DD281816A5 - Verfahren zur herstellung von serotyp c-streptokinase in bakteriellen l-form-staemmen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: SKC) in stabilen bakteriellen Protoplastentyp-L-Form-Staemmen. SKC ist ein in der Humanmedizin eingefuehrtes Thrombolytikum. Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine rekombinante Streptokinase, die mit der vom Wildtyp Streptococcus equisimilis H46A gebildeten identisch ist, in solchen L-Form-Staemmen herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete technische Aufgabe wird in der Weise geloest, dasz man{rekombinante Serotyp C-Streptokinase; Protein SKC; Thrombolytikum; bakterielle Protoplastentyp-L-Form-Staemme; Expressionsplasmid der pMLS-Familie; Expressionsplasmid pMLS10; Derivat eines multicopy-shuttle-Vektors; Submerskultivierung}

Description

Hierzu 2 Seiten Abbildungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: SKC) in stabilen Protoplastentyp-L-Form-Stämmen, wobei das gebildete Produkt in jeder Verfahrensvariante mit der vom Wildstamm Streptoccus equisimills H46A spezifizierten Streptokinase identisch ist. In der Humanmedizin ist Streptokinase ein eingeführtes Thrombolytikum.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für die Herstellung von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase in bakteriellen L-Form-Produzenten ist bisher bereits ein Verfahren vorgeschlagen worden, in dem I-Form-Stämme der Genera Escherichia, Proteus und Bacillus als Produzenten eingesetzt werden. Die mikrobiellen Produzenten tragen dabei rekombinante, Serotyp C-Streptokinase spezifizierende Plasmide, welche sich aus der pMF- sowie der pSM-Plasmidfamilie ableiten (siehe hierzu auch H.Malke, FEMS Lett. 11,27-31,1981). Für das erwähnte Verfahren zur Herstellung rekombinanter Serotyp C-Streptokinase bestehen jedoch folgende Nachteile:

- Die bisher eingesetzten rekombinanten Serotyp C-Streptokinase spezif ierenden Plasmide weisen ein relativ hohes Molekulargewicht auf und liegen in der jeweiligen Wirtszelle nur in einer geringen Kopiezahl vor;

- der Einsatz der nach dem bisherigen Verfahren erhaltenen rekombinanten L-Form-Produzentenstämme erbrachte jeweils nur relativ geringe Ausbeuten an Serotyp C-Streptokinase.

Ziel der .Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine rekombinante Serotyp C-Streptokinase, die mit der vom Wildstamm Streptococcus equisimllis H46A gebildeten identisch ist, in ökonomischerweise herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe unter Einsatz von neuartigen mikrobiellen Produzentenstämmen nach Transformation mit bislang nicht verfügbaren Expressionsplasmiden rekombinante, im o. g. Sinne authentische Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: SKC) in hohen Ausbeuten gewonnen werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug unter Anwendung von Standardoperationen der gentechnischen DNS-Verknüpfung und der Submersfermentation von rekombinanten prokaryotischen Mikroorganismen in der Weise gelöst, daß stabile Protoplastentyp-L-Form-Stämme bakteriellen Ursprungs (synonyme Bezeichnung: stabile L-Form-Bakterienstämme) nach ihrerTransformation mit einem skc-rekombinanten Expressionsplasmid, welches einerseits ein Derivat eines Streptococcus-Escherlchia coli-multicopy-shuttle-Vektors ist sowie andererseits eine von ihrer nativen Expressionseinheit regulierte, für die Aminosäuresequenz des Proteins Serotyp C-Streptokinase kodierende DNS (Kurzwort: Gen skc) trägt, submers kultiviert werden und nach Beendigung der Fermentation das Genf rodukt jeweils aus der Kulturflüssigkeit isoliert wird. In der weiteren Ausgestaltung des Grundzuges der vorliegenden technischen Lösung wird in jeder ihrer Varianten zur Konstruktion des verfahrensgemäß bereitzustellenden neuen skc-rekombinanten Expressionsplasmids - diese DNS-Moleküle werden nachfolgend als Plasmide der RMTS-Familie bezeichnet- einerseits ein Polylinker-tragender Streptococcus-Escherichla coilmulticopy-shuttle-Plasmidvektor minimierter Molekülgröße, vorzugsweise ein derartiger Polylinker-tragender multicopyshuttle-Vektor der pLM-Familie, eingesetzt. PLM-Expressionsvektoren dieser Kennzeichnung, so beispielsweise die shuttle-Plasmide pLM 2 und pLM 3, sind in Anwendung des Verfahrens einer erfinderischen Lösung des Zentralinstituts seit kurzem verfügbar geworden. Diese pLM-Vektoren enthalten jeweils einen Polylinker, der Spaltorte für so gebräuchliche Restriktasen wie u.a. EcoRI, SalI sowie PstI aufweist.

