DE10013223A1 - Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen Verwendung als Transplantationsmaterial - Google Patents
Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen Verwendung als TransplantationsmaterialInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein äußerst einfaches Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem und mechanisch stabilem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen Verwendung als Transplantationsmaterial zur Behandlung von Knorpel- oder Knochendefekten und von degenerativen Erkrankungen, wie z. B. Rheuma oder Arthrose sowie dessen Verwendung zur Testung von Wirkstoffen. Gegenstand der Erfindung sind auch das hergestellte Knorpel- oder Knochengewebe und therapeutische Zubereitungen, z. B. Injektionslösungen, die dieses Gewebe beinhalten.
Description
Die Erfindung betrifft ein äußerst einfaches Verfahren zur
in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem und
mechanisch stabilem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen
Verwendung als Transplantationsmaterial zur Behandlung von
Knorpel- oder Knochendefekten und von degenerativen
Erkrankungen, wie z. B. Rheuma oder Arthrose sowie dessen
Verwendung zur Testung von Wirkstoffen. Gegenstand der
Erfindung sind auch das hergestellte Knorpel- oder Knochen
gewebe und therapeutische Zubereitungen, z. B. Injektions
lösungen, die dieses Gewebe beinhalten.
Auf dem Gebiet des Tissue Engineering wird seit längerem
nach Lösungen zum Aufbau körpereigenen Gewebes gesucht.
Dazu werden zum einen körpereigene Zellen mit und ohne
Trägermaterial verwendet und zum anderen ausschließlich
Trägermaterialien in den Defekt eingebracht, wobei je nach
Indikation resorbierbare oder nicht resorbierbare Materia
lien verwendet werden können.
Bei der Verwendung von Trägermaterialien ist nachteilig,
daß deren Abbauprodukte andere Gewebe schädigen können und
daß bei Verwendung von nicht autogenen, also nicht patien
teneigenen Trägermaterialien Immunreaktionen oder Infek
tionen mit tierischen oder menschlichen Erregern auftreten
können.
Eine bekannte Methode unter Verwendung von körpereigenen
Zellen ist die Knorpel- und Knochenzelltransplantation, die
zur Behandlung von Knorpel- und Knochendefekten angewandt
wird. Dabei wird das Potential der Knorpel- und
Knochenzellen genutzt, um in vivo neues Gewebe aufzubauen.
So werden beispielsweise dem Patienten Knorpel- oder Kno
chenbiopsien entnommen, daraus Knorpel- oder Knochenzellen
isoliert, mittels Zellkultivierung vermehrt und an
schließend dem Patienten die Zellen im Bereich des
Gewebedefektes, z. B. durch Einspritzen, transplantiert.
Dort bilden sie neues Gewebe und füllen somit den Defekt
vollständig auf.
Durch die genannten Verfahren wird erreicht, daß nach
Applikation der Zelltransplantate oder Einbringen der
Trägermaterialien im Körper Gewebe aufgebaut wird.
Ein weiteres Ziel im Tissue Engineering besteht jedoch
darin, körpereigenes Gewebe bereits in vitro vorzufertigen.
Dazu sind aus der Literatur eine Vielzahl von Verfahren
bekannt (vgl. DE 195 40 487, WO 97/46665, DE 197 52 900,
US 5.932.459), die entweder spezielle Vorrichtungen oder
Träger benötigen, viele Verfahrensschritte beinhalten oder
die Zugabe von wachstumsfördernden Verbindungen, die
Fremdstoffe für den Körper darstellen, erforderlich machen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein
möglichst einfaches Verfahren zur Herstellung von typischem
Knorpel- oder Knochengewebe bereitzustellen, mit dem
vitales, dreidimensionales und mechanisch stabiles Gewebe
hergestellt werden kann, das zur Transplantation geeignet
ist und ein schnelles Anwachsen im Körper bzw. ein
schnelles Auffüllen des Knorpel- oder Knochendefektes
gewährleistet. Außerdem soll das in vitro hergestellte
Gewebe möglichst keine immunologischen Reaktionen im
Organismus, der das Transplantat erhält, auslösen.
Es wurde überraschender Weise gefunden, daß diese Aufgabe
mit dem in Anspruch 1 angegebenen, einfachen Verfahren
gelöst werden kann.
Erfindungsgemäß werden als Ausgangsmaterial patienteneigene
Gewebebiopsien oder -proben oder mesenchymale Stammzellen,
z. B. aus dem peripheren Blut oder Knochenmark verwendet.
