere, bereits literaturbekannte Varianten. Die hier beschriebenen Diene sind bespielhaft aufgeführt. Daneben gibt es noch eine weitere Zahl von Dienen, die nach Konjugation mit Sacchariden von den Erfindern in Diels-Alder Reaktionen eingesetzt wurden. Diese sind weiter unten tabellarisch dargestellt.
Synthese der saccharidhaltigen Diene
Die kovalente Verknüpfung der Furanderivate mit Sacchariden erfolgt bevorzugt nach der Imidatmethode (Schema 3, s. Fig. 6) . Im ersten Schritt der Reaktion (A) wird die einfache Galactosidierung errreicht, inde jeweils ein Äquivalent Furanderivat mit einem Äquivalent Galactosei idat zur Reaktion gebracht wird. Die Mono-galactosidierte Verbindung wird chromatographisch aufgereinigt. In einem zweiten Schritt der Umsetzung (B) wird dann 1 Äquivalent eines weiteren Glycosylimidates zugesetzt. Bei zweifacher Umsetzung mit Gal- I idat wird so nach Abspaltung der Schutzgruppen eine Verbindung mit zwei Galactoseeinheiten erhalten. Setzt man
dagegen in Schritt B das Fucose-imidat ein, so wird.-e.in gemischt glycosidiertes Furanderivat nach Abspaltung der Schutzgruppen erhalten. Die gesamte Reaktion kann aber auch durch Königs-Knorr-Reaktion oder andere in der Literatur bekannte Methoden erfolgen.
Kombinatorik mit Furansaαchariden
Umsetzung von 2, 3,4-Trishydroxyfuran (oder anderen „polyhydroxylierten" Furanderivaten) mit der dreifachen molaren Menge des Mixes an 10 verschiedenen Imidaten in gleichen Verhältnissen. Abspaltung der Schutzgruppen und Diels-Alder Reaktion mit einem markierten Maleinimid im Überschuß. Isolierung der markierten Bibliothek und Test auf fixierte Zellen. Durch Variation der Saccharidimidate, Hinzufügen und Weglassen und ihrer Konzentrationen lassen sich die optimal wirksamen Strukturen ermitteln.
Wird als Dien ein zweifach mit Zuckerresten .substituiertes Furan und als Dienophil ein N-substituiertes Maleinimid eingesetzt, das über einen Spacer beliebiger Länge ein Saccharid trägt, so entstehen bei der Diels-Alder-Reaktion Trisaccharide. Nach diesem Schema läßt sich bei der Verwendung von z.B. zehn unterschiedlichen Saccharidimidaten eine Bibliothek mit fast 1000 verschiedenen Trisacchariden generieren. Da die Schutzgruppen sowohl des Diens als auch des Dienophils vorher abgespalten werden können, kann die Diels-Alder-Reaktion in Wasser durchgeführt werden, was sich günstig auf die Reaktionsgeschwindigkeit und Ausbeute auswirkt (s. Fig. 2) .
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Substanzen/Bibliotheken herstellen, die sich eignen, die Interaktion von Lektinen mit Proteinen zu inhibieren. Solche
Substanzen können bei der Krebstherapie zur Vermeidung der Metastatisierung oder als Entzündungshemmer Verwendung finden. Bei Verwendung von Spacern, wobei diese sowohl im Dien als auch im Dienophil eingefügt werden können, oder von seltenen oder mit ungewöhnlichen funktionellen Gruppen versehenen Sacchariden, erhöht sich die Diversität der Bibliotheken. Die Multiantennarität, die für die Interaktion von Sacchariden mit Lektinen von Bedeutung sein kann, läßt sich ebenfalls mit Hilfe des erfindüngsgemäßen Verfahrens herstellen. Durch die zwei- oder dreifache Diels-Alder- Reaktion mit einem entsprechenden Dienophil sind solche Moleküle leicht zugänglich (s. Fig. 3) .
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Verbindungen/Bibliotheken generierbar, die neben den Sacchariden auch andere pharmakophore Gruppen enthalten, um allgemein neue Leitstrukturen für Therapeutika zugänglich zu machen. Solche Gruppen können Heterozyklen, Aromaten oder auch peptidische Strukturen sein, die entweder im Dien oder Dienophil enthalten sind. Durch diese vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten erhöht sich die Diversität der Bibliotheken beträchtlich. Günstig kann in diesem Zusammenhang auch die oft geringe konformative Beweglichkeit der entstehenden Diels-Alder-Produkte sein, da sich solche Strukturen besser an Rezeptoren anlagern. Durch das Vorhandensein der Saccharidreste in den Produkten sind diese entsprechend wasserlöslich.
