DD293265B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen Roetelnvirusantigen - Google Patents

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen Rötelnvirusantigen. Das Hauptanwendungsgebiet dieser monoklonalen Antikörper liegt in der Medizin, ζ. B. in dor Diagnostik akuter Rötelnerkrankungen, in klinisch-diagnostischen Einrichtungen des Gesundheitswesens.

Charakteristik des bekannten Stances der Technik

Die Diagnostik von akuten Rötelninfektionen wird heute allgemein über den Nachweis von rötelnspezifischem Immunglobulin M (IgM) vorgenommen. Sie hat besondere Bedeutung in der Schwangerschaftsvorsorge, denn im ersten Trimenon der Schwangerschaft sind Rötelninfektionen sehr häufig Ursache von Aborten und Embryopathien. Weiterhin dient der Röteln-IgM-Nachweis der Bestimmung des Immunstatus vor und nach einer Röteln-Impfung und der Differentialdiagnose von Infektions- und exanthematischen Krankheiten. Bisher genutzte Methoden gehen von einer physikalischen Abtrennung der IgM-Antikörper von denen der IgG-Klasse mit nachfolgender Bestimmung der antiviralen Aktivität dieser Fraktionen aus. Die bekanntesten Techniken im Zusammenhang mit dem Hämaglutinationshemmungs-Test als Detektionsmethode von fraktioniertem IgM (Liebhaber, J. Immunol. 104 [1970] 826) sind die Dichtegradientenultrazentrifugation (Best et al., Lancet 11 [1969] 65), die Säulenchromatographie (Morgan-Capner et al., J. Clin Path. 32 [1980] 1092) bzw. die Verminderung des IgG-Gehaltes von menschlichen Seren durch eine Behandlung mit Protein A (Leinikki et al., J. Lab. Clin. Med. 92 (1973) 849). Diese Serumfraktionierungen müssen vorgenommen werden zum Ausschluß von „falschpositiven" Resultaten, hervorge, jfen durch die Anwesenheit von Rheumafaktoren (Salonen et al., J. Infect. Dis. 142 [1980] 250) bzw. „falschnegativen" Resultaten, hervorgerufen durch Anwesenheit von hohen Konzentrationen an rötelnspezifischem IgM (Meurman et al., J. Clin. Path. 31 [1978] 483). Die Einführung der indirekten Enzymbestimmungsmethode (EIA) für den Nachweis von rötelnspezifischem IgM, bei denen trägerfixiertes Rötelnantigen spezifische IgM-Antikörper aus dem Patientenserum bindet und der Nachweis mit Anti-Immunglobulin-Antikörperkonjugaton geführt wird, konnte die aufgeführten Fehlerquellen nicht beseitigen (Cradock-Watson et al., J. Hug. 76 [1976) 109, Vejtorp, J. Virol. Meth. 1 [1980] 1).

Aufgrund der erheblichen Konsequenzen des Nachweises von akuten Rötclninfektionen bei Schwangeren (z. B. therapeutischer Abort) wurden Auswege mit dem direkten EIA oder Röteln IgM-Captura-EIA angestrebt, bei dem eine Vorbehandlung der Seren entfällt (Vejtorp, Acta path, microbiol. scand. Sect. B 89 [1981 ] 123, Kurtz et al., J. Clin. Path. 34 [1981 ] 1392). Die Fragen der Standardisierung der IgM-Präsentation konnten durch den Einsatz monoklonaler Anti-Human-IgM-Antikörper befriedigend gelöst werden (z.B. Patentschrift DD 268162 A1). Nichtgebundenes rötelnspezifisches IgG wird durch Waschen entfernt, mithin entfallen Probleme „falschnegativer" Aussagen. Hinsichtlich der Bereitstellung von rötelnspo/ifischen Antiseren zur Detektion des im Capture-ETA an das rötelnspezifische IgM gebundenen Antigens gibt es große Schwierigkeiten. Die Immunisierung von Versuchstieren (Kaninchen, Schaf etc.) mit gereinigtem Rötelnvirusantigen löst eine vergleichsweise schwache Immunantwort aus, da die immundeterminierenden Glykoproteinstrukturen Ei und E2 relativ unzugänglich in der Viruslipidhülle verankert sind. Zur Erhöhung der Spezifität sind Absorptionsprozeduren einzukalkulieren, die die Sensivität weiterhin negativ beeinflussen. Im Resultat lassen sich unspezifische Interaktionen (speziell bei Anwesenheit von Rheumafaktoren) nicht völlig unterdrücken und die Grenze zwischen positiven und negativen Seren nicht exakt festlegen.