Aus den Biopsien werden die gewebeaufbauenden Zellen
mittels enzymatischem Verdau des Gewebes, durch Auswandern
oder durch Reagenzien, die Zielzellen erkennen, mit
üblichen Methoden isoliert. Diese Zellen werden dann
erfindungsgemäß in einfacher Weise mit üblichem
Kulturmedium in Zellkulturgefäßen mit hydrophober Ober
fläche und sich verjüngendem Boden in Suspension so lange
stationär kultiviert, bis ein dreidimensionales Zell
aggregat entsteht, das zu mindestens 40 Volumen%, vorzugs
weise mindestens 60 Volumen% bis maximal 95 Volumen%,
extrazelluläre Matrix (ECM) beinhaltet, in welche
differenzierte Zellen eingebettet sind. Das entstandene
Zellaggregat weist einen äußeren Bereich auf, in welchem
proliferations- und migrationsfähige Zellen vorhanden sind.
Diesen Aufbau der erfindungsgemäß erhaltenen Zellaggregate
verdeutlichen die mikroskopischen Aufnahmen in Abb. 1 und
1a, wobei Abb. 1 die Ausschnittsvergrößerung des Quer
schnittes eines erfindungsgemäßen Zellaggregates mit vP als
Zone verminderter Proliferation und Auftreten der ersten
gewebespezifischen Matrixproteine und M als Zone der
Bildung von gewebespezifischen Matrixproteinen darstellt,
und Abb. 1a das gesamte Zellaggregat mit der äußeren
Proliferationszone P (Zone der Expression des Proteins
S 100) zeigt.
Es ist erstaunlich, daß alle Zellen, die in den nach dieser
Erfindung hergestellten Sphäroiden integriert sind,
überleben und auch nach fortschreitender Kultivierungsdauer
die Zellen im Inneren nicht absterben. Mit fortschreitender
Kultivierungsdauer differenzieren die Zellen im Inneren der
Aggregate aus und es bilden sich Sphäroide, die aus ECM,
differenzierten Zellen und einer Proliferationszone am Rand
bestehen. Der Prozeß der Bildung dieser gewebespezifischen
Matrix mit eingebetteten Zellen ist dem Prozeß der Gewebs
entstehung bzw. -neubildung und -umbildung im Körper sehr
ähnlich. Während der Differenzierung in Zellkultur wird der
Abstand der aggregierten Zellen durch Bildung der
gewebespezifischen Matrix immer größer. Es entsteht im
Inneren der Sphäroide eine Gewebehistologie, die dem
natürlichen Gewebe sehr ähnlich ist. Die Versorgung der
Zellen im Inneren der Sphäroide erfolgt allein durch die
Diffusion der Nährstoffe. Während der weiteren Herstellung
der Sphäroide bildet sich die Proliferationszone am Rand
der Sphäroide. Diese Zone hat den unschätzbaren Vorteil,
daß nach Einbringen der Sphäroide in Defekte, die in dieser
Randzone befindlichen Zellen in der Lage sind, auszuwandern
und aktiv den Kontakt zum umliegenden Gewebe herzustellen
bzw. eine Integration des in vitro gebildeten Gewebes in
seine Umgebung ermöglichen. Damit sind die hergestellten
gewebespezifischen Zellaggregate hervorragend zur Behand
lung von Gewebsdefekten und zum Neuaufbau von Gewebe in
vitro und in vivo geeignet.
In Abhängigkeit von der Größe des zu behandelnden
Gewebedefektes kann es von Vorteil sein, bereits größere
Gewebestücke zu transplantieren, um ein schnelleres
Auffüllen des Defektes zu erreichen. Für diesen Fall werden
mindestens zwei, besser aber mehr der erhaltenen
Zellaggregate fusioniert, indem sie gemeinsam unter den
gleichen Bedingungen und in den gleichen Kulturgefäßen wie
oben beschrieben bis zur gewünschten Größe weiterkultiviert
werden.
Abb. 1b zeigt zwei zu fusionierende Sphäroide nach einem
Tag.
Abb. 1c zeigt, daß bereits einige Stunden später die Grenze
zwischen den beiden Sphäroiden nicht mehr zu erkennen ist.
Nach einer weiteren Woche sind die Sphäroide vollständig
fusioniert und es ist ein größeres in vitro Gewebestück
entstanden (Abb. 1d). Der Aufbau der so erhaltenen größeren
Zellaggregate ist mit dem der zunächst erhaltenen Sphäroide
identisch. Sie können bis zu maximal 95% ECM beinhalten und
alle im erhaltenen Gewebestück enthaltenen Zellen sind
vital.
Das erhaltene Knorpel- oder Knochengewebe ist außeror
dentlich stabil. Die Zellaggregate können auf ¾ ihres
Durchmessers komprimiert werden, ohne daß sie zerbrechen
oder beispielsweise beim Injizieren in den Körper mittels
einer Kanüle auseinanderfallen. Es ist möglich, diese
Gewebestückchen mit einer Pinzette oder einer Pipette aus
dem Zellkulturgefäß zu entnehmen.
Um ausreichend Knorpel- oder Knochenzellen für die
erfindungsgemäße Suspensionskultivierung zur Verfügung zu
haben, werden die vom Patienten gewonnenen Zellen in einer
vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung zunächst in an
sich bekannter Art und Weise in Monolayerkultur vermehrt.