Die Diels-Alder-Reaktion von Dienen mit Dienophilen (z.B. substituierten Maleinimiden) kann auch zur Verbindung von Proteinen mit Sacchariden und von Sacchariden mit Nukleinsäuren eingesetzt werden. Hier ist es zweckmäßig, einen Lysinrest im Protein zu haben, der über die freie Aminogruppe die Anfügung des Maleinimid-Restes gestattet. Es
ist aber auch denkbar, daß am a inoterminalen Ende ein Lysin- Rest angefügt wird. Bei diesen so zugänglichen Neo- Glycoproteinen läßt sich der Einfluß von unterschiedlichen
(Oligo) Sacchariden auf die Wirksamkeit der Proteine oder deren Pharmakokinetik untersuchen. Auf dem gleichen Weg ist auch eine Markierung von Sacchariden mit Biotin problemlos durchführbar, was für eine mögliche Diagnostik auf der Basis von Lektin-Saccharid-Wechselwirkungen von Wichtigkeit wäre
(Fig. 2) .
Die Diels-Alder-Reaktion von Dienen (z.B. substituierten Furanen) mit Dienophilen (z.B. substituierten Maleini iden) führt auch zur Dotierung von Oberflächen mit Sacchariden, Lipiden, Peptiden oder (Oligo) nukleotiden. Dabei kann sowohl das Dienophil als auch das Dien auf der Oberfläche immobilisiert sein. Eine Anwendung in der Chip-Technologie ist somit denkbar. Auch die Erhöhung der Beladungsdichte auf der Oberfläche ist durch die Verwendung von Strukturen wie in Fig. 2 machbar.
Da die Diels-Alder-Reaktion mit diesen Komponenten sehr gut in Wasser durchzuführen ist und in der Regel keiner Katalyse bedarf, können alle Komponenten ohne Schutzgruppen miteinander umgesetzt werden. Dadurch entfällt die finale Abspaltung von Schutzgruppen, ein Prozeß der oftmals große Schwierigkeiten bereitet.
Da alle Diels-Alder-Reaktionen reversibel sind und sich die Gleichgewichte schon bei Raumtemperatur einstellen, kann die Umkehrung der Adduktbildung auch für die kontrollierte Freisetzung der Komponenten der Diels-Alder-Reaktion, die dafür mit Wirkstoffen beladen sind, eingesetzt werden.
Wie in der Einleitung bereits ausgeführt, sind die natürlichen Bindungskonstanten zwischen Proteinen und (Oligo) sacchariden nicht sehr hoch. Offenbar bestand im Rahmen der Evolution kein Bedarf für eine weitere Optimierung dieser Bindungskonstanten. Aus grundsätzlichen Erwägungen heraus sollte es möglich sein, durch Zulassung aller Arten von Wechselwirkungen einschließlich ionischer Interaktionen, auf der Basis von Sacchariden und Saccharidmimetika wirkungsvolle Agonisten und Antagonisten von Rezeptoren in Analogie zu Peptiden darzustellen. Die Verwendung von substituierten Sacchariden, wobei alle Arten von funktionellen Gruppen eingesetzt werden können, auch solche, die bisher nicht in Sacchariden vorkommen, ist sicher eine Voraussetzung für diese Optimierung.
Mit Hilfe der kombinatorischen Chemie ist es möglich, sehr wirkungsvolle Agonisten und Antagonisten auf der Basis von Peptiden, Lipiden oder Nukleinsäuren zu identifizieren. Um daraus Therapeutika, vor allem für die orale Applikation, zu entwickeln, bedarf es aber Substanzen, die oral verfügbar sind. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist die ausreichende Wasserlöslichkeit. Ein möglicher Ansatz zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit und damit der oralen Verfügbarkeit, ist die kovalente Verknüpfung von Wirkstoffen mit Sacchariden unter Bildung von Konjugaten. Mit dem erfindungsgemäßen Ansatz ist es möglich, unter Anwendung eines kombinatorischen Ansatzes von vornherein das Problem einer ausreichenden Wasserlöslichkeit durch die Verwendung geeigneter Bausteine zu berücksichtigen. Dies bietet darüber hinaus noch den Vorteil, daß diese Bausteine auf der Basis von Sacchariden und ihrer Derivate Teil des Wirkstoffs werden und damit zur Stärkung der Bindung des Wirkstoffs an sein Target beitragen können. Von den Erfindern ist auch daran gedacht worden, das Verfahren auf die Festphase zu
übertragen, wobei sinnvollerweise die Bindung an die Festphase über den Saccharidteil erfolgt .
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Figuren beschrieben.
