DE10058577C2

DE10058577C2 - Verfahren und Vorrichtung für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität

Info

Publication number: DE10058577C2
Application number: DE2000158577
Authority: DE
Inventors: Gerald Steiner; Reiner Salzer; Martin Hof; Martin Bnes
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2000-11-21
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2003-08-07
Anticipated expiration: 2020-11-22
Also published as: DE10058577A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) zur Messung der Fluoreszenzintensität der angeregten Moleküle nach den Oberbegriffen der Ansprüche 1 bzw. 7, wie aus tm - Technisches Messen, 63, 1996, Seiten 128-135 bekannt.

Bei der FCS werden molekulare Wechselwirkungen untersucht, indem man die Diffusionsmerkmale der Moleküle in einem sehr kleinen Probenvolumen bestimmt. Dazu werden die Moleküle mit einem fluoreszierenden Stoff markiert und in ein flüssiges, transparentes Medium eingebracht. Die fluoreszenzmarkierten Moleküle erzeugen bei ihrer Diffusion durch den Fokus der Anregungsstrahlung Fluktuationen der Fluoreszenzintensität, die mit einer geeigneten Optik detektiert werden kann. Hierzu werden in der Regel Mikroskopobjektive mit einer sehr großen numerischen Apertur verwendet. Die Strahlung wird in einem sehr kleinen Volumen fokussiert. Das Fluoreszenzlicht wird in gleicher Weise von diesem Volumen zu einem sehr empfindlichen Detektor geführt.

Wegen der sehr kleinen Anzahl von Molekülen in dem Meßvolumen ist die Fluoreszenzintensität sehr gering. Um diesen Umstand etwas entgegenzutreten verwendet man häufig Fluoreszenzmarker mit einer sehr großen Quantenausbeute, die also sehr große Fluoreszenzintensität zeigen. Da nur wenige Fluorophore eine große Quantenausbeute zeigen, ist die Auswahl an unterschiedlichen Fluorophoren sehr begrenzt. Außerdem lassen sich nicht alle Moleküle mit solchen stark fluoreszierenden Stoffen markieren.

Ein weiterer Nachteil ist die nicht optimale Anregung der Fluoreszenz. Aufgrund der geringen Intensitäten muß man mit sehr starken, meist monochromatischen, Lichtquellen die Fluoreszenz anregen. Häufig werden hierfür Laser eingesetzt deren Wellenlänge nicht in jedem Fall mit der optimalen Anregungswellenlänge der Markermoleküle zusammentrifft.

Schließlich wirken sich aufgrund der geringen Fluoreszenz Störungen von außerhalb sehr stark auf das Meßergebnis aus.

DE 44 29 239 A1 beschreibt eine Ausführung der FCS unter Verwendung von Lichtwellenleitern. Das Licht der Anregungsquelle wird von einer optischen Faser und über einen Faserkoppler zu der Probe geführt. Das von den Probenpartikeln ausgesendete Fluoreszenzlicht wird von der Faser zurückgeführt und über den Faserkoppler auf den Detektor geleitet. Die Schrift beschreibt keine Anordnung zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals.

Ein spezielles Verfahren der FCS unter Nutzung optischer Fasern wird in EP 0 697 590 A1 beschrieben. Die optischen Fasern erlauben einen vielseitigen Einsatz des Meßverfah rens, auch an Orten, die mit herkömmlichen Meßanordnungen nicht zugänglich sind. Dabei wird sowohl das Anregungslicht als auch das von den Molekülen abgestrahlte Fluores zenzlicht mittels Fasern geführt.

In der eingangs genannten Zeitschrift "tm - Technisches Messen", 1996, 63 (4), Seiten 128-135, wird ein Verfahren zur FCS unter Nutzung eines inversen Lichtmikroskopes beschrieben. Die Schrift behandelt weiterhin Möglichkeiten zur Auswertung der gemessenen Intensität und deren Interpretation.

EP 0 732 583 A2 beschreibt ein Verfahren zur Anwendung von feinsten Metallpartikeln für optochemische Fluoreszenzsensoren. Die Metallpartikel verstärken die Intensität des Fluoreszenzlichtes der Moleküle einer biorekognitiven Schicht, die sich unmittelbar in der Nähe der Metallpartikel befindet. Dadurch läßt sich auch die Empfindlichkeit des optochemischen Fluoreszenzsensors verbessern.

