DE10027113A1 - Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Bestimmung von bakterieller DNS, wobei die Probe mit bakterieller DNS vorgelegt wird, die Probe mittels eines PCR-Verfahrens behandelt und aus der mittels der PCR vervielfachten DNS die Bakterienart durch Hybridisierung Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonucleotiden DNS genauer bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS; ein Kit dazu sowie die Verwendung des Verfahrens.
Die schnelle Bestimmung von Mikroorganismen, insbesondere der häufig auftreten­ den Bakterien, Viren und Pilze, ist allgemein von Interesse, bspw. bei Lebensmit­ teln, auch Wasser, der Kriminalistik etc. Ein besonders wichtiges Einsatzfeld ist aber die klinische Diagnostik, insbesondere bei Intensivpatienten mit schweren bakteri­ ellen Infektionen, die ein hohes Risiko aufweisen, im Rahmen der systemischen Entzündungsreaktion Organschäden davon zu tragen oder sogar daran zu verster­ ben. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis, des septischen Schocks und des Mul­ tiorganversagens beträgt bis zu 90%. Es stehen zur Zeit keine laborchemischen Frühparameter zur Verfügung, welche den Beginn einer Infektion, auch einer schweren systemischen Infektion anzeigen. Bisherige Routineentzündungspara­ meter wie Anstieg der Leukozytenzahl oder Anstieg des C-reaktiven Proteins rea­ gieren erst mit einer zeitlichen Verzögerung von 1 bis 3 Tagen auf eine systemische Infektion, sind für diese nicht spezifisch und können auch ohne Infektion mit Mikroorganismen erhöht sein. Ein derartiges Verfahren ist aber auch für die Entzün­ dung von lokalen Infektionen, bspw. Augeninfektionen - auch nach Augenoperatio­ nen - die sonst sogar bis zum Verlust des operierten Auges führen können - oder aber lokalen Pilzinfektionen äußerst wünschenswert. Eine frühzeitige Diagnose ei­ ner Infektion ist essentiell für die Möglichkeit einer frühzeitigen Therapie. Insbeson­ dere ist es wichtig, den infizierenden Mikroorganismus zeitig zu identifizieren, um eine gerichtete Antibiotika-Therapie einleiten zu können. Die konventionelle mikro­ biologische Diagnostik durch Anzucht und Kulturnachweis ist hierbei jedoch nicht befriedigend. Zum einen dauert dieser Nachweis häufig mehrere Tage, zum ande­ ren ist diese Art des Nachweises nur möglich, wenn in der vorgelegten Probe vitale Bakterien enthalten sind. Da Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, bakterizide Eigenschaften aufweisen, ist dies jedoch häufig nicht der Fall auch wenn eine Infek­ tion vorliegt. Die konventionelle mikrobiologische Diagnostik weist daher eine hohe falsch negative Befundrate auf. Eine schnelle Diagnose einer Infektion sowie eine schnelle Identifizierung des infizierenden Mikroorganismus würde daher die Mög­ lichkeit einer frühzeitigen Therapie bedeuten, die speziell auf den aufgefundenen Organismen ausgerichtet ist und daher zu der Hoffnung berechtigt, die Krankheits­ schwere oder sogar die Mortalitätsrate der Erkrankung günstig zu beeinflussen. Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Quantifizierung und Qualifizierung mikrobieller DNS/RNS schneller als bislang zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1.
Zur Bestimmung mikrobieller DNS/RNS wird also eingesetzt:
  • - Vorlegen einer Probe mit RNS/DNS
  • - Anreichern der DNS/RNS der Probe
  • - Anreicherung der Probe mit mikrobieller DNS/RNS mittels eines PCR-Verfahrens (Polymerase Cham Reaction)
  • - Unspezifische Amplifikation der DNS/RNS durch die Verwendung von Konsen­ sus Primer wie z. B. der 16-S-RNS
  • - Analyse der physikalischen Eigenschaften der amplifizierten Konsensus- Sequenz wie z. B. die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung zur weiteren Spezifizierung des identifizierenden Mikroorganismus
  • - Weiterhin zur Spezifizierung ggf. Zugabe eines markierten Oligonucleotids
  • - Weiterhin zur weiteren Spezifizierung Analyse der physikalischen Eigenschaften des DNS/RNS-Oligonucleotidkomplexes, wie z. B. der Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung
Es ist vorteilhaft, wenn das PCR-Verfahren ein sog. Real-Time-PCR-Verfahren darstellt, da hierbei gleichzeitig eine Quantifizierung der vorgelegten RNS/DNS in der Probe durchgeführt werden kann sowie bei demselben PCR-Durchgang eine Spezifizierung des identifizierten Mikroorganismus durchgeführt werden kann. Ins­ besondere ermöglicht der Nachweis mikrobieller genomischer DNS mit der sehr sensitiven und quantitativen real time PCR eine sehr frühe laborchemische Detek­ tion einer mikrobiellen Infektion.
