DD278361A5

DD278361A5 - Träger zur enzymatischen oder chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an Festphasen

Info

Publication number: DD278361A5
Authority: DD
Publication date: 1990-05-02

Abstract

Die Erfindung betrifft Traeger zur enzymatischen oder chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsaeuren oder Nukleinsaeurefragmenten an Festphasen bestehend aus einem unloeslichen, nicht quellbaren, poroesen Polymeren, an das ein oder mehrere eventuell mit in der Nukleinsaeurechemie ueblichen Schutzgruppen versehene Nukleinsaeuren oder Nukleinsaeurefragmente fixiert sind, wobei die Poren des Polymeren im wesentlichen eine definierte Groesse zwischen 1 400 und 10 000 A besitzen, sowie die Verwendung solcher Traeger bei chemischen oder/und enzymatischen Umsetzungen von Nukleinsaeuren oder Nukleinsaeurefragmenten an fester Phase.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft unlösliche, polymere Träger zur enzymatischen oder chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an Festphasen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für die gezielte Synthese von Nukleinsäuren werden im allgemeinen Nukleinsäurefragmente, d. h. Bruchstücke ganzer Nukleinsäuren, Oligomere bzw. Monomere mittels einer Kombination chemischer und enzymatischer Reaktionen miteinander verknüpft. So können z.b. zum Aufbau von Deoxyribonul·'^insäure (DNA) Oligodeoxyribonukleotidfragmente von etwa 15-60 Einheiten Kettenlänge chemisch synthetisiert und diese dann nach Phosphorylierung am 5'-Ende gemischt und in enzymkatalysierter Reaktion mittels DNA-Ligase zu doppelsträngiger Nukleinsäure zusammengefügt werden, wobei die richtige Positionierung der einzelnen Fragmente durch gegenseitige Watson-Crick-Baserpaarung aufgrund der Hybridisierung und somit zumindest teilweise Überlappung der Fragmente erreicht wird. Chemisch synthetisierte oder in enzymkatalysierter Reaktion gewonnene Oligoribonukloetide lassen sich entsprechend mit RNA-Ligase zu Ribonukleinsäure (RNA) verknüpfen. Analog können auch Nukleinsäuren, die sowohl DNA- als auch RNA-Fragmente enthalten als Einzelstrang erhalten werden. Im folgenden werden unter Nukleinsäuren alle möglichen Arten und Formen von Nukleinsäuren verstanden. Es können sowohl Deoxyribonukleinsäuren als auch Ribonukleinsäuren und auch gemischte Polynukleotide sein, die sowohl aus Monomeren von Deoxyribonukleinsäuren und aus Monomeren von Ribonukleinsäuren bestehen. Weiter können die Nukleinsäuren als Einzeloder Doppelstrang vorliegen.

Teile oder Fragmente von Nukleinsäuren können sowohl Monomere wie Nukleoside oder Nukleotide sein als auch Oligomere aus 2-100 Monomereinheiten, und auch größere Polymere mit mehreren hundert Monomereinheiten sind möglich.

Für die enzymkatalysierte Verknüpfung von Nukleinsäumfragmenten hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn eines der Fragmente an einen polymeren unlöslichen Träger gebunden ist. So berichtßten Cozzarelli et al. in Bicchem. Biophys. Res.

Comm. 28,578-586 (1967) über die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mittels einer DNA-Ligase, wobei eines der Fragmente an Cellulose gebunden ist.

T. M.Jovin & A. Kornberg beschrieben in J. Biol. Chem.243, 250-259 (1968) den Einsatz eines an Cellulose-Partikei gebundenen Oligomers von Deoxyribothymidin als Primer und Matrize für DNA-Polymerase.

U.Bertazzoni et al., Biochim. Biophys. Acta 240, 515-521 (1971) berichteten über die Keltenverlängeruny von kovalent an Cellulose gebundenen Oligodeoxyribonukleotiden mittels terminaler Deox Tibonukleotidyl-Transferase.

A. Panet & H. G. Khorana, J. Biol. Chem. 249, 5213-5221 (1974) banden Polvdeoxyribothymidin an Cellulose und verlängerten diese trägergebundene Nukleinsäure mittels Ligase um ein weiteres DNA-Fragment. Mit dem so dargestellten cellulosegebundenen Polynukleotid und einem kurzen Primer wurde mit DNA-Polymerase ein Teil des Polynukleotids repliziert.

Die Vorteile des Einsatzes immobilisierter Nukleinsäurefragemnte für den enzymatischen Nukleinsäureaufbau sowie ganz allgemein für deren enzymatische Umsetzung werden vor allem in der leichten Abtrennung des immobilisierten Reaktionsprodukts von den übrigen für die Reaktion benötigten und während der Reaktion entstandenen Stoffe gesehen.

Aufgrund dieser einfachen Möglichkeit zur Isolierung eines gewünschten Reaktionsprodukts kann auch durch Anwendung von Überschüssen an Enzym und/oder nicht immobilisiertem Substrat eine Verschiebung des Gleichgewichts zu höheren Ausbeuten an immobilisiertem Reaktionsprodukt z. B. an kettenverlängertem Produkt, erreicht werdon, ohne die anschließende Aufreinigung dadurch wesentlich zu erschweren.

Während Gele, wie quellbare und unlösliche Polysaccharide, geeignete Träger für die enzymkatalysierte Umsetzung immobilisierter Nukleinsäuren oder Nukleinsaurefragmente sind, hat es sich aber gezeigt, daß sich solche Materialien nur schlecht eignen, um Nukleinsäuren mit Chornischen Methoden an polymeren unlöslichen Trägern aufzubauen oder zu verändern.

Go müssen z. b. bei der chemischen Synthese von Nukleinsäuren, die üblicherweise von entsprechenden Monomeren wie Nuk'leosiden oder Nukleotiden ausgeht, üblicherweise Zyklen durchlaufen werden, die im wesentlichen aus den Schritten:

Aktivierung des zu verlängernden Nukleinsäureteils, eventuelle Isolierung des Produkts, Zugabe und Ankondensation eines neuen Nukleosids oder Nukleotids und Isolierung des Produkts bestehen.

Die teilweise oder vollständige Automatisierung solcher chemischer Verfahren zum Aufbau von Nukleinsäuren gelang nach Einführung der Festphasenmethoden, wobei die zu verlängernden Nukleinsaurefragmente an unlösliche Träger fixiert sind. Die Immobilisierung des „wachsenden" Nukleinsäureteils ermöglicht so die jeweilige Reinigung des gewünschten Reaktionsproduktes durch einfaches Waschen der festen Phase. Lösliche Reaktionspartner werden mit der Festphase in Kontakt gebracht und nach Beendigung der Reaktion durch Waschen entfernt.

R. Frank et al., Nucl. Acids Res. 11,4365-4377 (1983) beschrieben den Einsatz von Cellulose in Form von Papierblättchen („disks") als feste Phase für die chemische Synthese von kurzen DNA-Fragmenten. Papier, Cellulose und generell alle Polysaccharide habeⁿ aber den grundsätzlichen Nachteil, daß alle nicht für die Fixierung der Nukleinsäure oder Nukleinsaurefragmente benötigten reaktiven Gruppen, wie Hydroxylreste, blockiert werden müssen, damit keine Störung der Synthesezyklen erfolgt.

Eine vollständige Blockierung aller nicht als Nukleotidanker benötigten reaktiven Gruppen von als Trägermaterialien verwendeten Polysacchariden ist jedoch unmöglich, um so mehr als bei vielmaliger Wiederholung der Reaktionszyklen sich oft die makroskopische Struktur solcher festen quellfähigen Träger, z. B. durch Ausbildung von Rissen, ändert und so vorher unzugängliche reaktive Gruppen dann für Reaktanden zugänglich werden und zu Störungen des Reaktionsablaufs oder zu Nebenreaktionen führen können. Speziell bei Verwendung von Papier als Trägermaterial für die chemische Synthese von Nukleinsäuren kann so eine große Zahl von Fehlsequenzen auftreten. Die mangelnde mechanische Stabilität von Papier bei längerer Chemikalienbeanspruchung bringt außerdem Schwierigkeiten in der maschinellen Synthese mit sich, weswegen bisher Sequenzen von mehr als 20-25 Basen so nicht dargestellt werden.