Fig. 1 : Einführung von 2 Saccharidresten in ein Furansystem Fig. 2 : Reaktion eines zweifach substituierten Furans mit einem N-substituierten Maleinimid Fig. 3 : Mehrfache Diels-Alder-Reaktion
Fig. 4 : Exemplarische Bausteine für die Diels-Alder Reaktion
Fig. 5 (a) - ( f) : Darstellung von mit Sacchariden konjugierbaren Für ander ivaten Fig. 6 : Glykosidierung von 2, 5-Bis-hydroxymethylfuran
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele verdeutlicht .
Beispiel 1 : Synthese von glycosidierten Hydroxymethyl- furanen
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20 mmol 3, 4-Bis-Hydroxymethylfuran 1 und 21 mmol Tri-O- Benzoyl-fucose-imidat 2 werden in 300 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird auf -40DC abgekühlt und mit einigen Tropfen Triflat versetzt. Die Reaktionslösung wird dann im Eisbad 1 Stunde gerührt, die organische Phase wird mit verdünnter Bicarbonatlösung und dann mit Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Das Reaktionsprodukt 3 wird nach Säulenchromatographie an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) in einer Ausbeute von ca. 60% erhalten.
6 mmol Mono-fucosyliertes Furan 3 wird mit 6.3 mmol Imidat 4 wie oben beschrieben umgesetzt. Die Reinigung erfolgt säulenchromatographisch an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) . Das Produkt 5 wird in einer Ausbeute von ca. 55% erhalten.
Zur Entschützung (Abspaltung der Benzoylgruppen) wurde das Produkt 5 mit Natriummethanolatlösung umgesetzt. Ausbeuten: ca. 60%.
Um die entspechenden 2,5-Produkte herzustellen, wird im ersten Schritt statt 3, 4-Bis-Hydroxymethylfuran das 2,5-Bis- Hydroxymethylfuran eingesetzt und analog wie vorstehend verfahren.
Beispiel 2: Glycosidierung von Maleinimid bzw. -Derivaten
5 mmol geeignet derivatisiertes Maleinimid 1 (Maleinimid + Spacer + OH) werden mit 4 .9 mmol Galactosyli idat 2 in 100 ml Dichlormethan gelöst und bei -40DC mit 10 Tropfen Triflat versetzt. Es wird bei ODC geruht.
" Nach vollständiger Umsetzung wird die Reaktionslösung mit verdünnter Bicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Das Lösungsmittel wird über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) chromatographiert. Ausbeute an Produkt 3: 54%.
Zur Abspaltung der Benzoylgruppen wird mit Natriummethanolat oder einer Mischung aus Methanol/Wasser/Triethylamin umgesetzt.
Beispiel 3: Diels-Alder Reaktion
a) Biotinylierung
50umol glycosidiertes Furan 1 (s. Beispiel 1) und 50 μmol Biotinderivat 2 (Fa. Pierce Kat.-No. 2 1900 ZZ) werden in 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Der Fortgang der Reaktion wird mittels HPLC kontrolliert. Nach beendeter Umsetzung wird die Reaktionslösung gefriergetrocknet. Das Produkt 3 (endo-/exo-Mischung) wird mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute 50-60%.
Unter den gleichen Bedingungen wurden auch folgende Reaktionen durchgeführt, wobei die Df-en-Komponente jeweils gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde und die Dienophil-Komponente gemäß K. Wakisaka et al., J. Med. Chem. 1997, 40, S. 2643-2652 hergestellt wurde.
Einführung eines Lysinrestes
c) Umsetzung von 2 , 5 und 3, 4-Glycosyl-hydroxymethylierten Furanen
Beispiel 4 : Darstellung von Glycoclustern mittels Diels-
Alder Reaktion
Eine Lösung von 50 μmol Tris (-2-Maleinimidoethyl) amin 1 (TMEA) und 190 μmol Bis-Galactosylfuran 2 in 1 ml Wasser wird 50 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produktgemisch 3 (Kombination aus endo- und exo-Produkten) wird mittels HPLC in ca. 30% Ausbeute erhalten.
Beispiel 5: Gekreuzte Diels-Alder Reaktion
Hierbei handelt es sich um die gleichzeitige Reaktion von
2,5- und 3,4-Furanen mit einem Dienophil (—> Kombinatorik)
50μmol eines Gemischs der glycosidierten 3,4- und 2,5-Furane 1, 2 (s. Beispiel 1) und 50 μmol N-Ethyl-Maleinimid 3 werden in 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Der Fortgang der Reaktion wird mittels HPLC kontrolliert. Nach beendeter Umsetzung wird die Reaktionslösung gefriergetrocknet. Die Produkte 4 und 5 werden mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute 50-60%.
