DD277087A1 - METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA - Google Patents
METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA Download PDFInfo
- Publication number
- DD277087A1 DD277087A1 DD32197888A DD32197888A DD277087A1 DD 277087 A1 DD277087 A1 DD 277087A1 DD 32197888 A DD32197888 A DD 32197888A DD 32197888 A DD32197888 A DD 32197888A DD 277087 A1 DD277087 A1 DD 277087A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- alpha
- monoclonal antibodies
- hybridoma
- zimet
- mice
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neutralisierender monoklonaler Antikoerper, die zur Reaktion mit humanem Interferon-alpha (HuIFN-alpha) befaehigt sind. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern zur Neutralisation der biologischen Wirkung von HuIFN-alpha. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man nach intralienaler Immunisierung von BALB/c-Maeusen mit nativem HuIFN-alpha deren Milzzellen mit Plasmozytomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 fusioniert, Hybridome, die neutralisierende Antikoerper bilden, selektiert und durch Klonierung und mehrfache Reklonierung der Hybridomzellen mittels Mikromanipulation eine stabile Hybridomlinie etabliert, die in ueblicher Weise weiter vermehrt wird. Nach dem erfindungsgemaessen Verfahren werden durch Kultivierung von Hybridomzellen der Linien H/B71C6 und H/B71E3 die neutralisierenden neuen monoklonalen Antikoerper ZIMET B71C6 bzw. ZIMET B71E3 gewonnen. Die neuen Hybridomzellinien H/B71C6 und H/B71E3 wurden unter den Nummern ZIM-0283 bzw. ZIM-0284 in der Hinterlegungsstelle fuer Zellinien im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der AdW der DDR hinterlegt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Humanmedizin, Biologie, Veterinaermedizin und die Biotechnologie.The invention relates to a method for obtaining neutralizing monoclonal antibodies which are capable of reacting with human interferon-alpha (HuIFN-alpha). The aim of the invention is the production of monoclonal antibodies to neutralize the biological activity of HuIFN-alpha. The method according to the invention is characterized in that, following intralesional immunization of BALB / c mice with native HuIFN-alpha, their spleen cells are fused with plasmocytoma cells of the line P3-X63-Ag8.653, hybridomas which form neutralizing antibodies are selected and by cloning and Multiple recloning of the hybridoma cells by means of micromanipulation establishes a stable hybridoma, which is further increased in the usual way. According to the process of the invention, the neutralizing new monoclonal antibodies ZIMET B71C6 or ZIMET B71E3 are obtained by culturing hybridoma cells of the lines H / B71C6 and H / B71E3. The new hybridoma cell lines H / B71C6 and H / B71E3 were deposited under the numbers ZIM-0283 and ZIM-0284 respectively in the depository for cell lines in the Central Institute for Molecular Biology of the AdW of the GDR. Areas of application of the invention are human medicine, biology, veterinary medicine and biotechnology.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha (HulFN-alpha). Diese Antikörper können zur Neutralisation der biologischen Wirkung von HulFN-alpha in Biologie und Medizin, zur immunchemischen Bestimmung von nativem HulFN-alpha sowie zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung von HulFN-alpha in der Biotechnologie eingesetzt werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die biologische und medizinische Forschung, die klinische Diagnostik und die Biotechnologie.The invention relates to a method for obtaining neutralizing monoclonal antibodies against human interferon-alpha (HulFN-alpha). These antibodies can be used to neutralize the biological activity of HulFN-alpha in biology and medicine, for immunochemical determination of native HulFN-alpha, and for immunoaffinity-chromatographic enrichment of HulFN-alpha in biotechnology. Areas of application of the invention are biological and medical research, clinical diagnostics and biotechnology.
Monoklonal Antikörper gegen HulFN-alpha sind seit 1980 bekannt (SECHER, D. S., und D. C. BURKE, Nature 285,446-450,1980; STAEHELIN.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA78,1848-1852,1981; IMAI, M. et al., J. Immunol. 128,2824-2825,1982; BERG, K., J.Interferon Res. 4,481-491,1984; NOVAK, M., et al., Acta Virol. 30,228-233,1986). Die Neutralisation von HulFN-alpha durch konventionelle und monoklonale Antikörper wurde von KAWADE und WATANABE untersucht (KAWADE. Y, und Y. WATANABE, Immunology 56,489-495,1985).Monoclonal antibodies to HulFN-alpha have been known since 1980 (SECHER, DS, and DC BURKE, Nature 285, 446-450, 1980; STAEHELIN T. et al., Proc. Natl. Acad., USA 78, 128-1852, 1981; IMAI, M. et al., J. Immunol., 128, 2824-2825, 1982; BERG, K., J. Interferon Res., 4, 481-491, 1984; NOVAK, M., et al., Acta Virol. 233.1986). Neutralization of HulFN-alpha by conventional and monoclonal antibodies was investigated by KAWADE and WATANABE (KAWADE.Y, and Y. WATANABE, Immunology, 56, 69-495, 1985).