Bei quellbaren Trägern können je nach Reaktionsmedium durch Quellung bzw. Entquellung dos Materials beträchtliche Wasch- und Reaktionszeiten auftriten. Außerdem kann es zu Diffusionsproblemen kommen. Wegen dieser Nachteile werden üblicherweise nicht quellbare Träger für die chemische Umsetzung insbesondere die Synthese von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten eingesetzt. Ein gebräuchliches Material hierfür ist Silicagel.

Silicagel ist ein oft eingesetzter unlöslicher Träger für den chemischen Aufbau von Nukleinsäuren. Dieses Material besitzt eine breite Verteilung verschiedener Porengrößen und eine unregelmäßige Porenstruktur.

Für die Synthese doppelsträngiger DNA unter Verwendung sowohl chemischer als enzymatischer Reaktionsschritte wurden von

Z. Hostomsky & J. Smrt in Nucleic Acids Research Symp. Ser. 18, 241-244 (1987) Fractosil 1000^R, ein Silicagel mit einer Porengröße von 10OOÄ und Sephacryl-500^R, ein durch dreidimensionale Vernetzung von linearen Dextran-Ketten mit N,N'-Mothylen-bis(acrylamid) erhältliches, hydrophiles, gelbildendes, d. h. quellbares Material auf ihre Eignung als Trägermaterialien miteinander verglichen. Es wurde dabei festgestellt, daß das nicht quellbare Silicagel im Gegensatz zu dem gelbildenden Träger die enzymatischen Reaktionen, Ligierung bzw. Freisetzung der fertigen Nukleinsture vom Trägermaterial teilweise bzw.

vollständig inhibierte.

Ziel der Erfindung

Nach wie vor bestand deshalb bis heute Bedarf an Trägermaterial für den kombinierten Einsatz chemischer und enzymatischer Methoden zur Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an unlöslichem, polymeren Trägermaterial, das für chemische Reaktionen die Nachteile quellbarer Träger vermeidet und vorteilhaft für enzymatische Reaktionen eingesetzt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung war es, geeignete Träger für die enzymatische oder chemische und enzymatische Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an Festphasen bereitzustellen, die die vorstehenden Anforderungen erfüllen. Gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Ansprüchen charakterisierte Erfindung. Der erfindungsgemäße Träger zur chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten besteht aus einem unlöslichen, nicht oder nicht wesentlich quellbaren, porösen Polymeren, an das die zur Reaktion zu bringenden Nukleinsäuren oder Teile von Nukleinsäuren eventuell mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehen, fixiert sind, wobei die Poren des Polymeren im wesentlichen eine definierte Größe innerhalb eines bestimmten Bereiches aufweisen. Die Poren müssen einerseits so groß sein, daß Enzyme im wesentlichen ungehinderten Zugang zu den zur Reaktion zu bringenden fixierten Nukleinsäuren oder Teilen von Nukleinsäuren haben. Andererseits müssen die Poren so klein sein, daß der Träger eine große Oberfläche aufweist, die viele Reaktionsstellen anbietet, um so mit möglichst wenig Trägermaterial möglichst viele Nukleinsäure-Moleküle umsetzen zu können. In diesem Sinne haben sich Träger als bevorzugt erwiesen, die Poren einer definierten Größe zwischen 1400 und 10000Ä besitzen. Bevorzugt sind solche Polymere, deren Poren im wesentlichen definierte Größen zwischen 1400 und 10000Ä besitzen. Bevorzugt sind solche Polymere, deren Poren im wesentlichen definierte Größen zwischen 2000 und 5000A, insbesondere zwischen mehr als 1500 und 5000Ä aufweisen, wobei unter „definiert" eine maximale Abweichung von ±10%vom angegebonon Wert verstanden wird. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß solche Polymere, die diese Porengrößenhedingungen erfüllen und die von ihrer Zusammensetzung her gegenüber den für die chemischo und enzymatische Umsetzung von Nukleinsäuren erforderlichen Agenzien resistent sind, sich gut für sowohl chemische als auch enzymatische Reaktionen, wie z. B. solche für die Synthese von Nukleinsäuren eignen, die manuell oder automatisch durchgeführt werden können. Insbesondere wenn es sich bei dem Trägerpolymeren um ein Material handelt, daß wäßrige Lösungen, insbesondere Pufferlösungen, als Medien für Enzymreaktionen nicht aus den Hohlräumen ausschließt, laufen enzymatische Reaktionen, wie Ligierungen mit Ligasen oder Abspaltungen von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten, z. B. mit Restriktionsenzymenn, schnell und vollständig ab. Als bevorzugte Trägerpolymere werden anorganische Materialien, insbesondere solche, die im wesentlichen aus Silicium- und Sauerstoffatomen aufgebaut sind, eingesetzt.

Ganz besonders geeignet hat sich für chemische und insbesondere auch für enzymatische Umsetzungen von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten Glas mit einer kontrollierten Porengröße von etwa 3000Ä erwiesen.

Die Art des polymeren Trägermaterials ist ausschlaggebend für die vorteilhafte Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Trägers für den kombinierten Einsatz chemischer und enzymatischer Methoden zur Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten. So ist es z. B. nicht nötig, nach Abschluß einer chemischen Synthese von Nukleinsäureketten diese von der hierfür verwendeten festen Phase abzutrennen und für die enzymatii;che Kettenverlängerung ein anderes Trägermaterial zu wählen. Verlustreiche Abtrenn- und Ankopplungsreaktionen können mit dem erfindungsgemäßen Träger vermieden werden. Ganz besonders für enzymatische Umsetzungen ist der erfindungsgemäße Träger hervorragend geeignet. Die immobilisierten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente können auf die unterschiedlichste Art und Weise an das Trägermaterial fixiert sein. Besonders vorteilhaft ist es jedoch, wenn der Träger zur Festphasensynthese von Nukleinsäuren die eventuell mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehenen Nukleinsäurefragmente kovalent an das unlösliche, nicht quellbare, poröse Polymere gebunden enthält. Für die chemische Synthese von Nukleinsäuren geht man dabei in bekannter Weise meist von eventuell geschützten Monomeren entsprechender Nukleinsäuren aus, es können aber auch Oligomere eingesetzt werden. Bei der enzymatischen Umsetzung sind oft größere Nukleinsäurefragmente an das polymere Trägermaterial gebunden. Die enzymatische Umsetzung von kleinen Nukleinsäurefragmenten ist aber natürlich oft genauso möglich.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trägers sind die Nukleinsäurefragmente über einen Spacer an das Polymer gebunden. Als Spacer kommen eine Vielzahl von Substanzen in Betracht, die von dem Fachmann je nach den zur Frage stehenden Umsetzungen ausgewählt werden können. Gesichtspunkte für eine solche Wahl sind insbesondere die Stabilität gegenüber den jeweils gewählten Reaktionsbedingungen bei sowohl den chemischen als auch den enzymatischen Umsetzungen. Ganz besonders vorteilhaft hat es sich innerhalb der Methoden der chemischen Nukleinsäuresynthese für die heutzutage vorherrschende Phosphitmethode erwiesen, wenn die zur Reaktion zu bringende eventuell mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehene Nukleinsäure oder der Teil einer Nukleinsäure mit einem Aminopropylsilyl-Spacer (-Si-(CH₂Ij-NH-) an das Trägermaterial gebunden ist. Speziell der allgemeinen Formel I

OR OO

POlYmGr-O-Si-CH₂-CH₂-CH₂-NH-C-CH₂-CH₂-C-O-NUkI. (D

OR'

in der

Polymer ein Glas mit einer kontrollierten Porengröße zwischen mehr als 2500 und 5000 A, bevorzugt von etwa 3000Ä, R und R', die gleich oder verschieden sein können, Ci-C₆-Alkyl oder Polymer, und Nukl. eine eventuell mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehenes Fragment einer Nukleinsäure bedeuten,

haben sich für die kombinierte chemische und enzymatische Synthese von Nukleinsäuren hervorragend bewährt. Insbesondere enzymatische Umsetzungen können hieran vorteilhaft durchgeführt werden.