Als zu untersuchende Proben eignen sich bspw. Körperflüssigkeiten, Abstriche oder auch homogenisiertes Gewebe. Da a priori in der Regel der infizierende Mikroorga­ nismus nicht bekannt ist, ist es sinnvoll, bei der PCR Primer zu verwenden, mit den möglichst unspezifisch eine Amplifikation von DNS/RNS bei möglichst allen für die Diagnostik in Betracht zu ziehenden Mikroorganismen möglich ist. Solche soge­ nannten Konsensusbereiche finden sich z. B. für Bakterien im Bereich der 16-S-RNS.
Da die für die PCR verwendeten Polymerasen meist bakteriellen Ursprungs sind und daher häufig mit bakterieller DNS verunreinigt sind, ist es in der Regel notwen­ dig, die Verunreinigung vor der "unspezifischen" PCR "unschädlich" zu machen, um zu verhindern, daß die verunreinigende DNS mitamplifiziert wird und so zu einem falschen Ergebnis führt. Es ist daher sinnvoll die in der PCR-Amplifizierung angesetzte Polymerase vor dem Einsatz zur Vervielfachung der mikrobiellen DNS/RNS zu dekontaminieren, bspw. durch Restriktionsenzym-Behandlung, durch Methoxypsoralen/UV-Bestrahlung oder andere geeignete Verfahren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Kit zur schnellen Bestimmung von mi­ krobieller DNS/RNS in Proben mit dekontaminierter Polymerase; Lösung mit einer Standard DNS/RNS-Konzentration einer bekannten Template) DNS/RNS. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung weist das Kit weiterhin mindestens eine DNS/RNS-Oligonucleotid-Sonde auf. Diese speziellen DNS/RNS-Sonden können auch einzeln für die Identifizierung bestimmter Mikroorganismen zum Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren vertrieben werden.
Ferner betrifft die Erfindung auch ein Verfahren oder aber Programm nach An­ spruch 12. Durch dieses Programm können Automaten, die zur Durchführung einer real time-PCR geeignet sind, ebenfalls zum Nachweis und zur Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt werden.
Die Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß zunächst bei unbekanntem Mikroorganismus eine unspezifische Amplifikation durchgeführt wird mit sog. Konsensus-Primer, das jedoch die DNA-Abschnitte, die sich zwischen dem Konsensus-Primer amplifiziert werden für die jeweiligen Bakterien spezifische Un­ terschiede aufweisen, Diese Unterschiede können herangezogen werden, um (nach unspezifischer Amplifikation) eine Identifizierung und Spezifizierung des tatsächlich vorliegenden Mikroorganismus durchzuführen.
Nach unspezifischer Amplifikation der DNS/RNS der Probe kann eine Identifizierung und Spezifizierung des infizierenden Mikroorganismus mit verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, von denen nachfolgend einige Beispiele aufgeführt sind:
  • A) Reverser Dot Blot
  • B) Mittels DNS/RNS-Mikrochip- bzw. Microarray-Technik
  • C) Analyse der Schmelzkurve der gesamten amplifizierten DNS/RNS-Sequenz
  • D) Hybridisierung des Amplifikates mit markierten Oligonucleotid-Sonden, vorteilhafterweise während einer PCR
  • E) Schmelzkurvenanalyse der hybridisierten Oligonucleotid-Sonden
  • F) Kombination der Verfahren unter C-E
ad A
Die DNS/RNS-Mikrochip-Technik ist bspw. als Cnvynne P. und Page G. "Microarray analysis, the next revolution in molecular biology" Scierice 1999 bekannt oder auch bei Sinclair B." Everything's Great When it sits an a Chip - a Bright future for DNS arrays", The Scientist 1999, May 24, 13(11) 18-20 bekannt.
ad B
Der reverse Dot Blot ist bekannt.
ad C
Die einfachste und schnellste Methode eine grobe Vorklassifizierung des infizieren­ den Mikroorganismus durchzuführen, besteht in der Analyse der Schmelztemperatur des gesamten Amplifikates. Hierdurch kann eine einfache Unterscheidung in Gruppen wie z. B. gram-positiver oder gram-negativer Bakterien durchgeführt werden.
ad D
Des weiteren kann bei Durchführung einer real time-PCR eine Spezifizierung mit speziellen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonucleotiden durchgeführt werden.
Weiterhin kann die kombinierte Information aus der Schmelzkurvenanalyse des amplifizierten DNS-Abschnittes sowie des Bindungsverhaltens an spezifische Oligonucleotid-Sonden zur genaueren Spezifizierung herangezogen werden.
ad E
Darüber hinaus kann die Information, die sich aus der Schmelztemperaturanalyse der Oligonucleotid-Sonden ergibt zusätzlich zur Spezifizierung herangezogen werden.
ad F
Schlußendlich ist es möglich, die Information, die sich aus allen genannten analyti­ schen Verfahren ergibt, in Kombination zu benutzen, um den infizierenden Mikroorganismus genauestens zu bestimmen.