Andererseits wird in der weiteren Ausgestaltung der Erfindung das zur Konstruktion des jeweiligen skc-rekombinanten pMLS-Expressionsplasmids benötigte, von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc aus einem rekombinanten

Trägerptasmid der pMF- bzw. der pSM-Familie, so beispielsweise aus dem Plasmid pSM752, vorzugsweise als 2438bp großes Sall-Pstl-Fragment bzw. als 2568 bp großes Pstl-Pstl-Fragment, entnommen. Sämtliche skc-rekombinanten Trägerplasmide dieser Familie stellen dabei das aus der chromosomalen DNS des Serotyp G-Donorstammes Streptococcus equislmllis H46A isolierte Streptokinase-Gen zur Verfugung, dessen Nukleotidstruktur seit einigen Jahren aufgeklärt ist (H. Malke, B. Roe & J.J.Ferreti, Gene 34,1985,357-362).

Nach diesen vorbereitenden Verfahrensschritten wird das DNS-Fragment mit dem so gekennzeichneten Gen skc mittels Ligation in den Polyjinker des jeweils herangezogenen pLM-multicopy-shuttle-Vektors inseriert bzw. mit dem Hauptfragment eines solchen pLM-Vektors verknüpft, und jedes im anschließenden Screening-Schritt-dieser wird bevorzugt in einem E. coli-System ausgeführt - als skc-rekombinantes multicopy-shuttle-Expressionsplasmid der pMLS-Familie erkannte neue DNS-Molekül wird verfahrensgemäß zur Transformation von bakteriellen L-Form-Rezipientenstämmen bereitgestellt. Für die Transformation mit einem so erhaltenen pMLS-shuttle-Expressionsplasmid werden bevorzugt stabile L-Form-Stämme eingesetzt, die aus (Normal-) Zellpopulationen der Bakterienarten Proteus mlrabilis sowie Bacillus subtilis adaptiert worden sind, d. h. im beschriebenen Verfahren erfolgt die Herstellung von SKC in jeder seiner Varianten auf dem Wege der Synthese dieses Plasminogenaktivators durch heterologe mikrobielle transformierte Produzentenorganismen, die von Natur aus keine Streptokinase zu bilden vermögen.

Für ihren gentechnischen Verfahrensabschnitt liegt die oben dargelegte Erfindung noch in einer besonderen Ausführungsform vor. Diese ist in ihrem Einleitungsschritt dadurch gekennzeichnet, daß für die Konstruktion eines Expressionsplasmids aus der Kollektion der Polylinker-tragenden Streptococcus-Escherichia coli-multicopy-shuttle-Vektoren das Plasmid pML3 (Molekülgröße 4,6kb; Phänotypmarker: Erythromycin-Lincomycin-Resistenzgen) ausgewählt wird. Für diesen Vektor hat sich erwiesen, daß er sowohl pro Streptococcus- bzw. Bacillus- als auch allgemein pro L-Form-Zelle in erhöhter Kopiezahl vorliegt. Wegen dieses Befundes und wegen der ausreichenden Stabilität, die für diesen Vektor auch bei Fermentationen ohne Selektionsdruck besteht, kann Plasmid pLM 3 vorteilhaft zur Expression von Genprodukten, d. h. für die Konstruktion entsprechender Expressionsplasmide, eingesetzt werden.

In einem Ligationsansatz wird das 4,2 kb große Pst I-Pst I-Hauptfragment dieses Vektors mit dem aus dem Trägerplasmid pSM 752 als 2568bp großes Pstl-Pstl-Fragment bereitgestellten skc-Gen fusioniert; und in einem im E. coli-Rezipientensystem durchgeführten Screening-Schritt (nach Klonen, die sowohl eine Erythromycin-Resistenz ausprägen als auch im Kasein/ Plasminogen-Überschichtungstest eine SKC-Synthese aufweisen) werden in diesem System unter den Fusionsprodukten solcher Klone die Plasmid-DNS-Moleküle in der 6,7 kb-Größenklasse isoliert sowie als neues skc-rekombinantes multicopyshuttle-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pMLS 10 etabliert (s. a. Abb. 1).