Das Fragment einer Nukleinsäure in der Bedeutung von Nukl. kann sowohl ein einzelnes Nukleotid als auch ein Oligomer aus 2-100 Monomereinheiten oder ein größeres Polymer mit mehreren hundert Monomereinheiten sein.

Als Fragment einer Nukleinsäure in der Definition von Nukl. haben sich für enzymatische Umsetzungen besonders Oligonukleotide aus 6-30 Nukleotiden bewährt. Ganz besonders bevorzugt sind solche Oligonukleotide aus 15-25 Nukleotiden.

Analog dem von T.Atkinson und M.Smith bei M. J.Gait (Ed.) in „Oligonucleotide Synthesis-a practical approach", IRL Press, Oxford, Washington D.C. (1984), S. 45-49 beschriebenen Verfahren kann ein solcher ganz besonders bevorzugter Träger durch Aminopropylierung von controlled pore glass 3000Ä (CPG 3000, Serva, Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland) und Umsetzung mit dem entsprechenden am 3'-Ende durch p-nitrophenylsuccinyl substituierten eventuell durch in der Nuklcinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehenen Nukleinsäurefragment hergestellt werden. Es können so Beladungsdichten von etwa 1 μίτιοΙ bis 30μιηοΙ Nukleinsäure oder Nukleinsäurefragment pro Gramm polymerem Trägermaterial hergestellt werden. Besonders bevorzugt sind Träger mit einer Beladungsdichte von 5 bis 11 pmol/g.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäure nach einer Festphasenmethode, wobei als feste Phase ein unlösliches, nicht quellbares, poröses Polymeres eingesetzt wird, dessen Poren im wesentlichen eine definierte Größe zwischen 1400 und 10000Ä besitzen. Vorzugsweise haben die Poren eine kontrollierte Größe zwischen 2000 und 5000Ä, insbesondere zwischen mehr als 2 500 und 5000Ä.

Unter Festphaseiimethoden werden hier alle diejenigen Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren verstanden, die heterogen ablaufen, d.h. wo ein Nukleinsäureteil, sei es ein Monomer, wie ein eventuell mit in derNukleinsäurechemieüblichon Schutzgruppen versehenes Nukleosid oder Nukleotid, oder ein aus mehreren Monomereinheiten bestehendes eventuell ebenfalls geschütztes Nukleinsäurefragment an ein unlösliches Trägermaterial fixiert wird, mittels chemischer und enzymatischer Reaktionen oder mittels enzymatischer Reaktionen alleine um eine oder mehrere Monomereinheiten verlängert und nach Abschluß der Synthese die fertige Nukleinsäure gegebenenfalls von der festen Phase abgelöst wird.

Für die chemische Synthese von Nukleinsäuren sind das Phosphodiester-, Phosphotriester- und das Phosphitverfahren üblich, wobei sich gerade die beiden letzten Methoden und hiervon insbesondere die Phosphitmethode für die Festphasensynthese von Nukleinsäuren als vorteilhaft erwiesen haben.

Während sich mit chemischen Verfahren am besten Oligonukleotide aus etwa bis zu 60 IvH.-iomereinheiten synthetisieren lassen, können diese mit enzymatischen Methoden zu Nukleinsäuren aus mehreren hundert Monomereinheiten verlängert werden, wie dies bereits in der Beschreibung des Standes der Technik wiedergegeben ist. Übliche Enzyme sind z. B. Kinasen, Polymerasen und Ligasen. Auch zur Abspaltung der an einer Festphase fertig synthetisierten Nukleinsäure von der Trägermatrix können Enzyme eingesetzt werden, z. B. Restrik'ionsendonukleasen.

Bisher war eine effiziente, eventuell automalisierbare Synthese von Nukleinsäuren, die chemische und enzymatische Verfahrensschritte beinhaltet, nur möglich, wenn im Falle des Einsatzes quellbarer Festphasen die Nachteile mangelnder mechanischer Stabilität, langer Wasch- und Reaktionszeiten sowie eventueller Nebenreakt'onen oder im Falle des Einsatzes nicht quellbarer Festphasen eventuelle Inhibierungen eingesetzter Enzyme und damit unvollständige Reaktionen in Kauf genommen wurden. Zur Vermeidung einiger Nachteile konnten die chemischen Syntheseschritte auf einem nicht quellbaren Trägermaterial und die enzymatischen Syntheseschritte auf einem quellbaren Material durchgeführt werden. Dies bedeutete jedoch, daß während der Synthese das Trägermaterial gewechselt werden mußte und verlustreiche Abtrenn- und Ankopplungsreaktionen durchgeführt mußten.

Das erfindungsgemäße Verfahren bestehend aus den Schritten:

Fixierung eventuell mit Schutzgruppen versehener Nukleinsäurefragmente an ein unlösliches, nicht quellbares, poröses Polymer, Verlängerung der immobilisierten Nukleinsäurefragmente durch weitere Nukleinsäurefragmente und gegebenenfalls Abspaltung fertiger Nukleinsäuren vom unlöslichen Polymer weist diese Nachteile nicht auf. Es ist in sehr vorteilhafter Weise für den kombinierten chemischen und enzymatischen Nukleinsäfeaufbau geeignet. Ein Wechsel des Trägermaterials bei Kombination chemischer und enzymatischer Syntheseschritte ist nicht nötig. Ganz besonders ist das Verfahren für die enzymatische Nukleinsäuresynthese geeignet.

Erfindungsgemäß wird als Trägermaterial ein im wesentlichen aus Silicium- und Sauerstoffatomen bestehendes Polymer bevorzugt, das sich durch seine große mechanische Stabilität und durch seine hohe permanente Porosität und geringe Quellungsporosität besonders auszeichnet. Dies gilt ganz besonders für Glas einer definierten Porengröße zwischen 1400 und 10000Ä. Insbesondere Glas einer kontrollierten Porengröße von etwa 2000-5000 A, vorzugsweise zwischen mehr als 2 500 und 5000Ä und ganz besonders solches einer kontrollierten Porengröße von etwa 3000A zeigt hervorragende Eigenschaften, die es als nicht quellbares, poröses Material für eventuell automatisierbare Festphasenverfahren empfehlen. Besonders hervorzuheben ist hierbei die Eignung zur Immobilisierung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten und die Eignung solcher festphasengebundener Substanzen als En?ymsubstrato zu wirken.

Nukleinsäurefragmente können auf die unterschiedlichste Art und Weise an das Trägermaterial fixiert werden. Besonders vorteilhaft ist es jedoch, wenn die Nukleinsäurefragmente, die gegebenenfalls mit Schutzgruppen versehen sein können, kovalent an das unlösliche, nicht quellbare Polymere gebunden werden, vorzugsweise über einen Spacer, wobei als Spacer eine Vielzahl von Substanzen in Betracht kommen, die von dem Fachmann je nach den zur Frage stehenden Umsetzungsbedingungen gewählt werden können. Ganz besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Nukleinsäurefragmente, die gegebenenfalls durch eine in der Nukleinsäurechemie übliche Schutzgruppe geschützt sein können, mit einem Aminopropylsilyl-Spacer (-Si-(CH₂)3-NH-) an das Trägermaterial gebunden werden, z. B. mittels (C₂H₅O)₃Si-O-(CH₂)S-NH₂. Insoweit sind die vo stehend beschriebenen Träger der allgemeinen Formel I besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren.

