DD286671A5 - Gefaesskombination zum nachweis von biomolekuelen - Google Patents

Abstract

Diese Erfindung betrifft eine Gefaeszkombination zum Nachweis von Biomolekuelen. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis mittels der erfindungsgemaeszen Gefaeszkombinationen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, Immunologie, Diagnostik und Mikrobiologie. Die Gefaeszkombination besteht aus einem oder mehreren Analysengefaeszen, die aus einer oder mehreren kleinen Reaktionskammern (1) von 1 bis 20 ml Volumen und einer groszen Inkubationskammer (2) von 50 ml bis 100 ml Volumen aufgebaut sind, wobei die Reaktionskammern (1) als Vertiefungen des Bodens und/oder der Seitenwaende der Inkubationskammer (2) ausgebildet sind. Das Nachweisverfahren besteht darin, in der Reaktionskammer ein Sondenmolekuel, z. B. ein Antigen oder einen Antikoerper, auf der Oberflaeche zu fixieren, anschlieszend das zu analysierende Biomolekuel in Loesung in die Reaktionskammer und Inkubationskammer zu geben, die spezifische Reaktion durchzufuehren und schlieszlich das zu analysierende Biomolekuel, z. B. durch eine Enzymreaktion, in der Reaktionskammer nachzuweisen. Mit der erfindungsgemaeszen Loesung koennen molekularbiologische Nachweisverfahren hoechster Empfindlichkeit mit kleinsten Mengen an Nachweisreagens bei groszen zu analysierenden Probenvolumina durchgefuehrt werden. Auszerdem ist eine Parallelbestimmung von verschiedenen Biomolekuelen aus der gleichen zu analysierenden Probe moeglich.{Gefaeszkombination; Nachweisverfahren, molekularbiologische; Reaktionskammer, kleine; Inkubationskammer, grosze; Vertiefungen; Sondenmolekuel; Antikoerper; Antigen; Enzymreaktion}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Gefäßkombination zur Durchführung von Nachwoisreaktionen für Biomoleküle und Verfahren, die mittels dieser Gefäßkombination durchführbar sind. Die Gefäßkombination, deren einzelne Analysengefäße und die Nachweisverfahren können in der Molekularbiologie, Immunologie, Diagnostik sowio in der Mikrobiologie angewendet worden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Mikrotiterplattenassays sind weitverbreitete Analysentechniken in der Molekularbiologie, siehe z. B. J. D. Buxbaum und Y. Dudni, Anal. Biochem. 169, 209-215 (1988) oder Produkt-Katalog der Firma Flow-Laboratories 1989, S. 94-95. Dabei werden sowohl Antikörper als auch Antigene meist unter Nutzung der ELISA-Technik bestimmt, siehe z. B. B. E. Engval! und P. Pcrlmann, Immunochemistry 8,871-874 (1971). Diese Mikrotiterplatten besitzen Kammervolumina von 0,1 bis 1 ml, die für alle Nachwoisschritte mit gleichen Volumina genutzt werden. Das bedingt einon hohen Verbrauch an Nachweisroagonzien und eine ungünstige Geometrie der Reaktionsfläche, was sich nachteilig auf den Untergrund bei der Nachwoisreaktion auswirkt. Bei den sogenannten Ultramikroliter-Testplatten (Polystyren, PVC) wird in einer Kammer mit einem Volumen von ca. 20μΙ für alle Nachweisschritte gearbeitet (siehe z. B. EP 203.443), bei der SIA-Technik in Tropfon von ca. 5μΙ Volumen auf speziellen Glasplatten ohne eigentliche Reaktionskammern. Das führt zwar zu einer Verbesserung der Geometrie der Reaktionsflache des Nachweises und damit des Untergrundes der Nachweisreaktion, hat aber den Nachteil, daß das Volumen der zu analysierenden Probo sehr klein ist, waJ oino Verringerung der Empfindlichkeit (Nachweis pg gesuchto Komponente/ml Tostflüssigkoit) zur Folgo hat.

