DD283824A5 - Verfahren zur herstellung eines peptids und dessen verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Peptids und dessen Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zur Behandlung von Immunstoerungen und zur Tumorinhibierung. Erfindungsgemaesz wird das Peptid Probursin in gereinigter Form aus Saeugerknochenmark oder -leber isoliert oder nach chemischen Standardsynthesen oder durch rekombinante Techniken hergestellt.{Peptid-Herstellung; Probursin; Isolierung; Saeugerknochenmark; Synthese, chemisch; Technik, rekombinant; Arzneimittel; Immunstoerungen; Tumorinhibierung}

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neu isolierter Peptide, die entweder in gereinigter Form aus intrahepatitischen Gallengängen der Leber von Säugern oder aus dem Knochenmark von Säugern isoliert worden sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Säugerpeptids, Probursin, das auf chemischem Wege synthetisiert oder recombinant reproduziert werden kann, sowie die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide als Therapeutika zur Behandlung von Immunkrankheiten undzurTumorinhibierung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Dies ist eine continuation-ln-part-Anmelduny der anhängigen US-Patentanmeldung 07/192482, eingereicht am 11. Mai 1986. Die B-Lymphozyten oder B-Zellen des Immunsystems von Wirbeltieren zeigen eine Antikörperreaktion auf ein in den Körper des Lebewesens eingeführtes Fremdantigen. Bei Vögeln differenzieren sich die Precursor-B-Zellen in einem Organ, das als die Bursa des Fabrlclus bezeichnet wird. In Säugern ist bisher kein der Bursa dee Fabrldus entsprechendes Organ entdeckt worden, und es wird angenommen, daß die blutbildenden Precursoren der B-Zellen vorhanden sind und sich in reife B-Zellen im Knochenmark differenzieren können.

Bis vor kurzem war der hormonale Auslöser der Differenzierung von B-Zellen-Precureoren in B-Zellen unbekannt. Allerdings wurde soon in früheren Untersuchungen von einem der jetzigen Mitorfinder und seinen Mitarbeitern das Vorhandensein eines speziellen Differenzierungsauslösers von B-Zellen in Extrakten der Bursa des Fabricius von Kühnern gezeigt. Über diese frühe Arbeit wurde in den folgenden Artikeln berichtet, auf die hier Bezug genommen wird: Brand et al., Science, 193:319-321 (23. Juli 1976); Brand et al., Nature, 269; 679-589 (13. Oktober 1977); Goldstein et al. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, XU: 6-8 (1977); und Gold&tein in „Molecular Control of Proliferation and Differentiation" S. 197-202, Academic Press (1977).

In jüngerer Zeit identi.izierten die jetzigen Erfinder und ändere Mitarbeiter ein Tripeptidhormon, das Bursln genannt wurde, das die Aminosäuresequenz Lys-His-Gly-Nt I₂ als einen speziellen Auslöser der B-Zellen-Differenzierung aufweist. Dieses Peptid, auch als Bursopoietln bekannt, Ist sowohl in Vögeln als auch In Säugern aktiv und in der US-PS 4 584 284 beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird.

Andere endokrine Peptide wurden in der Vergangenheit entdeckt. Somatostatin Inhibiert die Freisetzung einer Vielzahl von Hormonen, wie Somatotropin, Thyrotropin, Corticotropin, Insulin, Glucagon, Gastrin, Secretin und Renin. Ein anderes in dieser Weise regulierendes Peptid ist Tuftsin, ein basisches Terapeptid, das von dem zirkulierenden Immunglobulin produziert wird und die Phagozytose in polymorphonuklearen Leukozyten und in Makrophagen stimuliert (siehe z. B. V. A. Najjar et al., Nature 228: _u;2 [1970]; A. Constantopoulos et al., Cytobios., 6:97 [19721; und Y. Stabinsky et al., Mol. Cell. Biochem., 30: 71 [1980]). Die Beziehungen dieser Hormone untereinander, einschließlich des B-Zellendifferenzierungsfaktors Bursin, sind noch nicht ergründet worden. Die Entdeckung der Assoziation einer Vielzahl von Hormonen, die bei der B-Zellen-Differenzierung wirksam sind sowie Wirkungen auf andere Gewebe ausüben, eröffnet ein Potential für neue Behandlungen von Immunkrankheiten und Leberstörungen bei Menschen und Tieren.

Ziel der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren zur Herstellung neuer Peptide bereitgestellt, die wertvolle pharmazeutische Eigenschaften aufweisen und zur Behandlung von Immunkrankheiten, Lebererkrankungen und zur Tumorinhibierung geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue pharmazeutisch wirksame Peptide aufzufinden und Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Herstellung eines 14-Aminosäurenpeptids gelöst, das in gereinigter Form aus Säugerknochenmark oder -leber erhalten wird. Dieses Peptid, Probursin, kann auch über chemische Standardsynthesen hergestellt werden. Alternativ dazu kann dieses Peptid durch rekombinante Techniken hergestellt werden. Probursin ist unter anderem in der Lage, spezifisch die Differenzierung von Preeursor-Knochenmarkzellen in ß-Zellen auszulösen. Es ist daher im höchsten Grade nützlich bei der Behandlung von B Zellen-Defiziten des Immunsystems von Menschen und Tieren sowie bei der Behandlung einer Vielzahl von Lebererkrankungen. Darüber hinaus dient es dazu, die Freisetzung des Wachstumshormons aus der Hypophyse zu inhibieren. Die Freisetzung von Wachstumshormon korreliert mit dem Wachstum bestimmter kanzerogener Tumore. Daher ist Probursin auch einsetzbar bei bestimmten Krebserkrankungen, speziell um die Tumorinhibierung zu bewirken.