Eine spezielle optische Anordnung, insbesondere zur Mehrfarben-Fluoreszenzkorrelations spektroskopie wird in DE 197 35 119 A1 dargestellt. Das Anregungslicht fällt zunächst parallel auf die Probe ein und wird erst nach Passieren der Probe durch einen geeigneten Spiegel auf die Probe zurückgeworfen und fokussiert. Dadurch werden optische Fehler vermieden, so dass mit unterschiedlichen Wellenlängen gemessen werden kann. Eine Verstärkung des Fluoreszenzlichtes wird durch diese Anordnung nicht erreicht; vielmehr wird die Justage wesentlich vereinfacht und die Anwendungsbreite aufgrund der multispektralen Anregung erweitert.

Ebenfalls beschreibt DE 195 33 092 A1 ein spezielles Verfahren der FCS indem laserinduzierte Zweiphotonenprozesse mehrere Volumen derart umgrenzen, dass Proben in diesen Volumina mit einem Laser parallel beobachtet werden können.

Theoretische und praktische Untersuchungen zur Fluoreszenz an Metalloberflächen werden in Journal of Chemical Physics, 1983, 78 (9), Seiten 5324-5338, und in Journal of Electron Spectroscopy and Related Phenomena, 1983, 29, Seiten 363-370, dargestellt. Sie verallgemeinern die elektromagnetische Theorie der oberflächenverstärkten Schwingungs spektroskopie zur Beschreibung von molekularen Resonanzphänomenen. In den Schriften wird der Zusammenhang zwischen der Quantenausbeute und der Verstärkung beschrieben. So kann die Fluoreszenz eines Fluorophors mit einer Quantenausbeute von rund 0,01 bis um den Faktor 10 verstärkt werden. Bei einer Quantenausbeute von rund 1 kann es wegen der elektromagnetischen Wechselwirkungen zwischen der Metalloberfläche zu einem Verstärkungsgrad bis 0,1 kommen. Die Fluoreszenz wird demnach gelöscht.

Eine tiefgehende theoretische Beschreibung des Zusammenhangs ist zum Beispiel in Molecular Physics, 1993, 80 (5), Seiten 1031-1046, und in Journal of Chemical Physics, 1983, 79 (1), Seiten 509-514, dargestellt. Weitere theoretische Abhandlungen zu elektrooptischen Eigenschaften von Metallpartikeln sind in U. Kreibig, M. Volmer "Optical Properties of Metal Clusters", Springer-Verlag, 1995, Seiten 13-53 und 63-69, wiedergegeben.

In DE 195 01 802 A1 wird ein Verfahren zur Herstellung von Materialien mit Metallpartikeln durch Reduktion von Metallsalzen oder mittels Sol - Gel Verfahren beschrieben die sich für Anwendungen der oberflächenverstärkten Ramanspektroskopie (SERS) einsetzen lassen.

Ebenso beschreibt US 4,674,878 ein Verfahren zur Erzielung der Ramanverstärkung, indem kleinste Teilchen (microbodies) mit Metallfilmen überzogen werden. Weiterhin wird die Verwendung von rauhen Oberflächen (z. B. an Elektroden) erwähnt. Durch die Mikrorau higkeit wirken diese Oberflächen als eine Art Clusterschicht. Die Rauhigkeiten können z. B. elektrochemisch oder durch Mikrolithographie hergestellt werden.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von SERS - aktiven Schichten wird in WO 91/02 228 A1 beschrieben. Die Schichten zeichnen sich durch nadelförmige Cluster auf spe ziellen rauhen Flächen aus. Die Herstellung erfolgt durch Aufdampfen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, womit die beschriebenen Nachteile der geringen Fluoreszenzintensität und die einge schränkte Auswahl an geeigneten Markermolekülen überwunden werden.

Die Aufgabe der Erfindung wird in Verbindung mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 ge nannten Merkmalen des Verfahrens dadurch gelöst, dass zur Steigerung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung Metallpartikel in das Meßvolumen eingebracht werden, wobei die Moleküle mit den Metallpartikeln zur Fluoreszenzverstärkung in Wechselwirkung treten.

Vorteilhaft werden die Metallpartikel mittels eines optischen Substrates in das Meßvolumen eingebracht. Eine weitere Variante sieht die Einbringung der Metallpartikel durch eine Suspension in das Meßvolumen vor.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin in Verbindung mit den im Oberbegriff des An spruchs 7 genannten Merkmalen durch eine Vorrichtung mit den in seinem kennzeichnenden Teil angegebenen Merkmalen gelöst.