Der Nachteil der bekannton tachnischen Lösungen besteht darin, daß immer nur eine durchgängige Reaktionskammer verwendet wi'd, die keine Mitführung von Negativkontrollen oder eine Parallol-Untersuchung von mehreren zu analysierenden PiOmolekülen aus einer zur Verfügung stehenden, zu analysierenden Probo ermöglicht (siehe z. B. EP 206.561 bzw. EP 246.760).

ZIoI der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ee, eine Gofäßkombination zu konstruieren, in der molekularbiologische Nachweisver'ahren höchster Empfindlichkeit mit kleinsten Mengen des Nachweisreagenzes bei großen zu analysierenden Probenvolumina durchgeführt worden können. Außerdem soll eine Parallelbestimmung von verschiedenen Biomolekülen aus der gleichen zu analysierenden Probe möglich sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Eifindungsgemäb wird eine Gefäßkombination aus einem oder meieren Analysengefäßen zur Verfügung gestellt, die aus einer oder mehreren kleinen Reaktionskammern von 1 bis 20μΙ Volumen (1) und einer großen Inkubationskammer von 50 μΙ bis 100 ml Volumen (2) aufgebaut sind, woboi dio Reaktionskammern (1) als Vertiefungen des Bodens und/oder der Seitenwände der Inkubationskammer (2) ausgebildet sind (Abb. 1 und 2).

Durch die erfindungsgemäße Konstruktion der Gefäßkombination aus Analysengefäßen mit unterschiedlich großen Kammern, die miteinander verbunden sind, werden gegenüber herkömmlichen Verfahren und Analysengefäßen entscheidende Vorteile erzielt, die darin bestehen, daß Biomoleküle aus großen zu analysierenden Volumina in sehr kleinen Reaktionsvolumina nachgewiesen werden können und gleichzeitig eine Parallelbestimmung von verschieden Biomolekülen aus der gleichen zu analysierenden Probe ermöglicht wird. Die Kombination des großen Testvolumens mit sehr kleinen Reaktionsvolumen ermöglicht oine Minimierung der für die Nachweisreaktion eingesetzten Oberfläche und damit ein günstiges Signal/Untergrund-Verhältnis (Steigerung der Empfindlichkeit). Gleichzeitig werden sehr kleine Mangen des Nachweisreagenzes benötigt. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Inkubationskammern mit mehreren Reaktionskammern (Abb. 2), die Möglichkeit der Mitführung von Kontroll- und Paralleltests.

Das Material, aus dem die Reaktionskammern und die Inkubationskammer hergestellt werden, kann gleich (z. B. Polystyren) oder verschieden voneinander sein, z. B. Polystyren und PVC. Es ist möglich, für die Reaktionskammern ein Material, z. B. Nitrocellulose, und für die Inkubationskammer ein anderes Material, z. B. PVC, zu verwenden. Für die Kammern werden in erster Linie synthetische Polymere verwendet, z. B. Polystyren, PVC, Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polyamid, Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluorethylen usw.; es können jedoch auch modifizierte natürliche Polymere verwendet werden, z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat usw. Außerdem können die Materialien Ladungen aufweisen, indem z. B. negative und/oder positive Gruppierungen auf der Oberfläche fixiert sind. Bevorzugt werden für die Reaktionskammern und die Inkubationskammer PVC, Polystyren, Nitrocellulose und Polyvinylidenfluorid.