Beispiel 6: Diels-Alder Reaktion an der Festphase
1,0 g Tris-(2-aminoethyl)amin-Polymer (Aldrich #47,210-7) werden in 20 ml Wasser für 1 Std. quellen gelassen. Danach wird in 20 ml gesättigter NaHC03 - Lösung aufgeschlämmt und bei ODC mit 1080 mg Methoxycarbonylmaleimid versetzt und dann bei Raumtemperatur 16 Std. gerührt. Man stellt mit H2S04 auf pH 3-4 ein, extrahiert mit Essigester und Dichlormethan. Die wässrige Phase wird getrocknet. Zu 100 mg des Produktes werden 108 mg glykosyliertes Furanderivat (s. Beispiel 1) in
3 ml Wasser gegeben. Es wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 16 Stunden wird das Wasser entfernt und das Produkt mittels HPLC gereinigt.
Beispiel 7 Herstellung von Trisacchariden
5 mmol geeignet derivatisiertes Maleinimid 1 (Maleinimid + Spacer + Saccharid) werden mit 4.9 mmol diglycosyliertem Furan 2 in 100 ml Dichlormethan gelöst und bei -40DC mit 10 Tropfen Triflat versetzt. Es wird bei ODC geruht. Nach vollständiger Umsetzung wird die Reaktionslösung mit verdünnter Bicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Das Lösungsmittel wird über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) chromatographiert. Ausbeute an Produkt 3: 54%.
Beispiel 8: Glycosidierung von Furanderivaten mit Hydroxyfunktionen
(a) Verfahren A: Monoglycosidierung:
2, 5-Bishydroxymethylfuran (2 mmol, 265 mg) und 2,3,4-Tri-O- Benzoylfucoseimidat (2 mmol , 1,28g) werden in 50 ml Dichlormethan bei -40°C mit 5 Tropfen Triflat versetzt und anschließend bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Zugabe von verdünnter wässriger Bicarbonatlösung gestoppt. Die organische Phase wird mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend nach Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel (Petrolether/Essigester: 2/1) chromatographiert. Ausbeute: 700mg (60%); ESI-MS: [M+H+] : 58611 Diese Verbindung kann nun in einer zweiten Reaktion nochmals mit einem Äquivalent eines beliebigen Saccharidimidates umgesetzt werden.
(b) Verfahren B: Mehrfachglycosidierung
2, 5-Bishydroxymethylfuran (2 mmol, 265 mg) und 2,3,4, 6-Tetra- O-Benzoylgalctoseimidat (4 mmol, 1,48g) werden in 50 ml Dichlormethan bei -40°C mit 5 Tropfen Triflat versetzt und
anschließend bei 0°C für zwei Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Zugabe von verdünnter wässriger Bicarbonatlösung gestoppt. Die organische Phase wird mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend nach Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel (Petrolether/Essigester: 2/1) chromatographiert. Ausbeute: 1,4g (55%); ESI-MS: [M+H+] : 1284,3
Zur Abspaltung der Schutzgruppen werden die Verbindungen in methanolischer Lösung mit Natriummethanolat umgesetzt. Die Verseifung erfolgt quantitativ.
Enthält das Furanderivat mehrere glycosidierbare Hydroxylfunktionen, so wird zur schrittweisen Glycosidierung nach Verfahren A umgesetzt. Soll hingegen nur eine Kohlenhydratspezies an alle zur Verfügung stehenden Hydroxylfunktionen konjugiert werden, wird Verfahren B eingesetzt.
Auf diese Weise wurden folgende Furanderivate hergestellt:
3-Hydroxymethylfuranglycosid
Ri
Glucose
2 , 3-Bishydroxymethylfuranglycoside
2 , 4-Bishydroxymethylfuranglycoside
3, 4-Bishydroxymethylfuranglycoside
2, 5-Bishydroxym.ethylfuranglycoside
2, 3, 4-Trishydroxymethylfuranglycoside
2,3, 5-Trishydroxymethylfuranglycosid
Andere:
Beispiel 9: Darstellung von Dienophilen
Zahlreiche Dienophile vom Maleinimidtyp sind synthetisiert worden. Daneben sind jedoch auch einige kommerziell erhältich.
Allgemeine Maleinimid-Synthesen:
Synthese des N- ( ethoxycarbonyl) -maleini ids: 0. Keller, J. Rudinger, Hei. Chim. Acta 1975, 58, 531541.
J. T. Elliott, G. D. Prestwich, Bioconjugate Chemistry 2000,
11, 832-841.
S. Kaigutkar, B. C. Crews, L. J. Marnett, J. Med. Chem. 1996,
39, 1692-1703.
M. Dörr, R. Zentel, R. Dietrich, K. Meerholz, C . Bräuchle, J.
Wichern, S . Zippel, P . Boldt, Macromolecules 1998, 31, 1454-
1465.
- N-Dodecyl-maleinimid
300 mg (1.62 mmol) Dodecylamin werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N-methoxycarbonyl- maleinimid (NMM, 507 mg, 3.24 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (503 mg, 1.48 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.3 ml, 2.16 mmol) und läßt noch weitere 10 min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das N-dodecylamin wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 365 mg (85 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H) , 1.25 (br. s., 16H), 1.54-1.60 ( , 4 H) , 3.50 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 6.67 (s, 2H) .
