DD288837A5

DD288837A5 - Verfahren zur anreicherung rekombinanter proteine

Info

Publication number: DD288837A5
Application number: DD32155188A
Authority: DD
Inventors: Reinhard Sieron; Reinhard Wondraczek; Kurt Binder; Heike Dittmar; Klaus Lambrecht; Thessa Heinrich
Original assignee: Zi Fuer Mikrobiologie Und Experimentelle Therapie,De
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1988-11-08
Publication date: 1991-04-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Anreicherung von rekombinanten Proteinen aus Homogenisaten von Fermentationsbruehen bzw. resuspendierter Feuchtbiomassen. Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur effektiven Extraktion o. g. Proteine. Die diesem Ziel zugrunde liegende Aufgabe wird geloest, indem proteinhaltiges Homogenisat in einem waeszrigen Zweiphasensystem, bestehend aus Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol als phasenunvertraegliche Polymere, suspendiert wird und anschlieszend eine Phasentrennung erfolgt, wobei sich das Protein in der Oberphase anreichert, waehrend der ueberwiegende Teil der Biomasse in der Unterphase verbleibt. Die Extraktion wird im p H-Bereich von p H 5,0 bis p H 8,0 bei niedrigen Polymer- und Salzkonzentrationen durchgefuehrt. Die Anreicherung von Proteinen in der Oberphase wird durch Zusatz geringer Mengen chaotrop wirkender Substanzen weiter verbessert. Es sind Anreicherungen ueber 90%, bezogen auf den Wirkstoffgehalt, erreichbar.{Anreicherung rekombinanter Proteine; Fermentationsbruehen; Homogenisate; Feuchtbiomassen; waeszriges Zweiphasensystem; Polyethylenglykol; Polyvinylalkohol; chaotrop wirkende Substanzen}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung rekombinanter Proteine aus Homogenisaten von Fermentationsbrühen bzw. resuspendierten Feuchtbiomassen.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der biotechnologischen, speziell in der pharmazeutisch-mikrobiologischen Forschung und Industrie.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß wäßrige Zweiphasensysteme zur Proteinextraktion, insbesondere zur Enzymgewinnung, eingesetzt werden können. Solche Zweiphasensysteme können sowohl durch Suspension zweier phasenunverträglicher Polymerlösungen als auch durch Suspension einer Polymer- und einer Salzlösung erzeugt werden. Von der Vielzahl möglicher Phasensysteme haben Polyethylenglykol (PF.G)-Dextran-Systeme die größte Bedeutung erlangt.

(Albertson, P.A.: „Partition of Cell-Particles and Macromolecules", 2nd ed., Wiley, New York, 1986).

Zur Verbesserung der Selektivität der Verteilung werden bevorzugt PEG-Derivate eingesetzt, wodurch eine Affinitätsverteilung erreicht wird (Walter, H., Johansson, G.: „Partitioning in aqueous Two-Phase-Systems: An Overview"; Anal. Biochem. 155, 215-242, [1986]). Zur Reinigung von Interferon wurden sehr gute Ergebnisse duich selektive Verteilung von Rohinterferonlösungen in wäßrigen PEG-Dextran- bzw. PEG-Salz-Systemen unter Verwendung verschiedener PEG-Derivate erzielt (vgl. Patentschrift DE 2943016).

Nachteilig wirken sich hierbei für eine industrielle Nutzung einerseits die zusätzlichen Aufwendungen zur Herstellung der PEG-Derivate und andererseits dio relativ hohen Polymerkonzentrationen von 8 Gew.-% je Polymer bei PEG-Dextran-Syetemen bzw. die hohen Salzkonzentrationen von 16Gew.-% bis 20Gew.-% Alkaliphosphat bei PEG-Salz-Systomen aus.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, rekomblnante Proteine aus Homogenisaten von Fermentatlonsbrilhen bzw. resuspendierten Feuchtbiomassen in effektiver Weise zu extrahieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der Nachteile der bekannten technischen Lösungen ein technologisch einfaches Verfahren zur Anreicherung rekombinanter Proteine aus Homogenisaten von Fermentationsbrühen bzw. resuspendierten Feuchtbiomassen zu entwickeln, welches unter Verwendung von möglichst geringen Konzentrationen leicht verfügbarer Hilfsstoffe hohe Ausbeuten ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Anreicherung rekombinanter Proteine aus Homogenisaten von Fermentationsbrühen bzw. resuspendierten Feuchtbiomassen das protelnhaltige Homogenisat in einem wäßrigen Zweiphasensystem verteilt wird, das als phasenunverträgliche Polymere ein Polyetheralkohol und ein Polyol enthält.

