DD287852A7 - Verfahren zur bestimmung des freien thyroxins im blutserum - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des "freien", d. h. biologisch wirksamen Thyroxins (FT4) im Blutserum nach dem Prinzip des Analogtracers und loest die Aufgabe, die Bindung des Analogtracers an Albuminmolekuele moeglichst weitgehend zu verhindern. Das wird erreicht, indem der Probe ein Albuminbindungsinhibitor (Pharmaka mit blutlipidsenkender Wirkung oder Sulfonamide mit prolongierter Wirkung) im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,0 mg pro 0,1 ml Serum zugesetzt wird.{Thyroxin; freies Thyroxin; Blutserum; Analogtracer; Albumin; Bindungsinhibitor}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des .freien*, d. h. biologisch wirksamen Thyroxins (FT4) im Blutserum nach dem Prinzip des Analogtracers.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In der klinischen Endokrinologie nehmen Schilddrüsenerkrankungen einen vorderen Platz ein. Die quantitative Bestimmung des .freien", d. h. biologisch verfügbaren Thyroxins trägt in erheblichem Umfang zur sicheren Diagnostik bei. Als radioimmunologische Methode wird die FT4-Bestimmung bevorzugt in nuklearmedizinischen Laboratorien durchgeführt. Die SchüddrOsenhormone sind, wie auch andero Hcrmone, zu einem hohen Anteil an im Blutserum enthaltene Proteine gebunden (siehe z.B. CNn. Endocrinol. 7 [1977] 307). Die Bindungsproteine, vorrangig thyroxinbindendes Globulin (TBG), Präalbumin (PA) sowie Albumin (A), dionen dem Hormontransport im Blutkreislauf; außerdem wird hierdurch Abbau und Exkretion stark verlangsamt. Ein kleiner Anteil der Hormone ist ungebunden (.frei"); er ist deshalb ohne weiteres in der Lage, mit den Rezeptoren der Targetzellen der Erfolgsorgane zu reagieren. Beim Thyroxin beläuft sich dieser Anteil an freiem Hormon (FT4) auf 0,02-0,03% vom Gesamt-T4. Die Bestimmung erfolgt durch Ultrafiltration oder Gleichgewichtsdialyse unter Zusatz von radioaktiv markiertem T4 als Tracer und ist nicht für die labordiagnostische Routine geeignet.

Der Bedarf an .freien" T4 in den Organen kann über ein sich stets neu einstellendes Gleichgewicht zwischen .freiem" T4 und gebundenem T4 gedeckt werden. Dieses Gleichgewicht wird durch das Massenwirkungsgesetz reguliert; mithin gehen außer den aktuellen Konzentrationen der Bindungspartner (hier T4) und der Bindungsproteine (TPG, PA, A) auch deren Bindungsaffinitäten in die Betrachtung ein. Die Verteilung der Hormone auf die Bindungsproteine ist sehr unterschiedlich, was Ausdruck der spezifischen Bindungsaffinitäton und Kapazitäten ist (Akt. Endolkrinol. Stoffw. 5 (1984) 28). In letzter Zeit mehren sich Stimmen, die darauf hinweisen, daß auch dem albumingebundem Anteil des T4 eine wichtige (vielleicht sogar vorrangige) Funktion bei der Interaktion mit den Rezeptoren zukommt (unter anderem .Free Hormons in Blood", ed. A.AIbertinl und R.P.Ekins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam 1982; W.M.Pardridge, Amor. J. Physiol. 252 [1987J E157). Infolge der niedrigen Bindungskonstanten T4/Albumin sollte, besonders in den Kapillaren in unmittelbarer Nähe der Rezeptoren, jederzeit eine .bedarfsgerechte" Freisetzung der Hormonmoleküle vom Albumin und deren Bindung an die Rezeptorareale stattfinden. Die locker an Albumin gebundene T4-Fraktion könnte deshalb im nötigen Umfang für die Regulation des Zellstoffwechsels herangezogen werden. Wegen ihrer erheblichen Konzentration könnte sie stärkere Bedeutung haben als da j in vitro gemessene freie T4 (0,03% zu etwa 10%).

Soweit nachgeprüft, bestimmen die yorbroitotston FT4-RIA-Testsätze nicht den in vitro .freien" T4-Antell, sondern offensichtlich die locker an Albumin gebundene Fraktion. Eine Erfassung des sehr geringen FT4-Anteils ist per RIA bei dem vorgeschriebenen Testablauf auch nicht möglich, da die Empfindlichkeit, wie sich leicht nachrechnen läßt, dafür nicht ausreicht. Die Anwender der FT4-Tests sind sich über diesen Tatbestand meistens nicht im klaren.