Die Reaktionskammer sowie die Inkubationskammer können dabei aus optisch durchlässigem oder optisch undurchlässigem oder teilweise durchlassigem, gefärbten oder nicht gefärbten Material gefertigt sein. Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ist die Beschaffenheit des Materials nicht entscheidend, solange die konstruktiven Parametor eingehalten und eine Bindung des Sondenmoleküls ermöglicht wird. Somit stellt sich als ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß bei der Fertigung der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Einhaltung enger Toleranzen zur Durchführung dos Nachwoises mit optischen Methoden nicht unbodingt erforderlich ist, nur in den Fällen notwendig wird, wenn ein optisches Nachweisvorfahren, z.B. durch Farbreaktionen, gewünscht wird. Eine bevorzugte konstruktive Lösung der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, die Reaktionskammer als eine Vertiefung des Bodens der Inkubationskammer auszubilden. Wie in den verschiedenen Ausführungsformen der Abbildung 1 dargestellt wird, wird die Vertiefung dabei vorzugsweise in Form eines Kegeis (A), eines Zylinders (B), eines Kegelstumpfes (C), eines Kugelabschnittes (H) oder nus einer Kombination von zwei oder mehroren geometrischen Körpern, z.B. aus Zylinder und Kegel (D) oder aus Zylinder und Kegelstumpf, oder in Form von Rotationskörpern, z. B. in Form eines U-förmigen Rotationskörpers (G) oder aus zwei Kogelabschnitten (F), oder in Form von ringförmigen Vertiefungen, z. B. mit rechteckigem Querschnitt (E), mit dreieckigem Querschnitt (I) oder in Form von Vertiefungen am Rande mit rechteckigem Querschnitt (K) ausgebildet. Die Herstellung solchor Formen aus Polymeren ist bekannt und kann z. B. durch Pressen, Preßformen, Spr'tzguß, Bohren, Fräsen erfolgen. Weiterhin ist es möglich, eine der Kammern oder einen Teil einer oder beider Kammern mit β ".om anderen Material als dem, aus dem die Vorrichtung aufgebaut ist, zu beschichten. Die Beschichtung kann auch mit Lauungon aufweisenden oberflächenaktiven Mitteln erfolgen. Eine bevorzugte Ausführungsform Ladungen aufweisender Oberflächen der Reaktionskammern besteht darin, daß diese negative Ladungen aufweisen.

Für den Nachweis von Biomolekülen ist in der Rogol mehr als ein Reaktionsgefäß notwendig, da zur Sicherheit einer Kontrollprobe (Negativ-Kontrolle) mitgoführt wird, oftmals Mehrfachproben analysiert odor unterschiedliche Verdünnungon angewendet werden. Bei der automatisierten Durchführung der Nachweiso werden dann möglichst viele Proben gleichzeitig parallel untersucht, z. B. 48 oder 96 oder mehr. Für solche Anwendungen ist es günstig, die erfindungsgemäßen Vorrichtungen miteinander zu mehreren, d.h. mindestens zwei, zu verbinden, wobei die Verbindung mechanisch, durch Verkleben oder Vorpressen durchgeführt werden kann. Vorzugsweise wird eine Gefäßkombination zur Verfügung gestellt, die aus mehreren Analysengefäßen besteht, die dauerhaft odor zeitweise miteinander mechanisch vorbundon sind. Insbesondere werden Gufäßkof.jinationen hergestellt, die aus 8 bis 100 Analysengefäßen bestehen, die dauerhaft miteinander verbundon sind. Die Vorbindung kann z. B. durch Aneinander stecken, -schrauben, Verkleben der erfindungsgemäßen Analysengefäße einzeln oder in Blöcken erlolgen; es kann aber auch so verfahren worden, daß die erfindungsgemäßen Analysengofäße bereits in Blöcken von mohr als einem, vorzugsweise 8 bis 100, hergestellt werden, wobei die o.g. Herstellungsverfahren angewendet werden. Eine günstige Variante zur Ausbildung der orfindungsgomäßon Gofäßkombination zur Durchführung von Mehrfachbestimmungen besteht darin, eine Inkubationskammer (2) mit mehreren Reaktionskammern (1)zu verbinden (Abb. ?.). Dabei kann eino Inkubationskammor mit 1 bis 50 Reaktionskammorn ausgebildet sein. Diese Reaktionskammern können auf unterschiedlichste Art und Weise angeordnet sein. Bnsonders günstig ist es, wenn dio Reaktionskammern symmetrisch oder in einem Rastor angeordnet sind. Dadurch wird eine Auswertung, insbesondere cine automatische Auswertung, erleichtert. Eine bosonders bovorzugte Ausführungsform dieser ei flndungsgomäßen Gefäßkombination besteht darin, die Roaktionskammem als Vortiefungen des Bodens und/oder der Soitenwändo der Inkubationsforskammer auszubilden. Dabei könnon dio Reaktionskammern eine unterschiedliche Form aufweisen, wie es für den vorgesehenen Anwcndungsfall besonders günstig ist. In dor Abbildung 2 sind einige Ausführungsformen für ein Analysengefäß mit mehreren Reaktionskammorn (1) bei einer Inkubationskammer dargestellt. In der Variante (A) wird oin Analysc/igefäß mit zwei parallel angeordneten Reaktionsgefäßon mit Kegelform dargestellt. Dio Version (8) zeigt gleichartige Reaktionskammern (1), die jedoch symmetrisch angeordnet sind. In der Version (C) schließlich ist oin Analysongefäß mit einer Vielzahl symmetrisch in Rasterform angeordneter RcaUionskammorn (1) abgebildet.

