DD282921A5

DD282921A5 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST THE CROP PROTEIN GP 51 OF THE RINDERLEUKAEMIEVIRUS

Info

Publication number: DD282921A5
Application number: DD32835989A
Authority: DD
Inventors: Jueri Sober; Cornelia Platzer
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-05-08
Filing date: 1989-05-08
Publication date: 1990-09-26

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper (mAk) gegen das Huellprotein gp51 des Rinterleukaemievirus (BLV). Die Erfindung kann in der Landwirtschaft, Veterinaermedizin und Biotechnologie angewendet werden. Mit der Erfindung werden 7 stabile Hybridomklone, die mAk hoher Affinitaet gegen das Epitop A und gegen zwei neue, durch mAk noch nicht charakterisierte Epitope des Huellproteins gp51 produzieren, bereitgestellt. Die mAk sind zur immunologischen Charakterisierung des gp51 und zur effektiven Bestimmung von anti-gp51-Antikoerpern in Rinderseren (RS) oder von gp51-Antigen (Ag) geeignet. Die Hybridomklone wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle fuer Zellinien hinterlegt.{Antikoerper, monoklonale; Huellprotein gp51; Rinderleukaemievirus; Hybridomklone, stabile; Epitop A; Affinitaet, hohe; Epitope, neue; Charakterisierung, immunologische; anti-gp51-Antikoerper; Hinterlegung}The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies (mAbs) against the envelope protein gp51 of the rhineal leukemia virus (BLV). The invention can be applied in agriculture, veterinary medicine and biotechnology. The invention provides 7 stable hybridoma clones which produce mAbs of high affinity to the epitope A and to two new epitopes of the envelope protein gp51 not yet characterized by mAbs. The mAbs are suitable for the immunological characterization of gp51 and for the effective determination of anti-gp51 antibodies in bovine sera (RS) or gp51 antigen (Ag). The hybridoma clones have been deposited in the ZIM cell line depository. {Antibodies, monoclonal; Envelope protein gp51; Rinderleukaemievirus; Hybridoma clones, stable; Epitope A; Affinity, high; Epitopes, new; Characterization, immunological; anti-gp51 antibodies; Deposit}

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper (mAK) gegen das Hüllprotein gp51 des Rinderleukämievirus (BLV). Anwendungsgebiete der Erfindung sind Veterinärmed^n, Landwirtschaft und Biotechnologie.The invention relates to a method for obtaining monoclonal antibodies (mAb) against the coat protein gp51 bovine leukemia virus (BLV). Areas of application of the invention are veterinary medicine, agriculture and biotechnology.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Monoklonal Antikörper gegen virale Proteine werden zur Diagnostik von Viruserkrankungen, sowie zur Aufklärung von Problemen viraler Wirkungsmechanismen eingesetzt. Mit ihrer Hilfe können antigene Struktur und biologische Funktionen der Virusproteine charakterisiert werden. Das ist wiederum eine Voraussetzung für die Entwicklung neuartiger Vakzine und Diagnostika.Monoclonal antibodies against viral proteins are used for the diagnosis of viral diseases, as well as for the elucidation of problems of viral mechanisms of action. With their help, antigenic structure and biological functions of virus proteins can be characterized. This, in turn, is a prerequisite for the development of novel vaccines and diagnostics.

Für die Immunabwehr des Rindes gegen eine Infektion mit BLV spielen AK vor allem gegen das virale Protein gp51 eine wesentliche Rolle.For the immune defense of the bovine against an infection with BLV AK play an important role against the viral protein gp51.