Die Bestimmung nur einer bestimmten T4-Fraktion ist analytisch keine leichte Aufgabe; die Fraktionen unterscheiden sich lediglich durch die differente Proteinbindung der T4-Moleküle. Durch das sogenannte Analogtracerprinzip konnte bezüglich der Eliminierung der T4/TPG- bzw. T4/PA-Fraktion eine wesentlicher Fortschritt erzielt werden.

Bei der Bestimmung des Gesamt-T4 des Serums konkurriert, entsprechend dem von Yalow und Berson inaugurierten WA-Prinzip, der T4-Tracer (¹²*I-T4) mit dem durch Anilinnaphthalinsulfonsäure (ANS) freigesetzten Sorum-T4 um die Bindungsplätzo am Antikörper (die ANS verdrängt spezifisch das an die Transportprotoine gebundene T4). Zum Zwecke der Bindungsinhibierung des T4 an Präalbumin und TBG wurden auch andere Verbindungen vorgeschlagen, z. B. SaI,cylato und Barbiturate oder Merthlolat (US-PS 3928553). Um aber das biologisch aktive, .freie. T4 zu bestimmen (Albuminf'jktion und in vitro ungebundenes T4) muß unter Fortlassen der ANS bzw. der anderen genannten Inhibitoren ein Tracer verwendet werden, der zwar mit dem T-C Antiserum reagiert, aber nicht mit den Serumbindern in Aktion tritt, speziell nicht mit dem TPG und dem PA. Durch dieses T4-Derivat wird erreicht, daß nur das locker an Albumin gebundene T4 (zusammen mit dem „freien" T4-Antoil) in die Immunreaktion einbezogen wird. Von der chemischen Konstitution her handelt es sich bei denT4-Analogtracern um ^W6l-markierteT4-Deiivate, bei denen das Molekül so verändert wurde, daß eineTPG- und PA-Bindi. .ig nicht mehr stattfinden kann. Trotz des großen Fortschritts, den die Anwendung des Analogtracers für die Verifizierung eines pmktikablen FT4-RIAs gebracht hat (z. B. Unabhängigkeit von TBG-Schwankungen), bleiben immer noch Mängel bestehen. So werden z. B. sehr hohe Anteile des Analogtracers sofort nach seiner Zugabe zur Probe von den Albuminmolekülen dos Serums gebunden (bis zu 90%) und stehen damit nicht mehr für die Kompotitionsreaktion mit dem Probe-T4 am Antikörper zur Verfügung. Das drückt sich schon in einer

sehr niedrigen initialen Bo-Bindung aus. Oa die registrierte Impulsrate bei ansteigender Probemenge weiter absinkt, wird die Meßstatistiknoch schlechter, waszurVerlängerung der Meßzeit zwingt. Um die ungünstigen Bindungsverhältnisse wenigstens teilweise auszugleichen, wird die Tracermasse, d.h. der Einsatz von ^ml-Analogtracer pro Test erhöht, wodurch die Menge an radioaktivem Abfall zunimmt.

Ziel der Erfindung Das Ziel der Erfindung besteht in einer weiteren Verbesserung von FT4-RIAs unter Anwendung eines Analogtracers. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren zur Bestimmung des freien T4 so zu modifizieren, daß möglichst keine Bindung des FT4-Analogtracers an Albuminmoleküle auftritt.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem dem System ein Albuminbindungsinhibitor in solchen Mengen zugesetzt wird, daß seine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1,0mg pro 0,1 ml Serum beträgt. Als Albuminbindungsinhibitoren eignen sich vor allem Pharmaka mit blutlipidsenkender Wirkung (Anti· oder Hypolipämika) wie p-Chlorphenoxybuttersäure (Chlofibrinsäure) bzw. ihr Ethylester (Chlofibrat), Nicotinsäure unti ihre Derivate, Sulfonamide mit prolongierter Wirkung wie Sulfaphenazol (Depocid) sowie ausgewählte Analgetika wie 1-Phonylpyrazolldin-2-butyl-3,5-dion (Phenylbutazon). Die ausgewählte Substanz wird in vorher auszutestender Konzentration dem Assaymedium zugesetzt. Hierdurch wird eine Bindung des T4-Analogtracers an die Serumalbuminmoleküle praktisch verhindert, während die Bindungen der endogenen Hormone T4 »und T3) an Albumin und die anderen Binder nicht bzw. nicht meßbar beeinträchtigt werden. Der Analogtracer ist nun in der Lage, im erwünschten hohen Umfang mit dem T4-Antikörper zu reagieren, was sich In einer prozentual hohen Tracer-Antikörper-Bindung im Punkt Bo ausdrückt. Erst durch diesen Effekt kann die Tracermasse minimiert, die notwendige Empfindlichkeit zur Bestimmung kleinster Substanzmengen erreicht und die Aktivität pro Testsatz und damit auch der radioaktive Abfall gesenkt werden.