Der Erfindung liegt die Kenntnis der Oberflächenverstärkung von optisch-spektroskopi schen Effekten in der Nähe von sehr feinen Metallpartikeln, Metallclustern oder mi krostrukturierten Metalloberflächen zugrunde. Die in jedem Fall vorliegenden Metallpartikel haben Abmessungen von wenigen Nanometern und befinden sich auf der Oberfläche eines optischen Substrates. Fällt Licht auf diese Metallpartikel, so werden die freien Elektronen durch die Übergabe der Energie der Photonen in Schwingungen versetzt. Die Elektronen schwingen mit der gleichen Frequenz wie das einfallende Licht. Da das Volumen des Metallpartikels begrenzt und sehr klein ist, bildet sich ein elektrischer Dipol aus. Infolge der Elektronenschwingung entsteht um den Metallpartikel ein neues elektromagnetisches Feld mit der gleichen Frequenz, bzw. Wellenlänge, wie das ursprünglich einfallende Anregungslicht. Dieses Feld zeichnet sich durch eine sehr hohe Intensität in unmittelbarer Nähe der Metalloberfläche aus. Die Intensität des Feldes nimmt mit zunehmendem Abstand von der Oberfläche sehr stark ab. Befindet sich ein Molekül in diesem starken Feld, so werden die Wechselwirkungen zwischen dem Licht und dem Molekül ebenfalls stärker. Gegenüber einer metallpartikelfreien Anordnung beobachtet man eine Verstärkung der Fluoreszenzanregung. Dieser Prozeß ist vor allem darauf zurückzuführen, dass in der gleichen Zeit mehr Elektronen angeregt werden und folglich das gesamte abgestrahlte Fluoreszenzlicht intensiver wird. Eine spektrale Verschiebung des Fluorszenzlichtes tritt nicht auf.

Erfindungsgemäß wird zur Ausnutzung dieser Effekte in das im Fokus der Anregungsstrahlung liegende Meßvolumen ein optisches Substrat eingebracht, das zuvor mit einer sehr feinen Metallpartikelschicht überzogen wurde, wobei die zu untersuchenden Moleküle in die Nähe der Metalloberfläche gelangen können. Alternativ wird an Stelle eines optischen Substrats eine Suspension mit Metallpartikeln in das Meßvolumen eingebracht.

Dazu eignen sich Gold-, Silber-, Kupfer- und Aluminiumpartikel, die durch thermisches Aufdampfen, Sputtern, Implantieren oder reaktives Abscheiden fest mit dem optischen Substrat verbunden sind.

Die Intensitätsverstärkung hängt sehr stark von der Gestaltung der Metallschicht ab. Die Metallpartikel müssen weitestgehend voneinander elektrooptisch isoliert sein, damit sich lokale Dipole ausbilden können.

Vorteilhaft wird die Vorrichtung so ausgebildet, dass der mittlere Durchmesser der Metallpartikel im Nanometerbereich liegt.

Das optische Substrat kann in Form einer Spitze oder eines Kegels ausgebildet werden.

Das Licht der Anregungsstrahlung kann im Spektralbereich von Ultraviolett bis zu Nahinfrarot liegen.

Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sich die Vorrichtung in Mikroskopen zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ohne größere Umbaumaßnahmen einsetzen lässt.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen mittels schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des zugrundeliegenden physikalischen Prinzips der Fluoreszenzverstärkung

Fig. 2 eine Anordnung der Probenanordnung in einem herkömmlichen Fluoreszenzkorrelations-Mikroskop

Fig. 3 eine Anordnung der Vorrichtung unter Verwendung einer planaren Substratoberfläche

Fig. 4 eine Anordnung der Vorrichtung unter Verwendung einer sehr feinen Spitze als Substrat

Fig. 5 eine Anordnung der Vorrichtung unter Verwendung einer kolloidalen Metallpartikellösung.

In der Fig. 1 wird eine schematische Darstellung gezeigt, an der das zugrundeliegende physikalische Prinzip der Fluoreszenzverstärkung erläutert wird. Die Darstellung zeigt Metallpartikel 1 auf der Oberfläche eines optischen Substrates 2, die von der einfallenden Strahlung, dem Anregungslicht 3 getroffen wird. Die Moleküle 4 treten in Kontakt mit dem Lichtfeld 5 der Metallpartikel 1, so dass die Intensität des Fluoreszenzlichtes 6 stärker wird.

