DE10058577A1

DE10058577A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, insbesondere zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität

Info

Publication number: DE10058577A1
Application number: DE2000158577
Authority: DE
Inventors: Gerald Steiner; Reiner Salzer; Martin Hof; Martin Bnes
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2000-11-21
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2020-11-22
Also published as: DE10058577C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, bei dem das Licht einer Anregungsquelle (7) auf ein Meßvolumen (16) fokussiert wird, in das eine Probe (12) mit Molekülen (4) einbringbar ist, das von den Molekülen (4) abgestrahlte Licht zur Messung auf einen Detektor (15) ausgerichtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine verteilte Anhäufung von Metallpartikeln (1) in das Meßvolumen (16) eingebracht wird, wobei die Moleküle (4) mit den Metallpartikeln (1) in das Meßvolumen (16) eingebracht wird, wobei die Moleküle (4) mit den Metallpartikeln (1) in Wechselwirkung treten. DOLLAR A Das einfallende Anregungslicht bewirkt ein starkes Lichtfeld in unmittelbarer Umgebung der Metalloberfläche. Dadurch wird die Fluoreszenzanregung der Moleküle verstärkt und die Empfindlichkeit der Messungen wesentlich gesteigert. DOLLAR A Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, das sie ohne Änderungen in jeden Aufbau eines Fluoreszenzkorrelations-Mikroskops einfach eingebaut werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität der angeregten Moleküle nach den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 4.

Bei der FCS werden molekulare Wechselwirkungen untersucht, indem man die Diffusionsmerkmale der Moleküle in einem sehr kleinen Probenvolumen bestimmt. Dazu werden die Moleküle mit einem fluoreszierenden Stoff markiert und in ein flüssiges, transparentes Medium eingebracht. Die fluoreszenzsmarkierten Moleküle erzeugen bei ihrer Diffusion durch den Fokus der Anregungsstrahlung Fluktuationen der Fluoreszenzintensität, die mit einer geeigneten Optik detektiert werden kann. Hierzu werden in der Regel Mikroskopobjektive mit einer sehr großen numerischen Apertur verwendet. Die Strahlung wird in einem sehr kleinen Volumen fokussiert. Das Fluoreszenzlicht wird in gleicher Weise von diesem Volumen zu einen sehr empfindlichen Detektor geführt.

Wegen der sehr kleinen Anzahl von Molekülen in dem Meßvolumen ist die Fluoreszenzintensität sehr gering. Um diesen Umstand etwas entgegenzutreten verwendet man häufig Fluoreszenzmarker mit einer sehr großen Quantenausbeute, die also sehr große Fluoreszenzintensität zeigen. Da nur wenige Fluorophore eine große Quantenausbeute zeigen, ist die Auswahl an unterschiedlichen Fluorophoren sehr begrenzt. Außerdem lassen sich nicht alle Moleküle mit solchen stark fluoreszieren Stoffen markieren.

Ein weiterer Nachteil ist die nicht optimale Anregung der Fluoreszenz. Aufgrund der geringen Intensitäten muß man mit sehr starken, meist monochromatischen, Lichtquellen die Fluoreszenz anregen. Häufig werden hierfür Laser eingesetzt deren Wellenlänge nicht in jedem Fall mit der optimalen Anregungswellenlänge der Markermoleküle zusammentrifft.

Schließlich wirken sich aufgrund der geringen Fluoreszenz Störungen von außerhalb sehr stark auf das Meßergebnis aus.

Die Schrift DE 44 29 239 A1 beschreibt eine Ausführung der FCS unter Verwendung von Lichtwellenleitern. Das Licht der Anregungsquelle wird von einer optischen Faser und über einen Faserkoppler zu der Probe geführt. Das von den Probenpartikeln ausgesendete Fluoreszenzlicht wird von der Faser zurückgeführt und über den Faserkoppler auf den Detektor geleitet. Die Schrift beschreibt keine Anordnung zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals.

Eine spezielle optische Anordnung, insbesondere zur Mehrfarben-Fluoreszenzkorrelations spektroskopie wird in der Schrift DE 197 35 119 A1 dargestellt. Das Anregungslicht fällt zunächst parallel auf die Probe ein und wird erst nach passieren der Probe durch einen geeigneten Spiegel auf die Probe zurückgeworfen und fokussiert. Dadurch werden optische Fehler vermieden, so dass mit unterschiedlichen Wellenlängen gemessen werden kann. Eine Verstärkung des Fluoreszenzslichtes wird durch diese Anordnung nicht erreicht; vielmehr wird die Justage wesentlich vereinfacht und die Anwendungsbreite aufgrund der multispektralen Anregung erweitert.