Therapeutische Zusammensetzungen, die Probursin enthalten, werden beschrieben sowie die Verwendung dieser therapeutischen Zusammensetzungen, die Probursin enthalten, zur Behandlung von Zuständen oder Krankheiten, wie unzureichende B-Zellen-Differonzierung wegen des Mangels oder des Fehlens des B-Zellen-Differenzierungsfaktors, • unzureichende Steuerung solcher Hormone, die durch Somatotropin reguliert werden und/oder zur Stärkung der Fähigkeit des Immunsystems, fremde Teilchen bei der Zirkulation zu phagozytieren. Weitere Verwendungsmöglichkeiten von Probursin zur Behandlung von Krebserkrankunrjen wurden bereits oben angesprochen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide erfordert die Bereitstellung neuer Zwischenprodukte für die synthetische oder rekombinant9 Herstellung von Probursin, einschließlich neuer Peptidharz-Zwischenprodukte, neuer Vektoren und neuer transformierter Wirtszellen.

Die folgende detaillierte Beschreibung enthält die gegenwärtig bevorzugte Ausführu.igsform der Erfindung. Dabei stellen die Zeichnungen folgendes dar:

Fig. 1: graphische Darstellung optischer Dichten von gereinigten Fraktionen von Probursin aus Rinderleber; Fig. 2: Darstellung eines Dünnschichtchromatografie-Gels von Probursin;

Fig. 3 A: graphische Darstellung optischer Dichten verschiedener Titer von Antibursin-Antikörpern (Punkte) und

Kaninchenserum (Quadrate); Fig. 3 B: graphische Darstellung der optischen Dichte gegen die Absorptionsmittelkonzentration von KLH-Konjugatkontrolle (Quadrate), KLH-Bursin (Dreiecke) und freiem Probursin (Kreise);

Flg. 4: graphische Abbildung der Auebeute an PTH-Amiiiosäure pro Abbauzyklus; Fig. 5 A: graphische Darstellung der intrazellularen zyklischen GMP-Splegel in Daudiiellen nach Inkubation mit Probursin,

Bursin, Schweine-Insulin (A), Pferde-Myoglobin (B) und Rinderwachstumshormon (C); und » Flg. S B: graphische Darstellung von intrazellularen zyklischen GMP-Splegeln in MOPC-315-Zellen nach Inkubation mit Probursin,

Bursin und A, B und C wie oben als Kontrolle.

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neu isolierten Säugerpolypeptids, das Probursin genannt wurde, gekennzeichnet durch die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz:

(D (5) (10) (14)

Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-HJs-Gly-Gly-Arg-Arg

Die ersten fünf Aminosäurereste in den vierzehn Aminosäuren der Probursinsequenz korrespondieren mit der aktiven Stelle des Hormons Somatostatin. Die Amincsäurereste 5 bio 8 des Probursins korrespondieren mit der aktiven Stelle des Humanpeptids Tuftsin. Zusätzlich korrespondieren die Aminosäurereste 9 bis 11 des Probursins mit dem oben beschriebenen Peptid Bursin. Diese in der Probursinsequenz vorhandenen überlappenden Somatostatin-, Tuftsin· und Bursinsequenzen sind mit den Humansequenzen der aktiven Stellen der Peptide Somatostatin, Tuftsin und Bursin identisch. Somit ist vermutlich, obgleich das Probursin-Polypeptid ursprünglich aus der fötalen Rinderleber Isoliert worden ist, dessen Sequenz im wesentlichen identisch mit der anderer Säuger, insbesondere der von Menschen.

In ihren breitesten Aspekten betrifft diese Erfindung die Herstellung menschlichen Probursins oder ein Analoges davon in irgendeiner Form im wesentlichen frei von nativem Proteinmaterial, d. h. entweder aus Säugerleber oder Knochenmark Isoliert oder synthetisiert oder rekombinant produziert. Varianten von Probursin, einschließlich natürlich vorkommender allelischer Änderungen in der Sequenz von Säugerspazies zu Spezies und zwischen den einzelnen Gliedern einer einzelnen Spezies, sowie vorsichtig eingeführter Veränderungen in der Sequenz, zum Beispiel durch mutagene oder chemische Maßnahmen, oder Veränderungen auf Grund des Einsatzes verschiedener rekombinanter Wirte, z. B. Glycosylierungsänderungen, oder durch den Angriff anderweitiger Fremdmoleküle, z. B. radioaktiver Markierungen und ähnliches werden generell in dieser Beschreibung als Probursinanaloge bezeichnet. Die Herstellung derartiger Analoga wird durch die vorliegende Erfindung miterfaßt. Das Säugerprobursin ist vorzugsweise Human-Probursin. Probursin wurde ursprünglich aus fötaler Rinderleber isoliert unter Einsatz eines gegen Bursin gerichteten Antikörpers, um die Reinigung zu beobachten. Der Verfahrensablauf für die Reinigung von Probursin ist im Beispiel 1 beschrieben. Säugerprobursin wurde vorzugsweise aus der Leber isoliert; allerdings kann es auch aus dem Knochenmark mittels bekannter Methoden isoliert werden, die analog der Isolierung aus Rinderleber sind, wie im Beispiel 1 beschrieben. Während die Polypeptidsequenz von Probursin durch die gleiche oder im wesentlichen gleiche Sequenz wie oben genannt charakterisiert wird, ist es möglich, daß die allelischer Varianten der Sequenz ebenso wie die Varianten der Sequenz, die zusätzliche Aminosäuren enthält oder natives Material, durch Isolierung aus Säugermaterial erhalten werden kann. Darüber hinaus kann die Probursinsequenz mit 14 Aminosäuren chemisch synthetisiert werden, wobei ein neues synthetisches Peptid entsteht. Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein synthetisches Peptid der Formel

Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg

und dassen pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.

Um ein Säureadditionssalz des Polypeptids Probursin herzustellen, kann das freie Polypeptid mit einer entsprechenden Säuremenge behandelt werden. Säuren sind in der Lage, Salze mit dem Peptid der Erfindung zu bilden, einschließlich - aber nicht darauf beschränkt-anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Kohlensäure, Phosphorsäure und ähnliche. Andere für diesen Zweck nützliche Säuren sind organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfonylsäure und ähnliche.