Nachfolgend wird die Erfindung spezieller anhand der begleitenden Zeichnung so­ wie von Beispielen erläutert, auf die sie jedoch keineswegs eingeschränkt ist, die aber das Verständnis der Erfindung verbessern sollen. In der Zeichnung zeigt:
Fig. 1: Schmelzkurven von mit CYBER-Green markierten Gesamt-PCR-Produkten von 4 Bakterien, wobei die Fluoreszenz-Intensität als Funktion der Temperatur und die erste Ableitung dieser Kurve dl/dT dargestellt ist;
Fig. 2: Darstellung der Amplifizierung bakterieller DNS durch wachsendes Fluores­ zenzsignal am Ende der annealing-Phase des PCR-Zyklus;
Fig. 3: Schmelzkurven von DNS mit einer spezifischen fluoreszenzmarkierten Hy­ bridisierungssonde für gram-positive Keime (Fluoreszenz-Intensität in Abhängigkeit von der Temperatur bzw. die erste Ableitung der Kurve (darunter).
Fig. 4: Schmelzkurven wie in Fig. 3, aber für gram-negative Keime;
Fig. 5: Schmelzkurven von DNS mit einer spezifischen Hybridisierungssonde für PCR-Produkte der genomischen DNS verschiedener gram-negativer Keime - Fluo­ reszenz-Intensität in Abhängigkeit von der Temperatur bzw. erste Ableitung der Intensität nach der Temperatur.
Fig. 1 Schmelzkurvenanalyse des mit CYBER-Green markierten gesamten PCR-Produktes von vier verschiedenen Bakterien, wobei die Fluoreszenzintensität als Funktion der Temperatur bzw. die erste Ableitung der Intensität nach der Tem­ peratur (im unteren Teil der Abbildung) dargestellt ist. Aus der Abbildung wird deut­ lich, daß auch bei Verwendung eines Konsensus-Primers in diesem speziellen Fall für die 16-S-RNS die resultierenden PCR-Produkte für unterschiedliche Bakterien unterschiedliche physikalische Eigenschaften insbesondere unterschiedliche Schmelztemperaturen aufweisen. Während für Pseudomonas aeruginosa die Schmelztemperatur im Bereich von 86,35 Grad C liegt, lassen sich hiervon deutlich die Schmelztemperaturen von Proteus vulgaris (ca 86,9 Grad C), Serratia marce­ scens (ca 87,75 Grad C) und Klebstella pneumonia (ca 88,4 Grad C) diskriminieren. Es ist somit bereits an Hand der Schmelztemperaturkurvenanalyse des gesamten PCR-Amplifikates möglich, eine Gruppeneinteilung in mindestens 4 Gruppen vorzu­ nehmen. Die Reproduzierbarkeit der Schmelzkurven ist ausgezeichnet, wie sich aus der nachfolgenden Tabelle ergibt.
Fig. 2, 3 und 4 stellen Möglichkeiten dar, die sich durch Verwendung von Oligo­ nucleotid-Sonden bei der PCR ergeben. In diesem speziellen Falle handelt es sich um Sonden, die spezifisch für gram-negative und gram-positive Keime sind. Darge­ stellt sind als Beispiel DNS von E. coli und Staph.epi. Während die gram-negative Sonde bei der PCR nur ein Signal von E. coli darstellt, ergibt sich mit dieser Sonde bei der Probe mit DNS von Staph.epi. kein Signal (Fig. 2 oberer Teil). Umgekehrt identifiziert die Oligonucleotid-Sonde für gram-positive Bakterien eindeutig Staph. epi, ist aber für die Probe mit DNS von E. coli negativ.
Fig. 3 und Fig. 4 stellen für die gleichen Sonden die Schmelzkurvenanalyse dar. Auch an Hand der Schmelzkurven kann eine eindeutige Unterscheidung mit Hilfe der Oligonucleotide durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es möglich, auch innerhalb der gram-negativen Bakterien an Hand der Schmelzkurvenanalyse der Sonde für gram-negative Bakterien weiter zu differenzieren.
Fig. 5 stellt dar, daß sich bereits bei einem (n = 1) Mismatch (Pseudomonas aeru­ ginosa) eine deutlich niedrigere Schmelztemperatur ergibt als bei einem kompletten Match der Sonde (Enterobacter aerogenae und Serratia marcescens).