Dio erfindungsgemaßon Vorrichtungen sind in erster Linie für Nachweisvorfahren in der Medizin, Molekularbiologie, Immunologie, Serologie und Mikrobiologie gedacht, können natürlich auch für andere Zwecke oder Anwendungsgebiete eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung i&t ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen mittels der erfiodungsgemäßen Gefilßkombination. Die durchzuführenden Nachweisreaktionen können als Ziol den Nachweis eines bestimmten Antikörpers oder eines bestimmten Antigens oder mehrerer davon haben. Der Nachweis wird erfindungsgemäß in folgenden Schritten durchgeführt:

a) Fixierung eines oder mehrerer Sondenmoleküle oder eines zu analysierenden Biomoleküls oder eines Gemisches von OiomoloV.üleri, das das zu analysiertinde Biomolekül enthalt, auf der Oborflächo der Reaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit der zu analysierenden Probe, die ein oder mehrere nachzuweisende Biomoleküle enthält oder mit einem oder mehreren Sondennolekülen in dem/den Analysengei'äß(en);

c) Nachweis des/der ;:u analysierenden Biomoleküle In der/den Reaktionskammer(n) (1).

Bei dem Sondenmolehül handelt es sich hierbei um ein Molekül, das spezifisch ein zu analysierendes Biomolekül erkennt und dieses spezifisch bindut.

Der Nachweis des zu a nalysierenden Biomoleküls erfolgt nach einer zweiten spezifischen Reaktion des unterdessen über ein Sondenmolekül oder direkt an die Oberfläche der Reakticnskammer (1) gebundenen Moleküls mit einer zweiten enzymgekoppelten Sonde mittels der entsprechenden Er zymreaktion.

Nach einer ersten, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden die Schritte (a) und (b) folgendermaßen durchgeführt:

a) Fixierung eines oder mehrerer Sondenmoleküle auf der Oberfläche- der Reaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit der zu analysierenden Probe, die ein oiler mehrere nachzuweisende Biomoleküle enthält, und Waschen in dem/den Analyseiigefäß(en),

c) Nachweis des zu analysierenden Biomoleküls in der Reaktionskammer.

