DE10056704C2 - Quantitative Bestimmung von Stoffen mittels IR-Spektroskopie - Google Patents
Quantitative Bestimmung von Stoffen mittels IR-SpektroskopieInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die quantitative Be
stimmung von Stoffen durch Messung der Wechselwirkungen dieser
Stoffe mit Verbindungen, wobei sich durch diese Wechsel
wirkungen Änderungen im mittleren Infrarot-Spektralbereich er
geben.
Im Stand der Technik sind analytische Methoden bekannt,
die auf spektroskopischen Messungen im mittleren Infrarot-
Spektralbereich basieren. Beispielsweise offenbaren Shaw, R. A.
und Mantsch H. H. (2000) "Multianalyte Serum Assays from Mid-IR
Spectra of Dry Films on Glass Slides", Applied Spectroscopy,
Vol. 54, No. 6, S. 885 bis 889, daß die Absorption in einem
Wellenzahlenbereich von 2000 bis 4000 cm-1 zur quantitativen
Bestimmung von Blutbestandteilen, wie Albumin, Cholesterin,
Glucose, Gesamtprotein, Triglyceride und Harnstoff eingesetzt
werden kann. Die direkte Messung dieser Blutbestandteile hat
jedoch den Nachteil, daß sie nicht in Lösung durchgeführt
werden kann, weil die Absorption des Lösungsmittels, nämlich
Wasser, in diesen Wellenzahlenbereich die Absorptionen der
Blutbestandteile vollständig überlagert und somit eine Messung
in Lösung unmöglich wird. Dieses Problem wurde durch Trocknen
der Proben und Messen der getrockneten Proben gelöst.
Dieses Meßverfahren hat den Nachteil, daß jede zu messende
Probe getrocknet werden muß. Außerdem überlagern sich die
Spektren der zu messenden Blutbestandteile, so daß die
quantitative Bestimmung mehrerer Blutbestandteile in ein und
derselben getrockneten Probe schwierig bzw. unmöglich ist. Ein
weiteres Problem hinsichtlich der quantitativen Messung besteht
darin, daß für die Messungen von Blutproben ein Nullabgleich
nahezu unmöglich ist, d. h. es stehen quasi keine Proben zur
Verfügung, welche die gesamten Blutbestandteile außer dem zu
messenden Bestandteil enthalten und somit hinsichtlich des zu
messenden Bestandteils als Referenzproben dienen könnten.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zu
grunde, ein einfaches und sicheres Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Stoffen bereitzustellen. Dieses Problem wird
erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Verfahren be
reitgestellt wird, bei dem der zu quantifizierende Stoff nicht
direkt, sondern über eine mit dem zu messenden Stoff in
Wechselwirkung stehende Verbindung indirekt quantifiziert wird.
Diese Wechselwirkung zwischen dem zu quantifizierenden Stoff
und der Verbindung führt zu einer meßbaren Änderung des Signals
bzw. des Spektrums im mittleren Infrarot-Spektralbereich.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
selektiven quantitativen Bestimmung mindestens eines Stoffes in
wässeriger Lösung bereit, wobei der Stoff mit einer Verbindung
in Wechselwirkung gebracht wird und die auf diese Wechselwir
kung beruhende Änderung des Signals der Lösung im mittleren
Infrarot-Spektralbereich gemessen wird.