Die Passage der Zellen in Monolayerkultur wird so gering
wie möglich gehalten. Nach Erreichen des konfluenten
Stadiums werden die in Monolayer gewachsenen Zellen
geerntet und gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens in
Suspension, wie oben beschrieben, kultiviert.
Als Zellkulturmedium kann sowohl für die Suspensions- als
auch für die Monolayerkultur übliches Medium, z. B.
Dulbecco's MEM, unter Zusatz von Serum, verwendet werden.
Vorzugsweise wird DMEM und Hams im Verhältnis 1 : 1
eingesetzt. Um jedoch immunologische Reaktionen des
Patienten auf das in vitro hergestellte Gewebe zu
vermeiden, wird als Serum vorzugsweise autogenes Serum des
Patienten eingesetzt. Es ist auch möglich xenogenes oder
allogenes Serum zu verwenden.
Dem Kulturmedium werden erfindungsgemäß keine Antibiotika,
Fungistatika oder andere Hilfsstoffe zugesetzt. Es hat sich
gezeigt, daß nur die autogene, xenogene oder allogene
Kultivierung der Zellen und Zellaggregate sowie die Kulti
vierung ohne Antibiotika und Fungistatika eine unbeein
flußte Morphologie sowie Differenzierung der Zellen in der
Monolayerkultur und eine ungestörte Bildung der spezi
fischen Matrix in den Zellaggregaten ermöglicht. Weiterhin
sind durch den Verzicht sämtlicher Zusatzstoffe während der
Herstellung nach Einbringen des in vitro hergestellten
Gewebes in den menschlichen und auch tierischen Organismus
sämtliche immunologische Reaktionen ausgeschlossen.
Es ist allerdings überraschend, daß weder bei der Suspen
sionskultivierung, noch bei der Monolayerkultivierung
Wachstumsfaktoren oder andere wachstumsfördernde Zusätze
notwendig sind. Trotz des Fehlens dieser Zusätze werden
bereits nach zweitägiger erfindungsgemäßer Suspensionskul
tivierung dreidimensionale Zellaggregate mit gewebespezi
fischen Eigenschaften erhalten. Die Größe hängt natürlich
von der eingebrachten Zellzahl pro Volumen Kulturmedium ab.
Werden beispielsweise 1 × 107 Zellen in 300 µl Kulturmedium
eingebracht, so entstehen innerhalb von 1 Woche dreidi
mensionale Sphäroide von ca. 500-700 µm Durchmesser. Für
einen 1 cm2-Gewebedefekt müßten ca. 100 solcher Sphäroide
transplantiert, z. B. injiziert, werden. Die andere Mög
lichkeit ist die in vitro-Fusion der kleinen Zellaggregate
zu größeren - wie oben beschrieben - und das Einbringen
dieser in den Defekt. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß
zwischen 1 × 104 und 1. × 107 Zellen in 300 µl Kulturmedium
zur Herstellung der kleinen Zellaggregate verwendet,
besonders bevorzugt 1 × 105 Zellen. Die nach einigen Tagen
gebildeten Sphäroide werden dann für mindestens 2-4 Wochen
in Abhängigkeit von der Zellart und den patienten
spezifischen Charakteristika in dem geeigneten Kulturmedium
kultiviert, um die Ausbildung der gewebespezifischen Matrix
zu induzieren. Im besonderen Falle können dann einzelne
Sphäroide ab ca. einer Woche Kultivierung fusioniert
werden, um die Größe des Gewebestückes zu erhöhen.
Als Zellkulturgefäße müssen für die erfindungsgemäße
Kultivierung in Suspension solche mit hydrophober, also
adhäsionsverhindernder Oberfläche, wie z. B. Polystyrol
oder Teflon, eingesetzt werden. Zellkulturgefäße mit
nichthydrophober Oberfläche können durch Beschichten mit
Agar oder Agarose hydrophobiert werden. Weitere Zusätze
sind nicht erforderlich. Vorzugsweise dienen als Zellkul
turgefäße Napfplatten. Dabei können für die Herstellung der
kleinen Zellaggregate beispielsweise 96-Napfplatten und für
die Herstellung der fusionierten Aggregate 24-Napfplatten
Verwendung finden.
Erfindungsgemäß müssen die Zellkulturgefäße einen sich
verjüngenden, vorzugsweise gewölbten Boden aufweisen. Es
hat sich gezeigt, daß sich das erfindungsgemäße Gewebe in
Gefäßen mit flachem Boden nicht bildet. Offensichtlich
dient die Vertiefung zum Finden der Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist auch das nach dem oben
beschriebenen Verfahren hergestellte Knorpel- oder
Knochengewebe, das als autogenes, xenogenes oder allogenes
Transplantationsmaterial zur Behandlung von Knorpel- oder
Knochendefekten und von degenerativen Erkrankungen wie z. B.