- N-Stearyl-malinimid
500 mg (1.85 mmol) Stearylamin werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N-methoxycarbonyl- aleinimid (NMM, 580 mg, 3.71 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (574 mg, 1.69 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.34 ml, 2.46 mmol) und läßt noch weitere 10
min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das N-Stearylamin wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 515 g (80 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H) , 1.25
(br. s., 28H), 1.50-1.60 (m, 4H) , 3.50 (t, J = 7.3 Hz, 2H) ,
6.67 (s, 2H) .
ESI-MS: [M+H+] 350.0
- N-Cholesteryl-maleinimid
Cholesterylamin (1.0 g, 2.58 mmol) wird in CHC13 (50 ml) gelöst und mit Maleinsäureanhydrid (253 mg, 2.58 mmol) versetzt. Man läßt über Nacht rühren und entfernt anschließend das Lösungsmittel i. Vak.. Der Rückstand wird in Essigsäureanhdrid aufgenommen (30 ml) und mit Natriumacetat (300 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wird 4 h bei 100 °C gerührt anschließend auf 100 ml Eiswasser gegossen. Es wird mit Essigsäreethylester extrahiert (3 x 100 ml) und die organische Phase mit ges. NaCl-Lsösung gewaschen (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel (Petrolether/EtOac
7:1) aufgereinigt. Das N-Cholesteryl-maleinimid wird als farbloses Öl erhalten.
ESI-MS: [M+H+] 468.3
Synthese des Cholesterylamins: R. Krieg, R. Wyrwa, U. Möllemann, H. Görls, B. Schönecker, Steroids, 1998, "63, 531- 541; M. Hasan, N. Rashid, K. M. Khan, G. Snatzke, H. Duddeck, W. Voelter, Liebigs Ann. 1995, 889-896.
Bis-maleinimid
300 mg (1.49 mmol) 1,2 Diaminododecan werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N- ethoxycarbonyl-maleinimid (NMM, 702 mg, 4.49 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (508 mg, 1.49 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.5 ml, 3.97 mmol) und läßt noch weitere 10 min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das gewünschte Bis-maleinimd wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) und als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 420 mg (78 %)
1H NMR ( 250 MHz, CDC13 ) : δ = 1 .25 (br . s . , 16H) , 1 . 54-1-59 (m, 4H) , 3 . 50 (t, J = 7 . 3 Hz, 4H) , 6. 68 (s , 2H) .
- Tris-Maleinimid
Tris- (2-aminoethyl) amin (100 mg, 0.68 mmol) wird in 5 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl) aleinimid (641 mg, 4.13 mmol). Nach jeder Stunde wird 20 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) zugegeben. Nach 4 h bei 0°C extahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml). Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Man erhält die gewünschte Verbindung als hellgelben Feststoff.
Ausbeute: 140 mg
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 2.71 (t, J = 6.6 Hz, 6H) , 3.52 (t, J = 6.6 Hz, 6H) , 6.70 (s, 6H) . ESI-MS: [M+H+] 386.9
Synthese des Tris-maleinimids: J. C. Cheronis, E. T. Whalley, K. T. Nguyen, S. R. Eubanks, L. G. Allen, M. J. Duggan, S. D, Loy, K. A. Bonham, J. K. Blodgett, J. Med. Chem. 1992, 35, 1563-1572.
Polypropylenimin-tetraa in Dendri er (DAB-Am-4, 90 mg, 0.28 mmol) wird in 5 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl)maleinimid (356 mg, 2.27 mmol). Nach jeder Stunde wird 20 ml ges. NaHC03/THF-Lsg (1:1) zugegeben. Nach 4 h bei 0°C extrahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Man erhält die gewünschte Verbindung als hellgelben Feststoff.
Ausbeute: 120 mg
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 1.42-1.43 (m, 4H) , 1.69 (dt, J =
7.2, J = 7.2 Hz, 8H), 2.37-2.40 (m, 4H) , 2.40 (t, J = 7.0 Hz,
8H) , 3.55 (t, J = 7.4 Hz, 8H) , 6.68 (s, 8H) .
13C NMR (63 MHz): δ = 24.76, 26.16, 36.31, 51.24, 53.68,
134.04, 170.76.
ESI-MS: [M+H+] 637.2
- N-Maleinimido-butansäure
δ-Aminocarbonsäure (500 mg, 4.84 mmol) wird in 20 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl) maleinimid (910 mg, 5.81
mmol) . Nach 10 min bei 0 °C läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und gibt jede Stunde 20 ml ges. NaHC03/THF-Lsg (1:1) zu. Nach 3 h extrahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl- Lösung (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Chromatographie an Kieselgel (EtOAc) liefert die gewünschte Verbindung als farblosen Feststoff.