Gegebenenfalls werden eine oder mehrere chaotrop wirkende Substanzen sowie ein oder mehrere anorganische Salze zugesetzt. Das wäßrige Zweiphasensystem wird mit anorganischer Säure oder Lauge auf einen pH-Wert im Bereich von pH 5,0 bis pH 8,0 eingestellt.

Überraschenderweise ist in diesem System eine weitgehende Anreicherung der rekombinanten Proteine in der Oberphase zu verzeichnen, während der überwiegende Teil der Biomasse und anderer Fremdstoffe in der Unterphase verbleiben. Die rekombinanten Proteine werden abschließend zusammen mit der Oberphase abgetrennt.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird der jeweils gewählte Polyetheralkohol in einer Konzentration von 0,5 Gew.-% bis 4Gew.-% eingesetzt. Dabei findet als Polyetheralkohol Polyethylenglykol mit einer mittleren Molmasse von 1000 bis 20000, vorzugsweise von 4000 bis 8000, Verwendung. Das herangezogene Polyol kommt in einer Konzentration von 0,5Gow.-% bis 3Gew.-% zum Einsatz. Als Polyol wird bevorzugt Polyvinylalkohol (PVAL) mit einer mittleren Molmasse von 10000 bis 300000, vorzugsweise von 20000 bis 80000, verwendet. Dem wäßrigen Zweiphasensystem werden weiterhin 0,5Gew. % bis 4Gew.-%, vorzugsweise 2 Gew.-% Natrium- bzw. Kaliumphosphat zugesetzt. Das wäßrige Zweiphasensystem wird vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 7,0 eingesteilt.

Durch Zusatz niedriger Konzentrationen (0,05Mol/l bis 2Mol/l) chaotrop wirkender Substanzen, insbesondere durch Guanidinhydrochlorid, Harnstoff und/oder Rhodaniden, wird eine zum Teil beträchtliche Steigerung des Anreicherungseffekts erreicht. Als Rhodanide können sowohl Alkalisalze als auch Ammoniumsalze verwendet werden.

Bei dem so ausgestalteten Verfuhren wird selbst bei Feststoffgehalten von 20Gew.-% Feuchtmasse im Phasensystem eine vollständige Phasentrennung bei Zentrifugalbeschleunigungen von nur 1000g über eine Zeitdauer von 10 Minuten erreicht. Die angereicherten rekombinanten Proteine werden aus der Oberphase in an sich bekannter Weise, z.B. durch chromatographische Verfahren, isoliert.

Eine Übersicht der erzielten Ergebnisse ist in der Tabelle zusammengestellt.

Anhand von fünf Beispielen soll die Durchführung des Verfahrens erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

1. (vgl. Tabelle, Versuch 1)

In 10g eines Phasensystems, bestehend aus 8Gew.-% PEG 6000,2Gew.-% PVAL 55000 und 4Gew.-% K₂HPO₄ werden 15g einer homogenisierten Kulturlösung mit einem Feststoffgehalt von 30Gew.-% Feuchtmasse und einer IFN-Aktivität von 1,1 10⁷ IE/g suspendiert, so daß das Gemisch einen Gehalt von 3,2Gew.-% PEG 6000,0,8Gew.-% PVAL 55000 und 1,6Grw.-% K2HPO4 hat. Das Gemisch wird durch Zusatz von 10%iger Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt und anschließend zentrifugiert.

In 17,5 ml Oberphase wird eine Gesamtaktivität von 1,3 10⁸IE bestimmt.

In der Unterphase wird eine Gesamtaktivität von 3,5 -10⁷IE nachgewiesen.

Daraus resultieren ein Verteilungsfaktor K von 1,6, ein Volumenverhältnis von 2,3 und eine Anreicherung der IFN-Aktivität in der Oberphase von 79,6%, bezogen auf die Gesamtaktivität.

