DE10104389A1 - Multimere Photosensibilisatoren sowie deren Konjugate für die PDT - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind Konjugate, bestehend aus angiogenese-spezifischen Antikörpern und einem multimeren Photosensibilisatormolekül. Die Erfindung umfaßt im speziellen Proteine, Antikörper und deren Fragmente, die mit einem dendrimeren Multiplikator konjugiert sind, an welchen schließlich mehrere Photosensibilisatoren gekoppelt sind.

Description

Die Erfindung betrifft multimere Photosensibilisatoren sowie deren Konjugate mit Biomolekülen für die Photodynamische Therapie (PDT), wie sie in den Patentansprüchen definiert sind.

Die Photodynamische Therapie (PDT) stellt für unterschiedliche Karzinome (z. B. Bronchialkarzinom, Mesotheliome, Blasenkarzinom, Gehirntumoren, Mammakarzinom-metastasen, Ösophagus-, Magen-, Kolon-, Gallengangskarzinom) eine effektive Therapieform dar. Dabei werden Photosensibilisatoren intravenös oder durch topische Gabe verabreicht. Zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Verabreichung wird dann die PDT durchgeführt. Durch Einstrahlung von Licht, das durch den Photosensibilisator absorbiert wird, erfolgt eine elektronische Aktivierung und schließlich die Erzeugung von Singulettsauerstoff. In nachfolgenden photochemischen und chemischen Reaktionen können dann zytotoxische Sauerstoffradikale und in geringerem Ausmaß freie Radikale gebildet werden. Sowohl der Singulettsauerstoff wie auch die gebildeten Radikale führen durch direkte oder indirekte Wirkung zu einer Nekrose und Zerstörung des bestrahlten Gewebes. Da es sich um eine lokale Aktivierung handelt, resultieren wesentlich geringere systemische Nebenwirkungen als bei der Chemo- oder Radiotherapie.

Die bekanntesten Photosensibilisatoren sind Verbindungen aus der Klasse der Tetrapyrrole. Obwohl diese Verbindungen keine "aktive" selektive Akkumulation im Tumorgewebe aufweisen, kann doch wegen des unterschiedlichen Metabolismus in gesunden und tumorösen Zellen für einige dieser Verbindungen in bestimmten Zeitintervallen eine erhöhte Anreicherung im Tumorgewebe im Vergleich zu dem Umgebungsgewebe festgestellt werden. Photofrin® war der erste Photosensibilisator im klinischen Einsatz (1. Generation). In der Gastroenterologie wird er zur Therapie des Ösophaguskarzinoms, des Barrettösophagus und des Gallengangkarzinoms eingesetzt (Overholt BF et al. Gastrointest Endosc 1999; 49: 1-7). Nachteile für den klinischen Einsatz von Photofrin sind neben der Tatsache, daß es sich um ein in seiner Zusammensetzung schwer reproduzierbares Porphyringemisch handelt, dessen aktive Komponente bisher nicht eindeutig bestimmt werden konnte, vor allem die allen Porphyrinen eigene geringe Absorption im roten Bereich des Spektrums (molarer Absorptionskoeefizient ε < 5000 Mol^-1cm^-1, 630 nm), sowie die Hautsensibilisierung über einen Zeitraum von 4-6 Wochen.

Photosensibilisatoren der 2. Generation, z. B. Phorbide, Chlorine oder expandierte Porphyrine, besitzen vorteilhaftere Eigenschaften. Zur Zeit wird das artifizielle Meta- Tetrahydroxyphenylchlorin (mTHPC, Foscan®) in mehreren Studien erprobt (Ris HB et al. Lasers Surg Med 18 (1996) 39-45). Neben der Tatsache, daß m-THPC verbesserte photophysikalische Parameter aufweist (ε ≈ 40000 Mol^-1cm^-1, 652 nm), läßt es sich rein und einheitlich herstellen. Aufgrund des hohen Absorptionskoeffizienten ist zur Erreichung der gleichen Tumornekrose mit m-THPC eine geringere Dosierung (Energiedosis 10 J/cm² gegenüber 100 J/cm² bei dem Hämatoporphyrinderivat Photofrin®) erforderlich als mit den Photosensibilisatoren der 1. Generation. Ein weiterer Vorteil ist die geringere Photosensibilisierung der Haut (bis zu 10 Tagen). Von den Phorbiden, Derivaten des natürlich vorkommenden Chlorophylls, erwies sich Phäophorbid a als besonders effizient mit einem Absorptionsmaximum bei 670 nm und einem molaren Absoprtionskoefflzienten um 40000 Mol^-1cm^-1. Seine photodynamische Wirksamkeit wurde sowohl in vitro (Segelman AB et al. SPIE Proc. (1987) 847: 205-209) als auch in vivo (Beider B et al. Biophys Chem (1990) 35: 303-312) nachgewiesen.

Um eine möglichst selektive therapeutische Wirkung des Sensibilisators zu erzielen, ist ein signifikantes Konzentrationsgefälle an Photosensibilisator zwischen gesundem und zu behandelndem Gewebe ausschlaggebend. Im Idealfall soll sich in gesundem Gewebe kein Sensibilisator einlagern. Der Nachteil der o. g. Verbindungen der 1. und 2. Generation besteht jedoch darin, daß dieses Konzentrationsgefälle nicht durch ein aktives Anreicherungsverhalten zustande kommt und daher oftmals unzureichend ist. Mit dem Ziel einer Erhöhung der Selektivität von Photosensibilisatoren werden verschiedene Strategien verfolgt (3. Generation), z. B. durch Photosensibilisatorkonjugate mit hoher Affinität zu einem spezifischen Target an der Zielzelle (Akhlynina TV et al. Cancer Res (1995) 55: 1014-1019) oder durch Kopplung an geeignete Trägermoleküle, die bevorzugt in diesen Zellen akkumulieren. Beispiele sind Liposomen und Lipoproteine, Antikörperkopplungen und Cyclodextrinverkapselungen, Insulinkomplexe oder die Verwendung von Fluorocarbon-Emulsionen (Zhou CH et al. Photochem Photobiol 1988; 48: 487-492; Maziere JC et al. J Photochem Photobiol 9991) 8: 351-360; Oseroff AR et al. Photochem Photobiol (1987) 46: 83-96; McPerson AM et al. Abstr 4^th Congress EP Amsterdam 1991; A62-S81). Der Nachteil dieser Lösungen besteht darin, daß große Trägermoleküle benötigt werden, um eine kleine Zahl von Photosensibilisatormolekülen an das Zielgewebe zu bringen.