Somit kann durch Auswahl spezieller Sonden und Analyse der Schmelzkurven der Hybridisierungsprodukte die mikrobielle DNS sehr schnell ermittelt werden, welche DNS vorliegt. Dabei ist es nicht notwendig für jedes Bakterium eine spezifi­ sche Sonde herzustellen sondern es können mittels einiger weniger Sonden und den Schmelzpunkten des Hybridisierungsproduktes Aussagen über die Mikroorga­ nismusart getroffen werden. Überraschenderweise ist es damit möglich, in nur ei­ nem Analysengang bei der Online-PCR nicht nur einen quantitativen Nachweis der mikrobiellen DNA durchzuführen, sondern bereits im Anschluß an die Amplifikation durch Analyse mit wenigen Oligonucleotiden eine Identifizierung einer Vielzahl von verschiedenen Mikroorganismen.
Eine bevorzugte Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche ist die Schnellbestimmung von mikrobieller genomischer DNS insbesondere bei Intensiv­ patienten. Im Gegensatz zum konventionellen mikrobiologischen Nachweis mittels Kulturtechniken, die in der Regel mehrere Tage dauert, kann das hier dargestellte Verfahren mittels Online-PCR in weniger als 3 Stunden durchgeführt werden. Hier­ aus ergibt sich eine enorme Beschleunigung der Diagnostik und somit eine we­ sentlich frühzeitigere Möglichkeit der gezielten Therapie.
Das Verfahren kann jedoch überall eingesetzt werden, wo schnell mikrobielle Kontamination quantifiziert und qualifiziert werden muß bspw. in der Kriminalistik aber auch in der Lebensmittelüberprüfung etc.
Beispiel 1 Bestimmung bakterieller DNS aus Vollblut Isolation der DNS
Zur Isolation der freien bakteriellen DNS aus Patientenplasma wird Vollblut in ein EDTA-Vollblutröhrchen (3,2 ml; Sarstedt) gesammelt. Das Vollblut wird sofort nach der Abnahme bei 2000 g 3 min zentrifugiert. Das überstehende Plasma wird von den zellulären Bestandteilen vorsichtig abgezogen. Das Plasma wird entweder direkt weiter bearbeitet, oder bei -25°C gelagert.
Die DNS-Präparation erfolgt einheitlich mit dem Nucleinsäure-Isolations-Kit "High Pure viral Nucleic Acid Kit" der Firma Roche Molecular Biochemicals. Die Zentrifu­ gationsschritte werden in einer Zentrifuge der Firma Heraeus durchgeführt. Für die Inkubationen steht ein Thermomixer von Eppendorff zur Verfügung. Gearbeitet wird mit Pipetten von Eppendorff. Alle Pipettenspitzen sind autoklaviert und mit Filtern versehen. Folgendes Standardprotokoll wird zur Gewinnung von DNS aus 200 µl Plasma angewandt:
In ein 1,5 ml-Eppendorff-Reaktionsgefäß werden 250 µl Plasma mit 200 µl Binde­ puffer und 40 µl Proteinase K vermischt und für 10 min bei 72°C inkubiert. Dann wird die Probe mit 100 µl Isopropanol versetzt und gut gemischt. Die Probe wird in das obere Reservoir der High Pure Filter-Tube pipettiert und für 1 min bei 8000 × g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wird wiederholt. Die Elution der im Tube gebun­ denen Nukleinsäuren erfolgt mit 50 µl Elutionspuffer ebenfalls für 1 min bei 8000 × g. Die im Auffanggefäss erhaltene DNS-Lösung wird entweder bei -25°C gelagert oder sofort für die PCR verwandt.
Dekontamination des Mastermixes
Die 16 S RNS ist innerhalb des bakteriellen Genoms eine hochkonservierte Region und eignet sich daher sehr gut für den allgemeinen Nachweis mikrobieller DNS durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Kontaminierende bakterielle DNS von recombinant hergestellten Reagenzien wird allerdings ebenso mitamplifiziert und führt zu einem "Hintergrundrauschen" des Verfahrens aufgrund der Amplifikation kontaminierender mikrobieller DNS.
Aufgrund der rekombinanten Herstellung aller kommerziellen Taq-Polymerasen in einem bakteriellen Wirt und einer unzureichenden Aufreinigung des Enzyms, stellt die Taq-Polymerase selbst die Hauptkontaminationsquelle von mikrobieller geno­ mischer DNS dar. Eine Dekontamination der Polymerase und des Mastermixes, welcher die wesentlichen Reagenzien der PCR enthält, vor Zugabe der Template DNS ist notwendig, um das sogenannte Hintergrundrauschen" der Methodik zu verringern.
Alle folgenden Reagenzien stammen, wenn nicht anders angegeben, aus dem SYBR Green 1 Kit (Roche). Ansatz des Mastermixes zur Dekontamination in einem sterilen 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß:
9,4 µl ddH20
2,4 µl MgCl++-Stammlösung
2,0 µl CYBR-Green 1 Mastermix
0,2 µl (entspr. 1 Einheit) Mbo 1 (New England Biolabs).