Ebenfalls beschreibt die Schrift DE 195 33 092 A1 ein spezielles Verfahren der FCS indem laserinduzierte Zweiphotonenprozesse mehrere Volumen derart umgrenzen, dass Proben in diesen Volumina mit einem Laser parallel beobachtet werden können.

Theoretische und praktische Untersuchungen zur Fluoreszenz an Metalloberflächen werden in dem Journal Chemical Physics, 1983, 78(9) auf den Seiten 5324-5338 und in dem Journal Electron Spectroscopy Related Phenomena, 1983, 29 auf den Seiten 363-370 dargestellt. Sie verallgemeinern die elektromagnetische Theorie der oberflächenverstärkten Schwingungs spektroskopie zur Beschreibung von molekularen Resonanzphänomenen. In den Schriften wird der Zusammenhang zwischen der Quantenausbeute und der Verstärkung beschrieben. So kann die Fluoreszenz eines Fluorophors mit einer Quantenausbeute von rund 0,01 bis um den Faktor 10 verstärkt werden. Bei einer Quantenausbeute von rund 1 kann es wegen der elektromagnetischen Wechselwirkungen zwischen der Metalloberfläche zu einem Verstärkungsgrad bis 0,1 kommen. Die Fluoreszenz wird demnach gelöscht.

Eine tiefgehende theoretische Beschreibung des Zusammenhangs ist zum Beispiel in dem Journal Molecular Physics, 1993 80(5) auf den Seiten 1031-1046 und in dem Journal Chemical Physics, 1983. 79(1) auf den Seiten 509-514 dargestellt. Weitere theoretische Abhandlungen zu elektrooptischen Eigenschaften von Metallpartikeln sind in der Monographie Kreibig, Vollmer: "Optical Properties of Metal Clusters" wiedergeben.

In der Schrift DE 195 01 802 A1 wird ein Verfahren zur Herstellung von Materialien mit Metallpartikeln durch Reduktion von Metallsalzen oder mittels Sol-Gel Verfahren beschrieben die sich für Anwendungen der oberflächenverstärkten Ramanspektroskopie (SERS) einsetzen lassen.

Ebenso beschreibt die Schrift US 4,674,878 ein Verfahren zur Erzielung der Ramanverstärkung indem kleinste Teilchen (microbodies) mit Metallfilmen überzogen werden. Weiterhin wird die Verwendung von rauhen Oberflächen (z. B. an Elektroden) erwähnt. Durch die Mikrorauhigkeit wirken diese Oberflächen als eine Art Clusterschicht. Die Rauhigkeiten können z. B. elektrochemisch oder durch Mikrolithographie hergestellt werden.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung SERS-aktiven Schichten wird in der Schrift WO 91 02 228 A1 beschrieben. Die Schichten zeichnen sich durch nadelförmige Cluster auf speziellen rauhen Flächen aus. Die Herstellung erfolgt durch Aufdampfen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, die die beschriebenen Nachteile der geringen Fluoreszenzintensität und der eingeschränkten Auswahl an geeigneten Markermolekülen nicht aufweisen.

Die Aufgabe der Erfindung wird in Verbindung mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Merkmalen durch ein Verfahren dadurch gelöst, dass eine verteilte Anhäufung von Metallpartikeln in das Meßvolumen eingebracht wird, wobei die Moleküle mit den Metallpartikeln in Wechselwirkung treten.

Vorteilhaft wird die Anhäufung von Metallpartikeln mittels eines optischen Substrates in das Meßvolumen eingebracht. Eine Weitere Variante sieht die Einbringung der Metallpartikel durch eine Suspension in das Meßvolumen vor.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin in Verbindung mit den im Oberbegriff des Anspruchs 4 genannten Merkmalen durch eine Vorrichtung dadurch gelöst, dass zumindest während der Messung in das im Fokus der Anregungsstrahlung liegenden Meßvolumen eine verteilte Anhäufung von Metallpartikel einbringbar ist, wobei sich die zu untersuchenden Moleküle auf der Oberfläche oder im Strahlungsfeld der Metallpartikel befinden.

