DD288395A5 - Verfahren zur herstellung von alpha-amylase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentationstechnischen Gewinnung einer alpha-Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris, die sich insbesondere zur Hydrolyse von Staerkepolysacchariden eignet. Bevorzugt werden dabei Maltose und Maltotriose gebildet. Glucose entsteht nur in sehr geringen Mengen. Die Synthese des Enzyms erfolgt in einem 24stuendigen Fermentationsprozesz in einem komplexen Naehrmedium, wobei erfindungsgemaesz gewonnene Selektanten des Mikroorganismenstammes zum Einsatz gelangen.{Mikroorganismus; Thermoactinomyces vulgaris; Selektion; Vermehrung; Leistungssteigerung; Kultivation; alpha-Amylase; Staerkehydrolyse}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris mit besonderen Eigenschaften zur Spaltung von Stärkepolysacchariden in Maltose und Maltotriose, wobei Glucose nur in sehr geringen Mengen entsteht. Das Enzym kann vorteilhaft bei der heterogenen Hydrolyse von Stärken zu Maltosesirupen und für die Supplementierung von Glucoamylase bei der Traubenzuckerhersteliung eingesetzt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Verfahren zur Herstellung bakterieller und pilzlicher alpha-Amylasen sind zahlreich bekannt. Diese Enzyme spalten bevorzugt aus Stärkepolysacchariden Maltose ab. Aus thermophilen Mikroorganismen, zu denen Thermoactinomyces vulgaris zählt, gewinnt man ebenfalls verschiedene Amylasen mit unterschiedlichen Eigenschaften. M.J. KUO und P.A. HARTMANN (J.of Bacteriology, 92 [1966] 723-726) beschreiben die Synthese von thermostabiler alpha-Amylase aus Actinomyceten in einem Nährmedium, das Maltose und Stärke als Kohlenstoffquelle enthält.

Eine lange Fermentationszeit von mehr als 36 Stunden sowie die Verwendung von teurer Maltose im Nährmedium sind als nachteilig anzusehen.

Von M. SHIMUZU et al. (Agric. Biol.Chem., 42 [1978] 1681-1688) wird die Gewinnung einer alpha-Amylase aus einem Stamm von Thermoactinomyces vulgaris beschrieben. Das salzgefällte und durch Säulenchromatographie gereinigte Enzym hydrolysiert Pullulanan zu Pannose und Stärke unter Abspaltung von Maltose und Glucose. Nachteilig ist hierbei der entstehende hohe Glucoseanteil, der bei der Anwendung in thermischen Lebansmittelverarbeitungsprozessen infolge der Reaktion mit Aminosäuren zu unerwünschten Nebenprodukten führen kann. In Ergänzung zu den Ergebnissen von M. SHIMUZU et al. (1978) konnten F. G. PRIEST et al. (Stärke 40 [19(181 *36-429) nachweisen, daß sich d;e alpha-Amylase aus Thermoactinomyces putidus von dem Enzym des japanischen Thermoactinomyces vulgaris-Stammes durch das Fehlen der Pullulanaseaktivität unterscheidet und vergleichbar mit der von M. J. KUO und P.A. HARTMANN (1966) beschriebenen alpha Amylase ist. Über den Einfluß verschiedener C-Quellen in einem Fermentationsmedium mit Maismehl, Hefe und Salzen auf die extrazelluläre Enzymsynthese von alpha-Amylase durch Thermoactinomyces vulgaris berichtet I.A. TSAPLINA (Sixth Int.Symp. on Actinomycetes Biology, Debrecen [1985] Poster Abstr.). Nach Zugabe von 3% Maltose kommt es zu einem Anstieg der Enzymaktivität von 81 %. Von Y.TAKASAKI (Agric. Biol. Chem. 51 (1987] 9-16) wird ein Enzymkomplex (Pullulanase und alpha-Amylase) aus Bacillus subtilis beschrieben, wobei aus Pullulan Maltotriose und aus Stärke hauptsächlich Maltose und Maltotriose entstehen. Der Enzymkomplex eignet sich zur Herstellung von Maltotriosesirup mit einem Gehalt von 50 bis 55% Maltotriose, 20 bis 40% Maltose und 2 bis 5% Glucose. Optimale Hydrolysobedingungen sind bei pH6 bis 7 und 5O⁰C bis 6O⁰C. Demgegenüber beschreiben E. DOYLE (it al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 30 (1989] 492-496) eine alpha-Amylase aus Peniciilium expansum, die ohne entzweigende Nebenaktivitäten nach der Hydrolyse von Stärke 74% Maltose bei pH 4,5 und 6O⁰C abspalte?. Außerdem entstehen 21 % Glucose und 3% Maltotriose.