Daher befaßten sich verschiedene Arbeiten mit dem Konzept multimerer Photosensibilisatoren, bei welchem mehrere Photosensibilisatormoleküle über Multiplikatormoleküle an ein Trägermolekül gekoppelt sind. Beispiele sind das Konzept des "Polyphasic Tumor Targeting" (Moser JG et al. SPIE Proc 1994; 2325: 92-99), bei welchem monoklonale Antikörper als Trägersystem und ein Avidin-Biotin-Komplex als Vervielfältigungseinheit dienen. Kritisch ist hier, daß man mehrere Moleküle als Wirkstoffe zu entwickeln hat und die Verwendung höherer Mengen an Avidinkomplexen Immunreaktionen hervorrufen kann.

Als weiteres Beispiel wurden dendrimere Moleküle auf ihre Eignung als Multiplikatoren im Rahmen des modularen Trägermolekül-Konzeptes untersucht (Patentanmeldung DE 199 36 997.6). Der Vorteil solcher Multimere besteht darin, daß eine Abspaltung der Photosensibilisatormoleküle vom Dendrimer auftritt. Die Abspaltung erfolgt licht-induziert, enzymatisch oder chemisch. Dadurch kann eine große Anzahl von Photosensibilisatormolekülen durch eine Trägereinheit direkt an das Zielgewebe gebracht werden und dort unter Lichteinwirkung frei gesetzt werden. Die bisher beschriebenen Moleküle weisen allerdings keine spezifische Affinität zu tumorassoziierten pathogenen, molekularen Strukturen auf. Es ist bisher auch nicht beschrieben, wie derartige dendrimere Moleküle an Biomoleküle wie z. B. Peptide, Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Oligonukleotide gekoppelt werden könnten.

Die Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue multimere Photosensibilisatoren bereitzustellen, die sich leicht an Biomoleküle wie Peptide, Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Oligonukleotide koppeln lassen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Konjugate aus Biomolekülen und multimeren Photosensibilisatoren bereitzustellen, die eine spezifische Affinität zu tumorassoziierten pathogenen, molekularen Strukturen aufweisen und daher zur Herstellung von Mitteln für die Photodynamische Therapie besonders gut geeignet sind. Insbesondere werden therapeutische Mittel für die PDT gesucht, welche zur Behandlung von Tumoren, Tumormetastasen und Tumorvorstufen, wie Dysplasien, insbesondere des Gastrointestinaltraktes, des Hals/Kopfbereiches, der Blase, des Zervix und der Haut geeignet sind. Außerdem werden Mittel zur Behandlung nicht-onkologischer Erkrankungen gesucht, in denen Gefäßneubildung (Angiogenese) vorliegt, wie z. B. bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) oder bei Retinopathien.

Die genannte Aufgabe wird durch die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gelöst:

K-L-A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (I)

worin
K eine reaktive Gruppe darstellt,
L für eine direkte Bindung oder eine Linkerstruktur steht,
A einen stickstoffhaltigen Kaskadenkern der Basismultiplizität a darstellt,
X und Y unabhängig voneinander für eine direkte Bindung oder für eine Kaskadenreproduktionseinheit der Reproduktionsmultiplizität x bzw. y stehen,
Z eine Kaskadenreproduktionseinheit der Reproduktionsmultiplizität z darstellt,
W für eine direkte Bindung oder eine Linkerstruktur steht,
a eine Zahl 2 bis 8 darstellt,
x, y, und z jeweils für eine Zahl 1 bis 4 stehen,
und PS für ein Photosensibilisatormolekül steht.

Die Verbindungen enthalten eine reaktive Gruppe K, die mit einer Aminogruppe oder Thiolgruppe der Aminosäuren in den Biomolekülen eine Amid- oder Thioetherbindung eingehen kann. Diese reaktiven Gruppen K sind beispielsweise eine Carboxylgruppe, eine aktivierte Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, ein Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester, ein Carbonsäure-p- nitrophenylester, ein Carbonsäurepentafluorphenylester, ein Carbonsäure-(sulfo)-N- hydroxysuccinimidylester, ein Bis(carboxymethyl)amin-anhydrid, ein Isothiocyanat, ein Maleinimid, ein Bromalkyl, ein Bromacetyl, ein Bromacetamid, ein Iodalkyl, ein Iodacetyl oder ein Iodacetamid.

Die Linkerstruktur L steht für eine direkte Bindung oder für eine geradkettige oder verzweigte C₁-C₂₀-Alkylenkette oder eine zyklische oder teilweise zyklische C₅-C₂₀-Alkylenkette, die gegebenenfalls durch 1 bis 5 Sauerstoffatome, 1 bis 3 Stickstoffatome und/oder 1 bis 3 Schwefelatome unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Oxogruppen und/oder 1-3 Carboxygruppen substituiert ist, und gegebenenfalls 1 bis 5 Amidbindungen enthält.

Bevorzugt steht L für eine der Strukturen
α-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂ NH-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂ NH-(CO)-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β oder
α-CH₂-CH₂-CH₂ NH-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
worin α die Bindung zur reaktiven Gruppe K und β die Bindung zum Kaskadenkern A darstellt.

Der Aufbau von Kaskadenstrukturen wird ausführlich in DE 195 49 286 beschrieben. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) unterscheiden sich jedoch dadurch von den in DE 195 49 286 beschriebenen Verbindungen, daß eine Multiplizität des Kaskadenkerns A für eine Bindung zur reaktiven Gruppe K (gegebenenfalls über die Linkerstruktur L) genutzt wird.

Bevorzugt sind solche Moleküle, in denen A für ein Stickstoffatom oder eine der folgenden Strukturen steht:

worin
U₁ für ein Wasserstoffatom oder eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X steht,
U₂ für eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X steht,
U₃ für eine direkte Bindung zur Linkerstruktur L oder der reaktiven Gruppe K steht,
M für eine C₁-C₁₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder gegebenenfalls mit 1 bis 2 Oxogruppen substituiert ist.

Die Kaskadenreproduktionseinheiten X, Y und Z stehen unabhängig voneinander für eine der folgenden Strukturen:
#-CH₂-[CH₂]_n-NH-* mit n = 1 bis 5;
#-CH₂-[CH₂]_n-N<* mit n = 1 bis 5;
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄ N<*;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)-CH₂-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-NH-*;
#-(CO)-CH₂CH₂N<*;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)CH₂CH₂(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-CH(NH-*)-CH(COOH)-NH-*;
#-(CO)-CH(NH-*)-CH(COOH)-N<*;
worin # die Bindung zu A, X oder Y und * eine Bindung zu Y, Z oder W symbolisiert.