Der Ansatz wird kurz gevortext und zentrifugiert (13 000 g, 10 s). Es folgen 45 min Inkubation bei 37°C, in denen das Restriktionsenzym kontaminierendes bakterielles Template schneidet, das so in der folgenden PCR nicht mehr amplifiziert werden kann. Nach dieser Dekontamination wird die Restriktionsendonuklease bei 95°C 3 min inaktiviert - Abkühlen auf Eis. Danach werden je 0,5 µl (entsp. 10 µmol) PCR- Primer AR3 und AR4 hinzugefügt Die hier verwendeten Primer werden von Biomol (Belgien) bezogen und sind HPLC gereinigt.
Die Primersequenzen lauten wie folgt:
Der Mastermix wird anschließend kurz gevortext und zentrifugiert (13 000 g, 10 s). Danach werden 15 µl des dekontaminierten Mastermixes in die LightCy­ cler-Kapillare überführt und 5 µl Proben-DNS (oder Standard-Verdünnungs-Proben, Sau.) hinzugefügt. Die Kapillaren werden danach verschlossen, bei 1000 g 10 sec zentrifugiert und in den LightCycler-Rotor eingesetzt.
Ansetzen einer Standard-Verdünnungs-Reihe
Für die quantitative Bestimmung bakterieller genomischer DNS ist es notwendig, eine Standard-Verdünnungs-Reihe mit bekannten DNS-Konzentrationen aus Tem­ plate DNS herzustellen, die bei jeder PCR mitamplifiziert wird. Aus der Fluoreszenz der Standard-Verdünnungs-Proben ermittelt der LightCycler (Roche) eine Regressi­ onsgerade, über welche die Konzentration der Proben berechnet wird.
Für die Standard-Verdünnungs-Reihe wurde genomische DNS von staphylococcus epidermidis photometrisch bei 260 nm quantifiziert. Hierbei entspricht eine Optische Dichte (OD) von 1,0 50 pl/ml doppelsträngiger DNS. Die Reinheit der Proben wird aus dem Verhältnis OD(260) : OD(280) ermittelt. Ein Verhältnis von 1,8-2,0 gilt als rein. Anschließend erfolgt eine Verdünnung auf 500, 100, 50, 10, 5 und 1 fg/µl. Von diesen wurde je 5 µl als Template dem PCR-Mastermix zugesetzt.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR erfolgt auf einem LightCycler (Roche) unter Verwendung der Lightcycler Run Software 3.39. Es wurde zunächst eine initiale Denaturierung bei 95°C 30 sec mit 20°/sec Transition Rate durchgeführt. Es schlossen sich 45 Zyklen mit:
Denaturierung 95°C, 1 sec, 20°/sec
Annealing 60°C, 5sec, 20°/sec
Extension 72°C, 7sec, 20°/sec,
Measurement 83°C, 0 sec, 20°/sec, (Acquisition Mode: single) an.
Im Anschluß an die Amplifizierung wird das entstandene Produkt mittels Schmelz­ kurve analysiert. Die Bedingungen hierbei sind:
Denaturierung 95°C, 3 sec, 20°C/sec
Cooling 60°C, 30sec, 20°C/sec
Measurement 95°C, 0 sec, 0.1°C/sec, Acquisition Mode: continuous.
Abschließend wurde die PCR durch einen Kühlschritt mit 40°C, 30sec, 20°/sec be­ endet.
Datenanalyse/Quantifizierung
Für die Datenanalyse und Quantifizierung der bakteriellen DNS wird die halbau­ tomatische Lightcycler-Sollware 3.1.102 eingesetzt. Der Ablauf der Analyse und Quantifizierung erfolgt in drei Schritten und wird durch die Software vorgegeben:
  • 1. Festlegung der Autofluoreszenz-Schwelle durch Software im Arrhythmetikmodus
  • 2. Festlegung des Noise-Bands manuell anhand der Kurven der Standard- Verdünnungs-Reihe. Das Noise-Band wird in den loglinearen Anteil der Standard-Verdünnungs-Reihe unmittelbar nach dem unteren Inflexions­ punkt gelegt.
  • 3. Die Quantifizierung der Proben erfolgt anhand einer Regressionsgeraden, die durch die LightCycler-Software anhand der Standard-Verdünnungs-Reihe ermittelt wird.
Beispiel 2 Bestimmung bakterieller DNS im Plasma von Sepsis-Patienten
Es wurden die gleichen Verfahrensschritte, wie bei Beispiel 2 am Plasma von Sep­ sis-Patienten durchgeführt, allerdings erfolgte die Dekontamination der PCR-Rea­ gentien auf die nachfolgende Weise:
Reinigung der bakteriellen PCR-Reagentien durch Methoxypsoralen-Behandlung
Die Quantifizierung mikrobieller DNS/RNS by PCR-Amplification ist sinnvoll, wobei aber die Verunreinigung der PCR-Reagentien mit mikrobieller DNS ein schwerwie­ gendes Problem darstellt, die zu falsch positiven Resultaten führen, wenn ein universeller 16S-rRNS-Primer eingesetzt wird. Hier wird 8-Methoxypsoralen kombi­ niert mit UV-Bestrahlung zur Inaktivierung verunreinigender DNS eingesetzt.