Ausbeute: 798 mg (90 %)
- 5-Maleiιrtido-fluorescein
5-Aminofluorescein (500 mg, 1.44 mmol) wird in 50 ml Essigsäure/Chloroform (1:1) gelöst (evtl. Suspension). Bei Raumtemperatur versetzt man mit Maleinsäureanhydrid (141 mg, 1.43 mmol) und läßt über Nacht rühren. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel i. Vak. Und nimmt den Rückstand in Essisäureanhydrid (30 ml) auf. Man gibt Natriu acetat (200 mg) zu und erhitzt 4 h auf 100 °C. Die Reaktionsmischung wird auf 100 ml Eiswasser gegossen und mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wird einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird i. Vak.. entfernt und der Rückstand an Kieselgel (EtOAc/Hexan 3:1) chromatographiert.
Ausbeute: 590 mg ESI-MS: [M+H+] 512.0
N,N-Bis (2-chloroethγl) -4-maleinimidoanilin
N,N-Bis (2-chloroethyl) -4-nitroanilin (1.8 g, 6.87 mmol) wird in Methanol (40 ml) gelöst und mit 10 % Pd/C (200 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wird unter H2-Atmosphäre bei Normaldruck für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung filtriert und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Der Rückstand wird in 30 ml ges. NahC03/THF-Lösung (1:1) aufgenommen und bei 0 °C portionsweise mit N- ethoxycarbonyl) -maleinimd (1.61 g, 10.0 mmol) versetzt. Nach 10 min. entfernt man das Eisbad und läßt 3 h bei Raumtemperatur rühren. Nach jeder Stunde gibt man 20 ml ges. NaHC03/THF-Lösung (1:1) zu. Die Reaktionsmischung wird mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) extrahiert und die vereinigten organische Phasen mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit Hexan/EtOAc (1:1) chromatographiert. Die gewünschte Verbindung wird als orangefarbenen Feststoff erhalten.
Ausbeute: 600 mg (28 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 3.59-3.77 (m, 8H) , 6.73 (d, J =
9.2 Hz, 2H), 6.80 (s, 2H) , 7.17 (d, J = 9.2 Hz, 2H) .
13C NMR (63 MHz): δ = 40.24, 53.49, 112.22, 120.93, 127.84,
134.09, 145.86, 169.91.
ESI-MS: war nicht möglich
Synthese des N,N-Bis (2-chloroethyl) -4-nitroanilins: B. D. Palmer, W. R. Wilson, S. M. Pullen, W. A. Denny, J. Med. Chem. 1990, 33, 112-121.
- Synthese eines cis-Platin Maleinimid-Derivates
2 , 3-Diaminopropionsäuremethγlester Dihydrochlorid
2, 3-Diaminopropionsäure monohydochlorid (2.0 g, 14.3 mmol) wird in trockenem Methanol (80 ml) suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Trockenes HCl-Gas wird 30 min in die Lösung eingeleitet. Man läßt 48 h bei Raumtemperatur rühren und entfernt anschließend das Lösungsmittel i. Vak.. Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff erhalten und direkt für die nächste Umsetzung verwendet.
Synthese des 2, 3-Diaminopropionsäuremethylester Dihydrochlorids: P. Jones, G. B. Villeneuve, C. Fei, J. DeMarte, A. J. Haggarty, K. T. Nwe, D. A. Martin, A.-M. Lebuis, J. M. Finkelstein, B. J. Gour-Salin, T. H. Chan, B. R. Leyland-Jones, J. Med. Chem. 1998, 41, 3062-3077.
- N,N-Di-tert-butoxycarbonγl-2,3- diaminopropionsäuremethylester
2, 3-Diaminopropionsäuremethylester Dihydrochlorid (1.2 q, 6.31 mmol) wird in 1, 4-Dixan/Wasser (40 ml, 1:1) gelöst und
mit Triethylamin (4.4 ml, 31.61 mmol) versetzt. Anschließend gibt man Di-tert-butyl dicarbonat (3.0 g, 13.78 mmol) zu und läßt über Nacht rühren. Man gibt Essigsäureethylester (100 ml) und 1 N HCl (100 ml) zu der Reaktionsmischung. Die organische Phase wird mit ges. NaCl-Lösung gewaschen (2 x 100) und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Man entfernt das Lösungsmittel und reinigt den Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (EtOAc/Hexan 1:3). Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 1.83 g (91 %)
1H NMR (250 MHz, D6-DMSO) : δ = 1.36 (br. s, 18H, Boc-H) ,
3.20-3.25 (m, 2H) , 3.59 (s, 3H, OCH3) , 4.03 (t, J = 7.0 Hz,
CH), 6.78 (br. t, NH) , 6.98 (d, J = 7.6 Hz, NH) .