Die Linkerstruktur W steht für eine direkte Bindung oder für eine geradkettige oder verzweigte C₁- C₁₀-Alkylenkette oder eine zyklische oder teilweise zyklische C₅-C₂₀-Alkylenkette, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen ist und/oder gegebenenfalls mit 1 bis 2 Oxogruppen substituiert ist und/oder 1 bis 3 Amidbindungen enthält.

Die Photosensibilisatoren PS sind bevorzugt Tetrapyrrole wie z. B. Porphyrine, Benzoporphyrine, Chlorine, Chlorophyllderivate, Phorbide oder Phthalocyanine, welche entweder eine um eine Hydroxygruppe verminderte Carboxylgruppe oder eine um ein Wasserstoffatom verminderte Aminogruppe enthalten, an die W bindet. Unter den Chlorinen sind Chlorin e6 oder Zinn(IV)chlorin e6 besonders geeignet. Unter den Phorbiden sind Phäophorbide und Pyrophäophorbide besonders geeignet. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, die genau eine aktivierte funktionelle Gruppe enthalten, welche eine gerichtete Kopplung unter Ausbildung definierter Verbindungen erlaubt, wie z. B. Phorbidderivate und Benzoporphyrinderivate. Beispielsweise wird Phäophorbid a vor der Kopplung an W in den entsprechenden N- Hydroxysuccinimidester überführt (siehe nachfolgende Synthesebeispiele).

Die multimeren Photosensibilisatoren der allgemeinen Formel (I) enthalten vorzugsweise 2 bis 64 Photosensibilisatormoleküle PS, bevorzugt 2 bis 32 Photosensibilisatormoleküle PS, besonders bevorzugt 2 bis 16 Photosensibilisatormoleküle PS.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen
K für ein Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester, ein Carbonsäure-(sulfo)-N- hydroxysuccinimidylester, ein Bromalkyl, ein Bromacetyl oder ein Bromacetamid steht,
L für eine der Strukturen
α-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β oder
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-β steht,
worin α die Bindung zur reaktiven Gruppe K und β die Bindung zum Kaskadenkern A darstellt,
A für eine der folgenden Strukturen steht:

worin
U₁ für ein Wasserstoffatom, U₂ für eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X und U₃ für eine direkte Bindung zur Linkerstruktur L steht,
X und Y unabhängig voneinander für eine direkte Bindung oder für eine der Strukturen
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄ N<* oder
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂ stehen,
Z für eine der Strukturen
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄-N<* oder
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂ steht,
worin # die Bindung zu A, X oder Y und * eine Bindung zu Y, Z oder W symbolisiert,
W für eine direkte Bindung steht,
a eine Zahl 2 bis 8 darstellt,
x, y, und z jeweils für eine Zahl 1 bis 4 stehen,
und PS für ein Chlorophyllderivat, ein Benzoporphyrin, ein Chlorin oder ein Phäophorbid steht, welche entweder eine um eine Hydroxygruppe verminderte Carboxylgruppe oder eine um ein Wasserstoffatom verminderte Aminogruppe enthalten, an die W bindet.

Die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) erfolgt in der Regel so, daß ein stickstoffhaltiger Kaskadenkern, zum Beispiel 1,4,7-Triazaheptan oder 1,4,7,10-Tetraazododecan, welcher mit geeigneten Schutzgruppen, vorzugsweise Benzyloxycarbonyl, versehen ist, in Derivate überführt wird, die ein ungeschütztes Stickstoffatom enthalten. Dieses Stickstoffatom wird mit Reagenzien zum Aufbau der Linkerstruktur L oder eines Teilfragments der Linkerstruktur L umgesetzt. Beispiele für solche Reagenzien sind Bernsteinsäureanhydrid, Diglykolsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid.

Im nächsten Schritt erfolgt die Freisetzung der geschützten Aminogruppen durch Abspaltung der Schutzgruppen und die Verknüpfung mit der folgenden Kaskadenreproduktionseinheit. Dieser Schritt kann gegebenenfalls ein- bis dreimal unter Ausbildung der gewünschten Kaskadenmultiplizität wiederholt werden. Auf jeder Reproduktionsstufe kann nach Freisetzung der Aminogruppen der Kaskadenaufbau beendet werden, und die Aminogruppen können mit der Anzahl von Photosensibilisatoren, die der Anzahl der freien Aminogruppen entspricht, verknüpft werden. Dazu werden bevorzugt Photosensibilisatoren mit aktivierten Carboxylgruppen, beispielsweise Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester oder Carbonsäure-p-nitrophenylester, oder aktivierten Aminogruppen, beispielsweise Isothiocyanat, eingesetzt. Alternativ können die Aminogruppen mit einer Reproduktionseinheit, die bereits zwei bis vier Photosensibilisatormoleküle enthält, umgesetzt werden. Bevorzugt wird ein Lysin mit zwei Photosensibilisatormolekülen und einer aktivierten Carboxylgruppe verwendet.

Nach dem Aufbau der Kaskade mit Photosensibilisatormolekülen erfolgt gegebenenfalls eine Derivatisierung des Linkers, und im letzten Schritt die Aktivierung des Linkers zum Erhalt der beschriebenen Strukturen gemäß allgemeiner Formel (I). Dazu werden Linker, die eine Carboxylgruppe enthalten, d. h. Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

L'-A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (II)

in der L' für einen Rest L-COOH steht und die Variablen L, A, X, Y, Z, W, PS, z, y, x und a die oben angegebene Bedeutung haben, durch Umsetzung zu Reaktivestern aktiviert (siehe Houben- Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Band E 5 (1985), 633). Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid, Sulfo-N- Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Pentafluorphenol unter Erhalt einer Carbonsäure-N- hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Carbonsäure-(sulfo)-N-hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Carbonsäure-p-nitrophenylestergruppe oder Carbonsäurepentafluorphenylestergruppe.

Bei Linkern, die eine Aminogruppe enthalten, d. h. bei Verbindungen der allgemeinen Formel (III)

L"A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (III)

in der L" für einen Rest L-NH₂ steht und die Variablen L, A, X, Y, Z, W, PS, z, y, x und a die oben angegebene Bedeutung haben, wird diese Aminogruppe zu einer Isothiocyanatgruppe umgesetzt, oder durch Reaktion mit α-Halogenessigsäurehalogenid in eine Bromacetamid- oder Iodacetamidgruppe überführt. Linker mit einer Aminogruppe werden auch mit reaktiven Carboxyalkylmaleimiden zu Maleimidoalkylaminocarbonylgruppen umgesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Konjugate aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten und Oligonukleotiden.