In der DDR sind die Schutzrechte WP 231007 und WP 254593 bekannt, welche die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen HulFN-alpha betreffen. Die darin beschriebenen Antikörper haben den Nachteil, daß sie die biologische Aktivität des HulFN-alpha nicht odar nicht wesentlich hemmen. Diese Antikörper binden Teilstrukturen des HulFN-alpha-Moleküls, die für seine biologische Wirkung und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren nicht essentiell sind. Daraus ergibt sich als weiterer Nachteil, daß die Bindung dieser Antikörper an das HilFN-alpha die native Struktur von Molekülbereichen nicht voraussetzt, die für die biologische Aktivität des HulFN-alpha und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren essentiell sind.In the GDR, the protective rights WP 231007 and WP 254593 are known, which relate to the production of monoclonal antibodies against HulFN-alpha. The antibodies described therein have the disadvantage that they do not significantly inhibit the biological activity of HulFN-alpha. These antibodies bind partial structures of the HulFN-alpha molecule, which are not essential for its biological activity and in particular its binding to interferon receptors. This results in a further disadvantage that the binding of these antibodies to the HilFN-alpha does not require the native structure of molecular regions essential for the biological activity of HulFN-alpha and in particular its binding to interferon receptors.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen HulFn-alpha zu gewinnen, welche die biologische Wirkung des HulFN-alpha noutralisioron.The aim of the invention is to obtain monoclonal antibodies against HulFn-alpha which express the biological activity of HulFN-alpha noutralisioron.
Dor Erfindung liogt dio Aufgabe zugrunde, ein hinreichend einfaches und zuverlässig handhabbares Verfahren zur Gewinnung von noutralisiorondsn monoklonalen Antikörpern gegen HulFN-alpha anzugeben, die zur immunchemischen Bestimmung und immunaffinitätschromatographischen Anreicherung dos nativen HulFN-aipM einsotzbar sein sollen.It is the object of the present invention to provide a sufficiently simple and reliably manageable method for obtaining noutralisiorondsn monoclonal antibodies against HulFN-alpha, which should be capable of being segregated for immunochemical determination and immunoaffinity chromatographic enrichment of the native HulFN-aipM.
Erfindungsgemäß wird clioso Aufgabo wie folgt golöst:According to the invention, clioso feed is toasted as follows:
BALB/c-lnzuchimäuse werden mit nativem HulFN-alpha mehrmals intralienal immunisiert, ihre Milzzellen in bekannter Weise mit murinen Plasmozytomzellon dor Linie P3-X63-Ag 8.653 in vitro fusioniert, die daraus entstandenen Hybridzellklone durchBALB / c incubates are immunized several times intrinsically with native HulFN-alpha, their spleen cells fused in known manner with murine Plasmozytomzellon dor line P3-X63-Ag 8.653 in vitro, the resulting hybrid cell clones by
Kultivierung in einem Hypoxanthin-Azaserin-Medium seloktoniert und ihrer Kulturüberstände mit Hilfe eines biologischen Neutralisationstestes in an sich bekannter Weise auf HulFN-alpha-neutralisierende Wirkung getestet. Die Hybridomzellklone, die neutralisierende Antikörper bilden, werden verfahrensgemäß mit Hilfe einer speziellen Mikromanipulationsvorrichtungkloniert und mehrfach rekloniert. Die Hybridomzellen der nach diesem Verfahren neu etablierten Linien H/B71 C6 und H/B71 E 3 werden in vitro oder nach intraperitonealer Inokulation in Paraffinum perliquidumstimulierte Mäuse in Aszitesform in vivo vermehrt. Die Gewinnung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper erfolgt aus Kulturüberstän Jen der H/B71 C6- bzw. H/B71 E3-Zellen oder aus der Aszitesflüssigkeit Hybridom-tragender BALB/c-Mäuse bzw. vorzugsweise (BALB/c χ NMRI)F1- oder (NMRI χ BALB/c)FrHybridmäuse nach gebräuchlichen isolierungwerfahren.Cultivation in a hypoxanthine-azaserine medium seloktoniert and tested their culture supernatants by means of a biological neutralization test in a conventional manner for HulFN-alpha neutralizing activity. The hybridoma cell clones that form neutralizing antibodies are cloned according to the method using a special micromanipulation device and recloned several times. The hybridoma cells of the newly established by this method lines H / B71 C6 and H / B71 E 3 are propagated in vitro or after intraperitoneal inoculation in Paraffinum perliquidumstimulierte mice in ascites form in vivo. The neutralizing monoclonal antibodies are obtained from culture supernatants of the H / B71 C6 or H / B71 E3 cells or from the ascitic fluid of hybridoma-carrying BALB / c mice or preferably (BALB / c χNMRI) F 1 - or (NMRI χ BALB / c) F r hybrid mice by conventional isolierungwerfahren.