Eine Inhibierung von Enzymen wird hierbei nicht beobachtet. Dies gilt insbesondere für Polynukleotidkinase, DfiA-Polymerase sowie RNA- und DNA-Ligase und Restriktionsendonukleasen. Das erfir. Jungsgemäße Verfahren eignet sich deshalb ganz besonders für enzymkatalysierte Umsetzungen immobilisierter Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente. Beispiel solcher enzymatischen Umsetzungen sind die enzymatische Phosphorylierung von Oligonukleotidfragmenten, wie z. B.

Oligodeoxythymidylat mit T₄-Polynukloetid-Kinase,

das Anligieren von DNA-Fragmenten an Oligonukleotide, wie z. B. Oligodeoxythymidylat mit Hilfe von DNA-Ligase in Gegenwart eines Gegensirangfragments,

Kettenverlängerung durch einsträngiges Anknüpfen von DNA-Fragmenten mit 3'-Riboterminus an ein immobilisiertes Oligonukleotid, wie z. B. Oiigodeoxythymidylat, mit Hilfe von RNA-Ligase,

Replikation eines immobilisierten RNA-DNA-Hybridstranges durch Klenow-DNA-Polymerase in Gegenwart eines universell einsetzbaren Starteroligonukleotids, wie z. B. Oligodeoxyadenylat oder

Abschneiden eines immobilisierten Oligonukleotid-Doppelstranges durch den Einsatz von Restriktionsenzymen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines unlöslichen, nicht quellbaron, porösen Polymeren, dessen Poren im wesentlichen eine definierte Größe zwischen 1400 und 10000 A haben, als Trägermaterial für die Immobilisierung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten, insbesondere dann, wenn solche trägerfixierten Verbindungen zur enzymatischem oder chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an einer Festphase eingesetzt werden. Solche Polymere eignen sich auch zum Einsatz für Syntheseautomaten zum Aufbau von Nukleinsäuren, da sich die durch hohe mechanische Stabilität und dauerhafte Belastbarkeit mit wechselnden Reagenzien und Lösungsmitteln auszeichnen. Ganz besonders geeignet sind die vorgenannten Polymere jedoch als Trägermaterial für enzymatischo Umsetzungen, da diese daran ungehindert ablaufen.

Bevorzugt sind anorganische Polymere, insbesondere solche, die im wesentlichen aus Silicium- undSauerstoffatomen aufgebaut sind. Vorteilhafterweise besitzen solche Polymere Poren definierter Größe zwischen 2000 und 5000A, insbesondere zwischen mehr als 2500 und 5000Ä. Ganz besonders vorteilhaft hat sich Glas mit einer kontrollierten Porengröße von etwa 3000Ä erwiesen.

Solche weitporigen, nicht quellbaren Polymere eignen sich für die chemische Synthese, weil sie leicht auswaschbar sind, so daß Reagenzienüberschüsse und Lösungsmittel gut entfernt werden können. Außerdem erlaubt das erfindungsgemäße Trägermaterial sehr hohe, nahezu quantitative Ausbeute bei den chemischen Kondensationsschritten. Als besonders vorteilhaft erweist sich die erfindungsgemäße Verwendung weitporigen, nicht quellbaren Polymers für enzymatische Reaktionen zum Aufbau oder zur Abkopplung von Nukleinsäuren vom Trägermaterial, Enzyme werden durch das Material nicht inhibiert und akzeptieren die damit immobilisierten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente als Substrate. Im folgenden wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert. Diese sollen jedoch keine Einschränkung des Erfindungsgcyenstandes bedeuten.

Ausführungsbeispiele In den Beispielen verwendete Abkürzungen

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

DTT Dithiothreitol

ATP Adenosin-5'-triphosphat

EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure

Cpm Counts pro Minute

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

PEG Polyethylenglykol

TE Tris/EDTA-Puffer

BSA Rinderserum-Aibumin

DMTrdT mit Dimet¹· jxytritylgruppe in 5'-Position substituiertes Qeoxythymidin

MSNT 1-(Mesitylensulphonyl)-3-nitro-1,2.4-triazol

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

TFA Triethylamin

Beispiel 1

Synthese immobilisierter (dT)₂o Oligonukleotide

A) Synthese immobilisierten monomeren Deoxythymidins

a) Trägermaterial Controlled Pore Glass (CPG) (Serva, Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland) Aminopropylierung

Die Aminopropylierung des Trägermaterials erfolgte analog der Literaturstelle Matteucci und Caruthers, J. Amer. Chem. Soc 103,3185-3191 (1981).

Ansatz: 5 g CPG 1400 bzw. CPG 3000

2,6 ml 3-Aminopropyl-triethoxysilan 3 ml Trimethylchlorsilan

CPG 1400 bzw. CPG 3000 wird durch Umsetzung mit 3-Aminopropyl-trietho.vysilan in 50ml Toluol funktionalisiert. Die Reaktionsmischung wird 12h bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend 18h unter Rückfluß gekocht. Der Träger wird abgesaugt und dreimal mit je 20ml Toluol, dreimal mit je 20ml Methanol und zweimal mit je 20ml 50%iger wäßriger Methanollösung gewaschen. Das CPG wird dann über Nacht in wäßriger Methanollösung geschüttelt. Die flüssige Phase wird abgetrennt und das CPG zweimal mit je 20 ml Methanol gewaschen. Anschließend wird es zunächst an der Luft, anschließend im Vakuum getrocknet.

Nicht umgesetzte Hydroxylgruppen des Glases werden durch Reaktion mit Trimethylchlorsilan in 10 ml abs. Pyridin blockiert. Die Suspension wird über Nacht geschüttelt, anschließend abgesaugt und das Glas fünfmal mit je 20ml Methanol und dreimal mit je 20ml Diethylether gewaschen. Nach Lufttrocknung erfolgt die vollständige Trocknung des aminopropylierten CPG im Vakuum.

ö'-O-DMTr-S'-O-Succinyl-nucleosid

Analog dem Verfahren von Matteucci undCaruthers, J. Amer. Chem. Soc. 103,3185-3191 (1981) werden 2,5mmol DMTrdT

2,0 mmol (200 mg) Bernsteinsäureanhydrid

300 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP)

5 ml Pyridin, abs.

umgesetzt, 5'-O-DMTr-geschütztes Deoxythymidin wird in Pyridin aufgelöst, zweimal absolutiert und mit DMAP sowie Bernsteinsäureanhydrid versetzt. Der Ansatz wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann dünnschichtchromatographisch geprüft. Bei ausreichendem Umsatzgrad wird das Pyridin entfernt und der Rückstand in 30 ml Dichlormethan aufgelöst. Die Dichlormethanlösung wird gegen eisgekühlte 10%ige wäßrige Zitronensäure ausgeschüttelt und die organische Phase anschließend zweimal mit je 15 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Dichlormethanschicht über Natriumsulfat wird die Lösung am Rotationsverdampfer konzentriert und in 250ml Petrolether ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt und noch zweimal mit je 20ml Petrolether nachgewaschen. Die Ausbeute beträgt 90% der Theorie.

Darstellung des p-Nitrophenylesters

Analog dem Verfahren von Matteucci undCaruthers, J. Amer. Chem. Soc. 103,3185-3191 (1981) werden 1 mmol 3'-O-succinyliertes Nucleosid (wie vorstehend beschrieben hergestellt) 1 mmol (207 mg) Dicyciohexylcarbodiimid (DCC)

1 mmol (140mg)4-Nitrophenol

3 ml Dioxan, abs.