Bevorzugt werden monoklonale Antikörper (wie z. B. Immunglobuline) sowie deren Fragmente (F(ab), F(ab')₂) oder rekombinante Antikörper verwendet, welche nach dem Prinzip des "engeneering of antibodies" hergestellt werden. Dabei bedeutet F(ab) ein Fragment des Immunoglobins, welches bei der protolytischen Spaltung mit Papain entsteht. Es besteht aus einer leichten Kette, welche über eine Disulfid-Brücke mit einem Teil der schweren Kette verbunden ist. Es besitzt eine einzige Antigen-bindende Stelle. F(ab')₂ bedeutet ein Fragment des Immunoglobins, welches bei der protolytischen Spaltung mit Pepsin entsteht. Es besteht aus zwei leichten Ketten und dem variablen Teil, zuzüglich einer konstanten Region von zwei schweren Ketten, d. h. es besitzt zwei Antigen-bindende Stellen. Rekombinante Antikörper sind z. B. scFv, Diabodies oder Minibodies. Dabei steht scFv für ein Antikörperfragment, bei dem die variablen Regionen einer schweren und einer leichten Kette über ein synthetisches Linkerpeptid miteinander verbunden sind. Ein Diabody ist ein bispezifischer rekombinanter Antikörper, der aus zwei verschiedenen kovalent oder nicht-kovalent miteinander verbundenen scFv besteht. Ein Minibody ist ein scFv-CH3- Fusionsprotein, welches sich selbstständig zu einem bivalenten Dimer assoziiert.

Besonders geeignet sind solche Moleküle, die spezifisch an Rezeptoren für vaskuläre Wachstumsfaktoren, Rezeptoren auf Endothelzellen, an Entzündungsmediatoren oder an Matrixmoleküle und Matrixproteine, die spezifisch bei der Gefäßneubildung exprimiert werden, binden. Dabei sollte die Bindungskonstante im mikromolaren bis nanomolaren Bereich liegen.

Besonders bevorzugt sind Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen das Matrixprotein ED- B-Fibronektin gerichtet sind. ED-B-Fibronektin, auch als onkofetales Fibronektin bekannt, ist eine Splicevariante des Fibronektins, das spezifisch während der Angiogenese exprimiert wird. Das Antikörperfragment L19, welches gegen die Extradomäne B des ED-B-Fibronektins gerichtet ist, wurde bereits eingehend untersucht (VIII F et al. Cancer Res (1999) 59: 347-352). Da L19 an einen für die Angiogenese spezifischen Marker bindet, sind L19-Photosensibilisator(L19-PS)- Konjugate für die Behandlung von Krankheiten geeignet, in denen die Neubildung von Blutgefaßen, die als Angiogenese bezeichnet wird, involviert ist. Eine weitere Voraussetzung für eine Therapie mit L19-PS-Konjugaten ist die Zugänglichkeit des pathogenen Gewebes für Licht. Dazu gehören Tumoren, Tumormetastasen und Tumorvorstufen, wie Dysplasien, insbesondere des Gastrointestinaltraktes, des Hals/Kopfbereiches, der Blase, des Zervix, des Auges und der Haut. Die Gefäßneubildung im ocularen Bereich spielt bei vielen Krankheiten eine große Rolle, wie z. B. bei der diabetischen Retinopathie, der Frühgeborenen-Retinopathie, der altersbedingten Makuladegeneration, bei Hornhautverätzungen, bei der Infektion von Bindehaut und Hornhaut, der Myopie und der Neovaskularisation der Iris auf Grund von Diabetes mellitus.

Konjugate von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit Biomolekülen wie z. B. Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten und Oligonukleotiden lassen sich leicht herstellen, indem man die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit den Biomolekülen zur Reaktion bringt, wobei sich zwischen den Biomolekülen und den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Amid- bzw. Thioetherbindungen ausbilden. In den nachfolgenden Beispielen wird dies detailliert beschrieben.

Die theoretisch mögliche Anzahl an Verbindungen der allgemeinen Formel (I), die an ein Biomolekül geknüpft sind, wird durch die Anzahl der möglichen Reaktionsstellen im Biomolekül bestimmt. Im Fall von Dendrimeren, die eine gegenüber Aminogruppen reaktive Gruppe enthalten, werden Lysine des Biomoleküls unter Erhalt von Amidbindungen zur Reaktion gebracht. Bei mehreren Lysinen ist daher das tatsächlich erreichte molare Verhältnis zwischen Dendrimer und Biomolekül durch die Reaktionsführung bestimmt und die Verteilung der Reaktionsprodukte statistisch. Im Fall von Dendrimeren mit gegenüber Cysteinen (Thiolgruppen) reaktiven Gruppen wird die Zusammensetzung ebenfalls durch die Anzahl von Cysteinen im Biomolekül bestimmt, jedoch sind Cysteine in der Regel in geringerer Anzahl vertreten oder können selektiv aus Disulfldbrücken durch Reduktion freigesetzt werden. In rekombinant hergestellten Biomolekülen kann gezielt ein Cystein an eine definierte Position in der Sequenz kloniert werden. Das resultierende Konjugat ist dann strukturell eindeutig definiert.

Für die Therapie von Krankheiten mit multimeren Photosensibilisatoren bzw. deren Konjugaten mit Biomolekülen werden 0,1-10 mg/kg des Konjugats in den Patienten injiziert. Nachdem sich das Konjugat im Zielgewebe angereichert hat (nach ca. 3 bis 96 Stunden) wird das krankhafte Gewebe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, welche durch das Absorptionsspektrum des PS festgelegt wird (600-800 nm) und einer Energiedosis von 1-400 J/cm² bestrahlt. Die maximale Wellenlänge ist je nach verwendetem Photosensibilisatormolekül verschieden und beträgt z. B. für Phäophorbid a 670 nm, für Benzoporphyrine 690 nm, für Zinn(IV)-chlorin e6 630 nm, für Chlorin e6 665 nm und für Porphyrine 630 nm. Die Energiedosis hängt sowohl vom verwendeten Photosensibilisator als auch von der bestrahlten Gewebeart ab. Durch die Bestrahlung werden im bestrahlten Gewebe Singulett-Sauerstoff und Radikale erzeugt, welche dann zytotoxische Reaktionen auslösen.