Von Y. SUZUKi et al. (Stärke 39 [1987] 211-214) wird über maltogene und maltotriogone alpha-Amylasen aus Bac. thermoamyloliquefi. ciens KP 1071 berichtet, wobei die exogen wirkende maltogene alpha-Amylase in der Lage ist, die alpha-1,6-Bindungen im Amylopektin ;:u spalten.

Ein der Erfindung nahestehendes Verfahren zur Herstellung einer Protease mit alpha-amylolytischer Aktivität wird von RICHTER et al. vorgeschlagen (Wi'225711A1). Das Enzym aus einem Stamm von Thermoactinomyces vulgarls zeichnet sich durch die bevorzugte Spaltung von Störkepolysacchariden in Maltose und Maltotriose aus. Glucose entsteht nur zu einem sehr geringen Anteil. Das Verfahren besitzt jedoch verschiedene Nachteile, die sowohl bei der Herstellung des Enzyms als auch bei dessen Applikation zum Ausdruck kommen. Die verwendete Mutante (MET9515) produziert bevorzugt eine thermostabile Protease. Alpha-Amylase entsteht mit 0,73AE/ml Kulturlösung nur in sehr geringen Mengen. Nachteilig ist bei diesem Syntheseprozeß ferner, daß die gebildete Amylase nach einem Maximum wieder stark an Aktivität verliert, Die Notwendigkeit, während der Fermentation Nährstoffe zuzufüttern, bedeutet erhöhten Aufwand in der technologischen Ausstattung und Prozeßführung. Bei der Applikation kann der im Verhältnis zur Amylase sehr hohe Proteaseanteil störende Effekte hervorrufen und die wegen der geringen Amylaseaktivität erforderlichen Enzymmengen bedeuten ungünstige ökonomische Relationen beim Einsatz des Präparates.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris für die Spaltung von Stärkbpolysacchariden in Maltose und Maltotriose zu entwickeln, das die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und durch höhere Enzymausbeuten und einfache technologische Realisierbarkeit zur Verbesserung der Ökonomie führt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Dar Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die speziellen Verfahrensbedingungen zur Herstellung einer Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris mit hoher amylolytischer Aktivität aufzuzeigen.

Es wurde gefunden, daß aus einem Stamm Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutante- hinterlegt in der Zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelleTherapie in Jena unter IMET9512 und für die Mutante IMET9515 - durch Isolation von Einzelkolonien auf stärkehaltigen Nährböden Selektanten gewonnen werden können, die bei dor weiteron Kultivation in flüssigen stärke- und maisquellwasserhaltigen Substraten große Mengen an Amylase bilden. Erfindungsgemäß wird dabei so vorgegangen, daß aus einer verdünnten Sporensuspension des Stammes oder der Mutante auf Nähragar, bestehend aus Maisstärke, Maisquellwasser und Salzen, Einzelkolonien angezogen, von diesen zur Vermehrung Schrägrohre beimpft und von diesen nach Bebrütung Sporenabschwemmungen gewonnen werden, die zur Beimpfung von Schüttelkulturen dienen, in denen in einem Medium aus Stärke, Maisquellwasser und Salzen Keimung und Wachstum des Mikroorganismus erfolgt und in dem nach 24stündiger Kultivation die Amylaseaktivität bestimmt wird. Weiter wird so vorgegangen, daß von den als Ausgangsmaterial dienenden Sporensuspensionen eine Mischung derjenigen hergestellt wird, die in der Schüttelkultur hohe Amylaseausbeuten gezeigt haben, und daß von dieser Mischung Nähragar der genannten Zusammensetzung in Kolleschalen beimpft und nach Bebrütung davon Sporenabschwemmungen hergestellt werden, die bei Kühlschranktemperatur für die Beimpfung von Fermentationsansätzen aufbewahrt werden können.

Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, die Herstellung von Leistungsselektanten für die Gewinnung von alpha-Amylase nach dem aufgezeigten Schema ständig zu wiederholen und die Sporenabschwemmung direkt zur Beimpfung von Fermontationsansätzen zu verwenden oder die erzeugte Sporenabschwemmung der Leistungsselektanten durch Konservierung an Luvos-Heilerde in eine länger haltbare Form zu überführen und daraus bei Bedarf durch Beimpfung von Nähragar der o. g. Zusammensetzung in Kolleschalen nach Bebrütung frische Sporenabschwemmung für die Beimpfung von Fermentationsansätzen zu gewinnen. Es hat sich dabei gezeigt, daß Sporenabschwemmungen der Leistungsselektanten bis zu 3 Monaten ohne Leistungsverlust im Kühlschrank aufbewahrt werden können und daß an Luvos-Heilerde konservierte Sporen über mehrere Jahre zur Anzucht von frischen Sporensuspensionen geeignet sind. Nach diesem Verfahrensweg erfindungsgemäß hergestellte Leistungsselektanten sind daher jederzeit verfügbar.

Erfindungsgemäß werden die Sporensuspensionen der Leistungsselektanten zwecks Gewinnung von alpha-Amylase in eine Vorkultur gemäß WP156714 eingeimpft, dort vorkultiviert und danach auf Produktionsfermentoren übertragen, in denen unter Kulturbedingungen entsprechend WP225711A1 die Synthese der alpha-Amylase erfolgt. Die Enzymbildung beginnt nach 3 bis 4 Stunden Fermentationszeit und setzt sich mit konstanter Syntheserate bis zum Ende der Fermentation nach 24 Stunden fort. Es werden alpha-Amylaseaktivitäten von 40 bis 60 AE/ml Kulturlösung reproduzierbar erreicht. Im Gegensatz zur Kultivierung nach WP225711A1 sind zusätzliche Nährstoffgaben während der Fermentation nicht erforderlich, und die gebildete alpha-Amylase bleibt erhalten

Die Erfindung wird durch folgende Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Durch fortlaufende Selektion von Einzelkolonien einer Stammvariante der Mutante IMET9515 ist es möglich, leistungsgesteigertes Inokulum in Form von Sporensuspensionen für Fermentationsansätze zu gewinnen. Im einzelnen geht man so vor, daß von einer Sporenkonserve mit einem Mikrospatel eine Aufschwemmung in 2 ml 0,01%iger Tween-80-Lösung hergestellt wird, die je nach Bedarf zur Anzucht von Einzelkolonien auf einem Nähragar, bestehend aus Maisstärke, Maisquellwasser und Salzen (s. WP227449), bis auf 1:100 verdünnt worden kann. Jeweils 30 bis 50 Einzelkolonien überimpft man auf Schrägrohren mit dem gleichen Nähragar und inkubiert 20 Stunden bei 50^cC. Von diesen Schrägrohren werden Sporenabschwemmungen hergestellt und mit einer Sporenkonzentration von 3 bis 5x 10⁷/ml eine entsprechende Anzahl von Schüttelkulturen in dem o. g. Medium ohne Zusatz von Agar beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 5O⁰C auf einem Rundschwingtisch (180 bis 2?.0U/min) wird die aipha-Amylaseaktivität bestimmt. Diese liegt im Bereich von 14 bis 70AE/ml. Zur Gewinnung eines leistungsstarken, stabilen Inokulums werden die Sporensuspensionen der Schrägrohre mit