Es wird die Wirkung von 8-Methoxypsoralen auf die PCR-Agentien, insbesondere auf das Hintergrundrauschen verunreinigender 16S rRNS unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems zur Detektion mikrobieller DNA im Plasma von Sepsis-Pati­ enten untersucht. Auch hier wurden wieder alle PCR-Reaktionen auf dem Lightcy­ cler Instrument (Roche) durchgeführt. Quantifizierung wurde gemäß den SYBR Green I-Verfahren durchgeführt. Zur Dekontamination wurden 25 ug/ml 8-Meth­ oxypsoralen (Sigma) und 5 min UV-Bestrahlung (366 nm) eingesetzt. Das 8-Methoxypsoralen wurde in Dimethylsulfoxid 2,5%, gelöst. Durch die Dekontami­ nation der PCR-Agentien kann nun 16S rRNS von verstärkter Staphylococcus epi­ dermidis-DNS durch die Schmelzkurvenanalyse unterschieden werden (Schmelzpunkt der verunreinigenden E. Coli-DNS 89°C; Schmelzpunkt der Sta­ phylococcus epidermidis-DNS: 87°C. Die Behandlung der PCR-Reagentien mit 8-Me­ thoxypsoralen und UV-Bestrahlung führte zur Elimination von bis zu 800 Kopien DNS, wobei 400 Kopien, die zu einer Probe nach dem Dekontaminationsverfahren zugesetzt wurden, ohne Koamplifikation der verunreinigenden DNS amplifizert wer­ den konnten.
Die Behandlung der PCR-Reagentien mit 8-Methoxypsoralen und UV führt demzu­ folge zu einer zufriedenstellenden Elimination von verunreinigender mikrobieller DNS.
Die übrigen Schritte wurden wie bei Beispiel 1 durchgeführt.
Beispiel 3
Die Verfahren wurde, wie in Beispiel 1 durchgeführt, allerdings erfolgte die De­ kontamination der PCR-Agentien wie folgt:
Reinigung der PCR-Agentien durch DNAse
Ein alternatives Reinigungsverfahren für die PCR-Reagentien liegt im Einsatz von DNAse.
Zur Reinigung der PCR-Agentien, die zu falsch positiven Ergebnissen bei einer Real-Time-PCR führen und aus mikrobieller DNS bei der Herstellung der PCR-Rea­ gentien stammen, werden die PCR-Reagentien 15 min mit DNAse behandelt. Da­ nach wurde die DNAse durch Wärmebehandlung bei 95°C über 50 min inaktiviert. Deep-Vent-Exo(-)polymerase und Ampli-Taq-Polymerase wurden für die Amplifika­ tion mit Breitband-Primern von konservierter mikrobieller 16S ribosomaler DNS- Nucleotid-Sequenzen durch Polymerase Chain Reaction verwendet. Die derart de­ kontaminierten PCR-Agentien ermöglichten einen Ausschluß der verunreinigenden bakteriellen DNS aus den PCR-Reagentien.
Es konnten mit den erfindungsgemäß gereinigten PCR-Reagentien Bakterien-DNS- Konzentrationen von nur 6 pg/ml bestimmt werden.
Beispiel 4 Grobe Identifikation bakterieller DNS
Die DNS-Schmelzkurven verschiedener Bakterien wurden untersucht.
Die gram-negativen Bakterien zeigten eine Schmelztemperatur zwischen 89.7 und 89.1°C, während die gram-positiven Bakterien eine Schmelztemperatur zwischen 87,9 und 87,6°C aufwiesen. E. coli zeigt die gleiche Schmelztemperatur wie die die Taq-Polymerase verunreinigende DNS. Dieses weist darauf hin, daß die verunreini­ gende DNS aus von E. coli stammenden Polymerasen stammt. Im vorliegenden Fall zeigten Amplifikationsprodukte von Patienten mit Sepsis Schmelzkurven, die sich von diesem Hintergrundsignal unterschieden. Diese Kurven zeigten Schmelztem­ peraturen von 88.1 und 87.2°C. Die Identifizierung der Bakterien kann durch Hybri­ disierung Fluoreszenzfarbstoff-markierter Oligonucleotide mit der amplifizierten bakteriellen DNS verfeinert werden.
Demzufolge ist die DNS-Schmelzpunktanalyse in Kombination mit der Hybridisie­ rung spezifischer, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelter Oligonucleotide mit dem PCR- Produkt ein ausreichendes Verfahren, um Bakterienspezies sehr schnell zu unter­ scheiden und zu bestimmen.