Die nachfolgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung.

Synthesebeispiele Beispiel 1 Synthese eines dendrimeren Bausteins mit 4 Phäophorbid a-Molekülen und einer als NHS- Ester aktivierten Carboxylgruppe zur Kopplung an Biomoleküle a) 1,7-Bis-(benzyloxycarbonyl)-4-hydroxysuccinyl-1,4,7-triazaheptan

Die Synthese erfolgt ausgehend von 1,7-Bis-(benzyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan wie in DE 195 49 286 (darin Beispiel 1d und 5a) beschrieben.

b) 4-Hydroxysuccinyl-1,4,7triazaheptan dihydrochlorid

Eine Lösung von 5 g (13,5 mmol) 1,7-Bis-(benzyloxycarbonyl)-4-hydroxysuccinyl-1,4,7- triazaheptan (Beispiel 1a) und 13,5 ml Salzsäure (1 M) in 200 ml Methanol werden mit 500 mg Pd/C-Katalysator (10-proz.) versetzt und 16 h unter Normalbedingungen hydriert. Der Katalysator wird durch Filtration abgetrennt und die Lösung eingeengt. Nach Umkristallisation des Rückstandes aus Ethanol/Diethylether erhält man das Produkt als farblosen Feststoff;
Ausbeute: 3,56 g (96%).
Elementaranalyse:
berechnet: C 34,79, H 6,93, N 15,22,
gefunden: C 34,93, H 7,08, N 15,02.

c) 1,7-Bis-(N,N'-dibenzyloxycarbonyl-lysyl)-4-hydroxysuccinyl-1,4,7-triazaheptan

In Anlehnung an Beispiel 1b in DE 195 25 924 werden 3,5 g (12,7 mmol) 4-Hydroxysuccinyl- 1,4,7-triazaheptan dihydrochlorid (Beispiel 1b) und 4,5 g (44,5 mmol) Triethylamin in DMF gelöst, mit 17,0 g (31,8 mmol) N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-Lysin-p-nitrophenylester (Bachem) versetzt und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen, mit verdünnter Salzsäure ausgeschüttelt und die organische Phase nach Trocknung über Natriumsulfat eingedampft. Das Rohprodukt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt (Stufengradient Ethylacetat/Ethanol); Ausbeute: 7,58 g (60%).
Elementaranalyse:
berechnet: C 62,70, H 6,58, N 9,84,
gefunden: C 62,87, H 6,75, N 9,74.

d) 1,7-Bis-lysyl-4-hydroxysuccinyl-1,4,7-triazaheptan

7,50 g (7,53 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1c und 7,53 ml Salzsäure (1 M) werden in 120 ml Methanol mit 500 mg Pd/C-Katalysator (10-proz.) hydriert und das Produkt wie in Beispiel 1b beschrieben isoliert; Ausbeute: 4,47 g (98%) als farbloser Feststoff.
Elementaranalyse:
berechnet: C 39,68, H 7,49, N 16,19,
gefunden: C 39,45, H 7,34, N 16,37.

e) Darstellung von Phäophorbid a-N-hydroxysuccinimidylester (PhäoA-NHS-Ester)

Phäophorbid a wird nach Segelman AB et al., SPIE Proc. (1987) 847: 205-209 als Naturstoff gewonnen. 1,0 g (1,68 mmol) Phäophorbid a und 0,6 g (5,2 mmol) N-Hydroxysuccinimid in 20 ml Dichlormethan werden mit einer Lösung von 1,08 g (5,2 mmol) Dicyclohexylcarbodiiniid in 10 ml Dichlormethan versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 h bei 40°C unter Lichtausschluß gerührt. Das Produkt wird durch Zugabe von Diethylether/Hexan (1 : 1) ausgefällt und durch wiederholte Umfällung aus Dichlormethan/Hexan gereinigt. Ausbeute: 1,14 g (98%) eines grünen Feststoffes.
Elementaranalyse:
berechnet: C 67,71, H 5,97, N 10,12,
gefunden: C 67,86, H 5,94, N 10,31.

f) Darstellung eines PhäoA-Multimers aus 4 PhäoA-Molekülen und der Titelverbindung aus Beispiel 1d)

100 mg (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d und 130 mg (1,0 mmol) Diisopro­ pylethylamin (DIEA) werden in 1 ml DMF gelöst, mit einer Lösung von 0,94 g (1,36 mmol) PhäoA-NHS-ester (siehe Beispiel 1e) in 1 ml DMF versetzt und 24 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Anschließend werden ca. 20 ml Diethylether zugesetzt, der ausfallende Feststoff wird abfiltriert und mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wird in 20 ml Dichlormethan aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure ausgeschüttelt. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels erhält man die
Zielverbindung als roten Feststoff Ausbeute: 0,30 g (63%).
Dünnschichtchromatographie (Kieselgel): < 10% freies PhäoA.
MALDI-TOF-Massenspektrum: Molpeak bei 2770 (berechnet: 2766).

g) Darstellung des NHS-Esters der Verbindung aus Beispiel 1f)

50 mg (0,018 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1f), 9 mg (0,078 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 16 mg (0,078 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid werden in 0,5 ml DMF 24 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1e beschrieben mit mehrfacher Umfällung aus DMF/Diethylether. Man erhält 50 mg eines roten Feststoffes, der unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluß bei -20°C aufbewahrt wird.

Beispiel 2 Synthese eines dendrimeren Bausteins mit 4 Zinn(IV)-chlorin e6-Molekülen und einer als NHS-Ester aktivierten Carboxylgruppe zur Kopplung an Biomoleküle

a)-d) entspricht Beispiel 1

e) Darstellung von Sn(IV)-chlorin e6-N-hydroxysuccinimidylester (SnCle6-NHS-ester)

SnCle6 wird nach Lu XM et J Immunol Meth (1992) 156: 85-99 aus Chlorin e6 synthetisiert. Die Umsetzung zum NHS-Ester erfolgt in Anlehnung an Rakestraw SL et al. Bioconjugate Chem (1990) 1: 212-221. 1,0 g (1,28 mmol) SnCle6 und 0,18 g (1,54 mmol) N Hydroxysuccinimid in 6 ml DMF werden mit einer Lösung von 0,32 g (1,54 mmol) Dicyclohexylcarbodiiniid in 2 ml DMF versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 h bei 45°C unter Lichtausschluß gerührt. Das Produkt wird durch Zugabe von Diethylether ausgefällt und durch wiederholte Umfällung aus DMF/Diethylether gereinigt. Ausbeute: 1,1 g (97%) eines roten Feststoffes.
Elementaranalyse:
berechnet: C 51,67, H 4,45, N 8,03,
gefunden: C 51,89, H 4,61, N 8,17,
Metallbestimmung (ICP-AES):
berechnet: Sn 13,44,
gefunden: Sn 12,94.