Die synthetische Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann mittels Festphasensynthese erfolgen, beschrieben durch Marrifield in J.A.C.S. 85:2149-2154 (1963). Dieses Verfahren ist geläufig und stellt eine übliche Methode zur Herstellung von Peptiden dar. Alternative Methoden zur Herstellung von Peptiden sind in „Peptidsynthesen" von Bodansky et al., 2. Auflage, John Wiley and Sons, 1976, beschrieben. Zur Methode der Festphasensynthese von Peptiden gehört die stufenweise Zugabe der geschützten Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette, die mittels kovalenter Bindungen an ein Festharzteilchen gebunden ist. Bei diesem Verfahren werden Reaktionsmittel und Nebenprodukte durch Filtration entfernt, wodurch das Erfordernis der Reinigung der Zwischenprodukte entfällt. Das Generalkonzept dieser Methode hängt von dem Angriff der ersten Aminosäure der Kette auf ein festes Polymeres durch eine kovalente Bindung ab. Nachfolgend werden geschützte Aminosäuren hinzugefügt -eine in einem Zeitabschnitt oder in Blöcken - und zwar in einem Stufenverfahron, bis die gewünschte Sequenz vervollständigt ist. Schließlich wird das geschützte Peptid vom Festharzträger abgetrennt, und die Schutzgruppen werden abgespalten. Die Erfindung betrifft auch neue Peptidharz-Zwischenprodukte zur Herstellung des erfindungsgemäßon Peptids. Die Zwischenprodukte weisen Formeln auf, die gleich oder analog der folgenden Formel sind:

worin R¹ bis R¹⁰ geeignete Schutzgruppen darstellen an den entsprechenden Orten der genannten Aminosäuren. Das Harz ist ein geeignetes Festphasenpolymeres, das als Träger tür die Reaktion dient. Der Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese ist in der Lage, die entsprechenden Aminoschutzgruppen, Hydroxyschutzgruppen, Indolschutzgruppen, Imidazolschutzgruppen und

Harze auszuwählen, die beispielsweise in den oben genannten Literaturstellen ausgewiesen sind. Der Fachmann wird auch in der Lage sein, ähnliche Peptidharz-Zwischenprodukte für die Konstruktion der erfindungsgemäßen modifizierten Peptide zu gestalten.

Die Aminosäuren können an ein beliebiges Polymeres angebunden sein. Das Harz muß eine funktioneile Gruppe aufweisen, an die die erste geschützte Aminosäure über eine kovalente Binduno angefügt werden kann. Für diesen Zweck sind zahlreiche Polymere oder Copolymere geeignet, beispielsweise Zellulose, Polyvinylalkohol, Polymethylmethacrylat, Polystyren und Polystyrendivlnylbenzen. Entsprechend geeignete Schutzgruppen, die bei derartigen Synthesen und ihren Veikürzungen einsetzbar sind, sind aus dem obigen Text zu entnehmen oder auch aus J. F. W. McOmIe „Schutzgruppen in der organischen Chemie", Plenum Press, New York, 1973. Auf beide Werke wird hier Bezug genommen. Die hier benutzten üblichen Schutzgruppen sind t-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyl (BZL), t-Amyloxycarbonyl (AOC), Tosyl (TOS), o-Bromphonylmethoxycarbonyl(BrZ), 2,6-Dichlorbenzyl (CI₂BZL) und Phenylmethoxycarbonyl (Z oder CBZ). Die generelle Verfahrensweise bei der Herstellung dieses Peptids besteht darin, zuerst das Arginin (das an seinen alpha-Amino- und Gusnidin-Gruppen geschützt ist) an das Harz anzubinden. Nach dem Anbinden wird das Harz filtriert, gewaschen und die Schutzgruppe an der alpha-Aminogruppe des Arginins entfernt. Es ist wünschenswert, daß diese Schutzgruppe t-Butyloxyoarbnnyl ist. Die Entfernung dieser Schutzgruppe muß natürlich so erfolgen, daß dabei die Bindung zwischen Arginin und dem Harz nleht aufgebrochen wird/An das erhaltene Harzpeptid wird dann das an seinen alpha-Amino- und Guanidingruppen geschützte Arginin angekoppelt. Diese Kopplung erfolgt durch die Bildung einer Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des zweiten Arginins und der Aminogruppe des ersten, an das Harz gebundenen Arginins. Diese Abfolge von Vorgängen wird mit den entsprechenden Aminosäuren wiederholt, bis alle Aminosäuren an das Harz angefügt worden sind. Schließlich wird das geschützte Peptid vom Harz abgetrennt, und die Schutzgruppen wenden abgespalten, wobei man das gewünschte Peptid erhält. Die Technik des Abspaltens, die zur Abtrennung des Peptids vom Harz und zur Entfernung der Schutzgruppen angewandt wird, hängt von der Auswahl des Harzes und der Schutzgruppen ab und ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese geläufig.

Das Peptid kann auch unter Verwendung von Standardverfahren der Lösungspeptidsynthese hergestellt werden, wobei entweder eine stufenweise oder eine Blockkopplung der Aminosäuren oder Peptidfragmente unter Einsatz chemischer oder enzymatischer Methoden der Amidbindungsbildung erfolgt. Diese Lösungssyntheseverfarren sind aus dom Stand der Technik bekannt.