Arthrose oder Rheuma Verwendung finden kann. Dazu werden
die erfindungsgemäßen in vitro hergestellten Zellaggregate
mittels Injektion in das erkrankte oder abgebaute Gewebe
eingespritzt. Dazu muß die Injektionsnadel mindestens den
Durchmesser der Sphäroide haben. Die Zellen in der
Proliferationszone der Sphäroide wachsen schnell in das
umliegende Gewebe ein und ermöglichen eine schnelle
Einbindung des in vitro hergestellten Gewebes und stellen
ein Potential zur Neubildung von Gewebe in der Umgebung der
Sphäroide dar, da diese Zellen noch proliferieren und
Matrix bilden. Diese Behandlung kann im Fortschritt zu
bisherigen Verfahren im Tissue Engineering arthroskopisch
erfolgen.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch therapeutische
Zubereitungen, die das erfindungsgemäße Knorpel- oder
Knochengewebe umfassen, z. B. Injektionslösungen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des
erfindungsgemäßen Knorpel- oder Knochengewebes zur Testung
von Wirkstoffen, die z. B. die Bildung und Differenzierung
von Matrix und Zellen beeinflussen. Dazu werden die
Zellsphäroide erfindungsgemäß hergestellt und in
unterschiedlichen Reifestadien werden die zu testenden
Medikamente hinzugegeben und unterschiedlichste Parameter
der Sphäroidentstehung und -reifung charakterisiert. Diese
Tests sind im Vergleich zu den herkömmlichen Medika
mententests an Tieren oder Tumorsystemen durch die
Verwendung von nur autologem Material sehr patienten
spezifisch und ermöglichen eine individuelle Diagnose.
Nachfolgend soll die Erfindung an Ausführungsbeispielen
näher erklärt werden, ohne sie darauf einzuschränken.
Vom Patienten wird aus einem Bereich hyalinen, gesunden
Knorpels eine Biopsie entnommen. Aus dieser Biopsie werden
mittels enzymatischen Verdaus durch Inkubation mit
Kollagenaselösung die Chondrozyten isoliert. Nach Trennung
der isolierten Zellen vom unverdauten Knorpelgewebe, werden
diese in Zellkulturflaschen überführt und unter Zugabe von
DMEM/Hams F12 Kulturmedium (1/1) und 10% autologem Serum
des Patienten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Zweimal
wöchentlich wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach
Erreichen des konfluenten Stadiums wird die Zellayer mit
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mittels
Trypsin von der Zellkulturoberfläche geerntet. Nach einer
weiteren Waschung werden 1 × 105 Zellen in je ein
Zellkulturgefäß überführt, das mit Agarose beschichtet ist.
Nach einem Tag haben sich die ersten Zellen in Aggegaten
angeordnet. Diese Aggregate werden alle 2 Tage mit frischem
Medium versorgt und für mindestens 2 Wochen kultiviert.
Bereits nach einer Woche wurden Kollagen Typ II und
Proteoglycane im Zentrum der Aggregate nachgewiesen. Dazu
wurde ein spezifischer Antikörper gegen Kollagen Typ II
verwendet. Der an Kollagen Typ II gebundene
Primärantikörper wurde mit Hilfe eines Zweitantikörpers und
daran gekoppeltem ABC-System nachgewiesen. Das heißt, an
dem 2. Antikörper ist über Avidin-Biotin das Enzym
Alkalische Phosphatase gekoppelt, welches das Substrat
Fuchsin umsetzt, wobei ein roter Farbstoff entsteht.
Die Proteoglycane wurden mittels Goldnerfärbung nachge
wiesen. Kollagen Typ II und Proteoglykane sind Bestandteile
der Knorpelmatrix in vivo und stellen die wichtigsten
Strukturproteine dar, die für die Funktion des Knorpels von
entscheidender Bedeutung sind.
In der äußeren Schicht der Aggregate wurde zum gleichen
Zeitpunkt das für Knorpelzellen spezifische Protein S 100
nachgewiesen, welches in wenig differenzierten
Knorpelzellen zu finden ist. S 100 wird nicht in
Knochengewebe und Bindegewebe exprimiert. Nur diese Gewebe
könnten hierbei auch entstehen. Somit wurde eindeutig
nachgewiesen, daß das entwickelte Gewebe Knorpelgewebe ist.
Nach 1-2 Wochen Kultivierung liegen die Zellen noch dicht
beieinander. Mit steigender Kultivierungsdauer nimmt der
Anteil an extrazellulärer Matrix zu und der Anteil an
Zellen ab. Nach einer Woche ist mindestens 40% ECM
nachweisbar und nach 3 Wochen wurde bereits ca. 60% ECM
entwickelt. Das heißt, im Inneren der hergestellten
Aggregate wurde knorpelartiges Gewebe aufgebaut, welches im
Aufbau dem in vivo Knorpel entspricht und auch die Funktion
von Knorpelgewebe übernehmen kann.