0,2 TiI Pyridin, abs.

umgesetzt. ö'-O-Dimethoxytrityl-S'-O-succinyl-deoxythymidin wird in der pyridinhaltigen Dioxanlösung gelöst und das DCC zugefügt. Aus der anfangs klaren Lösung fällt innerhalb kurzer Zeit Dicyclohexylharnstoff aus. Nach zwei Stunden Reaktio:isdauer wird die Reaktionsmischung dünnschichtchromatographisch geprüft. Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert uo^ iias Filtrat sofort mit dem vorbereiteten Trägermaterial umgesetzt.

L msetzung der Aktivester mit dem aminopropylierten Träger

Analog Ma'.teucci und Caruthers, J. Amer. Chem. Soc. 103,3185-3191 (1981) werden 1 mmol 5'-0-DMTr-3'-O-(4-nitrophenyl)succinyl-deoxythymidin

2,5 g Trägermaterial

8 ml Dimethylformamid, wasserfrei

1 ml Triethylamin, wasserfrei

1 ml Acetanhydrid ι 5 ml Pyridin, wasserfrei

50 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP)

umgesetzt. Aminopropyliertes CPG wird in Dimethylformamid suspendiert. Die Lösung des Nitrophenyl-Aktivesters des Monomeren wird zugesetzt. Triethylamin zugegeben und die Reaktionsmischung vorsichtig goschüttolt. Nach 12 Stunden Reaktionsdauer wird der Träger abgesaugt und mit Dimethylformamid, Methanol und Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen an der Luft wird die Substanz in Vakuum aufbewahrt.

Die Maskierung unumgesetzter Aminogruppen erfolgt durch Umsetzung mit Essigsaureanhydrid in absolutem Pyridin. Als Katalysator wird DMAP zugesetzt. Nach 30 Minuten wird der Träger abgesaugt, mit Methanol gewaschen, an der Luft und im Vakuum getrocknet.

b) Trägermaterialien Cellulose bzw. Sofharose

Beladung der organischen Trägermuterialien mit 3'-O-succinyliertem Nucloosid Analog R. Frank et al., Nucl. Acids Res. 11,4365-4377 (1983) worden

2 g Trägermaterial (Whatman Filterkuchen, Nr.3, Durchmesser 0,9mm bzw. Sephfiroso4BCLin Dioxan) 1 mmol S'-O-succinyliertes Deoxythymidin

2,08 g (7 mmol) MSNT

0,2 ml 1-Methylimidazol

150 ml absolutes Pyridin

50 ml Pyridin

50 ml Chloroform

50 ml Ether

20 ml Acetanhydrid

1 g 4-N,N-Dimethylaniinopyridin (DMAP)

zur Reaktion gebracht.

Das Trägermaterial wird dreimal mit jeweils etwa 20ml absolutem Pyridin versetzt und absolutiert. Dann wird das S'-O-succinylierte Nucleosid, MSNT und 1-Methylimidazol zugegeben und der Ansatz 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die sich während dieser Zeit schwarz verfärbende Reaktionslösung wird in einer Schlenkschen Fritte weitgehend vom Träger abgesaugt und das Trägermaterial mit Pyridin, Chloroform und Ether wieder weiß gewaschen und getrocknet.

Zur Blockierung noch unumgesetzter Hydroxylgruppen wird der Träger mit 40ml einer Mischung aus 80ml Pyridin, 20ml Acetanhydrid und 1 g DMAP zwei Stunden lang geschüttelt. Danach wird das Material erneut mit Pyridin, Chloroform und Ether gewaschen und getrocknet.

c) Bestimmung der Trägerbeladung

Die Monomer-Beladung des Trägers wird durch die spektrophotometrische Quantifizierung der Farbe des Dimethoxytrityl (DMTr)-kations bestimmt: Eine 1 mg Probe wird entnommen, das DMTr-Kation durch Säurebehandlung freigesetzt und die Absorption bei 49Snm bestimmt. Die Desoxyribonucleosid-Beladung wird nach der Formel berechnet:

Ei.oa(nm)x V(ml) χ 14,3

= χ pmol Nucleotid/g Träger

Einwaage (mg)

498 = 7 χ 10⁴cm²mmol"¹

Es werden die folgenden Beladungen ermittelt:

Träger	Monomer	Beladung
		(μίϊΐοΙ/g
CPG 1400	DMTrdT	15,8
CPG 3000	DMTrdT	10,4
Cellulose	DMTrdT	96,2
Sepharose	DMTrdT	91,3

B) Synthese von CPG-IdT₂₀), Cellulose-(dT₂₀) und Sephjrose-(dT₂₀)

a) Synthese von CPG-IdT₂₀)

Jeweils 20-50mg mit dem unter A) hergestellten Deoxythymidin (3'-Terminus) beladenen CPG-Material werden in eine Stahlsäule oder Kartusche gefüllt, die durch ein Einspannsystem befestigt und mit einem SAM !-Synthesizer (Firma Biosearch) verbunden ist.

Reagenzien:

Detritylierung: 3%Trichloressigsäurein Dichlormethan

Kondensation DMTrdTp'" (NR₂, Me) mit R = isopropyl 350 mg Tetrazo! in 10 ml absolutem Acetonitril wasserfreies Acetonitril

Oxidation: 500 mg Jod in 125 ml Tetrahydrofuran, 12,5 ml Wasser und 1 ml Pyridin

Capping: 12,5 ml Acetanhydrid in 12,5 ml TEA, 75 ml Acetonitril und 4 ml 1-Methyiimidazol

Waschschritte: wasserfreies Acetonitril Die einzelnen Schritte eines Zyklus laufen wie folgt ab:

1. Detritylierung:

Die 3%ige Trichloressigsäure in Dichlormethan wird zur Abspaltung der Dimethoxytrityl-Gruppe 2-3 Minuten lang durch • das Trägernu terial gepumpt. Die rotgefärbten Detritylierungslösungen werden in einem rrobensammlnr aufgefangen und können zur Ausbeutebestimmung herangezogen werden.

2. Waschen:

Säurespuren werden durch Waschen mit Acetonitril entfernt.

3. Kondensation:

Von dem aktivierbaren Nucleosid (DMTrdTp'" (NR₂, Me) mix R = isopropyl) wird pro Kondensationszyklus 50 mg in einer Konzentration von 50 mg/ml in einem Vorratsgefäß vorgelegt, aus dem während den Kondensationszyklen vermischt mit der Tetrazol-Lösung das Monomere innerhalb einer Minute durch die Säule gepumpt wird. Anschließend wird das reaktionsfähige Monomere zur Verbesserung der Ausbeute 8 Minuten lang über eine Schleife durch die Säule umgepumpt.

4. Waschen:

Überschüssig eingesetzte Reaktanden werden durch mehrere Minuten dauerndes Waschen mit Acetonitril ausgespült.

5. Oxidation:

Durch zweiminütiges Durchpumpen der Jodlösung durch die Säule wird der dreiwertige Phosphor des Phosphorigsäuretriesters zum fünfwertigen Phosphor aufoxidiert.

6. Waschen:

Das Auswaschen der Oxidationslösung erfolgt wiederum durch Waschen mit Acetonitril.

7. Capping (Maskierung unumgesetzterHydroxylgruppen):

Die Capping-Lösung wird zwei Minuten lang durch das Trägermaterial gepumpt.