Bei der Durchführung des erfindungsgemSßen Nachwe'uiverfahrens wird der wesentliche Vorteil der erfindungsgemäßen Gefflßkombination deutlich: man verwendet kleinste Volumina, z.B. 5 oder 10μΙ, die entweder ein Sondenmolekül oder ein zu analysierendes Biomolekül enthalten, und bindet dieses nur auf der Oberfläche der Reaktionskammer. Die noch vorhandene freie Oberfläche wird mittels geeigneter Substanzen (Del.ergenzien, Fremdproteine) gegen unspezifische Bindung des zu analysierenden Biomoleküls oder Sondonmoleküls blockiert. Anschließend wird das fixierte Biomolekül mit entweder dem iu analysierenden Biomolekül oder einem Sondenmolekül in einem vergleichsweise großen Volumen einer Flüssigkeit, die ebenfalls eine biologische Flüssigkeit wie Blut, ein Serum oder Urin sein kann, in Kontakt und zur Reaktion gebracht. Durch diese Möglichkeit der Vervt endung großer Volumina werden Konzentrierung?- und/oder Reinigungsschritte in der Regel überflüssig, da das fixierte Biomolekül seinen entsprechenden Partner selektiv aus dem großen Volumen bindet.

Als Sondenmolekülo könnon z. B. Antikörper, Antigene, t pezifisch reagierende Proteine wie Protein A oder Protein G, verwendet werden. Der Nachweis erfolgt nach einer zweiten spezifischen Reaktion mit einer enzymgekoppelten Sonde. Die Kopplung des Enzyms an die Sondo kann durch bifunktionelle Reagenzien chemisch erfolgen. Besonders günstig für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ί ind enzymgekoppelte Sonden, die als Fusionsproteine mikrobiologisch erzeugt werden, wie sie z. B. in der EP 304.934 beschrieben werden.

Das nachzuweisende Biomolekül kann nun ebenfalls ein Antigen oder ein Antikörper sein. Als Antigene sind z.B. Hüllprotoino von Viren oder derer Fragmente, Proteine des Humanserums oder Oligopeptide möglich. Antikörper werden dann nachgewiesen, wenn ein für sie spezifisches Antigen auf der Oberfläche der Reaktionskammer gebunden ist. Beispiclo für nachzuweisende Antikörper sind z. B. gegen die des HIV, gegen Hepatitis B Virus usw., bei deren Nachweis ein Hüllprotein, z.B. des HIV, an die Oberllache der Reaktionskamrrer gebunden wird, z. 8. das gp48 oder pg 110. Weiterhin können monoklonal Antikörper gebunden werden, ar. dio das zu analysierende Biomolekül bindet. Anschließend wird der Nachweis mit einem zweiten Antikörper und einer cnzymgekoppelten Sonde (zweito spezifische Reaktion) geführt. Nach einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden die Schritte (a) und (b) folgendermaßen duichgeführt:

a) Fixierung eines zu analysierenden Biomcloküls oder eines Gemisches von Biomolekülen, das das zu analysierende Biomolokül enth! It, auf der Oberfläche der Roaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit einem oder mehreron Sondonmolekülen in dem/den Analysengofäß(on).

c) Nachweis des/der zu analysierenden Biomoleküle in dor/den Reaktionskammer(n).

Zum Nachweis einen Antikörpers sind entsprechend der ersten Ausführungsform die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchzuführen:

a) Fixierung eines Antigens (Sonde) auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockiorungs- und/odor Waschschritte;

b) Inkubation des fi «iorton Antigens mit der zu analysierenden Probe, die einen gesuchten Antikörper enthält, Waschschritte, Inkubation mit einer enzymgekoppelten Sonde, Waschschritte;

c) Nachweis des Ai tikörpers durch eine Enzymreaktion.

Zum Nachweis eines Antigens worden entsprechend der ersten Ausführungsform die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchgeführt:

a) Fixierung eines Antikörpers (Sonde) auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockierungs- und/oder Waschschritte;

b) Inkubation des fixierten Antikörpers mit der zu analysierenden Probe, die ein Antigen enthält, gegebenenfalls Waschschritte, Inkubntion mit einer enzymgekoppelten Sonde, dio spezifisch mit dem Antigen, aber nicht mit dom fixierten Antikörper reagiort. Waschschritte;

c) Nachweis des Antigens durch eine Enzymreaktion.