Das in Beispiel 1 hergestellte Gewebe (ca. 200 Sphäroide
uas je 1 . 105 Zellen) wurde in physiologischer Kochsalz
lösung aufgenommen und in einen ca. 1 cm2 großen, mit
Periost abgedeckten Knorpeldefekt des Probanden einge
spritzt. Es wurde festgestellt, daß der Knorpeldefekt
bereits innerhalb von 1 bis 2 Monaten mit Knorpelgewebe
aufgefüllt ist, während durch die bisherige Transplantation
von jungen, lediglich in vitro vermehrten Knorpelzellen die
Auffüllung eines Defektes einer solchen Größe erst nach 6-
12 Monaten zu verzeichnen ist. Das erfindungsgemäße in
vitro hergestellte Knorpelgewebe gewährleistet also neben
der Erfüllung der mechanischen Funktion des hergestellten
Gewebes die rasche Integration der hergestellten Gewebe
stücke durch die proliferationsfähigen und migrations
fähigen Zellen in der äußeren Schicht der Aggregate. Somit
erlaubt die Struktur und Funktion der Gewebestücke auch die
schnelle Reparatur von Defekten und degeneriertem Knorpel
gewebe.
Vom Patienten wird eine Knochenbiopsie aus dem Bereich des
Spongiosaknochens entnommen. Aus dieser Biopsie werden
mittels enzymatischen Verdaus durch Inkubation mit
Kollagenaselösung die Osteoblasten isoliert. Nach Trennung
der isolierten Zellen vom unverdauten Knochengewebe, werden
diese in Zellkulturflaschen überführt und unter Zugabe von
DMEM/Hams F12 Kulturmedium (1/1) und 10% autologem Serum
des Patienten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Zweimal
wöchentlich wird ein Mediumwechsel vorgenommen. Nach
Erreichen des konfluenten Stadiums wird die Zellayer mit
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mittels
Trypsin von der Zellkulturoberfläche geerntet. Nach einer
weiteren Waschung werden 1 × 105 Zellen in je ein
Zellkulturgefäß überführt, das mit Agarose beschichtet ist.
Nach einem Tag haben sich die ersten Zellen in Aggegaten
angeordnet. Diese Aggregate werden alle 2 Tage mit frischem
Medium versorgt und für mindestens 2 Wochen kultiviert.
Bereits nach einer Woche wurden Kollagen Typ I und
Proteoglycane im Zentrum der Aggregate nachgewiesen. Dazu
wurde eine spezifische Antikörper gegen Kollagen Typ I
verwendet. Durch den Nachweis von Kollage I wurde
zweifelsfrei nachgewiesen, daß es sich nicht um
Knorpelgewebe handelt. Der an Kollagen Typ I gebundene
Primärantikörper wurde mit Hilfe eines Zweitantikörpers und
daran gekoppeltem ABC-System nachgewiesen. Das heißt, an
dem 2. Antikörper ist über Avidin-Biotin das Enzym
Alkalische Phosphatase gekoppelt, welches das Substrat
Fuchsin umsetzt, wobei ein roter Farbstoff entsteht.
Die Proteoglycane wurden wie in Beispiel 1 mittels
Goldnerfärbung nachgewiesen. Kollagen Typ I und
Proteoglykane sind Bestandteile der Knochenmatrix in vivo
und stellen die wichtigsten Strukturproteine dar, die für
die Funktion des Knochens von entscheidender Bedeutung
sind.
In der äußeren Schicht der Aggregate wurde zum gleichen
Zeitpunkt proliferationsfähige Knochenzellen nachgewiesen.
Nach 2 Wochen Kultivierung liegen die Zellen noch dicht
beieinander. Mit steigender Kultivierungsdauer nimmt der
Anteil an extrazellulärer Matrix zu und der Anteil an
Zellen ab. Nach einer Woche ist mindestens 40% ECM
nachweisbar und nach 3 Wochen wurde bereits ca. 60% ECM
entwickelt. Das heißt, im Inneren der hergestellten
Aggregate wurde knochenartiges Gewebe aufgebaut, welches in
der Zusammensetzung dem in vivo Knochen entspricht und auch
die Funktion von Knochengewebe übernehmen kann.
Die in Beispiel 3 hergestellten Gewebe (ca. 50 Stück)
werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und in
den Bereich einer schwer heilenden Knochenfraktur
gespritzt. Es wurde festgestellt, daß der Prozeß der
Knochenheilung induziert werden konnte und bereits nach 3
Wochen neues Knochengewebe gebildet wurde, während bei
ausbleibender Behandlung des Defektes eine Bruchheilung
erst nach Monaten erfolgt wäre. Das in vitro gezüchtete
Knochengewebe gewährleistet also die schnelle Integration
des Gewebes in das umliegende Gewebe und die Auffüllung von
Knochendefekten. Somit erlaubt die Struktur und Funktion
der Gewebestücke die Heilung von Knochendefekten, die
Induktion der Osteosynthese und die Behandlung von
degenerativen Knochenerkrankungen.