2. (vgl. Tabelle, Versuch 3)

Es werden 20g eines Phasengemisches hergestellt, welches einen Gehalt von 2 Gew.-% PEG 6000,6Gew.-% PVAL 55000 und 4Gew.-% K₂HPO₄ sowie 1 mol/l NaCI hat.

In diesem Phasensystem werden 30 g einer Kulturlösung mit einer IFN-Aktivität von 9 · 10^e IE/g suspendiert, der pH-Wert durch Zusatz von 10%iger Phosphorsäure auf pH 6,7 eingestellt und anschließend das Gemisch mittels Ultraschalldesintegration homogenisiert.

Nach Zentrifugation wurden 36,5 ml Oberphase mit einem Interferon-Gehalt von 2,3 10⁸IE erhalten.

In der Unterphase mit einem Volumen von 13ml wurde eine IFN-Aktivität von 3,8 · 10⁷IE bestimmt.

Somit wurde ein Verteilungsfaktor K von 2,18 bei einem Volumenverhältnis der Phasen von 2,8 und eine Anreicherung der IFN-Aktivität in der Oberphase von 85,2%, bezogen auf die Gesamtaktivität, erreicht.

3. (vgl. Tabelle, Versuch 4)

Es werden 20g eines Phasensystems hergestellt, welches einen Gehalt von 4Gew.-% PEG 6000,1 Gew.-% PVAL 65000,

2 Gow.-% K₂HPO₄,1 mol/l Guanidinhydrochlorid und 0,5mol/l NaCI hat.

In diesem Phasensystem werden 5g Γ 'luchtbiomasso mit einer IFN-Aktlvltät von 2,46 10⁷ IE/g suspendiert, die Suspension

mittels Ultraschall homogenisiert und durch Zusatz 10%iger Phosphorsäure auf pH 6,9 eingestellt. Danach wird das

Homogenat zentrifugiert. Es werden 17,4 ml Oberphase mit einer IFN-Aktivität von 1,15 · 10⁸ IE und 5,7ml Unterphase mit einer IFN-Aktivität von

8,3 · 10^e IE erhalten, woraus sich ein Verteilungsfaktor K von 6,1, ein Volumonvorhältnls der Phasen von 2,3 und eine

Anreicherung der IFN-Aktivität in der Oberphaso von 93,5%, bezogen auf die Gesamtaktivität, ergeben.

4. (vgl. Tabelle, Versuch 8)

Es wenden 10g eines Phasensystems hergestellt, welches 8 Gow.-% PEG 6000,2Gew. ·% PVAL 55000,4Gew.-% K₂HPO₄ sowie

0,2mol/l NH₄SCN enthält.

In diesem Phasensystem werden 15g einer Kulturlösung mit einer IFN-Aktivität von 1,2 10⁷ IE/g und einem Feststoffgoholt

von 25Qew.-% Feuchtmasse suspendiert, die Suspension mittels Ultraschall homogenisiert und durch Zusatz 10%lgor

Phosphorsäure auf pH 6,8 eingestellt. Von dem Homogenat werden 20ml zentrifugiert. Es werden 14,3 ml Oberphase mit einer IFN-Aktivität von 1,3 · 10^e IE und 5,7 ml Unterphaso mit einer IFN-Aktivität von 1,4 · 10⁷ IE erhalten, woraus sich ein Verteilungsfaktor K von 3,7, ein Volumenverhältnis der Phasen von 2,5 und eine Anreicherung der IFN-Aktivität in der Oberphase von 90,2%, bezogen auf die Gesamtaktivität, ergeben.

5. (vgl. Tabelle, Versuch 10)

In 20g eines Phasensystems, welches 4Gew.-% PEG 6000,1 Gew.-% PVAL 55000,2Gew.-% K₂HPO₄,2 Mol/l Harnstoff und 0,3 Mol/l KSCN enthält, werden 5g Feuchtbiomasse mit einer IFN-Aktivität von 7,26 · 10⁷ IE/g suspendiert, die Suspension mittels Ultraschall homogenisiert und durch Zusatz 10%iger Phosphorsäure auf pH 6,7 eingestellt. Anschließend werden 20ml des Homogenats zentrifugiert.