1982 wurden von C. Brücket al. (Virology 122,342-36211982]) die ersten 15mAK gegen das Hüllprotein gp51 aus BLV hergestellt, die gegen 8 verschiedene antigene Determinanten (bezeichnet mit A-H) auf dem gp 51-Molekül gerichtet sind. Drei der acht Epitope (F, G und H) sind an biologischen Funktionen des Hüllproteins beteiligt. Die AK in Seren BLV-infizierter Rinder sind vorwiegend gegen diese drei Epitope gerichtet. (Brück et al. [1984]: Leukemia Res. 8,315-321.) Da unsere Untersuchungen mit den mAK von Brück zeigten, daß sie für die Anwendung in verschiedenen Testsystemen z.T. eine ungenügende Affinität besitzen, wurden 1987 von Platzerund Mitarb. (WP 265910) neue mAK gegen gp51 mit höherer Affinität hergestellt und in einem indirekten ELISA zur Bestimmung der anti-BLV-AK in Rinderseren (RS) bzw. zur Bestimmung von gp51-Antigen (Ag) eingesetzt. Zwei dieser mAK (Hybridomklone DDR-0218 und DDR-0223) definieren im Vergleich zu den 8 vonIn 1982, C. Brück et al. (Virology 122, 422-36211982]) prepared the first 15 mAb against the envelope protein gp51 from BLV directed against 8 different antigenic determinants (designated A-H) on the gp51 molecule. Three of the eight epitopes (F, G and H) are involved in biological functions of the envelope protein. The AK in sera BLV-infected cattle are mainly directed against these three epitopes. (Brück et al. [1984]: Leukemia Res. 8, 315-321.) Since our investigations with the MAb of Brück showed that they are suitable for use in different test systems. have an insufficient affinity, were in 1987 by Platzer and Mitarb. (WP 265910) produced new mAbs against gp51 with higher affinity and used them in an indirect ELISA for the determination of the anti-BLV-AK in bovine sera (RS) or for the determination of gp51-antigen (Ag). Two of these mAK (hybridoma clones DDR-0218 and DDR-0223) define in comparison to the 8 of

C. Brück bestimmten Epitopen neue antigene Determinanten, die mit I und K bezeichnet wurden. Die anderen dort beschriebenen mAK sind gegen die Epitope B/B' und D/D' gerichtet. Die Lage der Epitope A,B/B',D/D',E,I und K auf dem gp 51-Molekül konnte mit Hilfe von durch gentechnische Methoden hergestellten gp51-Fragmenten und synthetischen Peptiden durch Platzer und Mitarb, bestimmt werden (siehe WP 265910).C. Bring certain epitopes new antigenic determinants, designated I and K. The other mAKs described there are directed against epitopes B / B 'and D / D'. The location of epitopes A, B / B ', D / D', E, I and K on the gp51 molecule could be determined using gp51 fragments and synthetic peptides by Platzer and Mitarb (see WP 265910).

Bisher gibt es jedoch keine mAK mit hoher Affinität gegen das Epitop A. Brück berichtet zwar über eine „hohe Affinität" der AK gegen das Epitop A, jedoch erfolgte keine Bestimmung der Affinitätskonstante für die mAK mit in flüssiger Phase vorliegendem Antigen. Die Aussage über eine „hohe Affinität" der AK wurde nur aufgrund ihrer Bindungseigenschaften zum an eine feste Phase adsorbierten Antigen getroffen. Die Affinität der AK wurde im Vergleich zu den anderen in diesem Labor hergestellten gp51-spezifischen mAK relativ bewertet und gibt kein objektives Bild über ihre Leistungsfähigkeit (z. B. in anderen Testsystemen).So far, however, there is no mAb with a high affinity for the epitope A. Although Brück reports a "high affinity" of the AK for the epitope A, no determination of the affinity constant for the mAb with liquid phase antigen was made "High affinity" of the AK was only affected by its binding properties to the antigen adsorbed to a solid phase. The affinity of the AK was relatively evaluated compared to the other gp51-specific mAbs produced in this laboratory and gives no objective picture of its performance (eg in other test systems).