Claims (13)
1. Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidi
mensionalem, vitalem Knorpel- oder Knochengewebe,
dadurch gekennzeichnet, daß
aus einem menschlichen oder tierischen Organismus
Knorpelzellen, Knochenzellen, oder mesenchymale Stamm
zellen gewonnen werden und diese in Zellkulturgefäßen
mit hydrophober Oberfläche und sich verjüngendem Boden
als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert
werden bis ein Zellaggregat entsteht, das zu mindestens
40 Vol.% extrazelluläre Matrix (ECM) beinhaltet, in
welche differenzierte Zellen eingebettet sind, und das
einen äußeren Bereich aufweist, in welchem
proliferations- und migrationsfähige Zellen vorhanden
sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die aus dem Explantat gewonnenen Knorpel- oder
Knochenzellen zunächst in Monolayerkultur vermehrt
werden und anschließend die Kultivierung in Suspension
gemäß Anspruch 1 vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
je nach gewünschter Gewebegröße mindestens zwei der
entstandenen Zellaggregate fusioniert werden, indem sie
gemeinsam in Zellkulturgefäßen mit hydrophober
Oberfläche und sich verjüngendem Boden in Suspension
weiterkutiviert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Zellkulturgefäße Napfplatten eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
Zellkulturgefäße mit nichthydrophober Oberfläche durch
Beschichten mit Agar oder Agarose hydrophobiert werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Kultivierung ohne den Zusatz von wachstumsfördernden
Verbindungen durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Kulturmedium autogenes, xenogenes oder allogenes
Serum enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Kultivierung in Suspensionskultur so lange
durchgeführt wird, bis das erhaltene Zellaggregat
mindestens 60% ECM aufweist.
9. Knorpel- oder Knochengewebe hergestellt nach den
Ansprüchen 1 bis 8.
10. Verwendung von Knorpel- oder Knochengewebe gemäß
Anspruch 9 als autogenes, xenogenes oder allogenes
Transplantationsmaterial zur Behandlung von Knorpel-
oder Knochendefekten und von degenerativen
Erkrankungen.
11. Verwendung nach Anspruch 10 zur Behandlung von
Arthrose und Rheuma.
12. Verwendung von Knorpel- oder Knochengewebe gemäß
Anspruch 9 zur Testung von Wirkstoffen, die die
Bildung und Differenzierung von Matrix und Zellen
beeinflussen.
13. Therapeutische Zubereitung umfassend Knorpel- oder
Knochengewebe gemäß Anspruch 9.
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10013223A DE10013223C2 (de) | 2000-03-13 | 2000-03-13 | Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen Verwendung als Transplantationsmaterial |
EP01913858.5A EP1265986B1 (de) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Verfahren zur in vitro-herstellung von dreidimensionalem, vitalem knorpel- oder knochengewebe |
CA002403120A CA2403120A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Method for in vitro production of three-dimensional vital cartilage or bone tissue and use thereof as transplant material |
ES01913858.5T ES2566053T3 (es) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Procedimiento para la producción in vitro de tejido cartilaginoso u óseo tridimensional vital |
PCT/EP2001/002698 WO2001068811A2 (de) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Verfahren zur in vitro-herstellung von dreidimensionalem, vitalem knorpel- oder knochengewebe und dessen verwendung als transplantationsmaterial |
US10/239,701 US7887843B2 (en) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Method for in vitro production of three-dimensional vital cartilage tissue and use thereof as transplant material |
DK01913858.5T DK1265986T3 (en) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | METHOD FOR IN VITRO PRODUCTION OF dimensional, vital cartilage or bone |
AU2001239287A AU2001239287A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-03-09 | Method for in vitro production of three-dimensional vital cartilage or bone tissue and use thereof as transplant material |
CY20161100246T CY1117464T1 (el) | 2000-03-13 | 2016-03-23 | Μεθοδος για την in vitro παραγωγη τρισδιαστατου ζωτικου χονδρινου ή οστικου ιστου |
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003100039A1 (de) * | 2002-05-23 | 2003-12-04 | Biotissue Technologies Gmbh | Verfahren zur herstellung eines dreidimensionalen und flächigen gewebetransplantats |
WO2004110512A2 (en) * | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Interface Biotech A/S | A method for cell implantation |
EP2677027A1 (de) | 2012-06-21 | 2013-12-25 | Hochschule Lausitz | Verfahren zur Herstellung von funktionalem Fusionsgewebe aus humanen Chondrozyten |