In oinor besonders günstigon Variante de-s Nachweises eines Antigens worden die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchgeführt:

a) Fixierung eines zu analysierenden Antigens auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockiorungs- und/oder Waschschritte;

b) Inkubation dos fixierten Antigens mit einer enzymgekoppelten Sonde und gegebenenfalls Blockierungs· und/odor Waschschritto;

c) Nachweis des Antigens durch eino Enzymreaktion.

In den bevorzugten Varianten und Ausführungsformen wird das zu analysierende Biomolekül durch eine Enzymreaktion nachgewiesen. Durch die Reaktion, de;» jeweiligen Enzyms mit seinem Substrat, ggf. in Anwesenheit eines Cosubstrates, wird ei π nachweisbares Rcaktionsprodukt erzeugt. Dieses Reaktionsprodukt kann ein Farbstoff, ein fluoreszierendes Molekül oder ein radioaktiv markiertes Molekül sein. Dio Urzeugung gefärbter Reaktionsprodukte z.B. mit Peroxidase, Glucoionidaso oder Glucoseoxidaso ist bekannt. Nach dem EP 304.934 ist der Nachweis durch die radioaktive Markierung eines Substrates, z. B. von

Kanamycin durch (Y³²P) ATP. Als enzymgekoppelte Sonde wird hier z. B. ein Fusionsprotein aus Protein A und Neomyclnphosphotransferase Il (NPT II) verwendet. Solche Nachweisverfahren unter Verwendung von Fusionsproteinen aus NPT Il und molekularen Sonden werden für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt. Durch diese Erfindung werden Gefäßkombinationen zur Verfügung gestellt, in denen molekularbiologische Nachweisreaktionon in einem Volumen von 1 bis 10μΙ durchgeführt werden können. Die bisher erreichte Nachweisgrenze für das nachzuweisende Biomolekül, z. B. ein Antigen wie Humanserumalbumin, liegt bei 100 fg, was gegenüber dam bekannten Stand der Technik eine mindestens 100fache Steigerung bedeutet.

AusfÜhrungsbelspiolo Beispiel 1

In den Boden der Inkubationskammern einer Flachboden-Mikrotiterplatte von Polystyren (VEB MLW Polyplast Halberstadt), die ein Kammervolumen von 0,4ml besitzen, werden Bohrungen von 4mm Durchmesser und 1,2mm Tiefe angebracht. Diese Bohrung führt zu kegelförmigem Reaktionskammern von ca. 6μΙ Volumen.

Beispiel 2

Es wird bei gleichem Ausgangsmaterial wie in Beispiel 1 mit einem Fräser von 4 mm Durchmesser gearbeitet und auf 1mm Tiefe gefräst. Diese Arbeitswelse führt zu Reaktionskammern von Zylinderform mit einem Reaktionsvolumen von ungefähr 12,5μΙ.

Beispiel 3 Es wird ein gleiches Material wie in Beispiel 1 verwendet. In den Boden der Inkubationskammern wird ein Dorn bei einer Temperatur von 120°C gepreßt, so daß eine kegelförmige Reaktionskammer von etwa 10μί Volumen hergestellt wird. Beispiel 4 Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedoch wird ein Material aus PVC verwendet. Beispiel 5 Es wird das Beispiel 1 wiederholt. Nach Fertigstellung der Analysengefäße wird in jedo Reaktionskammer eine 1%ige Lösung von Nitrocellulose in Aceton eingebracht und des Lösungsmittel abgedampft.