Der Erfindung liegt die Kenntnis der Oberflächenverstärkung von optisch-spektroskopischen Effekten in der Nähe von sehr feinen Metallpartikeln, Metallclustern oder mikrostrukturierten Metalloberflächen zugrunde. Die in jedem Fall vorliegenden Metallpartikel haben Abmessungen von wenigen Nanometern und befinden sich vorzugsweise auf der Oberfläche eines optischen Substrates. Fällt Licht auf diese Metallpartikel, so werden die freien Elektronen durch die Übergabe der Energie der Photonen in Schwingungen versetzt. Die Elektronen schwingen mit der gleichen Frequenz wie das einfallende Licht. Da das Volumen des Metallpartikels begrenzt und sehr klein ist, bildet sich ein elektrischer Dipol aus. Infolge der Elektronenschwingung entsteht um den Metallpartikel ein neues elektromagnetisches Feld mit der gleichen Frequenz, bzw. Wellenlänge, wie das ursprünglich einfallende Anregungslicht. Dieses Feld zeichnet sich durch eine sehr hohe Intensität in unmittelbarer Nähe der Metalloberfläche aus. Die Intensität des Feldes nimmt mit zunehmenden Abstand von der Oberfläche sehr stark ab. Befindet sich ein Molekül in diesem starken Feld, so werden die Wechselwirkungen zwischen dem Licht und dem Molekül ebenfalls stärker. Gegenüber einer metallpartikelfreien Anordnung beobachtet man eine Verstärkung der Fluoreszenzanregung. Dieser Prozeß ist vor allem darauf zurückzuführen, dass in der gleichen Zeit mehr Elektronen angeregt werden und folglich das gesamte abgestrahlte Fluoreszenzlicht intensiver wird. Eine spektrale Verschiebung des Fluorszenzlichtes tritt nicht auf.

Erfindungsgemäß wird zur Ausnutzung dieser Effekte in das im Fokus der Anregungsstrahlung liegende Meßvolumen vorzugsweise ein optisches Substrat eingebracht, das zuvor mit einer sehr feinen Metallpartikelschicht überzogen wurde, wobei die zu untersuchenden Moleküle in die Nähe der Metalloberfläche gelangen können. Alternativ wird an stelle eines optischen Substrats eine Suspension mit Metallpartikeln in das Meßvolumen eingebracht.

Dazu eignen sich Gold-, Silber-, Kupfer- und Aluminiumpartikel, die durch thermisches Aufdampfen, Sputtern, Implantieren, reaktives Abscheiden o. dgl. fest mit dem optischen Substrat verbunden sind.

Die Intensitätsverstärkung hängt sehr stark von der Gestaltung der Metallschicht ab. Die Metallpartikel müssen weitestgehend voneinander elektrooptisch isoliert sein, damit sich lokale Dipole ausbilden können.

Vorteilhaft wird die Vorrichtung so ausgebildet, dass der mittlere Durchmesser der Metallpartikel im Nanometerbereich liegt.

Das optische Substrat kann in Form einer Spitze, eines Kegels o. dgl. ausgebildet werden.

Das Licht der Anregungsstrahlung kann im Spektralbereich von Ultraviolett bis zu Nahinfrarot liegen.

Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sich die Vorrichtung in Mikroskope zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ohne größere Umbaumaßnahmen einsetzen lässt.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen mittels schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des zugrundeliegenden physikalischen Prinzips der Fluoreszenzverstärkung

Fig. 2 eine Anordnung der erfindungsgemäß gestalteten Probenanordnung in einem herkömmlichen Fluoreszenzkorrelations-Mikroskop

Fig. 3 eine Anordnung der erfindungsgemäß gestalteten Vorrichtung unter Verwendung einer planaren Substratoberfläche

Fig. 4 eine Anordnung der erfindungsgemäß gestalteten Vorrichtung unter Verwendung einer sehr feinen Spitze als Substrat

Fig. 5 eine Anordnung der erfindungsgemäß gestalteten Vorrichtung unter Verwendung einer kolloidalen Metallpartikellösung.

In der Fig. 1 wird eine schematische Darstellung gezeigt, an der das zugrundeliegende physikalische Prinzip der Fluoreszenzverstärkung erläutert wird. Die Darstellung zeigt Metallpartikel 1 auf der Oberfläche eines optischen Substrates 2, die von der einfallenden Strahlung, dem Anregungslicht 3 getroffen wird. Die Moleküle 4 treten in Kontakt mit dem Lichtfeld 5 der Metallpartikel 1, so dass die Intensität des Fluoreszenzlichtes 6 stärker wird.

Die Fig. 2 zeigt eine dem Stand der Technik entsprechende Vorrichtung zur Erzeugung einer Anregungsstrahlung und Detektion des reflektierten Lichtes. Das Licht einer Anregungsquelle 7 wird durch eine Linse 8 parallelisiert und durch ein Anregungsfilter 9, einen Strahlteilerspiegel 10 durch eine weitere Linse 11 auf eine Probe 12 mit der erfindungsgemäßen Ausgestaltung geleitet. Das von den Molekülen ausgesendete Fluoreszenzlicht wird von der schon erwähnten Linse 11 aufgesammelt und passiert den Strahlteilerspiegel 10. Ein Filter 13 filtert das Anregungslicht heraus, so dass über eine weitere Linse 14 das Fluoreszenzlicht auf einen Detektor 15 gelangt.