EP3417888A1 (de) | 2017-06-25 | 2018-12-26 | co.don AG | Verfahren zum herstellen von transplantierbarem knorpelgewebe |
EP3744831A1 (de) | 2019-05-31 | 2020-12-02 | co.don AG | Verfahren zur kultivierung von knorpel und sphäroiden davon |
Families Citing this family (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7622562B2 (en) | 2002-06-26 | 2009-11-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue |
DE10253066A1 (de) * | 2002-11-07 | 2004-05-27 | Co.Don Aktiengesellschaft | Gewebeersatzstruktur, Verfahren zur Modifikation einer Gewebeläsion und Verwendung von vorgeformtem dreidimensionalem Gewebe als Lieferant von Botenstoffen und/oder Strukturbausteinen |
US7744869B2 (en) * | 2003-08-20 | 2010-06-29 | Ebi, Llc | Methods of treatment using electromagnetic field stimulated mesenchymal stem cells |
EP2338442B1 (de) | 2003-12-11 | 2013-01-30 | Isto Technologies Inc. | Teilchenförmiges Knorpelsystem |
EP1706157B1 (de) * | 2003-12-12 | 2016-08-17 | co.don AG | Verfahren zur herstellung von bandscheibenzelltransplantaten und deren anwendung als transplantationsmaterial |
US8241905B2 (en) * | 2004-02-24 | 2012-08-14 | The Curators Of The University Of Missouri | Self-assembling cell aggregates and methods of making engineered tissue using the same |
JP4044579B2 (ja) * | 2005-08-02 | 2008-02-06 | 株式会社Pgリサーチ | 人工軟骨組織 |
US8480757B2 (en) | 2005-08-26 | 2013-07-09 | Zimmer, Inc. | Implants and methods for repair, replacement and treatment of disease |
EP1764117A1 (de) * | 2005-09-20 | 2007-03-21 | Zimmer GmbH | Implantat zur Wiederherstellung von Knorpeldefekten und Verfahren zu seiner Herstellung |
US20070093905A1 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | O'neil Michael J | Degenerative disc regeneration techniques |
US20080166329A1 (en) * | 2005-10-24 | 2008-07-10 | Hsing-Wen Sung | Medical device and methods for living cell injection |
WO2007087402A2 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Brown University | Cell aggregation and encapsulation device and method |
EP1984488B1 (de) * | 2006-01-30 | 2017-12-27 | University Of Virginia Patent Foundation | Verfahren zur herstellung und charakterisierung mesenchymaler stammzellaggregate und ihre verwendung |
US8835170B2 (en) * | 2006-10-06 | 2014-09-16 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods and compositions useful for diabetic wound healing |
US8163549B2 (en) | 2006-12-20 | 2012-04-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Method of obtaining viable small tissue particles and use for tissue repair |
WO2008128075A1 (en) | 2007-04-12 | 2008-10-23 | Isto Technologies, Inc. | Compositions and methods for tissue repair |
AU2009271223B2 (en) | 2008-06-24 | 2013-05-16 | The Curators Of The University Of Missouri | Self-assembling multicellular bodies and methods of producing a three-dimensional biological structure using the same |
EP2339990A4 (de) * | 2008-07-06 | 2013-01-23 | Univ Missouri | Osteochondrale implantate, arthroplastische verfahren, vorrichtungen und systeme |
US20100098739A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-22 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for modular soft tissue repair |
TW201022435A (en) * | 2008-12-02 | 2010-06-16 | Univ Nat Taiwan | Method for transferring a cell onto a carrier and the applications thereof |
US8501476B2 (en) * | 2009-10-07 | 2013-08-06 | Brown University | Assays and methods for fusing cell aggregates to form proto-tissues |
CN102869391A (zh) | 2010-02-02 | 2013-01-09 | 密苏里大学管理者 | 工程化生物神经移植物的制备及其应用 |
CN105496601A (zh) | 2010-10-21 | 2016-04-20 | 奥加诺沃公司 | 用于制造组织的装置、系统和方法 |
EP2736357B9 (de) | 2011-07-26 | 2019-01-09 | The Curators Of The University Of Missouri | Bearbeitetes essbares fleisch |
US9468680B2 (en) | 2011-09-22 | 2016-10-18 | Brown University | Differential effects of drugs on transport in a multi-layer 3D spheroid model |
US9243278B2 (en) | 2011-09-22 | 2016-01-26 | Brown University | Mechanotransduction by the synergistic action of heterotypic cell interactions |
US9499779B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-11-22 | Organovo, Inc. | Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue utilizing UV cross-linking |
US20140178343A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Jian Q. Yao | Supports and methods for promoting integration of cartilage tissue explants |
US10072241B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-09-11 | Innovative Surface Technologies, Inc. | Conical devices for three-dimensional aggregate(s) of eukaryotic cells |
US9442105B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-09-13 | Organovo, Inc. | Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same |