In Verbindung mit dem Teilschritt „Konstruktion des Expressionsplasmids pMLS 10" der vorliegenden Erfindung ist darauf hinzuweisen, daß in Ankopplung an frühere Patentanmeldungen des Zentralinstituts in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR-6900, bereits die nachstehenden Hinterlegungen

Bezeichnung des Streptococcus sanguis Challis6(pSM752 Escher ichiacoli TG KpLM 3)

Registriernummer

ZIMET 10959 ZIMET 11308

vorgenommen worden sind, die die rekombinanten Ausgangsplasmide pSM752 sowie pLM 3 für den interessierten Fachwissenschaftler verfügbar machen.

In der bevorzugten Ausführungsform wird das im voranstehenden Verfahrensschritt konstruierte Polylinker-tragende multicopyshuttle-Expressionsplasmid pMLS 10 für die Übertragung der Fähigkeit zur Synthese von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase auf je einen ausgewählten L-Form-Stamm aus den Arten Proteus mirabills und Bacillus subtilis, nämlich auf die Rezipienten

P. mirabilisLVI (im Zusammenhang mit einer früheren Patentanmeldung in der o.g. Hinterlegungsstelle hinterlegt unter

derReg.-Nr.ZIMET11199) B. subtilis L170 (im gleichen Zusammenhang hinterlegt unter der Reg.-Nr. ZIMET11201),

hei angezogen. Die nach der jeweiligen Transformation vorliegenden rekombinanten L-Form-Stämme. P. mirabilis LVI (pMLS 10) und B. subtilis L170 (pMLS 10) werden in dieser Ausführungsform in belüfteter Submerskultur in einem modifizierten Bouillon-Medium mit Erythromycin- sowie gegebenenfalls mit Saccharose-Zusatz bis zum Erreichen der späten stationären Wachstumsphase bei 30°C i,m Falle des B. subtilis-L-Form-Stammes) bzw. bei 36⁰C (im Falle des P. mirabilis-L-Form-Stammes) inkubiert, und das Genprodukt SKC wird anschließend aus der Kulturflüssigkeit isoliert. Mit Hilfe eines Standard-Loch-Plattentests, der wiederum auf der Kasein-Plasminogen-Technik basierte, wurde dabei einerseits die SKC-authentische kaseinspaltende Wirkung des Genprodukts verifiziert sowie andererseits eine hinreichend genaue quantitative Bewertung der SKC-Bildung in der gewählten Kultivierungsperiode vorgenommen.

Wie anhand der Abbildung 2 ersichtlich, wird durch die nach dem voranstehend beschriebenen Verfahren gewonnenen neuen pMLSIO-Expressionssvcteme in stabilen L-Form-Stämmen bakteriellen Ursprungs bereits unter den angegebenen beispielhaften Kultivierungsbedingungen ein Niveau in der Bildung von authentischer Serotyp C-Streptokinase erreicht, welches das Synthese-Vermögen des Donorstammes H46A (nach den bislang bekannten Daten) um den Faktor 5 übertrifft.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Ausführungen sollen an einem Beispiel die einzelnen Schritte des Verfahrens zur Herstellung von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase (SKC) in bakteriellen L-Form-Stämmen veranschaulichen. Sie enthalten jedoch keine detaillierten Angaben zu den herangezogenen Standardverfahren der Gentechnologie und der Mikrobiologie (z. B. Gewinnung von Plasmid-DNS, Spaltung von DNS mit Restriktionsenzymen, Charakterisierung von Plasmid-DNS und Plasmid-DNS-Fragmenten mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, Gewinnung von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen, Einfügen von Gensequenzen in Vektorplasmide, Transformation von bakteriellen L-Form-Rezipientenstämmen mit Plasmid-DNS, usw.). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in einer Reihe von Veröffentlichungen ausführlich beschrieben, beispielsweise in: „Molecular Cloning, a Laboratory Manual" (T. Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook). Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

1.1) Bereitstellung von Vektor-DNS und skc-Gen

Zunächst werden die benötigten Mengen an Plasmid pLM 3-DNS (etwa 5pg) aus einer Kultur von E. coll JM101 (pLM3) isoliert, gereinigt und in Tris HCI-Puffer gelöst. Ebenso wird Plasmid pSM752-DNS (etwa 10pg) aus einer Kultur von E. coli JM101 (pSM 752) isoliert, gereinigt und in Tris HCI-Puffer gelöst.

1.2) Konstruktion des Expressionsplasmids pMLSIO

Zunächst wird das Plasmid pLM 3 mit Pst I verdaut. Die dabei entstehenden 2 Fragmente werden in einem Agarose-Gel getrennt, und ein 4,2 kb großes Fragment wird isoliert und gereinigt.