8. Waschen:

Die Capping-Lösung wird durch Waschen mit Acetonitril aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Der Ablauf eines Synthesezyklus im SAM-Synthesizer erfordert einen Zeitaufwand von etwa 25 Minuten.

b) Synthese von Cellulose-(dT₂₀) und Sepharose-(dT)₂₀

Bei den Cellulose- und Sepharose-Materialien wurden die unter a) genannten Waschschritte auf etwa die doppelte Zeit verlängert (von üblicherweise zwischen 2 und 3 Minuten auf etwa 5 Minuten). Nach der Detritylierung war die Einführung eines zusätzlichen Waschschrittes mit Dichlormethan vor dem Waschen mit Acetonitril erforderlich, um alle noch im Trägermaterial befindlichen Säurespuren vollständig entfernen zu können. (2 Minuten Waschen mit Dichlormethan).

c) Beladungsdichte

Die Herstellung von (dT₂₀)-Oligonukleotiden an den verschiedenen Trägermaterialien im SAM I-Synthesegerät ergab folgende Beladungen:

Träger Endbeladung

CPG1400 11,7Mmo!/g

CPG 3000 7,8Mmol/g

Cellulose-F. P. 25,4Mmol/g

Sepharose CL 30,7Mmol/g

Nach Abspaltung der Srhutzgruppen (DMTr und Methoxy) verblieb das Oligonucleotid an der festen Phase und wurde nach Entfernung von Reagenzien und organischen Lösungsmitteln bis zur Verwendung für enzymatische Umsetzungen getrocknet und im Kühlschrank aufbewahrt, d) Schutzgruppenabspaltung

Abspaltung der DMTr-Schutzgruppe:

Während einer Synthese wird die DMTr-Gruppe mit 2% Trichloressigsäure in Methylsnchlorid während 2 min bzw. 3% Dichloressigsäure ir· Methylenchlorid innerhalb 3min abgespalten. Soll das Produkt ohne Affinitätschromatographie aufgereinigt werden, so erfolgt die sofortige Detritylierung des Oligonucleotids noch im Synthesoapparat. Nach einer

affinitätschromatographischen Aufreinigung erfolgt die Aufreinigung erfolgt die Abspaltung der DMTr-Schut;gruppe vom Oligonucleotid durch eine 30minütige Behandlung mit 80%iger Essigsäure. Nach erfolgter Lyophilisation wird zweimal Wasser zugegeben und erneut lyophilisiert. Die DMTr-Gruppe wird dann mit Ether extrahiert und das Produkt eingedampft.

Abspaltung der Methoxy-Gruppe am Phosphat

Die Abspaltung der Methoxygruppe erfolgt durch Behandlung des Trägers mit einer frisch bereitoten Lösung aus Thiophenol:TEA:Dioxan = 1:2:2 über einen Zeitraum von 45min. Die flüssige Phase wird anschließend abgetrennt und der Träger dreimal mit 1 ml Methanol und dreimal mit 1 ml Diethylether gewaschen.

Statt der chemischen Synthese von trägergebundenem Oligothymidylat ist auch die Synthese von trägergebundenen Oligonucleotiden mit gemischter Basenzusammensetzung möglich.

Beispiel 2

Enzymatische 5'-Phosphorylierung eines immobilisierten (dT)₂o Oligonucleotids Zu 100ug CPG3000-(dT_2O) aus Beispiel 1 (etwa 500pmol-1 nmol 5'-OH-Enden) wird 1 μΙ Kinase-Puffer (40OmM Tris-SalzsäureputferpH 7,6,10OmM Magnesiumchlorid, 1OmM DTT, 50% Glycerin), 1 μΙ γ-^3?ρ-ΑΤΡ sowie 1 μΙ einer ΊΟΟμΜ kaiton ATP-Lösung, 1 μΙ T4-Polynukleotid-Kinase zugefügt und mit bidestilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10μΙ aufgefüllt. Die Reaktionsmischung wird 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Zur quantitativen Phosphorylierung der freien 5'-Hydroxy!gruppen wird anschließend 1 μ11 mM ATP zugegeben und weitere 15 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen. Die Beendigung der Reaktion erfolgt durch Zugabe von 1μΙ 25OmM ^P.DTA-Lösung/10pl Reaktionslösung Reaktionsansatz:

Stammlösung	Reagenz	Endkonzentration
	CPG 3000
	y-³²p-ATP	0,1 μΜ
4OdYnM	Tris.HCIpH7,6	4OmM
10OmM	Magnesiumchlorid	1OmM
1OmM	DTr	1mM
50%	Glycerin	5%
4μ/μΙ	T4-PN-Kinase	400μ/πιΙ
10μΙ	Gesamtvolumen

Der Träger wird anschließend zur Entfernung ungebundener Reaktanden und Puffer fünfmal mit jeweils 500μΙ 0,1 M Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung gewaschen. Die Effizienz der Waschungen wird durch Cerenkov-Messung überprüft. Die am Träger verbleibende Restaktivitätsmenge liegt bei diesem Verfahren zwischen 8 x 10⁵ und 2,4 x 10^ecpm. ³²P zerfällt mit einer Halbwertszeit von 14 Tagen. D jrch die Cerenkov-Messung werden die Zerfälle pro Minute (counts per minute, cpm) ermittelt. Dies erfolgt in einem normalen Szintillationszähler. Die Radioaktivitätsmenge zwischen 8 χ 10⁵ und 2,4 χ 10⁶cmp läßt einen Schluß auf die Menge des eingebauten radioaktiven Phosphats im am Trägermaterial immobilisierten Oligonucleotid zu. Da anschließend durch Zugabe von „kaltem" ATP vollständig phosphoryliert wird, macht die Radioaktivitätsmenge eine Auss; ie darüber, ob die Kinase-Reaktion überhaupt stattgefunden hat, oder sei es durch irgendwelche Kontaminationen im Träger oder durch Salze bzw. Unreinheiten des Oligonucleotids inhibiert war. Höhere Radioaktivitätsmengen sind günstig, da das Oligonucleotid über einen längeren Zeitraum sichtbar gemacht werden kann. Die Kinasierung des Träger-Oligonucleotids ist Voraussetzung für alle übrigen enzymkatalysierten Umsetzungen. Beim Einsatz größerer Trägermengen (500μg-1 mg) wird in einem Gesamtvolumen von 40μΙ gearbeitet, die anfängliche ATP-Konzentration liegt bei 100μΜ, nach 15 Minuten wird 1μΙ einer 1OmM ATP-Lösung zugesetzt. Reaktijnstemperaturund -dauer bleiben gleich.

Statt CPG-gebundenen Oligothymidylats sind auch an CPG 3000 gobundene Oligonucleotide mit gemischter Basenzusammunsetzung enzymatisch phosphorylierbar.

Beispiel 3

Enzymatische Verknüpfung von immobilisierten DNA-Fragmenten mit DNA-Ligase Das kovalent an CPG 3000 gebundenes, 5'-terminal phosphorylierte Oligothymidylat aus Beispiel 2 wird zunächst in 15 μΙ Wasser υηα2μΙ DNA-Ligase-Puffer (760mm tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,6,10mm Magnesiumchlorid, 1 mm ATP) mit Oligoadenylat und einem weiteren nicht immobilisierten Oligonucleotid, welches als 3'-Ende ein Oligothymidylat besitzt, durch dreiminütiges Aufheizen auf 100⁰C und anschließendes, langsames Abkühlen auf Raumtemperatur hybridisiert. 1μ11 mM ATP und 2μΙ DNA-Ligase werden zugegeben und das Reaktionsgemisch 2-24 Stunden bei 20°C inkubiert. Reaktionsansatz:

Stammlösung	Reagenz	Endkonzentration
	CPG 3000-
	IdT)₂₀P
	OligoA
	OligoT
1,5mM	ATP	150μΜ
1OmM	Magnesiumchlorid	ImM
76OmM	Tris.HCI,pH7,6	76mM
6μ/μΙ	DNA-Ligase	600μ/ΓηΙ
20 μΙ	Gesamtvolumen

Zur Bestimmung der Ausbeuten wird eine Probe entnommen (2μΙ Suspension), durch 30minütige Ammoniak-Behandlung vom Trüijer abgespalten und lyophilisiert. Anschließende Gelelektrophorese an einem 10-20%, denaturierenden Polyacrylamidgel, 0,4mm, sowie Ausschneiden der Edukt- und Produktbanden nach der Anfertigung des Autoradiogromms und Gelelution mit 0,5M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA wird durch CerenkovVergleichsmessung der Umsaizgrad errr.ttelt.