Das Polypeptid kann auch über die konventionelle Rekombinationstechnologie hergestellt werden. Übliche Techniken zur rekombinanten Herstellung von Polypeptiden sind bei Maniatis et al. in „Molekulares Klonieren-ein Laboratoriumshandbuch", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982) und in anderen Literaturstellen, die den Fachleuten bekannt sind, beschrieben worden. Somit stellen alle DNA-Sequenzen, die Probursin verschlüsseln, einen Teil dieser Erfindung dar. Diese DNA-Sequenzen können sich dadurch unterscheiden, daß sie alternative Codons enthalten, die dieselbe Aminosäure oder modifiziei te oder markierte Basen verschlüsseln, oder die Sequenzen können einen Teil eines DNA-Moleküls bilden, das geeignete Expressionssteuerungssequenzen in operativer Assoziation mit den DNA-Sequenzen enthält und in der Cage ist, die Exprimierung dieser nach der Transformation in Wirtszellen zu dirigieren. Diese DNA-Moleküle oder Vektoren können bekannte Vektoren von bakteriellen Hefen, Pilzen, Insekten oder mit Herkunft von Säugern darstellen. Die Vereinigung einer Probursin-DNA-Sequenz in Verbindung mit bekannten Vektorkomponenten ist für den Fachmann kein Problem. Ebenso sind die Selektion und Transformation mikrobieller oder Säuger-Wirtszellen mit den Probursin enthaltenden Vektoren der Erfindung übliche Techniken, die von den Fachleuten auf diesem Gebiet ohne zusätzliche Versuche verwirklich* werden können. Sowohl chemisch-synthetische als auch rekombinante Techniken zur Herstellung von Probursin können auch dazu eingesetzt werden, die aus 14 Aminosäuren bestehende Sequenz des Probursins, wie oben aufgeführt, zu modifizieren. Zu solchen Modifikationen kann das Entfernen oder Ersetzen einer oder mehrerer der 14 Aminosäuren an der obigen Sequenz gehören oder das Insertieren oder Hinzufügen weiterer Aminosäuren oder chemischer Gruppen zu der obigen Sequenz, um die biologischen oder pharmakologischen Wirkungen der erhaltenen Peptide zu verstärken oder in eine bestimmte Richtung zu lenken. Beispielsweise kann eine Vielzahl chemischer Gruppen an bine oder mehrere der Aminosäuren des Peptids angefügt werden, um eine Anzahl wünschenswerter Eigenschaften zu erzielen, z. B. Widerstand gegen enzymatischen Abbau, verbesserte Halbwertszeit und ähnliche. Derartige modifizierte Formen von Probursin werden von der vorliegenden Erfindung mit erfaßt. Da Probursin die überlappenden aktiven Stellen von drei bekannten Regulierungspeptiden kombiniert, ist zu vermuten, daß Probursin die gleichen oder analogen biologischen Aktivitäten wie Somatostatin, Tuftsin und Bursin hat. Probursin ist daher therapeutisch bei der Behandlung von Mensch und Tier nützlich, da es die Fähigkeit besitzt, die Differenzierung und Reifung von B-Zellen, die in die Immunreaktion des Körpers miteinbezogen sind, zu induzieren. Als Ergebnis dieser Charakteristika weist das Polypeptid mehrfache therapeutische Verwendungsmöglichkeiten auf. Dieses Polypeptid ist nicht nur in der Forschung sondern auch bei der Behandlung von Menschen und Tieren bei Kiankheiten einzusetzen, die mit einem Mangel oder dem NichtVorhandensein reifer B-Zellen einhergehen.

Von Probursin, dessen Fragmenten und dessen Analoga ist zu erwarten, daß es dio Fähigkeit besitzt, bestimmte der genannten Leberfunktionen (z. B. Stimulieren der phagozytischen Aktivität von Kupferzellen und Inhibieren der pathologischen Proliferation von Hepatocyten) zu demonstrieren. Somit können Probursin, dessen Fragmente und Analoga Anwendung bei der Behandlung verschiedener Leberstörungen, wie z. B. Zirrhose, eingesetzt werden.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Peptide als nützlich anzusehen, das gesamte Immunverhalten des Körpers zu stützen, indem sie zur Verbesserung der therapeutischen Stimulierung der humoralen Immunität verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Probursin-Polypeptide, Analoge und diese enthaltenden therapeutischen Zusammensetzungen sind generell überall dort als nützlich anzusehen, wo die humorale Immunität in Frage uteht und insbesondere dort, wo es Immunitätsmängel gibt. Daher können bei einer unzureichenden Antikörperproduktion wegen Mangels an B-Zellen die erfindungsgemäßen Peptide durch Stimulierung der Zellproduktion diese Bedingungen verändern. Probursin kann daher bei der Behandlung von Patienten mit bekannten Immunmangelerscheinungen eingesetzt werden, z.B. bei Patienten, die auf Vakzine nicht ausreichend reagieren, wie Hämodialysopatienten, die keine Antikörper auf Hepatitisvakzine bilden und bei älteren Patienten, die nicht auf pneumokokkale Vakzine reagieren.

Beispielsweise ist ein typischer Zustand, bei dem sich eino Behandlung mit Probursin empfiehlt, die X-gebundene Infantile Hypogammaglobulinämie. Diese Mangelerscheinung tritt fast ausschließlich bei Knaben auf und vermutlich aus dem Grunde, daß Kinder in dieser Entwicklungsstufe in ihrem Rückenmark und peripheren Blut Precursor-B-Zellen haben, die nicht zu Antikörper ausscheidenden B-Zellen ausreifen. Patienten in dieser Lage leiden daher an chronischen oder wiederkehrenden bakteriellen Infektionen.

Eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Peptlden ist auch möglich bei anderen Immunmangelerscheinungen, die mit einer völligen Abwesenheit oder einer verringerten Immunglobulinproduktion einhergehen, in Abhängigkeit vom Ort des immunologischen Defektes, der dieses Problem bewirkt. Wenn der Defekt in der Reifung der Pre-B-Zellen zu reifen Antikörpern ausscheidenden B-Zellen liegt, kann das Peptid des Erfindungsgegenstandes eingesetzt werden. Von einem Fachmann auf dem Gebiet der Behandlung von Immundefekten ist zu erwarten, daß er den Defektpunkt für Krankheitserscheinungen diagnostizieren kann, bei dem die Behandlung mit Probursin zu verantworten ist. Siehe z.B. .Grundlegende und klinische Immunologie" (Basic and clinical Immunology), Stites, Stobo, Fudenberg und Wells (Hrsg.) 4. Auflage, 1982, Lange Medical Publications, Los Altos, Kalifornien (Kapitel 25).

Es wurde weiterhin gefunden, daß Probursin die Freisetzung von Wachstumshormon inhibiert (siehe Beispiel 6). Die Inhibierung von Wachstumshormon wird als korrelierend mit der Inhibierung bestimmten kanzerogenen Tumorwachstums angesehen (siehe z. B. R.S. Hill et al., Diabetes, 34:115 (1985] und MJ. Berridge et al., Biochem. J., 212: 4/3 (1983)). Somit habe-i Probursin und/oder dessen Analoga oder modifizierten Versionen therapeutische Verwendungsmöglichkeit bei der Behandlung bestimmter Krebserkrankungon, wo Tumorwachstum durch Regulierung des Wachstumshormons beeinflußt werden kann. Probursin und dessen Analoga können auch als diagnostische Mittel verwendet werden, z. B. wenn sie mit einem radioaktiven oder anderweitig bestimmbaren Markierungsmittel gekoppelt werden.