Die Fig. 2 zeigt eine dem Stand der Technik entsprechende Vorrichtung zur Erzeugung einer Anregungsstrahlung und Detektion des reflektierten Fluoreszenzlichtes. Das Licht einer Anregungsquelle 7 wird durch eine Linse 8 parallelisiert und durch ein Anregungsfilter 9, einen Strahlteilerspiegel 10 durch eine weitere Linse 11 auf eine Probe 12 mit der vorstehend beschriebenen Ausgestaltung geleitet. Das von den Molekülen ausgesendete Fluoreszenzlicht wird von der schon erwähnten Linse 11 aufgesammelt und passiert den Strahlteilerspiegel 10. Ein Filter 13 filtert das Anregungslicht heraus, so dass über eine weitere Linse 14 das Fluoreszenzlicht auf einen Detektor 15 gelangt.

In der Fig. 3 ist der Bereich des optischen Fokus stark vergrößert dargestellt. Aufgrund spezieller optischer Konstruktionen bildet das fokussierte Anregungslicht 3 ein optisches Meßvolumen 16. Innerhalb dieses sehr kleinen Meßvolumens 16 befinden sich die Metallpartikel 1 auf einem planaren optischen Substrat 2. Diese Anordnung eignet sich zum Beispiel für die Untersuchung von ebenflächig geordneten Molekülen 4.

Die Fig. 4 zeigt die Verwendung einer sehr feinen Spitze 17 als Träger der Metallpartikel 1. Diese Ausgestaltung gestattet besonders die Untersuchung von Molekülen 4, die sich einzeln in einer Lösung bewegen. Die Spitze 17 kann mit einer sehr genauen Positioniereinrichtung in die optimale Position in das Meßvolumen 16 eingebracht werden.

Eine besondere Ausführungsform zeigt die Fig. 5. Die Verwendung von kolloidalen Metallpartikellösungen 18 erübrigt ein optisches Trägersubstrat. Die kolloidale Lösung wird zusammen mit den Molkülen 4 in das Meßvolumen 16 eingebracht.

Bezugszeichenliste

1

Metallpartikel

2

Substrat

3

Anregungslicht

4

Molekül

5

Lichtfeld

6

Fluoreszenzlicht

7

Anregungsquelle

8

Linse

9

Anregungsfilter

10

Strahlteilerspiegel

11

Linse

12

Probe

13

Filter

14

Linse

15

Detektor

16

Meßvolumen

17

Spitze

18

Metallpartikellösung

Claims

1. Verfahren zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, bei dem das Licht einer Anregungsquelle auf ein Meßvolumen fokussiert wird, in das eine Probe mit Molekülen einbringbar ist, die von den Molekülen abgegebene Fluoreszenzstrahlung zur Messung ihrer Intensität auf einen Detektor ausgerichtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass zur Steigerung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung Metallpartikel (1) in das Meßvolumen (16) eingebracht werden, wobei die Moleküle (4) mit den Metallpartikeln (1) zur Fluoreszenzverstärkung in Wechselwirkung treten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) in einer Suspension in das Meßvolumen (16) eingebracht werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) mittels eines optischen Substrates (2) in das Meßvolumen (16) eingebracht werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Durchmesser der Metallpartikel (1) im Nanometerbereich liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1), die mittels des optischen Substrates (2) in das Meßvolumen (16) eingebracht werden, fest mit dem optischen Substrat (2) verbunden sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) Gold-, Silber-, Kupfer- oder Aluminiumpartikel sind.

7. Vorrichtung für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, bestehend aus einer in einem Strahlengang liegenden Anregungsquelle, Mitteln zur Fokussierung des Lichts der Anregungsquelle auf ein Meßvolumen für darin einbringbare Moleküle, einem vom reflektierten oder transmittierten Fluoreszenzlicht gebildeten zweiten Strahlengang mit Mitteln zur Ausrichtung des Fluoreszenzlichtes auf einen Detektor, dadurch gekennzeichnet, dass zur Steigerung der Intensität des Fluoreszenzlichtes (6) im Messvolumen (16) ein optisches Substrat (2) angeordnet ist, mit dem Metallpartikel (1) fest verbunden und in einer Schicht nebeneinander angeordnet sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) durch thermisches Aufdampfen, Sputtern, Implantieren oder reaktives Abscheiden fest mit dem optischen Substrat (2) verbunden sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Substrat (2) transparent oder reflektierend ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Substrat (2) in Form einer Spitze (17) oder eines Kegels ausgebildet ist.