Durch Verdauung des Plasmids pSM752 mit dem Restriktionsenzym Pstl und anschließender Auftrennung der erhaltenen Fragmente isoliert und gereinigt. Dieses Fragment enthält das von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc einschließlich flankierender DNS-Sequenzen.

Die so gewonnenen Fragmente werde in einen Ligationsansatz gegeben. Aus dem bei dieser Ligation anfallenden Reaktionsgemisch wird ein rekombin jntes Plasmid in der Weise abgetrennt, daß mit Proben des Gemisches kompetente Zellen des Rezipientenstammes E. coli JM' 01 transformiert, Erythrom/cin-resistente Klone selektiert un diese Klone mit einem Kasein-Plasminogen-VVeichagar überschichtet werden. Alle Klone, welche in diesen Kasein-Plasminogen-Agar Aufhellungszonen (Höfe) bilden, werden anschließend isoliert und einem Screening nach DNS-Molekülen der Größe 6,7 kb unterworfen. Plasmid-DNS-Proben solcher Transformantenklone werden anschließend einer Verdauung mit den Enzymen Pstl, EcoRI und Hind III unterworfen und dann solche Plasmid-DNS-Proben identifiziert, die vom pMLS 10-Typ sind (Molekülgröße 6,7 kb; Größe des durch Pstl-Verdauung zu ermittelnden Inserts beträgt 2,5kb; s.a. Abb. 1).

1.3) Tranformation des Rezipientenstammes P. mirabilis LVI mit dem Expressionsplasmid pMLSIO

Zunächst werden benötigte Mengen des Plasmids pMLS 10 (etwa 5\ig) aus einer Kultur des Stammes E. coli JM101 (pMLS 10) gewonnen. Mit Proben dieser Plasmid-DNS wird anschließend der L-Form-Rezipientenstamm Proteus mirabilis LVI in an sich bekannterWeise transformiert und ein Screening nach Prythromycin-resistenten Klonen durchgeführt. Diese Klone werden danach mit einem Kasein-Plasminogen-Weichagar überschichtet und solche Klone selektiert, die in diesem Weichagar Höfe bilden. Aus solchen Klonen wird Plasmid-DNS isoliert und einer Verdauung mit Pstl, EcoRI und Hindll unterworfen. Nach einer Restriktionsanalyse werden dann solche DNS-Proben identifiziert, die vom pMLS 10-Typ sind (Molekülgröße 6,7 kb; Größe des durch Pst I-Verdauung zu ermittelnden Inserts beträgt 2,5 kb). Auf diese Weise konnte verifiziert werden, daß die im vorausgegangenen Teilschritt erhaltenen Transformantenklone tatsächlich das Plasmid pMLSIO in sich aufgenommen haben.

1.4) Kultivierung des rekombinanten Produzentenstammes P. mirabilis LVI (pMLS 10) und Expressionsnachweis

Zur Gewinnung von SKC wird der rekombinante Produzentenstamm P. mirabilis LVI (pMLS 10) eingesetzt. Als Kulturmedium

dient Bouillon-Medium (Fleisch-Bouillon, versetzt mit Bacto-Peptone 10g/l, Hefe-Extrakt 5g/l, Saccharose 20g/l, NaCI 5g/l;pH7,0). Dem Medium werden 10pg/ml Erythromycin zugesetzt.

Die Kultivierung erfolgt bei 36⁰C im Schüttelkolben (100ml) als Hauptkultur. Zunächst wird eine Kultur durch Beimpfung mit einer Einzelkolonie des Stammes P. mirabilis LVI (pMLS 10) bis zum Erreichen

der spaten stationären Wachstumsphase (etwa 24 Stunden) bebrütet. Wachstum und SKC-Bildung werden durch periodische

Probennahme vermessen. Die zur Bestimmung der SKC-Bildung entnommenen Proben werden zentrifugiert und der Kulturüberstand einem Standard-Lochplattentest zugeführt. Als SKC-Slandardprobe dient gereinigte SKC mit einer Aktivität von

1500U/ml. Als Maß für die SKC-Aktivität der einzelnen Proben dient der Durchmesser der im Lochplattentest erhaltenen

Aufhellungszone (Hof). Unter den Bedingungen dieses Ausführungsbeispiels waren in dem nach 24-stündiger Kultivierung

gewonnenen Kulturüberstand etwa 23 000 U/m ISKC enthalten (s. a. Abb. 2).

Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: SKC) in bakteriellen L-Form-Stämmen unter Anwendung von Standardoperationen der gentechnischen DNS-Verknüpfung und der Submersfermentation, gekennzeichnet dadurch, daß man

- mit jeweils einem skc-rekombinanten Expressionsplasmid, welches Derivat eines Streptococcus-Esgherlchia coli-multicopy-shuttle-Vektors ist sowie eine von ihrer nativen Expressionseinheit regulierte, für die A ninosäuresequenz des Proteins C-Streptokinase kodierende DNS (kurz: Gen skc) trägt, transformierte L-Form-Bakterienstämme submers kultiviert und

- das Genprodukt aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Konstruktion des jeweiligen skc-rekombinanten Expressionsplasmids einen Polylinker-tragenden Streptococcus-Escherichia coli-multicopy-shuttle-Plasmidvektor minimierter Molekülgröße heranzieht.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Konstruktion des jeweiligen skc-rekombinanten Expressionsplasmids einon Polylinker-tragenden Streptococcus-Escherichia coli-multicopy-shuttle-Vektor der pLM-Familie heranzieht.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Konstruktion des jeweiligen skc-rekombinanten Expressionsplasmids den Polylinker-tragenden multicopy-shuttle-Vektor pLM 3 heranzieht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man das zur Konstruktion des jeweiligen skc-rekombinanten Expressionsplasmids benötigte, von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc aus einem rekombinanten Trägerplasmid der pMF- bzw. der pSM-Familie entnimmt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man das von einer nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc aus dem Trägerplasmid pSM752 entnimmt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man das von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc dem Plasmid pSM752 asl 2438bp großes Sall-Pstl-Fragment entnimmt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man das von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc dem Plasmid pSM752 als 2568bp großes Pstl-Pstl-Fragment entnimmt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1,3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß man

- das einem skc-rekombinanten pMF- bzw. pSM-Trägerplasmid entnommene, von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc in den Polylinker eines pLM-multicopy-shuttle-Vektors inseriert und

- jedes erhaltene skc-rekombinante Expressionsplasmid der pMLS-Familie zur Transformation von bakteriellen L-Form-Rezipientenstämmen bereitstellt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 3,6 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß man

- das aus dem skc-rekombinanten Trägerplasmid pSM75;.' entnommene, von seiner nativen Expressionseinheit regulierte Gen skc in den Polylinker eines pLM-multicopy-shuttle-Vektors inseriert und

- jedes erhaltene skc-rekombinante Expressionsplasmid der pMLS-Familie zur Transformation von bakteriellen L-Form-Rezipientenstämmen bereitstellt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 4,8 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man

- das aus dem Trägerplasmid pSM752 als 2568bp-Pstl-Pstl-Fragment entnommene Gen skein den Polylinker des multi-copy-shuttle Plasmids pLM3 inseriert und

- das erhaltene skc-rekombinante Expressionsplasmid pMLS 10 (Molekülgröße 7,3kb; Phänotypmarker: Erythromycin-Lincomycin-Resistenzgen) zur Transformation von L-Form-Rezipientenstämmen bereitstellt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1,9 oder 10, gekennzeichnet dadurch, daß man

- zur Transformation mit einem skc-rekombinanten pMLS-Expressionsplasmid jeweils einen bakteriellen L-Form-Rezipientenstamm bereitstellt und

- nach Kultivierung dertransformierten Zellen aus der Kulturflüssigkeit das Genprodukt isolieit.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1,9 oder 10 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man

- zur Transformation mit einem skc-rekombinanten pMLS-Expressionsplasmid jeweils einen L-Form-Rezipientenstamm einer der nachstehenden Arten Proteus mirabilis sowie Bacillus subtilis bereitstellt und

- nach Kultivierung der transformierten Zellen aus der Kulturflüssigkeit das Genprodukt isoliert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 11 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß man

- zurTransformationmitdemskc-rekombinantenExpressionsplasmidpMLSIOden L-Form-Rezipientenstamm P. mirabilis LVI bereitstellt und

- nach Kultivierung des transformierten Stammes P. mirabilis LVI (pMLS 10) das Genprodukt aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

15. Verfahren gemäß Anspruch 11 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß man

- zur Transformation mitdemskc-rekombinanten Expressionsplasmid pMLSIOden L-Form-Rezipientenstamm Bacillus subtilis L170 bereitstellt und

- nach Inkubation des transformierten Stammes B. subtilis L170 (pMLS 10) das Genprodukt aus der Kulturflüssigkeit isoliert.