>40AE/ml gemischt. Mit dieser Mischung werden Kolleschalen mit dem o.g. Nähragar beimpft und 24 Stunden bei 50°C inkubiert. Durch Abschwemmung der Kolleschalen mit der o.g. Tween-Lösung und nachfolgender Homogenisierung in einem Glaskugelhomogenisator steht das entsprechende Inokulum für Fermentationsansätze zur Verfügung. Dieses ist bis zu 3 Monaten ohne Leistungsverlust im Kühlschrank lagerbßr. Für eine Gewinnung neuer Sporensuspensionen ist immer wieder von einer Sporenkonserve auszugehen, und die beschriebenen Verfahrensschritte müssen eingehalten werden, da sonst nur eine Amylase-Leistung von s 14 AE/ml erreicht wird.

Beispiel 2 Ein 300-l-Rührfermentor wird mit 1501 Medium der Zusammensetzung Maisstärke 1,00 Masse in % Maisquellwasser (50%ig) 1,00 Masse in % Trockenhefe 0,03 Masse in % Magermilchpulver 0,05 Masse in % NaCI 0,50 Masse in % CaCI₂ 0,05 Masse in %

befüllt und sterilisiert. Die Beimpfung erfolgt mit einer Sporenabschwemmung der gemäß Beispiel 1 hergestellten Leistungsselektante, die nach WP156714, Beispiel 1, vorkultiviert wird. Die Fermentationstemperatur beträgt 50°C ±1K. Luftmenge und Rührerdrehzahl werden stufenweise innerhalb von 6 Stunden von 20l/min auf 1401/min bzw. von 300min"¹ auf 500min'¹ erhöht. Als Entschäumer werden dem Medium vor der Beimpfung 0,51 Rapsöl zugesetzt. Die Amylasebildung beginnt nach 3 bis 4 Stunden Fermentationszeit und setzt sich bis zum Fermentationsende nach 24 Stunden mit konstanter Syntheserate fort. Nach 24 Stunden wird die Fermentation beendet und die alpha-amylasehaltige Kulturlösung geerntet. Sie enthält alpha-Amylase mit einer Konzentration von 40 bis 60 AE/ml. Protease ist nur in geringen Mengen von 3 bis 4TE/ml Kulturlösung enthalten.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amyla'' aus Thermoactinomyces vulgaris mit besonderen Eigenschaften zur Spaltung von Stärkepolysr, chariden in Maltose und Maltotriose, wobei Glucose nur in sehr geringen Mengen entsteht, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Stamm Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutanten - hinterlegt in der Zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter IMET9512 und für die Mutante IMET9515- aus verdünnten Sporensuspensionen auf Nähragar aus Maisstärke, Maisquellwasser und Salzen Einzelkolonien angezogen, von diesen zur Vermehrung Schrägrohre mit gleichem Nähragar beimpft und von diesen nach Bebrütung Sporenabschwemmungen gewonnen werden, von denen nach einem Leistungstest in Schüttelkulturen Mischungen derjenigen Sporenabschwemmungen hergestellt werden, die im Leistungstest eine hohe alpha-Amylasebildung zeigten, und daß diese Mischung der Sporenabschwemmungen der Leistungsselektante zur Vermehrung auf Nähragar aus Maisstärke, Maisquellwasser und Salzen überimpft und nach Bebrütung davon Sporenabschwemmungen hergestellt werden, die zur Beimpfung von Fermentationsansätzen verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporenabschwemmungen der Leistungsselektante aus dem Stamm Thermoactinomyces vulgaris jeweils frisch hergestellt und für die Beimpfung von Fermentationsansätzen verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporenabschwemmungen der Leistungsselektante an Luvos-Heilerde konserviert und daraus bei Bedarf durch Bebrütung auf Nähragar eine Sporenabschwemmung hergestellt wird, die zur Beimpfung von Fermentationsansätzen dient.