Der zu quantifizierende Stoff kann in Lösung oder in ge
trockneter Form vorliegen. Das Lösungsmittel absorbiert
vorzugsweise im mittleren Infrarot-Spektralbereich nicht. Die
Messung einer Probe in einem Lösungsmittel, das im mittleren
Infrarot-Spektralbereich absorbiert, wird dadurch ermöglicht,
daß einerseits der zu bestimmende Stoff nicht direkt, sondern
indirekt gemessen wird. Dies ermöglicht einen Nullabgleich der
zu messenden Probe, wenn eine in Wechselwirkung mit dem Stoff
stehende Verbindung gewählt wird, die ohne diese Wechselwirkung
kein Signal im mittleren Infrarot-Spektralbereich zeigt. Ein
Nullabgleich ist somit dadurch möglich, daß entweder eine Probe
ohne die Verbindung zum Abgleichen verwendet wird oder das
Signal zum Zeitpunkt Null des Kontaktierens des Stoffes und der
Verbindung zum Abgleichen verwendet wird. Der Abgleich unter
Verwendung des Signals zum Zeitpunkt Null der Wechselwirkung
zwischen dem Stoff und der Verbindung kann auch bei
Verbindungen eingesetzt werden, die an sich ein Signal im
mittleren Infrarot-Spektralbereich zeigen, d. h. auch ohne die
Wechselwirkung mit dem zu quantifizierenden Stoff.
Andererseits ist die Messung der Probe in Lösung auch
dadurch möglich, daß Verbindungen ausgewählt werden, die bei
einer Wechselwirkung mit dem zu quantifizierenden Stoff ein
sehr starkes spektroskopisches Signal erzeugen. Dadurch können
Fehler, wie z. B. Pepitierfehler, in ihren Auswirkungen auf das
Ergebnis der Messungen erheblich beschränkt werden.
Die untersuchte Probe, welche den oder die zu quantifi
zierenden Stoffe in Lösung enthält, kann beispielsweise Blut
oder Serum sein. Dabei kann es sich bei dem zu quantifizie
renden Stoff um einen Blutbestandteil handeln. Die vorliegende
Erfindung ist für die quantitative Bestimmung aller Stoffe, wie
Blutbestandteile, geeignet, die mit einer Verbindung in
Wechselwirkung gebracht werden können und bei denen diese
Wechselwirkung zu einer Änderung des Signals im mittleren
Infrarot-Spektralbereich führt. Solche Stoffe können z. B. sein:
Zucker, wie Glucose, Fructose oder Galactose, Eiweiße, wie
Enzyme, Fett, Fettsäuren, Cholesterin, Lipoproteide,
Triglyceride, Harnstoff, Harnsäure, Bilirubin, Tyroxin, Phos
phatide, Hormone, Mineralstoffe und dergleichen. Außerdem kann
es sich bei den Blutbestandteilen auch um Blutzellen handeln.
Die Wechselwirkungen zwischen dem zu quantifizierenden
Stoff und der Verbindung sind hinsichtlich ihrer Art nicht
eingeschränkt. Bei diesen Wechselwirkungen kann es sich um
ionische Wechselwirkungen, Dipolwechselwirkungen, von-der-Waal-
Wechselwirkungen oder hydrophobe Wechselwirkungen handeln.
Entscheidend dabei ist, daß sich durch diese Wechselwirkungen
das Signal im mittleren Infrarot-Spektralbereich ändert. Diese
Änderung kann konkret darauf beruhen, daß die physikalische
Wechselwirkung zwischen dem Stoff und der Verbindung
unmittelbar zu einer Änderung des Signals führt. Die Änderung
des Signals kann jedoch auch dadurch bewirkt werden, daß die
Wechselwirkung zwischen dem zu quantifizierenden Stoff und der
Verbindung zu einer chemischen Veränderung entweder des Stoffs
oder der Verbindung führt. Wenn beispielsweise der zu
quantifizierende Stoff ein Enzym ist, kann ein Enzymsubstrat
zugegeben werden, welches dann durch die Wechselwirkung mit dem
Enzym gespalten wird. Durch diese Spaltung kann beispielsweise
eine im mittleren Infrarotspekralbereich absorbierende
Verbindung gebildet werden. Umgekehrt kann natürlich auch die
chemische Veränderung des zu quantifizierenden Stoffes zu einem
meßbaren Signal führen, wenn dieser Stoff beispielsweise ein
Enzymsubstrat ist und als Verbindung, die mit diesem Stoff in
Wechselwirkung treten soll, das entsprechende Enzym zugegeben
wird. Ein Beispiel für eine Enzym-Substrat-Wechselwirkung, die
in dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt werden kann, ist
die Wechselwirkung zwischen alkalischer Phosphatase und dem
Substrat Dinatrium-3-phenylprop-2-in-1-olphosphat. Dieses
Substrat zeigt eine Absorption bei einer Wellenzahl von 2160
bis 2100 cm-1. Durch Wechselwirkung mit alkalischer Phosphatase
wird Phosphat abgespalten, so daß 3-Phenylprop-2-in-1-ol
entsteht. Durch die Abspaltung des Phosphats ergibt sich eine
Änderung des Spektrums bzw. eine Änderung der
Absorptionsintensität in dem genannten Wellenzahlenbereich. Die
Verwendung dieses Substrats und anderer Verbindungen, die in
diesem Wellenzahlenbereich absorbieren, ist deshalb vorteilhaft
und bevorzugt, weil die Blutmoleküle in dem Wellenzahlenbereich
von 1700 bis 2400 cm-1 nicht absorbieren.