Spezifizierung der amplifizierten PCR-Produkte
Ein Beispiel für die im zweiten Schritt der Methodik durchgeführte Identifikation der Keimspezies ist die Technik des reversen Dot Blots. Die Spezifizierung der Keime ist nicht auf diese Technik beschränkt sondern auch zum Beispiel mittels DNS-Mi­ krochip-Technik durchführbar.
Beispiel 5 Spezifizierung der amplifizierten DNS/RNS Reverser Dot Blot
Es wurden verschiedene Mikroorganismen, wie aus der nachfolgenden Tabelle er­ sichtlich, nach Amplifizierung ihrer DNS/RNS bestimmt.
Das PCR-Produkt der Quantifizierungsreaktion von bakterieller DNA wird während der PCR-Reaktion durch Einbau von Digoxigenin-markiertem dUTP markiert (die Amplifikation von Pilz-DNA wird anhand der in Liste 1 angegebenen Konsensus­ primer PFU1 und PFU2 durchgeführt). Das PCR-Produkt dient nach seiner Quantifi­ zierung durch "Real Time PCR" zur Hybridisierung mit auf einer positiv geladenen Nylonmembran fixierten keimspezifischen Oligonucleotidsonde (reverser Dot Blot). Die positive Bindung des PCR-Produktes an eine spezifische Sonde (Sondendesign für die Bakterienspezies und Pilzart: Liste 1) wird anhand einer Antikörperbindung und Substratreaktion durch Chemilumineszenzsignal auf einem Röntgenfilm detektierbar.
Benötigte Materialien
  • - Falkon-Röhrchen (50/25 ml);
  • - Nylonmembran (bspw. Roche Diagnostics) (ca. 5 × 8 cm2).
Die entsprechenden Oligonucleotid-Sonden in einer Konzentration von 100 pMol/µl und das PCR-Produkt, durch Dig-dUTP-Einbau markiert (Positivkontrolle für die Detektion) wurden je 2µl auf die trockene Nylonmembran aufgebracht. Die Nuclein­ säuren wurden auf der Nylonmembran durch UV-Bestrahlung (Crosslinking mit UV- Licht (302 nm, 400 mJoule/cm2) fixiert.
Prähybridisierung (1 Stunde)
30 ml Standardhybridisierungspuffer wurden in Falkon-Röhrchen gefüllt, die Mem­ bran eingelegt, und 1 Std. bei Hybridisierungstemperatur (50°C) inkubiert.
Hybridisierung (1 Stunde)
Die DNS des zu spezifizierenden Dig-dUTP-markierten PCR-Produktes wurde 10 min bei 95°C hitzedenaturiert, dann auf Eis gekühlt. Falls die eingefrorene (-20°C) Hybridisierungslösung mit markierter DNA wiederverwendet werden soll, wird diese ebenfalls vorher 10 min bei 95°C denaturiert.
Der Prähybridisierungspuffer wird verworfen. Das Filter darf bis zur Hybridisierung nicht trocken werden. 6 ml erwärmter Standardhybridisierungspuffer + 40 µl PCR- Produkt werden in Falkon-Röhrchen gefüllt und 1 h inkubiert. Danach wird 2 × 5 min bei Raumtemperatur mit 2 × Waschlösung (2 × SSC, 0,1% SDS) gewaschen, so­ dann 2 × 15 min bei Hybridisierungstemperatur mit 0.5 × Waschlösung (0.5 × SSC, 0.1% SDS). Danach wird die Nylonmembran luftgetrocknet oder weiter detektiert.
Für die Hybridisierung verwendete Puffer
Hybridisierungspuffer: 5 × SSC, 0,1% N-Lauroylsarkosin, 0,021/o SDS, 1% Blockie­ rungsreagenz (Kasein in Maleinsäurepuffer), bei 70°C gelöst.
Maleinsäurepuffer: 0,1 M Maleinsäure, 0,15 NaCl, auf pH 7,5 mit NaOH eingestellt.
Detektion des spezifisch an die Nylonmembran gebundenen PCR-Produktes
Alle Inkubationen erfolgen bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Die Membran wird kurz (1-3 min) in Waschpuffer gewaschen, 30 min im Blockierungs­ puffer (leicht schütteln) inkubiert; danach 30 min in 30 ml-Blockierungspuffer unter Zugabe von 3 µl Anti-DIG-AP (Verdünnung 1 : 10.000) inkubiert. Dann wird die Membran zwei mal jeweils 15 min in Waschpuffer gewaschen, danach 2 min im Detektionspuffer. Dann wird die Membran (bis auf eine Seite!) eingeschweißt.
In einem sterilen Eppendorfröhrchen werden 990 µl Detektionspuffer + 10 µl CSPD (Box im Gefrierschrank) gemischt und mit der sterilen Pipette gleichmäßig auf die Membran aufgebracht.