Tabelle: DNA-Ligase-Reaktionen:

CPG 3000-	OligoA	OligoT	Ausbeute an
IdT)₂₀-			Ligierungs-
Phosphat			produkt
	IdA)₂₀	IdT)₁₀
1 mg	1 nmol	1,1 nmol	47%
	(dA),₂_,₈	IdT)₁₀
1mg	0,8 nmol	1,1 nmol	47%
	P IdA)₂₅-W	IdT)₁₀
500 pg	2,3 nmol	5,5 nmol	69%
	IdA)₂₀	IdCTAGGT₁₀)
100Mg	1 nmol	1 nmol	95%

Statt CPG gebundenen 5'-terminal phosphorylierten Oligothymidylats können auch an CPG 3000 gebundene 5'-termina! phosphorylierte Oligonucieotide mit gemischter Basenzusammensetzung mittels DNA-Ligase mit passenden Oligonucleotiden verknüpft werden.

Beispiel 4

Enzymatische Verknüpfung von immobilisierten DNA-Fragmenten und Desoxyoligonucleotiden mit ribo-Terminus mit RNA-Ligase

Alle Puffer und Lösungen die eingesetzt werden, werden zunächst autoklf.viert oder steril filtriert.

Zu 100 Mg immobilisiertem 5'-tern'inal phosphorylierten Eicosathymidylat aus Beispiel 2 wird Desoxyoligonucleotid mit 3'-R:bo-Terminus gegeben ur.d lyophiliaiert. Anschließend werden 15μΙ 100μΜ ATP-Lösung,4Ml 1OmM Spermin, 4μΙ 10OmM Magnesiumchlorid:osung und 4μΙ 10OmM DTT-Lösung dazugegeben und lyophilisiert. 2μΙ 50OmM HEPES und 3μΙ DMSO werden zugefügt, kurz geschüttelt und dann mit 10μΙ 40%iger Polyethylenglykol-Lösung sowie mit 5μΙ RNA-Ligase aufgefüllt.

Die Reaktionsmischung wird 48 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Reaktionsansatz:

Stammlösung	Reagenz	Endkonzentration	Ausbeute
	Träger-(dT)₂₀p
	Oligonucleotid-rA		55%
100μΜ	AtP	75 μΜ	70%
1OmM	Spermin	2mM	63%
10OmM	Magnesiumchlorid	2OmM	66%
10OmM	DTT	2OmM	82%
50OmM	HEPES-Puffer,pH7	,5 5OmM	80%
100%	DMSO	15%	66%
40%	Polyethylenglykol	20%	30%
	(MW 6000)		40%
11 mg/ml	RNA-Ligase	28pg/Ml	46%
20 μΙ	Gesamtvolumen
Durchgeführte	Umsetzungen:
Ansatz	gelöstes	Menge
	Oligonucleotid
1	d(T₇A₂)rA	1 nmol
2	d(T₇A₂)rA	2 nmol
3	d(T₇A₂)rA	4 nmol
4	d(T₇A₂)rA	4 nmol
5	d(T₇A₂)'A	5 nmol
6	d(GATCCA)rA	5nmol
7	d(GATCCA)A	2 nmol
8	dlNWA	500pmol
9	dlNWA	500pmol
10	dlNUrA	700pmol

Nach erfolgter Umsetzung wird der Träger dreimal mit jeweils 500μΙ TE (1OmM Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,6,2,5mM EDTA) gewaschen, eine Probe entnommen, mittels Ammoniakbehandlung vom Träger abgespalten und gelelektrophoretisch an einem 10-20%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Analog zum Verfahren bei den DNA-Ligasereaktionen aus Beispiel 3 werden die Ausbeuten nach der Gelelutiop. durch Cerenkov-Vergleichsmessungen bestimmt.

Wenn nach der ersten RNA-Ligasereaktion weitere RNA-Ligase-Reaktionen durchgeführt werden sollen, muß zunächst eine quantitative Phosphorylierung der DNA-Termini mit Hydroxylenden erfolgen. Hierfür muß der Träger zur Entfernung von Reagenzien aus der RNA-Ligasereaktion phenolisiert werden:

- Zugabe von 500μΙ Phenol, 30 Sekunden mixen, 1 Minute zentrifugieren, Phenolphase abnehmen;

- Zugabe von 500μΙ Phenol: Chloroform = 1:1,30 Sekunden mixen, 1 Minute zentrifugieren, organische Phase abnehmen;

- Zugabe von 500μΙ Isoamylalkohol: Chloroform = 1:25,30 Sekunden mixen, 1 Minute zentrifugieren, organische Phase abnehmen, kurz evaporieren.

Durch eine anschließende erneute Durchführung der Phosphorylierungsreaktion mit T4-Polynucleotid-Kinase liegt die Radioaktivität des Trägers wieder auf 1-2 χ 10⁶cpm und die 5'-Termini sind phosphoryliert. Eine weitere, im Anschluß durchgeführte Einzelstrangverknüpfung mit RNA-Ligase gibt am Beispiel der Trägerprobe 10, welche als immobilisierte Oligomere die Oligonucleotide IdT)₂₀P und dT₂₀(dN)4jAp enthält, folgende Umsetzungen:

Träger gelöstes Produkt Nebenprodukt

Oligonukleotid Ausbeute Ausbeute

CPG-T₂₀rAd|N)₄₈p d(N)₃₂rA CPG-UT₂OrAd(NWAd(N)₃₂ CPG-dT_2OrAd(N)₃₂

19% 11% Abkürzungen:

d(N)₄₈rA = 5' CGCCATCATCAAGAACGCCTACAAGAAGGGCGAGTGATAACTGCAGCArA

d(N)₃₂rA = 5' GAG CCA GAC GCC CCT GGT GAC GCT GTT CAA AA rA

Beispiel 5

Replikation eines immobilisierten Oligonucleotids mit Hilfe von DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) Das universell einsetzbare Starteligonucleotid (dA)_1(M8wird in 16μΙ bidestilliertem Wasser und 3μΙ Nicktranslation-Puffer (BOOmMTris-Salzsäure-Puffer, pH7,2,10OmM Magnesiumsulfat, 1 mm DTT, 500pg/ml BSA) mit dem immobilisierten Eicosathymidylat aus Beispiel 1 hybridisiert. Dazu heizt man 3 Minuten auf 100⁰C auf und läßt dann vorsichtig auf Raumtemperatur abkühlen. Nach Zugabe von 5μΙ 1OmM Desoxynucleosidtriphosphat (enthält jeweils 2,5mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP) und 3pla-³²p-dATP sowie 3μΙ des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase wird die Replikation des am Träger immobilisierten Oligonucleotids eingeleitet.

Reaktionsansatz:

Stammlösung	Reagenz	Endkonzentration
	Träger-(dT)₂₀-Oligo.
	OligoA
2μΜ	Q³VdATP	0,2μΜ
1OmM	dNTP	1,6μΜ
50OmM	Tris.HCIoH7,2	5OmM
10OmM	Magnesiumsulfat	1OmM
1mM	DTT	0,1mM
500μg/ml	BSA	50μg/ml
30 μΙ	Gesamtvolumen

Durchgeführte Umsetzungen:

a) 200pmol (dA),₆ werden in Gegenwart von 2 μ KlenowPolymerasenach Hybridisierung an CPG 3000-dT J₀-TAIdA₃T₇) aus Beispiel 4 verlängert. Bestimmung des Erfolgs der Umsetzung durch Cerenkov-Vergleichsmessung nach fünfma'igem Waschen mit jeweils 500μΙ TE (1OmM Tris-HCI-Puffer, 0,2 5mM EDTA, pH8,0):

cpm Träger vor der Replikation: 41400

cpm Träger nach der Repükation: 243850

cpm Träger nach Denaturierung: 52570

cpm Überstand nach Denaturierung: 184330

b) Etwa 1 nmol des Oligoadenosin-Produkis aus dem Überstand nach Denaturierung aus Beispiel 5a) (0,250. D.) als Oligonucleotidprimer und 15μ Klenow-Polymerase werden analog Beispiel 5a) eingesetzt.