Neben den Enzym-Substrat-Wechselwirkungen können für die
Quantifizierung eines Stoffes auch Affinitätswechselwirkungen
ausgenutzt werden, wie z. B. Antikörper-Antigen-Wechselwirkun
gen. Da Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen hoch spezifisch und
sehr stark sind, können sehr kleine Mengen an zu
quantifizierenden Stoffen nachgewiesen und bestimmt werden.
Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen können in dem
erfindungsgemäßen Verfahren dadurch eingesetzt werden, daß ein
zu quantifizierender Stoff als Antigen dient und ein selektiver
Antikörper in die Probe, die den Stoff enthält, gegeben wird.
Eine Änderung des Signals im mittleren Infrarot-Spektralbereich
kann sich entweder dadurch ergeben, daß durch die Antikörper-
Antigen-Wechselwirkung ein Signal erzeugt wird, daß auf der
geänderten Absorption eines Moleküls, mit dem der Antikörper
markiert ist, beruht. Ein anderer Ansatz besteht darin, daß zu
der zu messenden Probe Moleküle gegeben werden, die mit dem zu
quantifizierenden Stoff identisch sind, jedoch mit einem im
mittleren Infrarot-Spektralbereich detektierbaren Molekül
markiert sind, und durch Zugabe des Antikörpers in die Probe
der markierte Stoff, dessen Signal im mittleren Infrarot-
Spektralbereich durch die Wechselwirkung mit dem Antikörper
verändert wird, mit dem zu quantifizierenden Stoff um die
Bindung an den Antikörper konkurriert.
Der Begriff "mittlerer Infrarot-Spektralbereich", wie er
in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet einen
Wellenzahlenbereich von 1700 bis 4000 cm-1. Da beispielsweise
die Blutmoleküle in einem Wellenzahlenbereich von 1700 bis 2400 cm-1
keine Absorption keine zeigen, ist für die Messung von
Blutbestandteilen dieser Bereich bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierung von
Stoffen ermöglicht die einfache und verläßliche Bestimmung von
mehreren Stoffen in einer einzigen Probe. Dies wird dadurch
ermöglicht, daß das erfindungsgemäße Verfahren kein direktes,
sondern ein indirektes Verfahren ist. Durch diesen indirekten
Charakter können je nach Bedarf mehr als eine Verbindung,
nämlich zwei Verbindungen oder mehr, die mit jeweils einem
anderen zu quantifizierenden Stoff in Wechselwirkung treten,
ausgewählt werden, wobei durch die Wechselwirkungen mit dem
jeweiligen Zielmolekül Änderungen der Signale im mittleren
Infrarot-Spektralbereich bewirkt werden, die sich nicht
überlappen bzw. die sich durch geeigneten Abgleich der Proben
vor oder zu Beginn der Wechselwirkung den jeweiligen
spezifischen Wechselwirkungen zuordnen lassen. Somit hat das
erfindungsgemäße indirekte Quantifizierungsverfahren einen
Vorteil dahingehend, daß durch eine einzige Probenentnahme
mehrere Stoffe in dieser Probe gleichzeitig quantifiziert
werden können, d. h. in einem einzigen Probenansatz,
beispielsweise einer einzigen Proben-Küvette. Wie bereits
erwähnt, können mehrere Parameter der Probe durch geeignete
Auswahl der spektroskopisch aktiven Verbindungen und geeignete
Änderung der Wellenzahl, bei der gemessen wird, in Abhängigkeit
von den jeweiligen spektroskopisch aktiven Verbindungen oder
deren Kombinationen gemessen werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann somit eine
Vielzahl von quantitativen Bestimmungen in einer Probe und mit
der gleichen Meßapparatur durchgeführt werden. Dies führt zu
einer Vereinfachung und Beschleunigung der Meßverfahren und
somit zu einer kostengünstigeren quantitativen Bestimmung von
Stoffen.