Alternativ dazu können Probursin und dessen Analoga an antigenen Substanzen eingesetzt werden, um polygonale oder monoklonale Antikörper nach Standardverfahren wie dem Kohler-Milstein-Hybridiommethoden zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung beschreibt daher Verfahren zur Regulierung des Immunsystems eines Objektes, das eine solche Regulierung benötigt, durch Verabreichung einer wirksamen Menge an einer der erfindungsgemäßen Verbindungen an das Objekt.

Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die aus relativen oder absoluten Defekten der Leberfunktionen eines Objektes herrühren, und umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge Probursin oder eines seiner Analoga an das Objekt.

Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Hervorrufen der Differenzierung und Reifung von B-Zellen, bestehend im Verabreichen einer therapeutisch wirksamen induzierenden Menge Probursin oder dessen Analoga an das Objekt. Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Inhibieren des Tumorwachstums durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen. Wachstumshormon inhibierenden Menge Probursin oder dessen Analoga au einen Patienten.

Der hier benutzte Begriff „therapeutisch wirksame Menge" bedeutet eine Menge, die bei der Behandlung der entsprechenden Zustände oder Mangelerscheinungen des Immunsystems oder der Leber wirksam ist, wie oben beschrieben. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für die oben genannten Behandlungsmethoden. Zum Einsatz als pharmazeutische Zusammensetzung kann das erfindungsgemäße Peptid im Bereich von etwa 1 Mikrogramm pro kg bis etwa 10 Milligramm pro kg wirksam sein. Für einen Fachmann auf dem Gebiet der Behandlung von Immundefekten ist es leicht, aus den hier {enannten Ergebnissen zu extrapolieren und die entsprechende Dosierung der arfindungsgemäßen Peptide ohne unnötige Versu :..ö im die entsprechende klinische Anwendung auszuwählen. Beispielsweise wird der behandelnde Arzt die Dosierung auf Basis traditioneller klinischer Parameter wie Alter, Körpermasse, Geschlecht und Allgemeinzustand des Patienten festlegen. Dieses Peptid ist nicht auf eine bestimmte Verabreichungsart beschränkt. Die gegenwärtig bevorzugte Methode ist allerdings die parenteral Verabreichung wegen möglichen Abbaus des Sequenzpotentials durch gastrische Enzyme. Während die am meisten wünschenswerte parenteral Verabreichungsart die subkutane ist, kann das Peptid aber auch perkutan, intramuskulär, intranasal, intraperitoneal, intravenös, bukkai oder über Zäpfchen verabreicht werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann das Probursin als aktiver Bestandteil im innigen Gemisch mit pharmazeutischen Trägerstoffen und/oder Exzipienten nach üblichen pharmazeutischen Verarbeitungstechniken kombiniert werden. DerTrägerstoff kann eine Vielzahl von Formen aufweisen, abhängig von der für die Verabreichung gewünschten Präparationsform, einschließlich Mittel in Suspensionen, Elixieren und Lösungen. Für parenterale Produkte ist der Träger üblicherweise steriles Wasser oder Salzlösung. Andere Inhaltsstoffe können noch einbezogen werden, um dem pharmazeutischen Produkt zusätzliche erwünschte Merkmale zu verleihen, z. B. zur Verbesserung der Löslichkeit oder als Präserve. Injizierbare Suspensionen können ebenfalls hergestellt werden mit entsprechenden flüssigen Trägerstoffen, Suspendierungsmitteln und ähnlichem. Für den Fachmann auf dem Gebiet der parenteralen Formulierung ist es einfach, die Herstellung einer solchen Zusammensetzung zu bestimmen.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele erläutern dio Isolierung von Rinderprobursin aus fötaler Leber, ein Verfahren zur Herstellung von synthetischem Probursin und Untdrsuchungsmethoden zum Nachweis der Wirksamkeiten der Peptide. Die Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Rohextraktion von Burtln und Probursin * 500g fötale Rinderleber wurden mit 25%!gem (Masse/Vol.) Ammoniumbicarbonatpuffer (6OmM, pH8,0), der 1 mMPolymethyleulfonsäure (PMSF), 1 mM EthylendiamintriesslgsBure (EDTA) und 1 mM beta-Murcaptoethanol enthielt, extrahiert. Die Gewebe wurden bei 4⁰C drei Minuten In einem Mischer homogenisiert und bei 4⁰C 45 Minuten bei 9 000 U/min zentrifugiert. Des Überstehende wurde durch eine Gaze filitriert. Die gereinigten Filtrate wurden bei 60°C gelagert. Ein 26-ml-Aliquotes wurde lyophilisiert und In 10ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert.

Die Lösung wurde zentrifugiert, und 2,6-m!-Aliquote wurden einer PD-IO/PharmaciaASäulenchromatografie unterzogen. Die zurückgehaltenen Fraktionen mit niedriger Molekularmasse wurden lyophilisiert und in 1 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (5OmM, pH 8,0) gelöst für den im Beispiel 2 beschriebenen Enzym-gekoppelten Immunbindungstest (ELISA). Probursin wurde weiter von fötaler Rinderleber durch (A) Gelfiltration über eine Sephadex G-75-Molekularsiebsäule (Pharmacia), gefolgt von (B) einer lonenaustausch-CM-Sephadexsäule (Pharmacia) gereinigt. Bursin, das zur Immunretktivität der Fraktion beitrug, wurde während der Durchführung der nächsten Reinigungsstufe (C), der Dünnschichtchromatografie, entfernt. Die erhaltene Fraktion wurde nochmals (D) über Sephadex G-75 filtriert, und das verbliebene Filtrat wurde (E) einer Anionenaustausph-Protein-Flüssig-Schnellchromatograpfie über eine Mono-Q-Säule (Pharmacia) unterzogen. Als letzte Reinigungsstufe folgte (F) die Umkehrphasen-FPLC. Ausbeuten und Ablauf sind in Tabelle 1 weiter unten erläutert.