Diese begrenzenden Faktoren wurden durch den Einsatz von mAkgegen Rötelnvirusantigene eliminiert (Wielaard et al., J. Virol. Meth. 10 [1985] 349; Gerna et al., J. Clin. Microbiol. 25 [1987] 1033).

Dabei haben verschiedene Autoren unabhängig voneinander murine monoklonale Antikörper in der Literatur vorgestellt, die gegen unterschiedliche Antigene des Rötelnvirus gerichtet sind. Von Bedeutung sind die Arbeiten von Chong, P. et al., J. Virol. Methods 10(3) (198öl 261-268; von Waxham, M. N. et al., Virology 143(1) [1985] 153-165; ferner von Green, K. Y. et al., J. Virol. 57(3) (1986) 893-898 und von Ho-Terry, L. et al.. Arch. Virol. 90(1-2) (1986] 145-152. Praktisch eingesetzt werden die monoklonalen Antikörper, die gegen Epitop E1 gerichtet sind, zum Infektionsnachweis, zur Hämagglutinationshemmung und zur Neutralisation des Virus. Die monoklonalen Antikörper, die gegen Epitop E 2 gerichtet sind, bleiben bisher in ihrer Bedeutung für die praktische Anwendung zurück.

Die entwickelten Testsysteme zeigten eine wesentlich höhere Spezifität. Bei simultaner Inkubation von Rötelnantlgenen und monoklonalem Anti-Rötoln-Antikörperkonjugat sind neben dem Ausbleiben von „falschpositiven" Reaktionen mit gleichzeitig im Serum vorhandenen Rheumafaktoren erhebliche Zeit- und Materialeinsparungen durch Wegfall von Fraktionierungsschritten zu verzeichnen. Die bisher bekannten mAk gegen Rötelnvirusantigen genügen jedoch bezüglich Spezifität und Sensitivität noch

nicht allen Anforderungen. Das betrifft die Kreuzreaktivität mit z. B. Rheumafaktoren ebenso wie die Notwendigkeit der Vorbereitung der Patientenseren. Hier liegt der Ansatzpunkt zu Verbesserungen, die es ermöglichen könnten, die Rötelndiagnostik auf die wünschenswert zu untersuchende Altersgruppe der weiblichen Bevölkerung insgesamt auszudehnen

unter Vermeidung „falschpositiver" Aussagen und unter Beachtung der Kosten der Diagnostik. Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise und kostengünstig monoklonale Antikörper gegen Rötelnvirusantigen bereitzustellen, die sich in an sich bekannter Weise mit Enzymen (z.B. Meerrettich-Peroxidase) konjugieren lassen und damit eine Eignung für den Nachweis von rötelnspezifischen IgM-Antikörpern in einem IgM-Capture-EIAüber eine Virusantigenbrücke offerieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Rötelnvirusantigene ist dadurch gekennzeichnet, daß zunächst zwei Tage alte weibliche Balb/c-Mäuse intracerebral mit Rötelnvirusantigen, gewonnen aus einer infizierten Verozellkultur mit anschließender Dichtegradientenzentrifugation, immunisiert werden. Nach 4 Wochen wird eine erneute Applikation mit Rötelnvirusantigen in den Augenpiaskörper vorgenommen.

Weitere Immunisierungen erfolgen in bekannter Weise intraperitoneal. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuso isoliert, mit P3-X63-Ag8.653-Myelomzellen fusioniert und die Zellsuspension im Selektionsmedium kultiviert.

Die Zellkulturüberstände mit Hybridzellwachstum werden auf antigenspezifische Antikörperbildung im direkten EIA geprüft. Die hierfür einzusetzenden Mikrotestplatten sind alternierend mit Rötelnantigen und Kontrollantigen (unifiziertes Verozellmaterial identisch aufgeschlossen und gereinigt) beschichtet, um eine Reaktivität mit Virusantigenen nachzuweisen und eine Reaktivität mit Verozellantigen auszuschließen.