13C NMR (63 MHz, D6-DMSO) : δ = 28.10, 40.97, 52.39, 61.24,
77.52, 77,58, 155.15, 155.84.
ESI-MS: [M+Na+] 341.1; [M+H+] 319.1
Methode: E. B. van der Toi, H. J. van Ramesdonk, J. W. Verhoeven, F. J. Steemers, E. G. Kerver, W. Verboom, D. N. Reinhoudt, Chem. Eur. J. 1998, 4, 2315-2323.
- N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2 ,3-diaminopropanol
N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2, 3-diaminopropionsäuremethylester (1.5 g, 4.70 mmol) wird in trockenem THF (30 ml) gelöst. Bei 0 °C gibt man portionsweise einen Überschuß Lithiumaluminiumhydrid (150 mg) zu und läßt 2 h bei Raumtemperatur rühren. Die Reaktionsmischung wird auf 0 °C gekühlt und durch Zugabe von Wasser hydrolisiert. Man extrahiert mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht
mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml). Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und der Rückstand an Kieselgel mit Hexan/EtOAc (1:1) chromatographiert. Der Alkohol wird als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 966 mg (70 %)
1H NMR (250 MHz, D6-DMS0) : δ = 1.37 (br. s, 18H, Boc-H) #
2.94-3.06 ( , 2H) , 3.30 (dd, J = 5.5 Hz, J = 9.5 Hz, 2H) ,
3.40-3.46 (m, 1H, CH) , 4.50 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 6.23
(br. d, 1H, NH) , 6.57 (br. t, 1H, NH) .
13C NMR (63 MHz, D6-DMSO) : δ = 28.10, 40.97, 52.39, 61.24,
77.52, 77.58, 155.15, 155.84.
ESI-MS: [M+Na+] 312.9; [M+H+] 290.9
- N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2,3-diaminopropyl-maleinimid
N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2, 3-diaminopropanol (400 mg, 1.38 mmol) wird in trockenem THF gelöst und mit Triphenylphosphin (398 mg, 1.52 mmol) und Maleinimid (148 mg, 1.52 mmol) versetzt. Anschließend gibt man tropfenweise DEAD (0.26 ml, 1.67 mmol) zu und läßt 24 h bei Raumtemperatur rühren. Das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt und der Rückstand zweimal an Kieselgel mit Hexan/EtOAc 2:1 chromatographiert. Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff, jedoch nicht rein erhalten. Auch eine Trennung mittel HPLC brachte nicht den gewünschten Erfolg.
Ausbeute: 50 mg
ESI-MS: [2M+Na+] 761.2; [M+Na+] 392.0; [M+H+] 370.1.
IH NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 1.39 (br. s, 9H, Boc-H)^.1.44
(br. s, 9H, Boc-H), 3.22 (t, J = 5.9 Hz, 2H) , 3.61 (d, J =
6.6 Hz, 2H) , 3.80-3.88 (m, IH) , 5.00-5.15 (m, 2H, NH) , 6.72 (s, 2H) .
Mitsunobu-Reaktionen mit Maleinimid:
M. A. Walker, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 665-668.
M. A. Walker, J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5355.
M. A. Walker, Tetrahedron 1997, 53, 14591-14598.
K. I. Booker-Milburn, C. E. Anson, C. Clissold, N. J. Costin,
R. F. Dainty, M. Murray, D. Patel, A. Sharpe, Eur. J. Org.
Chem. 2001, 1473-1482.
Mitsunobu-Reaktionen mit Scavenger-Reagenzien:
L. D. Arnold, H. I. Assil, J. C. Verderas, J. Am. Chem. Soc.
1989, 111, 3973-3976.
Kommerziell erhältliche Maleimidderivate, die in der Diels- Alder Reaktion erfolgreich eingesetzt wurden:
N-Ethylmaleinimid
Beispiel 10: Diels-Alder-Reaktionen
Alle gezeigten Verbindungen wurden nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt und per HPLC gereinigt. Sie wurden mindestens durch ESI-Massenspektren, häufig zusätzlich durch NMR (4.- und 13C) charkterisiert.
Allgemeine Vorschrift:
Das Furan-Derivat wird mit dem entsprechenden Maleinimid- Derivat in Wasser oder wenn nötig in einem Gemisch aus THF/Wasser (5:2) gelöst und mehrere (2-4) Tage bei 50 °C gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel i. Vak. entfernt und der Rückstand an Kieselgel (CH2Cl2/MeOH 5:1) aufgereinigt. Die entsprechenden Diels-Alder Addukte wurden als Gemische der exo-/endo- erhalten und konnten zum Teil aufgetrennt werden.