Tabelle 1 Reinigung von Probursin aus fötaler Rinderleber

Reinigungsstufe	Gesamt	Gesamt	Probursin	Reinigung	Rückgewinnung
	Probursin	Protein	(%)	(-fach)	(%)
	(mg)	(mg)
Fötale Leber (Feuchtmasse l">00 g)	—	73400	—	-	-
A Gelfiltration, Sephadex G-75	92,6	7400	1,25	1	100
B Ionenaustausch, CM Sephadex	28,7	950	3	2	3?
C Dünnschichtchromatografie*	6,4	91,2	7	5	7
D Gelfiltration, SephaedexG-25	2,6	27,4	10	8	2,8
E Anionenaustaus:hFPLC, Mono-Q	2,1	5,3	40	"32	2,3
F Umkehrphasen FPLC	1.4	1,5	93	74	1,5

* Bursln, das zur Immunreaktivität beitrug, wurde in dieser Stufe entfernt.

Es wurden optische Dichten bei 254nm der stufenweise gereinigten Fraktionen erzielt. Graphische Darstellungen dar Fraktionen A, B, E und F sind in Fig. 1 aufgeführt. Fig.2 erläutert ein Gel, das aus der Dünnschichtchromatografie von Stufe C erhalten wurde.

Beispiel 2 ELISA

A. Kanlnchen-Antlserum

Für die Kaninchenimmunisierung wurde Probursin an das sog. keyhole-limpet-HJSmocyanin (KLH) über 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyDcarbodiimid (ECDI) nach dem Verfahren von Tamura et al. Cell, 34:587 (1983) angekoppelt. Dabei wurden 5 mg Bursin in 400 Mikroliter Wasser gelöst, mit Salzsäure auf pH 3,0 gebracht und dann auf einem Eisbad abgekühlt. Zehn Milligramm ECDI in einem 20-pl-Volumen wurden hinzugegeben und das erhaltene Gemisch 15 Minuten in einem Eisbad inkubiert. Zu dem Gemisch wurden 15mg KLH in 0,5 ml angesäuertem (pH 3,0) Wasser gegeben. 0,5ml gesättigte Ammoniumcarbonatlösung wurden zu der Lösung gegeben und eine geringe Menge an trockenem Ammoniumcarbonat hinzugesetzt, um die Lösung gesättigt zu halten. Das Gemisch wurde drei Stunden unter Rühren in einem Eisbad inkubiert und anschließend gegen zwei Liter Wasser dialysiert bei jeweils mit drei Wechseln über einen Zeitraum von 40-48 Stunden und anschließend PBS über Nacht. Das Konjugat wurde mit PBS verdünnt auf 1 mg/ml Bursin.

Zweihundert Mikrogramm KLH-Bur.sin in einem 200-pl-Volumen wurden mit 400μΙ kompletten Freundschen Adjuvanz vermischt. Fünfhundort Mikroliter dieser Suspension wurden dazu eingesetzt, jedes-der fünf Kaninchen subkutan an mehreren Stellen zu immunisieren. In 4-6-Wochen-lntervallen wurden die Kaninchen mit einer gleichen Suspension, die unvollständiges Freundsches Adjuvanz enthielt, aufgefrischt.

B. ELISA-Protokoll

Es wurden Antiseren auf ihre Aktivität in dem folgenden FLISA-Protokoll getestet. Die Assays wurden nach der Methode von Voller et al., Bull. WHO, 53:55 (1976) durchgeführt. Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten (Fisher Scientific, Springfield, NJ) wurden über Nacht mit 100Mi/Vertiefung einer Lösung von 10pg/ml Tetrameres von Probursin in 0,1 M Phosphatpuffer, pH7,2, überzogen. Die Platten wurden gewaschen und nachfolgend überzogen mit 150pl/Vertiefung 0,5%igem Rinderserumalbumin in PBS, pH7,2, über eine Stunde bei Zimmertemperatur. Die Platten wurden gewaschen, getrocknet bei 37⁰C 6-24 Stunden und dann in vorher sorgfältig getrocknetem Verpackungsmaterial dicht verschlossen und bei 4°C gelagert. Die zu testenden Antiseren wurden in PBS verdünnt, das 0,05% Tween 20 enthielt. Einhundert Mikroliter der verdünnten Seren wurden pro Vertiefung hinzugegeben (dreifach). Normales Kaninchen- oder Mäuseserum wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach 60 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Platten dreimal mit PBS Tween 20 gewaschen. Einhundert Mikroliter alkalische Phosphatase, angekoppelt an Affinitäts-gereinigtes Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (schwere und leichte Ketten), verdünnt 1:2000 in PBS Tween 20, wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden bei Zimmertemperatur

60 Minuten inkubiert. Dann wurden die Platten gewaschen und zu Jeder Vertiefung 100μ11 mg/ml para-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminpuffer gegeben. Nach 30minütiger Inkubatin bei Zimmertemperatur wurde die Reaktion mit der Zugabe von ΒΟμΙ/Vertiefung an 6N NaOH beendet und die optische Dichte bei 410nm bestimmt.

C. Ergebnisse

Zwei von fünf Kaninchen entwickelten nach fünf Monaten Antikörper gegen Probursin, deren Titer annähernd bei 1:800 lagen (Flg.3A). Die Anti-Bursin-Antieerumkopplung wurde durch KLH-Bursin blockiert und auch durch freies Probursin, nicht jedoch durch KLH-Kor.trollkonjugat (Fig.3B).

Beispiel 3 Automatische« N-Termlnnl-Proteinsequenzleren

Es wurden automatische Sequenzanalysen an intaktem Probursin sowie try ptischen und cyanogenen Bromidfragmenten von Probursin durchgeführt durch Gasphasensequenzieren unter Verwendung eines Gasphasensequenzers Modell 470 A von Applied Biosystems mit Polybren als Träger und einem Einzelkupplung-Einzelspaltung-Standardprogramm. Die erhaltenen Phenylthiohydantoin-derivatisierten Aminosäuren wurden über HPLC mit einem Hewlett Packard Hochdruck-Flüssigchromatographen Modell 1084 B identifiziert. Fig.4 erläutert die Ausbeuten.