Monoklonal AK fcegen das Epitop A mit hoher Affinität gegenüber dem löslichen Antigen werden aber für einen diagnostischen Test benötigt, da der zu verwendende mAK das angebotene Antigen aus einer ungereinigten Proteinlösung mit hoher Effektivität und Spezifität fixieren muß.However, monoclonal antibodies, which are highly affinitive to the soluble antigen, are required for a diagnostic test because the MAb to be used must fix the antigen offered from an unpurified protein solution with high efficiency and specificity.

Bei der Verwendung von viralem gp 51 als Antigen wird durch die Bindung des mAK an das Epitop A die Reaktionsfähigkeit der AK des zu testenden Rinderserums mit den Epitopen F, G und H nicht beeinträchtigt.When viral gp 51 is used as the antigen, binding of the mAb to the epitope A does not affect the reactivity of the AK of the bovine serum to be tested with the epitopes F, G and H.

Das Epitop A, lokalisiert im C-terminalen Abschnitt des gp51 und damit in der Übergangsregion zum gp30, besitzt eine Bedeutung, wenn man gentechnisch hergestellte Fragmente, die diesen Abschnitt enthalten, als Antigen einsetzt.The epitope A, located in the C-terminal part of gp51 and thus in the transition region to gp30, is meaningful when using genetically engineered fragments containing this part as an antigen.

Außerdem ist anzunehmen, daß auf dem Hüllprotein gp 51 weitere, durch mAK noch nicht charakterisierte, Epitope vorhanden sind, deren Aufklärung große Bedeutung für die Vervollkommnung effektiver diagnostischer Testsvsteme und die Entwicklung von Vakzinen hat.In addition, it is to be assumed that there are further epitopes on the coat protein gp 51 which have not yet been characterized by mAb, the elucidation of which has great importance for the perfection of effective diagnostic test systems and the development of vaccines.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, stabile Hybridomklone, d^:e mAK hoher Affinität gegen das Epitop A und gegen neue, durch mAK noch nicht charakterisierte Epitope des Hüllproteins gp51 des BLV produzieren, herzustellen. Die mAK sollen zur weiteren immunologischen Charakterisierung des gp51 (Aufklärung der Antigenstruktur, Epitopmapping, biologische Fuktion), und zur effektiven Bestimmung von anti-gp51-Antikörpern in Rinderseren oder von gp51 geeignet sein.The invention has the objective of stable hybridoma clones, ^d: produce, prepare e mAb high affinity to the epitope A, and with a new, not yet characterized by mAb epitopes of the envelope protein gp51 of the BLV. The mAb should be suitable for further immunological characterization of the gp51 (elucidation of the antigen structure, epitope mapping, biological function), and for the effective determination of anti-gp51 antibodies in bovine sera or gp51.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von mAK gegen das Hüllprotein gp51 des BLV ist dadurch gekennzeichnet, daß man Balb/c Mäuse mit gereinigtem BLV, gereinigtem gp51 oder mit durch gentechnische Methoden hergestellten gp51-Derivaten immunisiert, die Milzzellen entnimmt und mit Hilfe von Polyäthylenglykol (PEG) oder einem elektrischen Puls mit Maus-Myelomzellen (X63-Ag3.653) in an sich bekannter Weise fusioniert.The process according to the invention for the production of mAb against the envelope protein gp51 of the BLV is characterized in that Balb / c mice are immunized with purified BLV, purified gp51 or gp51 derivatives prepared by genetic engineering, the spleen cells are removed and with the aid of polyethylene glycol (PEG ) or an electrical pulse with mouse myeloma cells (X63-Ag3.653) in a manner known per se.