- Synthetisierte Diels-Alderprodukte mit N-Ethylmaleinimid als Dienophil:
Ri / R2 : Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose
Ri / R2 : H/H; H/Galactose; H/Fucose; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose, Lactose/Lactose
Ri / R2 : ; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose
Ri / R
2 : ; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose
Ri / R2 / R3 : ; Fucose/Fucose/Fucose
- Synthetisierte Diels-Alderprodukte mit Biotin-Maleinimid als Dienophil :
Ri / R2 : Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose
Verbindungen mit Biotin-Maleinimid eignen sich besonders zur Aufklärung von zellulären Oberflächenstrukturen und deshalb für die Diagnostik und Therapie .
- Andere synthetisierte Diels-Alderprodukte :
Acrylamid als Dienophil
Ri / R2 : Fucose/Fucose
- Einführung von Carboran-derivatisiertes Furan und N- Ethylmaleinimid
- Diels-Alder Reaktion mit Nukleosiden (Als Beispiel für Diels-Alder-Reaktion an Oligonukleotiden, DNA)
Trimethoxyphenylmaleinimid (potentielle Wirkstoffe, P53)
Bromphenylmaleinimid (potentielle Wirkstoffe, P53)
Diese Reaktion wurde auch mit zweifach Fucosylierten oder galactosylierten 3,4- und 2, 5-Bishydroxymethylfuranen erfolgreich durchgeführt.
Bei beiden vorstehenden Verbindungen ist ein kombinatorischer Ansatz erfolgt. So lassen sich durch Kombination verschiedenartig glycosylierter Furane mit unterschiedlich subtituierten Maleinimiden kleinere Bibliotheken neuartiger, potentieller Arzneimittel, z.B. als Modulatoren von/für p53 herstellen.
- Diels-Alder-Produkt mit MaleiSäureanhydrid
Rι/R2 : Fucose/Fucose
Und ein Derivat davon :
Bei den folgenden vier Reaktionen wurde als Furanderivat das 2-Glucosylmethyl-5-hydroxymethlfuran eingesetzt .
Ansatz: 240 mg (0.82 mmol) Furan
530 mg (1.13 mmol) N-Cholesteryl-fαaleinimd Ausbeute: 250 mg (44 %) ESI-MS: [M+C1-] 792.7
- Dodecan (lipophiler Rest)
Ansatz: 200 mg (0.69 mmol) Furan
365 mg (1.38 mmol) N-Dodecyl-maleinimid Ausbeute: 210 mg (55 %) ESI-MS: [M+Na+] 578.0
- Sterylrest (lipophiler Rest)
Ansatz: 200 mg (0.69 mmol) Furan
300 mg (0.86 mmol) N-Stearyl-maleinimid Ausbeute: 230 mg (52 %) ESI-MS: [M+C1-] 674.5
Anilinlost (analog Glu-IPM)
Ansatz: 100 mg (0.34 mmol) Furan
215 mg (0.68 mmol) Anilin-N-Lost 7irιaleinimid Ausbeute: < 50 mg ESI-MS: [M+Na+] 625.0
Beispiel 11: Diels-Alder-Reaktion mit einer Aminosäure (Lysin)
2-tert-Butoxycarbonylamino-6- [3, -dioxo-8, 9-bis- (3,4,5- trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxymethyl)-10-oxa-4- aza-tricyclo [5.2.1.02, 6]dec-4-yl]-hexanoic acid (3): Zu einer Lösung von 0,042 g (0,1 mmol) 1 in 3ml Wasser, welches auf pH=6,9 eingestellet ist, werden 0,033 g (0,1 mmol) 2 (nach der Vorschrift [1] hergestellt) hinzugegeben und anschliessend 4 Tage bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Gefriertrocknung entfernt und das weisse Rohprodukt (0,075 g) mittels präparativer HPLC aufgereinigt.
Es werden dabei 12 mg und 16 mg zweier Konformerer erhalten.Gesamtausbeute 40%. ESI-MS: 647,2 [ (MH-Boc)+H]+, 669,1 [ (MH-Boc)+Na]+ , 769,2 [M+Na]+, 1293., 3 [2 (MH-Boc) +H]+, 1315,4 [2 (MH-Boc) +Na]+
HPLC: Abimed. : analytisch: Merck Lichrospher-RPl8 (E) 5μ, (250x4) mm,
Wasser :CH3CN (100:0)% Grad 40 min 100% CH3CN, 1 ml/min Fluss, detektion bei 210 n präparativ: Merck Lichrospher-RPlδ (E) 5μ, (250x25) mm,
Wasser:CH3CN (100:0)% Grad 45 min 25% CH3CN, 10 ml/min Fluss,
Detektion bei 210 nm