Beispiel β

Eine Verdünnungsreihe von 10ng bis 0,1 pg Humanserumalbumin (HSA) einschließlich einer Nullkontrollo in jeweisl 5μΙ PBS

worden in die Reaktionsgofäße der in Beispiel 1 beschriebenen Analysengefäß-Kombination eingefüllt und das Antigen über

Nacht bei 4⁰C fixiert. Nach dreimaligem Wischen mit PBS wer do η das Inkubationsgefäß und dio Hoaktionskammor mit 100 μΙ 5% Magermilchpulver-Emulsion in PBS gefüllt und 30 Minuten bei Zimmertemperatur geblockt. Die Antikörporroaktion erfolgt

mittels eines Anti-Humanserumalbumin-Serums (Kaninchen, Verdünnung 1:1000,5% Magermilchpulver in PBS, 0,2%

Tween*20) in einem Volumen von 100 μΙ über Nacht bei Zimmertemperatur. Nach 6maligen Waschen (5 Minuten) mit PBS, 0,2% Tweon*20 wird mit einem Fusionsprotein, bestohend aus Protein A und Noomycin-Phosphotransferase II, nach EP 304.934

(1 μΙ/100μΙ 5%igo Magermilchpulvor-Emulsion in PBS) eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wird erneutfünfmal 5 Minuton mit PBS gewaschen. Dio Enzymreaktion erfolgt in einem Volumen von 5μΙ Enzympuffer im Roaktionsgefäß1 Stunde bei 37*C.

Enzympuffor: 2OmM Tris-HCI, pH7,2; 125mM NH₄CI, 2OmM MgCI₂,1OmM DTE, 50mg/ml Kanamycin-Sulfat, 5x 10'cpm |γ-"Ρ|

ATP/ml.

Von der Enzymreaktionslösung werden 1 μΙ Aliquots auf Phosphorcellulose-Papier gotüpfelt, ointrocknon gelassen, mit Wasser

gewaschen und autoradiographiert. Es können 0,1 pg Humanserumalbumin zweifelsfrei nachgewiesen wordon.

Beisptol 7

In ein Polystyren-Röhrchen von 11 mm Innendurchmesser und 17 mm Höhe werden in den Beden vier Vertiefungen von 4 mm Durchmesserund 1,8 mm Tiefe gofräst, so daß sie 10μΙ aufnehmen können (siehe Abbildung 2B). Ineiner der Vertiefungen worden 10μΙ PBS mit 100pg HSA, in dio zweite 10μΙ PBS mit 1 pg HSA, in dio dritte 10μΙ PBS mit 100pg Myoglobin und in dio vierte 10μΙ PBS mit 5% Magermilchpulver gegeben. Danach wird über Nacht bei 4"C fixiert und anschließend wie in Beispiel 1 weiter verfahren.

Von jeder Reaktionskammor werden anschließend Aliquots auf Phosphorcellulose-Papier getüpfelt, eintrocknen gelassen, gewaschen und danach 30 Minuten boi Zimmertemperatur autoradiographiort. Nur dio beiden Probon mit HSA können deutlich nachgewiesen werden.

Claims (17)

1. Gefäßkombination zum Nachweis von Biomolekülen, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus einem oder mehreren Analysengefäßen besteht, die aus einer oder mehreren kleinen Reaktionskammern von 1 bis 20 μΙ Volumen (1) und einer großen Inkubationskammer von 50 μΙ bis 100 ml Volumen (2) aufgebaut sind, wobei die Reaktionskammern (1) als Vertiefungen des Bodens und/oder der Seitenwände der Inkubationskammer (2) ausgebildet sind.

2. Gefäßkombination nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus mehreren Analysengefäßen besteht, die dauerhaft oder zeitweise miteinander mechanisch verbunden sind.

3. Gefäßkombination nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus 8 bis 100 Analysengefäßen besteht, die dauerhaft miteinander verbunden sind.

4. Gefäßkombination nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Material, aus dem die Reaktionskammer(n) (1) und das Material, aus dem die Inkubationskammer (2) besteht, gleich oder verschieden voneinander ist.

5. Gefäßkombination nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Material, aus dem die Reaktionskammern (1) hergestellt sind, verschieden voneinander ist.