Die Lagerung von Konserven der Hybridomzellinien H/B71 C6 bzw. H/B71 E3 erfolgt in flüssigem Stickstoff. Din HybridomzellinienH/B71 C6undH/B71 E 3 wurden unter den Nummern ZIM-0283 bzw. ZIM-0284 in dsr Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR-1115 Berlin, Robert-Rössle-Str. 10, hinterlegt.The storage of canned hybridoma cell lines H / B71 C6 or H / B71 E3 takes place in liquid nitrogen. Din hybridoma cell lines H / B71 C6 and H / B71 E 3 were assigned under numbers ZIM-0283 and ZIM-0284 respectively in the cell site storage facility of the Central Institute for Molecular Biology of the GDR Academy of Sciences, GDR-1115 Berlin, Robert-Rössle-Str. 10, deposited.
Die verfahrensgemäß gewonnenen neutralisierenden Antikörper ZIMcT B71 C6 und ZIMET B71 E3 haben gegenüber anderen monoklonalen Antikörpern den Vorteil, daß sie die biologische Wirkung von HulFN-alpha aufheben und bevorzugt natives HulFN-alpha binden. Sie erlauben infolge ihrer differenzierten Spezifität ei.ie Unterscheidung der biologischen Wirkung von HulFN-alpha 1 und HulFN-alpha 2.The neutralizing antibodies ZIMcT B71 C6 and ZIMET B71 E3 obtained according to the method have the advantage over other monoclonal antibodies that they abrogate the biological activity of HulFN-alpha and preferentially bind native HulFN-alpha. Due to their differentiated specificity they allow a distinction to be made between the biological activity of HulFN-alpha 1 and HulFN-alpha 2.
Ausführungsbeispielembodiment
Die Gewinnung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper erfolgt in den folgenden Arbeitsschritten:The recovery of the neutralizing monoclonal antibodies takes place in the following steps:
- Weibliche Mäuse des Stammes BALB/c werden in mehrwöchigen Abständen mit jeweils 107I. U. HulFN-alpha immunisiert. Drei Tage nach der letzten intralienalen Antigeninjektion erfolgt die Fusion der Milzzellen mit murinen Plasmozytomzellen der Linie P3-X63-Ag 8.653 nach bekannten Verfahren.- Female mice of the strain BALB / c are immunized at intervals of several weeks with each 10 7 IU HulFN-alpha. Three days after the last intralesional antigen injection, the fusion of the spleen cells with murine plasmacytoma cells of the line P3-X63-Ag 8.653 is carried out according to known methods.
- Die in einem Hyproxanthin-Azaserin-Selektionsmedium wachsenden Hybridomzellklone werden nacheinander mittels ELISA auf Produktion von murinem Immunglobulin und mittels eines zweiten ELISA auf Freisetzung von HulFN-alpha-spezifischen Antikörpern untersucht. Die neutralisierende Wirkung der monoklonalen Antikörper wird im Virus-Wirts-System Vcsicularstomat'tisviius/Madin Darby bovine Nierenzellen (MDBK) geprüft. Es werden Antikörperverdünnungsreihen mit Faktor 2 hergestellt und mit verschiedenen Interferonkonzentrationen (500,250,125 usw. bis 0,5!E/ml) 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Reduktion der IFN-Wirkung durch Bestimmung der noch vorhandenen 50%igen Hemmung der viralen Zellzerstörung im Mikrotitertest ermittelt.Hybridoma cell clones growing in a hyproxanthin-azaserine selection medium are sequentially assayed for murine immunoglobulin production by ELISA and for release of HulFN-alpha specific antibodies by a second ELISA. The neutralizing effect of the monoclonal antibodies is tested in the virus-host system Vcsicularstomat'tisviius / Madin Darby bovine kidney cells (MDBK). Antibody dilution series with factor 2 are prepared and incubated with different concentrations of interferon (500, 250, 125, etc. to 0.5 IU / ml) for 2 hours at 37 ° C. Subsequently, the reduction of the IFN effect is determined by determining the remaining 50% inhibition of viral cell destruction in a microtiter test.