Beispiel 4 Herstellung eines erfindungsgemfißen synthetischen Peptide

Das Peptid wurde nach der Festphasenmethode auf einem ABI 430 Peptidsynthetisator nach Standardvorschriften für BOC-Aminosäurederivate synthetisiert. Die Synthese wurde mit 0,05OmMoI BOC-(Tos)Arg-PAM-Harz begonnen. Das vollständige Peptidharz wog 1,87g. Das Harz wurde mit 20ml HF und 2g p-Kresol bei 0°C eine Stunde behandelt. Die HF wurde unter vermindertem Druck entfernt und zu dem Rückstand Ethylacetat gegeben. Das Gemisch wurde filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Dann wurde Trifluoressigsäure zu den Feststoffen gegeben und das Gemissh filtriert. Das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft und mit Ether versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Ether gewaschen, wobei man 1,04g eines weißen Feststoffes erhielt. Eine 400-mg-Portion dieses Produktes wurde zu 50ml 1M AmmoniuTibicarbonat von pH 9,0 gegeben, um den Formylrest von Trp abzutrennen. Die Lösung wurde durch Stickstoffspülung sauerstoiffrei gemacht und 1 β Stunden in einem verschlossenen Kolben stehengelassen. Dann wurde die Lösung mit Wasser verdünnt und lyophilisiert. Das Peptid wurde durch präparative HPLC auf einer Partisil-ODS-M-20-Säule gereinigt unter Eluierung mit 20% Acetonitril/0,1 % TFA. Das Peptid wurde durch Zusatz von verdünntem TFA auf etwa pH 3 verdünnt und in 5 Portionen injiziert. Die Mittelfraktionen des Hauptpoaks wurden kombiniert, das organische Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand lyophilisiert. Das Produkt wurde in das Acetatsalz durch Passage durch eine Säule mit Amberlit IR-68-Anionenaustauscherharz umgewandelt. Das lyophilisierte Produkt mit der folgenden Sequenz wog 112g:

Phenylalanyl-Phenylalanyl-Tryptophyl-Lysyl-Threonyl-Lysyl-Prolyi-Arginyl-Lysyl-Histidyl-Glycyl-Glycyl-Arginyl-Arginin.

TLC (Silicagel 60): R,0,10 n-BuOH:HOAc:H₂O:pyr 4:2:3:1 R,0,04 EtOAc:pyr:HOAc:H₂O P:5:1:3 Aminosäureanalyse: Thr-0,88; Pro-1,04; GIy-2,01 ;Phe-2,00;His-1,02; Lye-2,91;Trp-0,81; Arg-3,14;73%Peptid. Beispiel S Biologische Aktivität-Cyclische GMP-Assay Daudi-Zellen wurden frisch angesetzt und 2 Tage wachsen gelassen und dann gemäß T. Audhya et al., Arch. Biochem. Biophys.,

234:167-177 (1984) geerntet. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und in RPM11640 zu einer Konzentration von1,0 x 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Man ließ sie 30 Minuten bei 37⁰C ins Gleichgewicht kommen und gab dann die

Testverbindungen (25μΙ) Bursin und Probursin und die Kontrollpeptide Schweineinsulin (A), Pferde-Myoglobin (B) und Rinderwachstumshormon (C) hinzu. Die Inkubation erfolgte in einem geschüttelten Wasserbad über 4 bis 5 Minuten und wurde

durch Zugabe von 1 ml eiskaltem TCA (10%) beendet.

Die Zellen im TCA wurden homogenisiert und beschallt, um cyclisches Nucleotid freizusetzen. Die Suspension wurde mit

3000 χ g 20 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in 0,1 N NaOH gelöst, um den Proteingehalt zu

bestimmen. TCA wurde aus der Fraktion des Überstehenden durch viermaliges Extrahieren mit 5ml wassergesättigtem

Diethylether entfernt. Nach der letzten Extraktion wurden die restlichen Etherspuren durch Erhitzen über 10 Minuten in einem

50°C Wasserbad entfernt. Nach dem Lyophilisieren wurde die Probe in 5OmM Acetatpuffer (pH6,2) für die Radioimmunoassayvon cyclischem GMP zur ursprünglichen Konzentration gelöst.

Dosisabhängige Kurven von 0 bis 1000 Mikrogramm/ml wurden für Bursin, Probursin und die Kontrolldurchläufe aufgestellt. Fig. 5 zeigt typische dosisabhängige Kurven für aktives Bursin und Probursin sowie für inaktive Verbindungen in Daudi-Zellen

(Fig. 6A) und in MOPC-315 Zellen (Fig. 5 B). Eine Schwellenaktivität wurde für jedes getestete Peptid bestimmt. Diese ist definiertals niedrigste Konzentration de.·; Testpeptids (1 μρ/ΓηΙ), die einen intrazellulären Spiegel an cyclischem GMP größer als zwei

Standardabweichungen Ober der Kontrolle induziert. Die Kontrollen wiesen intrazelluläre cyclische GMP-Werte von weniger als

0,1 Picc mol/nrcl (mittlere 1 Standardabweichung) auf. Die Testergebnisse wurden als positiv angesehen, wenn der Spiegel ancyclischem GMP größer als das 1,52fache (2 Standardabweichungen) war, der für die parallele negative Kontrolle bestimmtworden war.

Beispiele Biologische Aktivität - Wachstumshormoninhlbierung

Es wurde eine Assay durchgeführt, um die Wirkung von Probursin in Kombinatin mit Wachstumshormon-freisetzenden Faktor (GRF) zu untersuchen, da diese Kombination die Freisetzung von ³H-lnositolphosphat (IP) und Wachstumshormon(GH)-Akkumulction in SV40-transformierten Hamster-beta-Zellen (HIT) bewirkt. Das Experiment wurde nach der von M. J.Berridge et al., der bereits oben zitiert worden war, beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt.

Es wurden kommerziell erhältliche HIT-Zellen bei 37⁰C für 1 Stunde in metabolischem RPMI-Medium mit 5%igem fötalen Kälbereerum (FCS) inkubiert. Dann würde GRF in unterschiedlichen Konzentrationen, die in der unten folgenden Tabelle . aufgeführt sind, zu der Zellkultur hinzugegeben und 15 Minuten bei 37"C inkubiert. Die Zellen wurdon bei 800U/minzentrifugiert und das Überstehende gesammelt. Die GH- und IP-Spiegel im Überstehenden wurden durch Radioimmunoassay (RIA) ebenfalls gemäß Berridge et al. gemessen. Diese Messungen bildeten die GRF-Kontrolle. Dieselbe Prozedur wurde ohne den GRF-Zusatz durchgeführt und wurde unten als Kontrolle angeführt. Um die Wirkung von Probursin auf GRF auszuweisen, wurde ähnlich wie oben verfahren, mit der Ausnahme, daß GRF und Probursin mit den entsprechenden in der folgenden Tabelle angegebenen Konzentrationen *u den Zellen zusammen zugegeben wurden, gefolgt von einer 1 Bminütigen Inkubation und einer Zentrifugierung. Während das Überstehende durch RIA, wie oben beschrieben, gemessen wurde, wurden die erhaltenen Konzentrationen von IP und GH, wie in der Tabelle unten erläutert, bestimmt.

Die in der Tabelle unten aufgeführton Daten zeigen, daß Probursin erkennbar die Unterdrückung der Wirkung des Wachstumshormon freisetzenden Faktors anzeigt, ähnlich wie die von Somatostatin, wie von Hill et al. (oben zitiert) beschrieben.

Tabelle

	[IP) (cpm)	[GH](ng/ml)
Kontrolle	15±4	14±2
GRF (0,1 nM)	489 ±19	162 ±4
GRF/0,1 nM) + Probursin (0,1 μΜ)	239 ±13	35 + 4
GRF(I nM)	2810±290	648+26
GRF (1 nM) + Probursin (0,1 μΜ)	1911 ±310	480 ±31
GRF (1 nM) + Probursin (1,0 μ M)	444 ±22	77 ±6
GRF(IOnM)	8 962 ±821	• 1162±84
GRF(IOnM) +Probursin (10,0μΜ)	382 ±16	29±3

Die Erfindung wurde hier unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, wobei jedoch zahlreiche Abweichungen und Modifikationen der Erfindung für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sind. Diese Abweichungen werden von den Patentansprüchen miterfaßt.

Zeichnungen

Fig. 1 Abszisse: Fraktionszahl

Ordinate: Optische Dichte (254 nm) Fig.3A Abszisse: Titer(x 10²)

Ordinate: Optische Dichte (410 nm) Fig. 3 B Abszisse: Absorptionsmittel (μρ/πιΙ)

Ordinate: Kaninchen-Antiserum Fig. 4 Abszisse: Abbau2yklen

Ordinate: Ausbeute an PTH-Aminosäuren (pMol) Fig. 5A Abszisse: Peptidkonzentration (Mikrogramm/ml)

Ordinate: c-GMP-Spiegel (Picomol/ml) Fig. 5 B Abszisse: Peptidkonzentration (Mikrogramm/ml)

Ordinate: c-GMP-Spiegel (Picomol/ml)

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung einos Peptids, dessen Aminosäuresequenz genau oder fast genau der Formel Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-. \rg entspricht, gekennzeichnet durch

(a) Festphasensynthese mit dem gleichen oder fast gleichen Peptid-Harz-Zwischenprodukt der Formel R^Phe-Phe-IR^Trp-IR^-Lys-IR^Thr^R^Lys-Pro-IR^Arg-IR^Lys^R^His-Gly-Gly-IR^-Arg-(R¹⁰)Arg-Harz, worin R¹ bis R¹⁰ unabhängig voneinander gewählt werden aus Aminoschutzgruppen, Hydroxy-Schutzgruppen, Indol-Schutzgruppen, Imidazol-Schutzgruppen, und das Harz ein Festphasenpolymer ist, an welches Arginin durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann;oder

(b) Peptidsynthese in Lösung, die eine schrittweise oder Blockkupplung von Aminosäuren oder Peptidbrychstücken, die in der obigen Formel enthalten sind, und die Bindung des genannten Fragments durch Amidbindungen untereinander umfaßt, wobei das genannte Verfahren zu dem Peptid der o. g. Formel führt; oder

(c) Züchtung einer Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen, die mit einem DNS-Molekül transformiert ist, welches eine DNS-Sequenz enthält, die die genannte Aminosäuresequenz codiert, unter Kontrolle einer geeigneten Expressions-Kontrollsequenz, die die Expression des genannten Peptids in der genannten Wirtszelle dirigieren kann; oder

(d) Reinigung des genannten Peptids aus Säugetierzellen, gewählt aus menschlichen Leberzellen oder menschlichen Knochenmarkzellen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Harz ein Polymer oder Copolymer aus der Gruppe Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethylmethacrylat, Polystyren und Polystyren-Divinylbenzen ist.

3. Verfahren fcernäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Schutzgruppen tert-Butoxycarbonyl, Benzyl, tert-Pentyloxycarbonyl, Tosyl, 2-Brom-benzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlor* benzyl und Benzyloxycarbonyl umfassen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in Beispiel 4 beschriebenen Stufen umfaßt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten DNS-Moleküle aus bakteriellen, Hefe-, Pilz-, Insekten- und Säugetiervektoren gewählt werden können.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Wirtszellen mikrobielle oder Säugetierwirtszellen umfassen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der Ablösung oder des Austausches einer oder mehrerer der Aminosäuren in der genannten Sequenz oder Einfügung oder Anfügung zusätzlicher Aminosäuren oder chemischer Gruppen zu den Aminosäuren der genannten Sequenz umfaßt wird.

8. Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung eingesetzt wird, die geeignet ist, (a) das Immunsystem eines Patienten zu regulieren odor (b) die Freisetzung von Wachstumshormonen in ausreichendem Maße zu inhibieren, um das Wachstum eines Tumors zu inhibieren.