f) Darstellung eines Multimers aus 4 SnCle6-Molekülen und der Titelverbindung aus Beispiel 1d)

80 mg (0,14 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d und 104 mg (0,8 mmol) Diisopro­ pylethylamin (DIEA) werden in 1 ml DMF gelöst, mit einer Lösung von 0,97 g (1,1 mmol) SnCle6-NHS-ester (siehe Beispiel 2e) in 1 ml DMF versetzt und 24 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Es wird ca. 20 ml Diethylether zugesetzt und der ausfallende Feststoff mittels Zentrifugation isoliert. Dieser Vorgang wird mehrfach wiederholt. Abschließend wird das Rohprodukt in 5 ml Wasser (+5% DMSO) gelöst und mittels Gelchromatographie (Sephadex; Phanmacia) gereinigt. Die produktenthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert. Ausbeute: 0,25 g (51%).
MALDI-TOF-Massenspektrum: Molpeak bei 3529 (berechnet: 3533), 3497 (-Cl), 3461 (-2Cl).

g) Darstellung des NHS-Esters der Verbindung aus Beispiel 2f)

50 mg (0,014 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2f), 2,4 mg (0,021 mmol) N- Hydroxysuccinimid und 4,7 mg (0,023 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid werden in 0,5 ml DMF 72 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1g beschrieben. Man erhält 45 mg eines roten Feststoffes, der unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluß bei -20°C aufbewahrt wird.

Beispiel 3 Synthese eines dendrimeren Bausteins mit 8 Phäophorbid a-Molekülen und einer als NHS- Ester aktivierten Carboxygruppe zur Kopplung an Biomoleküle a) Konjugat aus PhäoA-NHS-ester (Beispiel 1e) und Lysin

0,2 g (1,1 mmol) Lysin-Hydrochlorid und 0,16 ml (1,1 mmol) Triethylamin werden in DMF gelöst, mit 1,9 g (2,75 mmol) PhäoA-NHS-Ester (Titelverbindung aus Beispiel 1e) versetzt und 24 h bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft, in Dichlormethan aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand chromatographisch gereinigt (Lichtausschluß; Stufengradient Ethylacetat/Ethanol). Ausbeute: 0,8 g (58%).
Elementaranalyse:
berechnet: C 70,24, H 6,67, N 10,78,
gefunden: C 70,56, H 6,74, N 10,70.

b) NHS-Ester der Verbindung aus Beispiel 3a)

Die Darstellung des NHS-Esters erfolgt wie in Beispiel 1g beschrieben. Aus 100 mg N,N'- Bis(PhäoA)-Lysin werden 105 mg N,N'-Bis(PhäoA)-Lysin-NHS-Ester als roter Feststoff erhalten.

c) Multimer mit 8 PhäoA-Molekülen aus Beispiel 3b) und Beispiel 1d)

100 mg (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d und 130 mg (1,0 mmol) Diisopro­ pylethylamin (DIEA) werden in 1 ml DMF gelöst, mit einer Lösung von 1,88 g (1,36 mmol) N,N'-Bis(PhäoA)-Lysin-NHS-Ester (Beispiel 3b) in 1 ml DMF versetzt und 48 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Anschließend werden ca. 20 ml Diethylether zugesetzt, der ausfallende Feststoff wird abfiltriert und mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wird in 20 ml Dichlormethan aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure ausgeschüttelt. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt in 50 ml Wasser (+ 10% DMSO) gelöst und mittels Ultrafiltration (Amicon; Cut- Off 3000) gereinigt. Ausbeute: 0,36 g (38%).
MALDI-TOF-Massenspektrum: Molpeak bei 5590 (berechnet: 5586).

d) NHS-Ester der Verbindung aus Beispiel 3c)

Die Darstellung des NHS-Esters erfolgt wie in Beispiel 1g beschrieben. Aus 50 mg der Verbindung aus Beispiel 3c) werden 46 mg NHS-Ester als roter Feststoff erhalten.

Beispiel 4 Synthese eines dendrimeren Bausteins auf 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-Basis mit 6 Phäophorbid a-Molekülen und einer als NHS-Ester aktivierten Carboxlygruppe zur Kopplung an Biomoleküle a) 1,4,7-Tris-{7-benzyloxycarbonylamino-5-[2-(benzyloxycarbonylamino)ethyl]-4-oxo-5- azaheptanoyl}-10-hydroxysuccinidyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

Die Darstellung erfolgt gemäß Beispiel 5b-5d in DE 195 49 286 A1.

b) 1,4,7-Tris-[7-amino-5-(2-aminoethyl)-4-oxo-5-azaheptanoyl]-10-hydroxysuccinidyl- 1,4,7,10tetraazacyclododecan hexahydrobromid

2,0 g (1,2 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 4a werden in 40 ml Eisessig gelöst und unter Rühren mit 33-proz. Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach 5 h wird die begonnene Fällung durch Zugabe von Diethylether vervollständigt, der entstandene Feststoff mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,6 g (quantitativ).

c) Multimer aus 6 PhäoA-Molekülen und der in Beispiel 4b) beschriebenen Kaskade

100 mg (0,076 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 4b und 71 mg (0,55 mmol) Diisopropylethylamin werden in DMF gelöst und mit einer Lösung von 0,62 g (0,9 mmol) PhäoA- NHS-Ester (Beispiel 1e) in DMF versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 72 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Durch Zugabe von Diethylether/Hexan (1 : 1) wird das Produkt ausgefällt, in Dichlormethan aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure ausgeschüttelt. Nach Trocknung über Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels wird der erhaltene Feststoff mehrfach aus Dichlormethan/Hexan umgefällt, schließlich mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,23 g (71%).
MALDI-TOF-Massenspektrum: Molpeak bei 4282 (berechnet: 4288).

d) NHS-Ester der Verbindung aus Beispiel 4c)

Die Darstellung des NHS-Esters erfolgt wie in Beispiel 1g beschrieben. Aus 50 mg der Verbindung aus Beispiel 4c) werden 51 mg NHS-Ester als roter Feststoff erhalten.