6. Gefäßkombination nach Anspruch 1,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Material zur Herstellung der Reaktionskammer(n) und/oder der Inkubationskammer (2) PVC, Polystyren, Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid ist.

7. Gefäßkombination nach Anspruch 1 und 4 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Oberfläche einer oder mehrerer Reaktionskammern (1) negative Ladungen aufweist.

8. Gefäßkombination nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine Inkubationskammer (2) mit 1 bis 50 Reaktionskammern (1) ausgebildet ist.

9. Gefäßkombination nach Anspruch 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionskammern (1) symmetrisch oder rasterartig angeordnet sind.

10. Gefäßkombination nach Anspruch 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionskammern (1) als Vertiefungen des Bodens und/oder der Seitenwände der Inkubationskammer (2) eine unterschiedliche Form aufweisen.

11. Gefäßkombination nach Anspruch 1,8 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionskammern (1) die Form eines Kegels, Zylinders, Kegelstumpfes, Kugelabschnitts, Kombination aus Zylinder und Kegel oder Kegelstumpf oder eines U-förmigen Rotationskörpers aufweisen.

12. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, gekennzeichnet dadurch, daß der Nachweis in einer Gefäßkombination gemäß Anspruch 1 in folgenden Schritten durchgeführt wird:

a) Fixierung eines oder mehrerer Sondenmoleküle oder eines zu analysierenden Biomoleküls oder eines Gemisches von Biomolekülen, das das zu analysierende Biomolekül enthält, auf der Oberfläche der Reaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit der zu analysierenden Probe, die ein oder mehrere nachzuweisende Biomoleküle enthält oder mit einem oder mehreren Sondenmolekülen in dem/den Analysengefäß(en);

c) Nachweis des/der zu analysierenden Biomoleküle in der/den Reaktionskammer(n) (1).

13. Verfahren nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) und (b) folgemdermaßen durchgeführt werden:

a) Fixierung eines oder mehrerer Sondenmolekülo auf der Oberfläche der Reaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit der zu analysierenden Probe, die ein oder mehrere nachzuweisende Biomoleküle enthält, und Waschen in dern/den Analysengefäß(en).

14. Verfuhren nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) und (b) folgendermaßen durchgeführt werden:

a) Fixierung eines zu analysierenden Biomoleküls oder eines Gemisches von Biomolekülen, das das zu analysierende Biomolekül enthält, auf der Oberfläche der Reaktionskammer(n) (1);

b) Inkubation mit einem oder mehreren Sundenmolekülen in dem/den Analysengefäß(en)

15. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchgeführt werden:

a) Fixierung eines Antigens (Sonde) auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockierungs- und/oder Waschschritte;

b) Inkubation des fixierten Antigens mit der zu analysierenden Probe, die einen gesuchten Antikörper enthält, Waschschritte, Inkubation mit einer enzymgekoppelten Sonde, Waschschritte;

c) Nachweis des Antikörpers durch eine Enzymreaktion.

16. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchgeführt werden;

a) Fixierung eines Antikörpers auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockierungs- und/oder Waschschritte;

b) Inkubation des fixierten Antikörpers mit der zu analysierenden Probe, die ein Antigen enthält, gegebenenfalls Waschschritte, Inkubation mit einer enzymgekoppelten Sonde, die spezifisch mit dem Antigen, aber nicht mit dem fixierten Antikörper reagiert, Waschschritte;

c) Nachweis des Antigens durch eine Enzymreaktion.

17. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadu/ch, daß die Schritte (a) bis (c) folgendermaßen durchgeführt werden:

a) Fixierung eines zu analysierenden Antigens auf der Oberfläche einer Reaktionskammer und gegebenenfalls Blockierungs- und/oder Waschschritte;

b) Inkubation des fixierten Antigens mit einer enzymgekoppelten Sonde und gegebenenfalls Blockierungs- und/oder Waschschritte;

c) Nachweis des Antigens durch eine Enzymreaktion.