Die fusionierten Zellen werden in Mikrotiterplatten ausgesät und die gpb1 -spezifischen antikörperproduzierenden Hybridzellen mit Hilfe geeigneter immunchemischer Screenlngverfahren solektiert. Anschließend werden die Hybridomklone, die mAK gegen das Epitop A und gegen bisher nicht definierte Epitope des gp51 sekretieren, ausgewählt, kloniert, weiter vermehrt, ggf.The fused cells are seeded in microtiter plates and the gpb1-specific antibody-producing hybrid cells are solubilized by means of suitable immunochemical screening methods. Subsequently, the hybridoma clones secreting MAb against the epitope A and against previously undefined epitopes of gp51 are selected, cloned, further propagated, if necessary

in flüssigem Stickstoff gelagert und zur Produktion der mAK in bekannter Weise in vitro oder in vivo kultiviert. Aus den gewonnenen Kulturüberständen bzw. Ascitesflüssigkeiten werden die mAK über Hydroxylapatit gereinigt und anschließend charakterisiert. Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstello für Zellinien am 10.4.1989 unter folgenden Nummern hinterlegt: ZIM 0471 bis 0477 Die auf diese Weise gewonnenen 7 Hybridomklone sind stabil und produzieren mAK gegen das Hüll ι Jteingp51 des BLV in guten Ausbeuten. Die mAK sind durch eine hohe Affinität gegenüber dem in Lösung befindlichen Antigen gekennzeichnet und binden ebenso an denaturiertes gp 51 (Western Blot nach SDS-PAAG-Elektrophorese) sowie an gp 51, das an PVC oder Polystyrol adsorbiert ist.stored in liquid nitrogen and cultured in a known manner in vitro or in vivo for the production of the MAb. From the culture supernatants or ascites fluids obtained, the MAb are purified by means of hydroxylapatite and subsequently characterized. The hybridomas used for the antibody production according to the invention were deposited in the ZIM deposit cell for cell lines on April 10, 1989 under the following numbers: ZIM 0471 to 0477 The 7 hybridoma clones obtained in this way are stable and produce mAb against the envelope Jteingp51 of the BLV in good yields , The mAbs are characterized by high affinity for the antigen in solution and also bind to denatured gp51 (Western blot after SDS-PAAG electrophoresis) and to gp51 adsorbed on PVC or polystyrene.

Eine zusammenfassende Charakterisierung der erfindungsgemäß hergestellten mAK gegen gp51 gibt Tab. 1.A summary characterization of the mAK according to the invention against gp51 is given in Table 1.

Die Charakterisierung der erhaltenen mAK gegen das Epitop A (mAK gp51/1 und 2) zeigt, daß sie mit hoher Affinität (1,4 χ 10⁸) das in Lösung befindliche gp 51 binden und den IgG-Subklassen 2 a und 2 b angehören. Erfindungswesentlich ist, daß durch den Vergleich aller gp5'i-spezifischen mAK untereinander und die Reaktion mit den durch gentechnische Methoden hergestellten gp51-Fragmenten zwei neue antigene Determinanten auf dem gp51-Molekül ermittelt werden konnten, die mit L (mAK gp51/3, 6,7 und 8) und Pi (mAK gp 51/5) bezeichnet wurden.The characterization of the resulting mAb against the epitope A (mAb gp51 / 1 and 2) shows that they bind with high affinity (1.4 χ 10 ⁸ ) the gp 51 in solution and belong to the IgG subclasses 2 a and 2 b , It is essential to the invention that two new antigenic determinants on the gp51 molecule could be determined by comparing all the gp5'i-specific mAbs with each other and the reaction with the gp51 fragments produced by genetic engineering methods, with L (mAK gp51 / 3, 6 , 7 and 8) and Pi (mAK gp 51/5).

Das Epitop L ist eine antigene Struktur, die nicht durch die in E.coli oder S.cerevisiae hergestellten gp51-Derivate gebildet wird.Epitope L is an antigenic structure that is not formed by the gp51 derivatives produced in E. coli or S. cerevisiae.