Nach Klonselektion aus den eindeutig positiv reagierenden Kavitäten der Masterplatten werden die Hybridzellen nach an sich bekannten Methoden (Klonierung, antigenspezifisches Screening und Verbreiterung) etabliert und in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Unter den etablierten Hybridomen befinden sich 3 Zellinien

Sifin-Rub-A1-58E10

Sifin-Rub-B1-12F10

Sifin-Rub-B2-18D10,

die unter den genannten antigenspezifischen direkten EIA-Bedingungen hochaktiv reagieren. Diese Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zellinien unter den Nummern ZIM-0504, ZIM-0505 und ZIM-0506 hinterlegt.

Die monoklonalen Antikörper dieser Zellinien sind vom IgG 2 a-lsotyp. Die Epitopanalyse im Immunoblotting nach SDS-Polyacrylamidgelektophorese (PAGE) und Isoelektrofokussierung (IEF) zeigt eine eindeutige Reaktion der 3 mAk mit dem E1-Rötelnpolypeptid (60KDt).

Der Hauptvorteil derartiger Antikörper liegt in der strikten Standardisierung der Herstellung von hochspezifischen Testreagenzien, mit denen klinisch relevante Aussagen zum akuten Röteln-Infektionsstatus bei Schwangeren und Risikopatienten mit höchstmöglicher Präzision getroffen werden müssen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten monoklonalen Antikörper gegen das Rötelnpolypeptid E1 weisen am Beispiel der Antikörper der Zellinie Sifin-Rub-B 1-12F10 die für einen Röteln-lgM-Capture-EIA mit einem positiven Kontrollserum notwendige Empfindlichkeit auf (Abb. 1 und 2).

Ein Nachweis der Kreuzreaktivität mit Virusantigenen von HIV, Hepatitis A, Influenza PR8, CMV, Masern und Mumps verläuft im direkten EIA mit negativem Resultat.

Mit der Anwendung der erfindungsgemäß gewonnenen monoklonalen Antikörper gegen Rötelnvirusantigene sind folgende Vorteile verbunden:

- Entwicklung eines Röteln-lgM-Capture-EIA unter Verwendung von Anti-Röteln-mAk-Konjugaten, die gegenüber polyklonalen Antikörperkonjugaten keine unspezifischen Interaktionen zeigen und damit eine wesentlich exaktere Unterscheidung zwischen positiven und negativen Seren ermöglichen. Hierbei ist von besonderer Bedeutung, daß die mAk-Konjugate nicht mit Rheumafaktoren interferieren, womit eine zeit· und kostenaufwendige Vorbehandlung von Seren entfällt.

- Entwicklung eines verbesserten indirekten Röteln-lgG-EIA, bei dem die Anti-Röteln-mAk als Beschichtungsantikörper Röteln-Antigen in „nativer Form" aus relativ grobgereinigten Fraktionen dem Patientenserum präsentieren. Spezifität und Sensitivität sind damit entscheidend verbessert worden.

Ausführungsbeispiel

1. Milzzellen werden gewonnen von Balb/c-Mäusen, die mit jeweils einer intracerebralen (Umino et al.. Arch. Virol. 8311985) 33) und intraokularen (Thompson, J. Immunol. 65 [1950] sowie mindestens zwei intraperitonealen Applikationen mit gereinigtem Rötelnvirusantigen zu immunisieren sind, und werden nach bekannten Techniken (Kearney et al., J. Immunol. 123 (1979) 1548) mit P3-X63-AG 8.653-Myelomzellen fusioniert. Die Zellsuspension wird in HAT-Selektionsmedium (Littlefield, Science 145(1964]709) DMEM,supplementiert mit 15%fetalem Kälberserum,2mMol/l Glutamin,5 x 10~⁶Mol/l2-Mercaptoethanol, 3g/l Natriumcarbonat, IOmMol/1 Hepes, 240IE/ml Penicillin, 150μg/ml Streptomycin, 4 x 10"⁷Mol/l Aminoptenin, 1 x 10~⁴Mol/l Hypoxanthin, 1,6 x 10~^sMol/IThymidin, unter Zusatz von 1 χ 10⁵ Maus-Peritonealexsudatzellen/ml Kulturmedium bei 37⁰C in einer wassergesättigten 5-6%igen COyAtmosphäre inkubiert.