Es werden 14ml Oberphase mit einer IFN-Aktivität von 2,74 · 10^s IE und 6ml Unterphase mit einer IFN-Aktivität von 1,65 -10⁷IE gewonnen, woraus sich ein Verteilungsfaktor K von 7,1, ein Volumenverhältnis der Phasen von 2,3 und eine Anreicherung der IFN-Aktivität in der Oberphase von 94,3%, bezogen auf die Gesamtaktivität, ergeben.

Tabelle

Versuch	PEG	Systemkomponenten*	Guanidin-	Harnstoff	KSCN	NH₄SCN	pH ve	K	Anreiche
	6000	PVAL K₂HPO₄	hydrochlorid						rung*^
	(Gew.-%)	55000	(mol/l)	(rnol/l)	(mol/l)	(mol/l)			(%)
	(Gew.-%) (Gew.-%)

3,2	0,8	1,6
1,6	0,8	1,6
0,8	2,4	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	1,6
3,2	0,8	,6

-	-	-	6,9	2,3	1.6	79,6
-	-	-	6,7	2,8	2,3	86,6
--	-	-	6,7	2,8	2,2	85,2
-	-	-	6,9	2,3	6,1	93,5
-	0,08	-	6,8	2,1	3,0	86,1
-	0,24	-	6,7	2,6	3,8	90,9
-	0,4	-	6,7	2,3	5,4	92,6
-	-	0,08	6,8	2,5	3,7	90,2
1,6	0,08	-	6,8	1,9	3,6	87,6
1,6	0,24	-	6,7	2,3	7,1	94,3

Anmerkungen:

+: Die Konzentrationsangaben beziehen sich auf die Kulturlosung-Phasengemisch-Suspension.

+ + : Die Suspension enthielt 0,4mol/l NaCI.

H- + : Die Anreicherung bezieht sich auf die IFN-Aktivität der Oberphase im Verhältnis zur Gesamtaktivität. K: Verteilungsfaktor. ^Vo/vn: Verhältnis zwischen dem Volumen der Ober- und der Unterphase.

Claims

1. Verfahren zur Anreicherung rekombinanter Proteine aus Homogenisaten von Fermentationsbrühen bzw, resuspendierten Feuchtbiomassen, wobei nach Homogenisation diese Protein-Suspensionen in einem wäßrigen Zweiphasensystem, bestehend aus einer Suspension zweier phasenunverträglicher Polymere, verteilt sind, gekennzeichnet dadurch, daß als phasenunverträgliche Polymere ein Polyetheralkohol und ein Polyol eingesetzt werden, gegebenenfalls Zusätze einer oder mehrerer chaotrop wirkender Substanzen sowie eines oder mehrerer anorganischer Salze erfolgen, das wäßrige Zweiphasensystem mittels anorganischer Säure oder Lauge mit einem pH-Wert im Bereich von pH 5,0 bis pH 8,0 eingestellt wird und nach Zentrifugation bei niedrigen g-Werten die die rekombinanten Proteine enthaltende Oberphase abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polyetheralkohol in einer Konzentration von 0,5Gew.-% bis 4Gew.-% eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyetheralkohol Polyethylenglykol eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß Polyethylenglykol mit einer mittleren Molmasse von 1000 bis 20000, vorzugsweise von 4000 bis 8000, zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polyol in einer Konzentration von 0,5Gew.-% bis 3Gew.-% eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyol Polyvinylalkohol eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß Polyvinylalkohol mit einer mittleren Molmasse von 10000 bis 300000, vorzugsweise von 20000 bis 80000, eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis7,gekennzelchnetdadurch,daßalschaotropwirkendeSubstanzen Guanidinhydrochlorid, Harnstoff und/oder Rhodanid im Bereich von 0,05Mol/l bis 2Mol/l zugesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß als Rhodanid Kalium- oder Ammoniumrhodanid zugesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß als anorganisches Salz ein Phosphat in einer Konzentration von 0,5Gew.-% bis 4Gew.-%, vorzugsweise von 2Gew.-%, zugesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß Kaliumphosphat bzw. Natriumphosphat zugesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß das wäßrige Zweiphasensystem vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 7,0 eingestellt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Zentrifugation bei 1000g über eine Zeitdauer von 10 Minuten durchgeführt wird.