Ihre Integrität ist somit abhängig von der authentischen Glykosylierurig des gp 51. Außerdem konkurrieren die mAK gp 51/3,6,7 und 8 mit den AK aus dem Serum eines BLV-infizierten Rindes. Das Epitop L ist also ein weiteres Epitop (neben den von Brück beschriebenen Epitopen F, G und H, Virology 136, 20-31.), gegen welches das Rind nach BLV-Infektion AK bildet.Their integrity is thus dependent on the authentic glycosylation of the gp 51. In addition, the mAB gp 51/3, 6, 7 and 8 compete with the AK from the serum of a BLV-infected bovine. The epitope L is therefore another epitope (in addition to the epitopes F, G and H described by Brück, Virology 136, 20-31.), Against which the cattle after AKV BLV infection forms.

Das Epitop M ist eine Sequenz-Determinante auf dem C-terminalen Abschnitt (zwischen der 217. und der 268. Aminosäure) des gp51. Wie Konkurrenzbindungstests mit den mAKgp51/5und 11 zeigten, ist das Epitop M räumlich dem Epitop D/D' benachbart, das sich zwischen der 170. und der 217. Aminosäure befindet. Der mAKgp51/11 wird vom Hybridom unter der Hinterlegungsnummar ZIM-0215 produziert. Er ist in WP 265910 beschrieben.Epitope M is a sequence determinant on the C-terminal portion (between the 217th and 268th amino acids) of gp51. As demonstrated by competitive binding assays with mAKgp51 / 5 and 11, epitope M is spatially adjacent to epitope D / D 'located between the 170th and 217th amino acids. The mAKgp51 / 11 is produced by the hybridoma under the accession number ZIM-0215. He is described in WP 265910.

Die erfindungsgemäß hergestellten mAK, sind für die Entwicklung eines effektiven ELISA zur Bestimmung von anti-gp51-AK in Rinderseren geeignet. Die mAK gp 51/1,2 und 5 haben eine hohe Affinität zum gelösten Ag und zeigen im diagnostischen ELISA einen sehr niedrigen Untergrundwert, d. h. keine Kreuzreaktivität mit verschiedenen Komponenten aus dem Ag-Präparat, dem RS und dem anti-Rinci-Konjugat. Der Test erreicht somit hohe P/N-Werte und eine sehr hohe Empfindlichkeit. Außerdem hemmen die mAK gp51/1, 2 und 5 nicht (oder kaum) die Bindung der AK aus dem Serum desinfizierten Rindes und sind einsetzbar, wenn ein gp 51-Derivat, das den Abschnitt von der 217.-268. Aminosäure des gp51 enthält, als Ag eingesetzt wird.The mAb prepared according to the invention are suitable for the development of an effective ELISA for the determination of anti-gp51-AK in bovine sera. The mAb gp 51 / 1,2 and 5 have a high affinity for dissolved Ag and show a very low background value in the diagnostic ELISA. H. no cross-reactivity with different components of the Ag preparation, the RS and the anti-Rinci conjugate. The test thus achieves high P / N values and very high sensitivity. In addition, mAbs gp51 / 1, 2, and 5 did not (or barely inhibit) the binding of AK from serum of bovine infertility and are useful when a gp 51 derivative containing the section from 217.-268. Amino acid of the gp51 contains, as Ag is used.

Verschiedene Kombinationen der mAK gegen die Epitope A, L und M können außerdem bei der Quantifizierung von gp51 in immunometrischen Tests eingesetzt werden.Various combinations of mAbs against epitopes A, L and M can also be used in the quantitation of gp51 in immunometric assays.

Die mAK gegen das Epitop L (gp51/3,6,7 und 8) sind aufgrund ihrer hohen Affinität gut zur weiteren Aufklärung (Lokalisierung, Rolle der Glykosylierung) von biologisch wichtigen und funktioneilen antigenen Determinanten des BLV geeignet.The mAbs against the epitope L (gp51 / 3,6,7 and 8) are well suited for further elucidation (localization, role of glycosylation) of biologically important and functional antigenic determinants of BLV due to their high affinity.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Weibliche Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem viralem gp51 immunisiert.1. Balb / c female mice were immunized with purified viral gp51.