2. Zur Selektion von Hybridzellen, die spezifische Antikörper gegen Rötelnvirusantigene in das Kulturmedium sezernieren, wird mit der Abnahme des ersten und zweiten Mediumwechsels aus den Masterplatten ein direkter EIA durchgeführt. Die hierfür '.Inzusetzenden Mikrotestplatten sind alternierend mit Röteln- und Kontrollantigen beladen. Die Hybridzellklone, die eine positive Reaktion mit dem Rötelnantigen und eine negative Reaktion mit dem Kontrollantigen zeigen, werden durch Klonselektion isoliert, anschließend separat in Kultur geführt und nach bekannten Methoden rekloniert und kryokonserviert.

3. Die Hybridoma Sifin-Rub-A1-58E10 (ZIM-Nr. 0504) Sifin-Rub-B 1 -12 F10 (Z;M-Nr. 0505)

Sifin-Rub-B2-18D10 (ZIM-Nr. 0506),

deren sezernierte mAk sowohl im direkten als auch im indirekten EIA spezifischen IgM nach Bindung des Rötelnantigens detektieren, können mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt v/erden. Die Spezifität und Sencitivität bei der Anwendung in einem IgM-Capture-EIA ist für 100 Patientensereri mit Verdacht auf akute Rötelninfektion im Vergleich zu einem lizensierten Testkit 100%ig best itigt.

4. Eine Produktion der genannten Antikörper durch Vermehrung der Hybridomzellen als Ascites Tumor in Pristane (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) vorbehandelten Balb/c-Mäusen wies für 20 eingesetzte Tiere eine 100%ige Tumorangelirate auf. Die sezernierten Antikörper werden sowohl aus dem Zellkulturüberstand als auch aus dem Ascitespunktat nach bekannten Verfahren gereinigt und konjugiert.

Legende zu den Abbildungen

Abb. 1: Rötelnvirus-lgM-Capture-EIA Mikrotestplatten werden mit monoklonalen Anti-Human-lgM-Antikörpern (Sifin-lgM-11 G4) adsorptiv beschichtet und mit den angezeigten Konzentrationen eines Röteln-positiven und Röteln-negativen Patientenserurm (phosphatgepufferte Verdünnung) in Kontakt gebracht. Die Bindung von erregerspezifischen IgM wird mit dem peroxidasemarkierten monoklonalen Anti-

Rötelnvirus-Antikörper Sifin-Rub-B 1-12F10 und dem Substrat H2O2 und Orthophenylendiamin angezeigt und photometrisch

bewertet.

Abb.2: Rötelnvirus-lgM-Capture-EIA Testdurchführung s. Abb. 1 Die 10"²-Verdünnung des Positivserums entspricht 30IU. Zur Ermittlung der Empfindlichkeit in IU wurde das Positivserum in

Negativserum vorverdünnt und nachfolgend alle Mischungen in der 10"²-Phosphatpufferverdünnung dem IgM-Capture-EIA

angeboten.

Claims (1)

1. -ι- 293 285

   Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Rötelnvirusantigen, dadurch gekennzeichnet, daß man Milzlymphozyten von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigtem Rötelnvirusantigen immunisiert wurden, mit Myelomzellen der Linie P 3-X 63-AG 8.653 fusioniert, spezifische antikörperbildende Hybridome über eine direkte Enzymimmunbestimmungsmethode mit Rötelnvirusantigen und Kontrollantigen (uninfiziertes Zellmaterial) selektiert, kloniert, kryokonserviert und kultiviert sowie die ausgewählten Hybridome Sifin-Rub-A1-58E 10 (ZIM-Nr. 0504), Sifin-Rub-B1-12F10/ZIM-Nr.0505),Sifin-Rub-B2-l8D10(ZIMNr. 0506) fürdie Antikörperproduktion in der Zellkultur vermehrt bzw. in der Ascitesform in syngeno Mäuse transplaniert.