Die Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren
durchgeführt werden kann, kann ein herkömmliches IR-Spektral
photometer sein, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Um
mehrere Stoffe gleichzeitig in einer einzigen Probe messen zu
können, muß das IR-Spektralphotometer so ausgestattet sein, daß
der gegebenenfalls erforderliche Abgleich der Probe mit
mehreren Referenzproben gleichzeitig möglich ist. D. h., das
Photometer muß mehrere Halter für Probenbehälter aufweisen.
Außerdem muß das Photometer derart ausgerüstet sein, daß eine
Messung bei unterschiedlichen Wellenzahlen oder eine Messung
über den gesamten mittleren IR-Spektralbereich möglich ist.
Durch die Weitergabe der gemessenen Daten an einen Rechner kann
dann, der interessierende Stoff hinsichtlich seiner Menge bzw.
Konzentration in der gemessenen Probe berechnet werden. Das
gleiche gilt entsprechend für mehrere Stoffe, die gleichzeitig
bzw. in einem einzigen Probenansatz untersucht und quantitativ
bestimmt werden sollen.
Claims (17)
1. Verfahren zur selektiven quantitativen Bestimmung
mindestens eines Stoffs in wässeriger Lösung, wobei der Stoff
mit einer Verbindung in Wechselwirkung gebracht wird und die
auf diese Wechselwirkung beruhende Änderung des Signals der
Lösung im mittleren Infrarot-Spektralbereich gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Lösung Blut oder
Serum ist.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der
Stoff ein Blutbestandteil ist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der
Stoff ein Enzym ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der
Stoff ein Metabolit ist.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die
Verbindung ein Enzymsubstrat ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym alkalische
Phosphatase und das Enzymsubstrat Dinatrium-3-phenylprop-2-in-
1-olphosphat ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die
Verbindung ein Antikörper ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Stoff mit einem
Molekül, das mit einer im mittleren IR-Bereich nachweisbaren
Gruppe versehen ist, um die Bindung an den Antikörper
kompetiert.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der
mittlere Infrarot-Spektralbereich 1700 bis 4000 cm-1 ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Änderung des Signals
bei 2160 bis 2100 cm-1 gemessen wird.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die
Konzentrationen von zwei oder mehr Stoffen in einer einzigen
Probe gemessen werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei für jeden der Stoffe
eine nachweisbare Verbindungsspezies eingesetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Änderungen der
Signale der jeweiligen Verbindungsspezies unterschiedliche
Infrarot-Spektren ergeben.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Änderungen der
Signale der jeweiligen Verbindunsspezies bei unterschiedlichen
Wellenzahlen gemessen werden.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei zum
Abgleich eine Probe ohne den zu bestimmenden Stoff eingesetzt
wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die
Verbindung in Abwesenheit einer Wechselwirkung mit dem Stoff
in dem zur Messung verwendeten Infrarot-Spektralbereich kein
Signal zeigt und zum Abgleich eine Probe ohne die Verbindung
eingesetzt wird.
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- 2000-11-15 DE DE10056704A patent/DE10056704C2/de not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10056704A1 (de) | 2002-06-06 |
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