Die zugeschweißte Membran wurde 15 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde die ein­ geschweißte Membran in eine Belichtungskassette eingelegt, ein Röntgenfilm auf­ gelegt (im Dunkeln), markiert und verriegelt. Die Belichtung des Röntgenfilms wird 20-30 min durchgeführt. Nach der Belichtungszeit wird der Röntgenfilm entwickelt. Der Keimbefund wird anhand des Chemilumineszenz-Signals als dunkler Punkt (Dot) auf dem Röntgenfilm abgelesen.
Zur Detektion verwendete Puffer
Waschlösung 0,3% Tween 20 in Maleinsäure-Puffer
Maleinsäurepuffer: 0,1M Maleinsäure, 0,15M NaCl, pH 7,5 mit NaOH einstellen
Blockierungspuffer: 10% Blockierungsreagenz in Maleinsäurepuffer
Detektionspuffer: 100 mM TRIS-HCl, pH 9.5; 100 mM NaCl
Als keimspezifische Sonden und Primer können - wobei die Erfindung keinesfalls auf diese beschränkt ist bspw. für die angegebenen Mikroorganismen die nach­ folgenden Oligonucleotide eingesetzt werden:
Basensequenzen von Beispielen als keimspezifische Sonden und Primer anwend­ baren Oligonucleotiden in 5' nach 3' Richtung
Die Erfindung kann bspw. mit den oben aufgeführten Oligonucleotiden verwirklicht werden, sie ist aber keineswegs auf die oben beispielhaft aufgeführten Mikroorga­ nismen eingeschränkt, sondern läßt sich, mutatis mutandis, wie dem Fachmann offensichtlich ist, auch auf weitere Mikroorganismen anwenden. Während die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele erläutert wurde, ist sie kei­ neswegs auf diese beschränkt, sondern erstreckt sich auf alle dem Fachmann ge­ läufigen, unter den Schutzbereich der Ansprüche fallenden Ausführungsformen.

Claims (12)

1. Verfahren zur Bestimmung mikrobieller DNS/RNS, gekennzeichnet durch:
  • - Vorlegen einer Probe mit RNS/DNS;
  • - Anreichern der DNS/RNS der Probe
  • - Zugabe von mindestens einem markierten Oligonucleotid und temperaturabhängige Hybridisierung
  • - Bestimmung der DNS/RNS aufgrund der physikalischen Eigenschaften des DNS/RNS/Oligonucleotidkomplexes, wie der Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung.
2. Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch:
  • - Anreichern der Probe mit mikrobieller DNS/RNS mittels eines PCR-Verfahrens; und
  • - Bestimmung der mittels der PCR vervielfachten DNS/RNS-Kopien.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das PCR-Verfahren ein real-Time- PCR-Verfahren ist und damit die Menge mikrobieller DNS/RNS in der Ausgangsprobe ermittelt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der mikrobiellen DNS/RNS über die Schmelzkurve eine Vorklassifizierung des mindestens einen Mikroorganismus durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der mikrobiellen DNS/RNS ein reverser Dot Blot mit geeigneten DNS/RNS-Sonden eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der mikrobiellen DNS/RNS ein DNS-Chip/DNS-Microarray eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die in der PCR verwendeten Polymerasen vor dem Einsatz zur Vervielfachung der mikrobiellen DNS/RNS dekontaminiert werden, wie durch Restriktionsenzym-Behandlung, durch Methoxypsoralen/UV- Bestrahlung.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe Körperflüssigkeit, Abstriche oder Gewebe ist.
9. Kit zur schnellen Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS in Proben, gekennzeichnet durch dekontaminierte Polymerase und Lösung mit einer Standard-DNS/RNS-Konzentration einer bekannten (Template) DNS/RNS.
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner DNS und/oder DNS-Sonden aufweist.
11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche zur Schnellbestimmung von mikrobieller genomischer DNS oder von RNS.
12. Programm zur Bestimmung von DNS/RNS in einem Automaten während einer PCR in Gegenwart mindestens einer markierten DNS/RNS-Sonde, die bei Bindung an DNS/RNS ein bindungstypisches optisches Signal ergibt, mit:
Eingabe der speziellen DNS/RNS-Sonde;
Erhalt und Speichern von Meßwerten von für die Bindung der DNS/RNS-Sonde an DNS/RNS- Abschnitte spezifischen Signalen in Abhängigkeit von der Temperatur während eines PCR- Verfahrens;
Berechnen der ersten Ableitung des optischen Signals von Temperatur dl/dT und
Berechnen des mindestens einen Tmax des maximalen Fluoreszenzsignals;
Vergleich des berechneten Tmax des Fluoreszenzsignals mit einer abgespeicherten Wertetabelle, in der typische Werte für bestimmte Mikroorganismen abgelegt sind; und
Ausgabe von Informationen über die mit der ermittelten Tmax übereinstimmenden Mikroorganismus-Art/en.
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