Ermittlung des Erfolgs der Replikation duich Gelelektrophorese. Es werden zwei Proben A und B aufgetragen..

Bahn A): Banden nach Ammoniak-Behandlung einer Trägerprobe

Ergebnis: homologe Reihe ab etwa 14 mer bis 30 mer, 20 mer und 30 mer zeigen stärkers Bande Bahn B): Banden nach Trägerdenaturierung (nur Überstand)

Ergebnis: ho'nologe Reihe ab etwa 14merbis30mer

Beispiel 6

Einsatz von Restriktionsenzymen zum Abschneiden eines Oligonucleotid-Doppelstranges vom Träger Eingesetzt wird CPG3OOO-dT_2O-rA(dA₂T7) nach erfolgter Klenow-Reaktion aus Beispiel 5 Der Ansatz wird in einem Gesamtvolumen von 20 μΙ durchgeführt. Eine etwa 25 μg Trägerprobe (ein Viertel des Ansatzes aus der DNA-Polymerase-Reaktion) aus Beispiel 5 wird mit 16μΙ Wasser versetzt, 2 μΙ Low-salt-restriktionsendonuclease-Puffer (1OmM Tris-Salzsäure-Puffer,pH7,5,1OmM Magnesiumchlorid, 1 mm DTT) υηα2μΙ EcoRI zugegeben. Der Ansatz wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Stammlösung	Reagenz	Endkonzantration
	CPG 3000-
	(dT)₂₀-Oligo.
1OmM	Trie. Cl pH 7,5	1mM
1OmM	MgCI₂	1mM
1mM	DTT	OJmM
20 μΙ	Gesamtvolumen

Das Ergebnis der Spaltung wird nach Abspaltung der Proben vom Träger und deren Kinasierung durch Gelelektrophorese geprüft, wobei die Probe zunächst geteilt wird. Teil 1 wird hitzedenaturiert, Teil 2 wird sofort durch Ammoniakbehandlung abgespalten (enthält die immobilisierten sowie die durch Hybridisierung gebundenen Sequenzen). Die abgespalteten Oligonucleotide werden über eine Sephadex G 50-Säule (Pasteurpipette) mit bidestilliertem H₂O, pH 8, als Elutionsmittel entsalzt. Die im Totvolumen eluierten Proben werden lyophilisiert und nach der für Oligonucleotide in Lösung angegebenen Methode phosphoryliert. Zur Überprüfung des Ergebnisses der Spaltung wird ein Polyacrylamidgel eingesetzt. Man erhält Produkte, die alle kürzer als das eingesetzte 30mer sind. Es wird keine Inhibierung des Restriktionsenzyms beobachtet.

Beispiel 7

Anligieren eines DNA-Fragmentes mit Hilfe von DNA-Ligase an ein an einen quellfähigen Träger gebundenes Oligonukleotid Reaktionsansatze:

Träger/Menge	OligoA	dT₁₀	Ausbeute	IdT)₃₀
			Ligierungsprodukt ges.
CFG 3000	p(dA)₂₆_3o
500 μg	2,3nmol	5,5nmol	69%	51%
Cellulose Fp	p(dA)_2W0
1mg	2,3nmol	5,5nmol	68%	43%
SepharoseCL4B	p(dA)₂₅_3o
1mg	2,3nmol	5,5nmol	65%	41%

Die angegebenen Ausbeuten sind bezogen auf den Umsatz des radioaktiv markierten Oligonucleotids am Träger.

Alle drei verwendeten Trägermaterialien waren bei der Kinasierung mit T4-PN-Kinase und der DNA-Ligasereaktion vergleichbar.

Die beiden quellfähigen Träger waren jedoch sehr viel schwieriger von eingesetzten Reaktanden (deutlich sichtbar beim Auswaschen des eingesetzten radioaktiv markierten ATP) zu befreien. Selbst nach ausführlichen Waschschritten waren bei der Gelelektrophorese noch Anteile nicht kovalent gebundenen radioaktiven Phosphats vorhanden.

Bei der DNA-Ligasereaktion waren die Ausbeuten bei allen drei Trägern vergleichbar. Aufgrund der besseren chemischen Synthese an CPG 3000 ist jedoch die Ausbeute am gewünschten Lig jtionsprodukt IdT)₃₀ bei CPG 3000 eindeutig besser.

Cellulose Filterplättchen weisen bei der chemischen Synthese das Problem auf, daß durch Entstehen neuer Hydroxylgruppen durch die mechanische Beanspruchung des Trägermaterials Sequenzen kürzerer Kettenlänge gebildet werden. Dies ist beobachtbar durch Zunahme der Tritylfarbe.

Am problematischsten ist eine chemische Synthese bei Sepharose CL. Da der Träger äußerst quellfähig ist, müssen Waschschritie zwischen den Reaktionsschritten über einen bedeutend längeren Zeitraum durchgeführt werden. Die Automatisierung der Synthese ist nur sehr schwierig durchführbar: Aufserdem ist wie bei Cellulose eine Zunahme der Tritylfarbe beobachtbar, so daß auch hier eine homologe Produktreihe, wenngleich mit deutlich stärker auftretendem Endprodukt entsteht.

Claims

1. Träger zur enzymatischen oder chemischen und enzymatischen Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an einer festen Phase,bestehend aus einem unlöslichen, nicht quellbaren, porösen Polymeren an das ein oder mehrere eventuell mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehene Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente fixiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren des Polymeren im wesentlichen eine definierte Größe zwischen 1400 und 10000Ä besitzen.

2. Träger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer im wesentlichen aus Silicium- und Sauerstoffatomen aufgebaut ist.

3. Träger gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Glas mit einer definierten Porengröße zwischen mehr als 2 500 und 5000Ä ist.

4. Träger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eventuell mit Schutzgruppen versehene Nukleinsäurefragmente kovalent an das Polymere fixiert sind.

5. Träger gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daßjeventuell mit Schutzgruppen versehene Nukleinsäurefragmente über Aminopropylsilyl-Spacer (-Si-(CH₂)3-NH-) an das Polymer fixiert sind.

6. Verfahren zur enzymatischen oder chemischen und enzymatischen Festphasensynthese von Nukleinsäuren, wobei eventuell mit Schutzgruppen versehene Nukleinsäurefragmente an ein unlösliches, nicht quellbares, poröses Polymerfixiert, die immobilisierten Nukleinsäurefragmente •durch weitere Nukleinsäurefragmente vergrößert und fertige Nukleinsäuren abschließend gegebenenfalls vom unlöslichen Polymer abgelöst werden, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein solches eingesetzt wird, dessen Poren im wesentlichen eine definierte Größe zwischen 1400 und 10000Ä besitzen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Glas einer definierten Porengröße zwischen mehr als 2500 und 5000Ä ist.

8. Verwendung eines unlöslichen, nicht quellbaren, porösen Polymeren, dessen Poren im wesentlichen eine definierte Größe zwischen 1400 und 10000Ä besitzen, als Trägermaterial für die enzymatische oder chemische und enzymatische Umsetzung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmenten an fester Phase.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere im wesentlichen aus Silicium und Sauerstoffatomen aufgebaut ist und Poren einer im wesentlichen definierten Größe zwischen mehr als 2500 und 5000Ä besitzt.

10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere Glas einer kontrollierten Porengröße von etwa 3000Ä ist.