EP3028042B1 (de) | 2013-07-31 | 2021-06-30 | Organovo, Inc. | Automatisierte vorrichtungen, systeme und verfahren zur herstellung eines gewebes |
WO2015038988A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Modern Meadow, Inc. | Edible and animal-product-free microcarriers for engineered meat |
AU2015214092B2 (en) | 2014-02-05 | 2018-11-15 | Fork & Goode, Inc. | Dried food products formed from cultured muscle cells |
JP2017518070A (ja) | 2014-04-04 | 2017-07-06 | オルガノボ インコーポレイテッド | 人工的な三次元の乳房組織、脂肪組織、および腫瘍疾患モデル |
CA2962778C (en) | 2014-10-06 | 2023-05-16 | Organovo, Inc. | Engineered renal tissues, arrays thereof, and methods of making the same |
JP2017537654A (ja) | 2014-11-05 | 2017-12-21 | オルガノボ インコーポレイテッド | 人工三次元皮膚組織、そのアレイ、およびその製造方法 |
DE102014222898A1 (de) * | 2014-11-10 | 2016-05-12 | Universität Konstanz | Herstellung und Isolierung einer nativen humanen dermalen extrazellulären Matrix |
WO2017053433A1 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Modern Meadow, Inc. | Fiber reinforced tissue composites |
WO2017083402A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Organovo, Inc. | Improved methods for tissue fabrication |
KR101733137B1 (ko) * | 2015-12-30 | 2017-05-08 | (주)엑셀세라퓨틱스 | 연골조직 제조를 위한 3차원 오가노이드 블록 제작 방법 |
US11286354B2 (en) | 2016-02-15 | 2022-03-29 | Modern Meadow, Inc. | Method for making a biofabricated material containing collagen fibrils |
JP2019535705A (ja) | 2016-11-10 | 2019-12-12 | オルガノボ インコーポレイテッド | バイオプリントされた毛包およびその使用 |
WO2018220051A1 (en) * | 2017-05-30 | 2018-12-06 | Katholieke Universiteit Leuven | Engineering functional bone organs |
AU2018253595A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-30 | Modern Meadow, Inc. | Biofabricated leather articles having zonal properties |
RU2691916C1 (ru) * | 2018-05-03 | 2019-06-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) | Способ хирургического лечения деформирующего остеоартроза коленного сустава |
CN113286864A (zh) | 2019-01-17 | 2021-08-20 | 现代牧场股份有限公司 | 层状胶原材料及其制备方法 |
CN111019888A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-04-17 | 中怡(深圳)医疗科技集团有限公司 | 一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19540487A1 (de) * | 1995-10-20 | 1997-04-24 | Olaf Schultz | Zellinteraktionssystem zur Induktion künstlicher Gewebe |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5723331A (en) * | 1994-05-05 | 1998-03-03 | Genzyme Corporation | Methods and compositions for the repair of articular cartilage defects in mammals |
US5655546A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-12 | Halpern; Alan A. | Method for cartilage repair |
US6152964A (en) * | 1996-03-01 | 2000-11-28 | Isotis B.V. | Method for in vitro production of bone |
US6811776B2 (en) * | 2000-12-27 | 2004-11-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Process for ex vivo formation of mammalian bone and uses thereof |
-
2000
- 2000-03-13 DE DE10013223A patent/DE10013223C2/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
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2016
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19540487A1 (de) * | 1995-10-20 | 1997-04-24 | Olaf Schultz | Zellinteraktionssystem zur Induktion künstlicher Gewebe |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003100039A1 (de) * | 2002-05-23 | 2003-12-04 | Biotissue Technologies Gmbh | Verfahren zur herstellung eines dreidimensionalen und flächigen gewebetransplantats |
WO2004110512A2 (en) * | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Interface Biotech A/S | A method for cell implantation |
WO2004110512A3 (en) * | 2003-06-12 | 2005-05-06 | Interface Biotech As | A method for cell implantation |
EP2677027A1 (de) | 2012-06-21 | 2013-12-25 | Hochschule Lausitz | Verfahren zur Herstellung von funktionalem Fusionsgewebe aus humanen Chondrozyten |
WO2013190088A1 (de) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Brandenburgische Technische Universität Cottbus-Senftenberg | Verfahren zur herstellung von funktionalem fusionsgewebe |
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WO2019002148A1 (de) | 2017-06-25 | 2019-01-03 | Co.Don Ag | Verfahren zum herstellen von transplantierbarem knorpelgewebe |
EP3744831A1 (de) | 2019-05-31 | 2020-12-02 | co.don AG | Verfahren zur kultivierung von knorpel und sphäroiden davon |
WO2020240040A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Co.Don Ag | Method for cultivation of cartilage and spheroids thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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CA2403120A1 (en) | 2002-09-13 |
DK1265986T3 (en) | 2016-04-04 |
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US20030153078A1 (en) | 2003-08-14 |
WO2001068811A3 (de) | 2001-12-27 |
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