Beispiel 5 Synthese eines dendrimeren Bausteins mit 4 Phäophorbid a-Molekülen und einer Bromacetylamidgruppe zur Kopplung an Biomoleküle (Derivatisierung der Titelverbindung aus Beispiel 1f) a) (PhäoA)₄(Lys)₂-diethylentriamin-3-aminopropyl-carbonsäureamid durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 1f mit 1-(^tButyloxycarbonylamino)-3-propylamin

Eine Lösung von 100 mg (0,036 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1f) und 4,4 mg (0,043 mmol) Triethylamin in 2 ml DMF wird mit einer Lösung von 14 mg (0,043 mmol) 2-(1H-Benzotriazol-1- yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Tetrafluoroborat (TBTU, Aldrich) in DMF versetzt und 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 12,5 mg (0,072 mmol) 1- (Butyloxycarbonylamino)-3-propylamin zugefügt und weitere 2 h gerührt. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand chromatographisch gereinigt (Kieselgel; Dichlormethan/Hexan).
Ausbeute: 65 mg.

Zur Spaltung der Boc-Schutzgruppe wird das Zwischenprodukt in 1 ml Dichlormethan gelöst, 0,5 ml Trifluoressigsäure zugegeben und das Gemisch 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch wiederholte Zugabe von Dichlormethan mehrfach eingedampft und schließlich aus Dichlormethan mit Hexan gefällt. Ausbeute: 60 mg (56%).

b) (PhäoA)₄(Lys)₂-diethylentriamin-3-(bromacetyl)aminopropyl-carbonsäureamid durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 5a mit Bromacetylbromid

50 mg (0,017 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 5a, 17 mg (0,17 mmol) Triethylamin und 34 mg (0,17 mmol) Bromacetylbromid werden in 1 ml Dichlormethan 24 h bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, der Rückstand mit Diethylether/Hexan (1 : 2) mehrfach gewaschen und schließlich durch Zentrifugation isoliert.
Ausbeute: 46 mg (92%).
MALDI-TOF-Massenspektrum: Molpeak bei 2940 (berechnet: 2943).

Beispiel 6 Kopplung des NHS-Esters von (PhäoA)₄(Lys)₂-diethylentriamin-COOH (Beispiel 1g) an anti-ED-B-Fibronektin-"Single chain fragment"-Antikörper L19

Die Konjugation erfolgt durch Reaktion des NHS-Esters des PhäoA-Multimers (Beispiel 1g) mit ε-Aminogruppen des Lysins unter Ausbildung einer Amid-Verknüpfung in Anlehnung an Birchler M et al. J Immunol Meth (1999) 231: 239-248. L 19 wird gemäß VIII F et al. Cancer Res (1999) 59: 347-352 und Pini A et al, J Biol Chem (1998) 273: 21769-21776 hergestellt, isoliert und gereinigt.

Aus der Titelverbindung von Beispiel 1g wird eine Stammlösung der Konzentration 50 mg/ml (= 17,5 µmol/ml) in DMSO hergestellt.

Eine Lösung von 0,5 mg (17,9 nmol) Anti-ED-B-Fibronektin "Single chain" Antikörperfragment L19 (Molekulargewicht 28 kDa) in 1,2 0,7? ml Boratpuffer (pH 8,5, 100 mM Natriumtetraborat in dest. Wasser) mit 5% DMSO unter Eiskühlung mit 5,1 µl (= 5 Moläquivalente) der oben genannten Stammlösung versetzt und 2 h unter Eiskühlung und Lichtausschluß inkubiert. Anschließend erfolgt eine Reinigung und Abtrennung des freien PhäoA-Multimers durch Gelchromatographie über PD 10-Säulen (Pharmacia) unter Verwendung des Elutionspuffers PBS/10%Glycerin. Die erhaltene Lösung wird bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

Beispiel 7 Kopplung von (PhäoA)4(Lys)2-diethylentriamin-3-(bromacetyl)aminopropyl­ carbonsäureamid (Beispiel 5b) an Anti-CD31-Antikörper (PharMingen)

Anti-CD31-Antikörper (PharmMingen) wird nach Thakur ML et al. INucl Med (1996) 37: 1789- 1795 mit Ascorbinsäure reduziert und gereinigt. Dadurch werden freie Thiolgruppen im Fc-Teil des Antikörpers generiert, die mit der Titelverbindung aus Beispiel 5b zur Reaktion gebracht werden.

Aus der Titelverbindung von Beispiel 5b wird eine Stammlösung der Konzentration 50 mg/ml (= 17 µmol/ml) in DMSO hergestellt.

1,5 mg reduzierter Anti-CD31-Antikörper (10 nmol) werden in 1,5 ml Phosphatpuffer (100 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 7,5) mit 3 µl der o. g. Stammlösung an Titelverbindung 5b (= 5 Moläquivalente) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgt eine Reinigung und Abtrennung freien PhäoA-Multimers durch Gelchromatographie über PD10- Säulen (Pharmacia) unter Verwendung des Elutionspuffers PBS/10% Glycerin. Die erhaltene Lösung wird bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

Claims (18)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
K-L-A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (I)
worin
K eine reaktive Gruppe darstellt,
L für eine direkte Bindung oder eine Linkerstruktur steht,
A einen stickstoffhaltigen Kaskadenkern der Basismultiplizität a darstellt,
X und Y unabhängig voneinander für eine direkte Bindung oder für eine
Kaskadenreproduktionseinheit der Reproduktionsmultiplizität x bzw. y stehen,
Z eine Kaskadenreproduktionseinheit der Reproduktionsmultiplizität z darstellt,
W für eine direkte Bindung oder eine Linkerstruktur steht,
a eine Zahl 2 bis 8 darstellt,
x, y, und z jeweils für eine Zahl 1 bis 4 stehen,
und PS für ein Photosensibilisatormolekül steht.

2. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 2 bis 64 Photosensibilisatormoleküle PS enthalten.

3. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe K eine Carboxylgruppe, eine aktivierte Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, ein Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester, ein Carbonsäure-p-nitrophenylester, ein Carbonsäurepentafluorphenylester, ein Carbonsäure-(sulfo)-N-hydroxysuccinimidylester, ein Bis(carboxymethyl)amin-anhydrid, ein Isothiocyanat, ein Maleinimid, ein Bromalkyl, ein Bromacetyl, ein Bromacetamid, ein Iodalkyl, ein Iodacetyl, ein Iodacetamid ist.

4. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Linkerstruktur L für eine geradkettige oder verzweigte C₁-C₂₀ Alkylenkette oder eine zyklische oder teilweise zyklische C₅-C₂₀ Alkylenkette steht, die gegebenenfalls durch 1 bis 5 Sauerstoffatome, 1 bis 3 Stickstoffatome und/oder 1 bis 3 Schwefelatome unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Oxogruppen substituiert ist, und gegebenenfalls 1 bis 5 Amidbindungen enthält.

5. Verbindungen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Linkerstruktur L für eine der folgenden Strukturen steht:
α-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂ NH-(CO)-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β oder
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
worin α die Bindung zur reaktiven Gruppe K und β die Bindung zum Kaskadenkern A darstellt.

6. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kaskadenkern A für ein Stickstoffatom oder eine der folgenden Strukturen steht:
worin
U₁ für ein Wasserstoffatom oder eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X steht,
U₂ für eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X steht,
U₃ für eine direkte Bindung zur Linkerstruktur L oder der reaktiven Gruppe K steht,
M für eine C₁-C₁₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder gegebenenfalls mit 1 bis 2 Oxogruppen substituiert ist.

7. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kaskadenreproduktionseinheiten X, Y und Z unabhängig voneinander für eine der folgenden Strukturen stehen:
#-CH₂-[CH₂]_n-NH-* mit n = 1 bis 5;
#-CH₂-[CH₂]_n-N<* mit n = 1 bis 5;
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄ N<*;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)-CH₂-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-NH-*;
#-(CO)-CH₂CH₂N<*;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂;
#-(CO)CH₂CH₂(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂]₂;
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-NH-C₆H₄-CH[CH₂-CO)-N(CH₂CH₂N<*)₂]₂;
#-(CO)-CH(NH-*)-CH(COOH)-NH-*;
#-(CO)-CH(NH-*)-CH(COOH)-N<*;
worin # die Bindung zu A, X oder Y und * eine Bindung zu Y, Z oder W symbolisiert.

8. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Linkerstruktur W für eine geradkettige oder verzweigte C₁-C₁₀-Alkylenkette oder eine zyklische oder teilweise zyklische C₅-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen ist und/oder gegebenenfalls mit 1 bis 2 Oxogruppen substituiert ist und/oder 1 bis 3 Amidbindungen enthält.

9. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Photosensibilisatormolekül PS für ein Tetrapyrrol steht, welches entweder eine um eine Hydroxygruppe verminderte Carboxylgruppe oder eine um ein Wasserstoffatom verminderte Aminogruppe enthält, an die W bindet.

10. Verbindungen gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrapyrrol ein Chlorophyllderivat, ein Porphyrin, ein Benzoporphyrin, ein Chlorin, ein Phäophorbid oder ein Phthalocyanin ist.

11. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin
K für ein Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidylester, ein Carbonsäure-(sulfo)-N- hydroxysuccinimidylester, ein Bromalkyl, ein Bromacetyl oder ein Bromacetamid steht,
L für eine der Strukturen
α-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-O-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-β,
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-CH₂-CH₂-(CO)-β oder
α-CH₂-CH₂-CH₂-NH-(CO)-CH₂-O-CH₂-(CO)-β steht,
worin α die Bindung zur reaktiven Gruppe K und β die Bindung zum Kaskadenkern A darstellt,
A für eine der folgenden Strukturen steht:
worin
U₁ für ein Wasserstoffatom, U₂ für eine direkte Bindung zur Kaskadenreproduktionseinheit X und U₃ für eine direkte Bindung zur Linkerstruktur L steht,
X und Y unabhängig voneinander für eine direkte Bindung oder für eine der Strukturen
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄-N<* oder
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)N(CH₂CH₂NH-*)₂ stehen,
Z für eine der Strukturen
#-(CO)-CH(NH-*)-(CH₂)₄-NH-*;
#-(CO)-CH(N<*)-(CH₂)₄ N<* oder
#-(CO)-CH₂-CH₂-(CO)-N(CH₂CH₂NH-*)₂ steht,
worin # die Bindung zu A, X oder Y und * eine Bindung zu Y, Z oder W symbolisiert,
W für eine direkte Bindung steht,
a eine Zahl 2 bis 8 darstellt,
x, y, und z jeweils für eine Zahl 1 bis 4 stehen,
und PS für ein Chlorophyllderivat, ein Benzoporphyrin, ein Chlorin oder ein Phäophorbid steht, welche entweder eine um eine Hydroxygruppe verminderte Carboxylgruppe oder eine um ein Wasserstoffatom verminderte Aminogruppe enthalten, an die W bindet.

12. Konjugate aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 mit Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Oligonukleotiden.

13. Konjugate gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide, Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Oligonukleotide spezifisch an Rezeptoren für vaskuläre Wachstumsfaktoren, Rezeptoren auf Endothelzellen, an Entzündungsmediatoren, an Matrixmoleküle und Matrixproteine, welche spezifisch bei der Gefäßneubildung exprimiert werden, mit einer Bindungsaffinität im mikro- bis nanomolaren Bereich binden.

14. Konjugate aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen das Matrixprotein ED-B-Fibronektin gerichtet sind.

15. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)
L'A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (II)
in der L' für einen Rest L-COOH steht und die Variablen L, A, X, Y, Z, W, PS, z, y, x und a die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, mit N-Hydroxysuccinimid, Sulfo-N- Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol oder Pentafluorphenol unter Erhalt einer Carbonsäure-N- hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Carbonsäure-(sulfo)-N- hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Carbonsäure-p-nitrophenylestergruppe oder Carbonsäurepentafluorphenylestergruppe umgesetzt werden.

16. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppe einer Verbindung der allgemeinen Formel (III)
L"A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (III)
in der L" für einen Rest L-NH₂ steht und die Variablen L, A, X, Y, Z, W, PS, z, y, x und a die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, zu einer Isothiocyanatgruppe umgesetzt wird, oder durch Reaktion mit α-Halogenessigsäurehalogenid in eine Bromacetamid- oder eine Iodacetamidgruppe überführt wird, oder mit reaktiven Carboxyalkylmaleimiden zu einer Maleimidoalkylaminocarbonylgruppe umgesetzt wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
K-L-A-{X-[Y-(Z-(W-PS)_z)_y]_x}_a (I)
worin K, L, A, X, Y, Z, W, PS, z, y, x und a die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, mit einem Protein, Antikörper, Antikörperfragment, Peptid oder Oligonukleotid unter Ausbildung von Amidbindungen oder Thioetherbindungen zur Reaktion gebracht wird.

18. Verwendung von Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Herstellung von Mitteln für die Photodynamische Therapie.