In der Fig. 3 ist der Bereich des optischen Fokus stark vergrößert dargestellt. Aufgrund spezieller optischer Konstruktionen bildet das fokussierte Anregungslicht 3 ein optisches Meßvolumen 16. Innerhalb dieses sehr kleinen Meßvolumens 16 befinden sich die Metallpartikel 1 auf einem planaren optischen Substrat 2. Diese Anordnung eignet sich zum Beispiel für die Untersuchung von ebenflächig geordneten Molekülen 4.

Die Fig. 4 zeigt die Verwendung einer sehr feinen Spitze 17 als Träger der Metallpartikel 1. Diese Ausgestaltung gestattet besonders die Untersuchung von Molekülen 4, die sich einzeln in einer Lösung bewegen. Die Spitze 17 kann mit einer sehr genauen Positioniereinrichtung in die optimale Position in das Meßvolumen 16 eingebracht werden.

Eine besondere Ausführungsform zeigt die Fig. 5. Die Verwendung von kolloidalen Metallpartikellösungen 18 erübrigt ein optisches Trägersubstrat. Die kolloidale Lösung wird zusammen mit den Molkülen 4 in das Meßvolumen 16 eingebracht.

Bezugszeichenliste

1

Metallpartikel

2

Substrat

3

Anregungslicht

4

Molekül

5

Lichtfeld

6

Fluoreszenzlicht

7

Anregungsquelle

8

Linse

9

Anregungsfilter

10

Strahlteilerspiegel

11

Linse

12

Probe

13

Filter

14

Linse

15

Detektor

16

Meßvolumen

17

Spitze

18

Metallpartikellösung

Claims

1. Verfahren zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, bei dem das Licht einer Anregungsquelle (7) auf ein Meßvolumen (16) fokussiert wird, in das eine Probe (12) mit Molekülen (4) einbringbar ist, das von den Molekülen (4) abgestrahlte Licht zur Messung auf einen Detektor (15) ausgerichtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine verteilte Anhäufung von Metallpartikeln (1) in das Meßvolumen (16) eingebracht wird, wobei die Moleküle (4) mit den Metallpartikeln (1) in Wechselwirkung treten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) in einer Suspension in das Meßvolumen (16) eingebracht werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) mittels eines optischen Substrates (2) in das Meßvolumen (16) eingebracht werden.

4. Vorrichtung zur Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, bestehend aus einer in einem Strahlengang liegenden Anregungsquelle (7), Mitteln (8, 9, 10, 11) zur Fokussierung des Lichts auf ein Meßvolumen (16) mit darin einbringbaren Molekülen (4), einem vom reflektierten oder transmittierten Licht gebildeten zweiten Strahlengang mit Mitteln (11, 10, 13, 14) zur Ausrichtung des Lichtes auf einen Detektor (15), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest während der Messung in das im Fokus der Anregungsstrahlung liegenden Meßvolumen (16) eine verteilte Anhäufung von Metallpartikel einbringbar ist, wobei sich die zu untersuchenden Moleküle (4) auf der Oberfläche oder im Strahlungsfeld der Metallpartikel (1) befinden.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Durchmesser der Metallpartikel (1) im Nanometerbereich liegt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) mittels eines optischen Substrates (2) in das Meßvolumen (16) einbringbar sind, wobei die Metallpartikel fest mit einem Substrat (2) verbunden sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) mittels einer Suspension in das Meßvolumen (16) einbringbar sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) Gold-, Silber-, Kupfer- oder Aluminiumpartikel sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel (1) durch thermisches Aufdampfen, Sputtern, Implantieren, reaktives Abscheiden o. dgl. fest mit einem optischen Substrat (2) verbunden sind.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Substrat (2) transparent oder reflektierend ist und die Metallpartikel fest aufnimmt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 4 bis 6 und 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Substrat (2) in Form einer Spitze (17), eines Kegels o. dgl. ausgebildet ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass trägerlose, sehr feine Metallpartikel als Suspension in das Meßvolumen (16) eingebracht sind und mit den zu untersuchenden Molekülen in Wechselwirkung treten.

13. Vorrichtung nach Anspruch 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) im Spektralbereich von Ultraviolett bis zu Nahinfrarot liegt.