2. Die Milzzellen wurden mit X63-Ag8.653 Myelomzellen mit Hilfe von PEG 4000 fusioniert. Die Selektion, Kultivierung und Klonierung der Hybridome erfolgte entsprechend den üblichen in der Literatur beschriebenen Methoden.2. Spleen cells were fused with X63-Ag8.653 myeloma cells using PEG 4000. The selection, cultivation and cloning of the hybridomas was carried out according to the usual methods described in the literature.

3. Hybridomklone, die Antikörper gegen gp51 produzieren, wurden mit Hilfe eines ELISA auf der Basis von gereinigtem gp51 selektiert. Anschließend wurden durch kompetetive Bindungsversuche mit den bisher zur Verfügung stehenden gp51-spezifischen mAK (gegen die Epitope A-K) diejenigen ausgewählt, die mAK gegen das Epitop A bzw. gegen bisher nicht definierte Epitope auf dem gp51-Molekül produzieren.3. Hybridoma clones producing antibodies to gp51 were selected by ELISA based on purified gp51. Subsequently, by competitive binding experiments with the hitherto available gp51-specific mAb (against the epitopes A-K) those were selected which produce mAb against the epitope A or against previously undefined epitopes on the gp51 molecule.

4. Die geeigneten Hybridome wurden rekloniert, vermehrt und zur Produktion von mAK in vivo verwendet. Dazu wurden 1-2 Mio Hybridomzellen in mit Pristane vorbehandelte weibliche Oalb/c-Mäuse transplantiert. Nach etwa 8-10 Tagen konnte mittels Punktierung mit der Ernte der Ascitesflüssigkeit begonnen werden. Im Durchschnitt wurden pro Maus 10 ml Ascites mit einem Gehalt von 5-10mg IgG/ml erhalten. Der Titer betrug im ELISA 10⁸ bis 10⁸.4. The appropriate hybridomas were recloned, propagated and used to produce mAb in vivo. To this end, 1-2 million hybridoma cells were transplanted into pristane-pretreated female Oalb / c mice. After about 8-10 days it was possible to begin puncturing with the harvest of the ascites fluid. On average, 10 ml of ascites containing 5-10 mg IgG / ml per mouse were obtained. The titer was 10 ⁸ to 10 ⁸ in the ELISA.

5. Der spezifische gp 51-Titer und der IgG-Gehaltdes Kulturüberstandjs bzw. der Ascites Hieb auch nach3monatiger Kultivierung der Hybridome bzw. nach 3maliger Transplantation (von Maus zu Maus) konstant und nach Reklonierung zeigte sich keine Aufspaltung der Hybridome in produzierende und nichtproduzierende Klone.5. The specific gp 51 titer and the IgG content of the culture supernatant (s) also persisted after 3 months of hybridoma culture or transplantation (from mouse to mouse) and after cloning, no cleavage of the hybridomas into producing and non-producing clones was observed ,

6. Die Anreicherung bzw. Reinigung der mAK erfolgte mit Hilfe von Fällung (Ammoniumsulfat oder PEG) oder Chromatografie (Hydroxylapatit).6. The accumulation or purification of the MAb by means of precipitation (ammonium sulfate or PEG) or chromatography (hydroxyapatite).

Claims

Methods of producing monoclonal antibodies include bovine leukemia virus (BLV) envelope protein gp51, immunization of Balb / c mice with purified BLV, purified gp51 or gp51 derivatives prepared by genetic engineering, fusion of their spleen cells with mouse myeloma cells Selection of the anti-gp51 antibody-producing hybridomas and their cultivation or transpiontation in mice, characterized in that the clones ZIM-0471 to 0477 are used for the cultivation or transplantation.

Field of application of the invention