Die bevorzugt anzuwendende Inhibitorsubstanz, das Chlofibrat, wird in einem typischen Beispiel in einer Menge von 500) ig pro 0,2ml Analogtracerlösung angewandt, wodurch die initiale Bindung B₀ von 10,6%(ohne Inhibitor) auf 64,2% ansteigt. Hierdurch erhöht sich die Impulsrate um den Faktor β mit gleichzeitiger Verbesserung der Zählstatistik.

Ausführungebeispiel Es werden folgende Substanzen eingesetzt:

- Humanserumstandards mit 0; 1,1; 2,2; 4,2; 8,4; 16,7; 33,4 und 66,9pmolFT4/l Serum;

- Analogtracerlösung mit 10-15pg '"!-Tracer und 500pg Chlofibrat pro 200μΙ in 0,1 mol/l Phosphatpuffer;

- FT4-Antiserum, austitriert gegen die Analogtracermasse. z.B. 1:8000 verdünnt und 0,1 mol/l Phosphatpuffer;

- B/F-Trennmittel, bestehend aus Normalkaninchenserum und dazu austitriertem präzipitiarendem 2. Antisemit) mit 3% Polyothylenglykol f 000 in destilliertem Wasser.

Je 100μΙ der genannten Serumstandards werden in 4-ml-Proberöhrchen aus Polystyren pipettiert. Es werden jeweils 200 μ! Analogtracerlösung uitd 100μΙ FT4-Antiserum dazu gegeben. Die Lösungen werden auf einem Mixer durchmischt und 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 1 ml B/F-Trennmittel wird weitere 15 Minuten inkubiert. Anschließend wird bei ca. 2500xg für 20 Minuten zentrifugiert. Zur Trennung der gebundenen von der freien Phase wird der Überstand quantitativ abgesaugt. In einem geeigneten Kernstrahlungsmeßgerät wird die Impulsrate jedes Röhrchens ermittelt und durch die Impulsrate von 200 μΙ Analogtracorlösung (Totalimpulsrate) dividiert, um die Bindung als Prozentwert zu erhalten. Die Ergebnisse sind in der fönenden Tabelle enthalten:

Tabelle 3 Beispiel einer Standardkurve mit und ohne Inhibitor Total-Impulsrate: 32345cpm

Standard	ohne Chlofibrat	Bindung	mit Chlofibrat	Bindung
konzentration		(%)		(%)
	Impulsrate	10,6	Impulsrate	64,2
(pmol/l)	(cpm)	9,2	(cpm)	67,8
0	3429	8,2	20759	51,7
1,1	2983	7,1	18710	41.9
2,2	2654	5,2	16723	30,9
4,2	2287	2,9	13539	18.1
8.4	1680	1,1	9993	7,1
16,7	953	0.4	5864	2.7
33,4	370	2296
66,9	125	865

Es lassen sich folgende Schlüsse ziehen:

- ohne Zusatz des Albuminbindungsinhibitors ist der Assay gestört, der Analogtracer wird durch ungehinderte Albuminbindung der spezifischen Antikörperreaktion weitestgehend entzogen. Folglich ergeben sich sehr geringe Impulsraten mit geringer Differenzierung und großem statistischem Meßfehler.

- Mit Zusatz des Albumininhibitors wird die Bindung an AlbumlnmolekQle unterdrückt, der Tracer kann mit dem Antikörper in hohem Maße kompetitieron. Daraus resultieren hohe Impulsraten mit großer Differenzierung und guter Meßstatistik.

Claims (3)

1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung des „freien", d. h. biologisch wirksamen Thyroxins im Blutserum nach dem Prinzip des Anelogtracers, gekennzeichnet dadurch, daß der Probe ein Albuminbindungsinhibitor für den Analogtracer im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,0mg pro 0,1 ml Serum zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Albuminbindungsinhibitor Pharmaka mit blutlipidsenkender Wirkung oder Sulfonamide mit prolongierter Wirkung eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß p-Chlorphenoxybuttersäure (Chlofibrinsäure) oder ihre Ester (Chlofibrat) oder Nikotinsäure bzw. deren Derivate oder Sulfaphenazol oder 1-Phenylpyrazolidin-2-butyl-3,5-dion (Phenylbutazon) eingesetzt werden.