- Hybridomzellklone, die neutralisierende monoklonal Antikörper mit Spezifität für HulFN-alpha freisetzen, werden mit Hilfe einer speziellen Mikromanipulationsvorrichtung kloniert und bis zur Etablierung einer stabilen Hybridomzellinie mehrfach rekloniert.- Hybridoma cell clones releasing neutralizing monoclonal antibodies with specificity for HulFN-alpha are cloned using a special micromanipulation device and recloned several times until a stable hybridoma cell line is established.
- Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper ZIMET B71C6 bzw. ZIMET B71 E 3 werden Hybridomzellen der neuen Linien H/B71C6bzw. H/B71E 3 entweder in vitro oder in Aszitesform in geeigneten Mäusen, vorzugsweise (NMRI χ BALB/c)F|-oder (BALB/c χ NMRIJFi-Hybridmäusen, vermehrt. Die neutralisierenden monoklonalen Antikörper werden aus dem Kulturüberstand bzw. aus der Aszitesflüssigkeit nach üblichen Methoden angereichert und gereinigt.- To obtain the monoclonal antibody ZIMET B71C6 or ZIMET B71 E 3 hybridoma cells of the new lines H / B71C6bzw. H / B71E 3 either in vitro or in ascites form in suitable mice, preferably (NMRI χ BALB / c) F-or (BALB / c χ NMRIJFi hybrid mice) .The neutralizing monoclonal antibodies are obtained from the culture supernatant or from the ascitic fluid, respectively enriched and purified by conventional methods.
- Eigenschaften der neutralisierenden monoklonalen Antikörper ZIMET B71C6 und ZIMET B71E3:Properties of the neutralizing monoclonal antibodies ZIMET B71C6 and ZIMET B71E3:
1.1 Bestimmt nach FRIGUET, B., et al., J. Immunol. Methods 77, 305-319,1<)85.1.1 Determined by FRIGUET, B., et al., J. Immunol. Methods 77, 305-319,1 <) 85.
2.) Bostimmt nach KAWADE, Y„ und Y. WATANABE, Immunology 56,489-495,198G.2.) According to KAWADE, Y "and Y. WATANABE, Immunology 56, 69-495, 198G.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD32197888A DD277087A1 (en) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD32197888A DD277087A1 (en) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD277087A1 true DD277087A1 (en) | 1990-03-21 |
Family
ID=5604082
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD32197888A DD277087A1 (en) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DD (1) | DD277087A1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
-
1988
- 1988-11-21 DD DD32197888A patent/DD277087A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
US8349331B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-01-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
US8557967B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-10-15 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69330523T4 (en) | IMMUNOGLOBULINE WITHOUT LIGHT CHAINS | |
DE60124863T2 (en) | AGAINST HUMAN INTERLEUKIN-1-BETA RECOMBINANT ANTIBODIES | |
LV11042B (en) | METHOD FOR PRODUCING OF PERMANENT ANIMAL AND HUMAN CELL LINES AND USE THEREOFL ACARICIDALLY ACTIVE TETRAZINE DERIVATIVESrylpirrole | |
DD277087A1 (en) | METHOD FOR OBTAINING NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA | |
DD283154A5 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN INTERFERON ALPHA 1 | |
DD254593A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN INTERFERON ALPHA | |
WO1991009873A1 (en) | New proteins | |
DE3105150A1 (en) | PREPARATION OF ANTI-T LYMPHOCYTE GLOBULIN. | |
DE19905048A1 (en) | Use of depletoric or mitogenic antibodies in immunotherapy | |
DE69231058T3 (en) | HIGH-AFFINE HUMANIZED MONOCLONAL ANTIKOERPER | |
EP0547076A1 (en) | Cd58-specific monoclonal antibodies and their use | |
DD282921A5 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST THE CROP PROTEIN GP 51 OF THE RINDERLEUKAEMIEVIRUS | |
DD259635A1 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN INTERLEUKIN-2 | |
DD276601A3 (en) | Process for the preparation of monoclonal antibodies against streptokinase | |
DD230883B1 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANES IGA | |
DD255001A1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST PROTEIN P24 OF THE BOVINE ELECTRIC VIRUS (BLV) | |
DD279266A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN INTERFERON ALPHA-1 (HUIFN ALPHA-1) | |
DD243184A3 (en) | Process for the preparation of monoclonal antibodies for L chains | |
DD252200A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO CEA | |
DD265910A1 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST THE HUMAN PROTEIN OF THE BOVINE ELECTRIC VIRUS | |
DD230884A1 (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMAN IGG | |
DD230882B1 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR A MONOCYTE ANTIGEN | |
DD296698A5 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST GONADOTROPE HORMONE | |
DD294728A5 (en) | MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST DIGOXIN AND DIGITOXIN PRODUCING HYBRIDOCELLINE | |
DD251156B5 (en) | METHOD FOR OBTAINING HAPTEN-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |