DE19529026C2

DE19529026C2 - Monoclonal antibodies against human interleukin-10

Info

Publication number: DE19529026C2
Application number: DE1995129026
Authority: DE
Inventors: Robert Sabat; Martina Dr Rer Nat Seifert; Uwe Dr Med Marx; Ralf Dr Rer Nat Glaser; Hans-Dieter Prof Dr Med Volk
Original assignee: Robert Sabat; Martina Dr Rer Nat Seifert; Uwe Dr Med Marx; Ralf Dr Rer Nat Glaser; Volk Hans Dieter Prof Dr Med
Current assignee: ProBioGen AG
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2015-07-29
Also published as: DE19529026A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Hybridom-Zellinien und davon abgeleitete monoklonale Antikörper (mAK), die gegen verschiedene Epitope des humanen Interleukin-10 (hIL-10) gerichtet sind, die Wirkung dieses Zytokins inhibieren und dessen Konformation ändern. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zu ihrer Herstellung, zu ihrer Reinigung, weiterhin die Verwendung dieser monoklonalen Antikörper für prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Zwecke und ihre Anwendung zur Reinigung sowie zur quantitativen Bestimmung von hIL-10 und zur Immunmodulierung von Prozessen, die von diesem Zytokin abhängig sind.The invention relates to new hybridoma cell lines and monoclonal antibodies (mAb) derived therefrom, directed against different epitopes of human interleukin-10 (hIL-10) inhibit this cytokine and change its conformation. The invention further relates to methods for their preparation, for their purification, the use of these monoclonal antibodies for prophylactic, therapeutic or diagnostic purposes and their use for cleaning as well for the quantitative determination of hIL-10 and for the immune modulation of processes by this Cytokine dependent.

Interleukin-10, ursprünglich als Zytokin Synthese hemmender Faktor - cytokine synthesis inhibitory factors, CSIFs (US(-Patent) 5231 012) bezeichnet - das von T-Helfer-2-Zellen gebildet wird und bei murinen T-Helfer-1-Zellen die Synthese von Zytokinen hemmt (Fiorentino, D.F. et al., 1989, J. Exp. Med. 170 : 2081), ist einer der wesentlichen Mediatoren des Immunsystems. Die Gene für hIL-10 sind auf dem Chromosom 1 lokalisiert (Kim, J. M. et al., 1992, Immunol. 148 : 3618). Das Zytokin zeigt eine hohe Homologie mit einem - Epstein-Barr-Virus (EBV) kodierten - Protein, dem BCRF1 (Moore, K.W. et al., 1990, Science 248 : 1230). Humanes Interleukin-10 ist ein Dimer aus zwei identischen, nicht kovalent gebundenen Untereinheiten. Jede dieser Einheiten besteht aus 178 Aminosäuren, hat ein Molekulargewicht von 18,6 kDa und kann am N-terminalen Ende glykosyliert sein. Die Glykosylierung scheint keinen wesentlichen Einfluß auf die biologische Wirkung zu haben. Bei Menschen wird hIL-10 durch die aktivierten T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und Keratinozyten synthetisiert und sezemiert. Diese beiden Prozesse können durch humanes Interleukin-4 (hIL-4) und humanes Interferon-g (hIFN-g) inhibiert werden. Humanes Interleukin-10 ist ein pleiotropes Zytokin mit immunsuppressiven und immunstimulierenden Eigenschaften. Es besitzt einen starken Effekt auf die Morphologie, Funktion und die Zytokinproduktion bei menschlichen Monozyten und Makrophagen. Humanes Interleukin-10 hemmt die Synthese proinflammatorischer Proteine, wie TNF-a, TNF-b, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF (Fiorentino, D. E. et al., 1991, J. Immunol. 146 : 3815) und verstärkt die Expression des Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten als einem der antiinflamatorischen Faktoren (de Waal, M. R. et al., 1992, Curr. Opin. Immunol. 4 : 314). Weiterhin suppremiert es die Synthese von Superoxiden, Nitrogenen und oxygenierenden Metaboliten, senkt die Expression von Major Histocompatibility Complexes, MHC-Klasse-2-Molekülen und wirkt deaktivierend auf Monozyten und Makrophagen. Humanes Interleukin-10 hemmt die antigenabhängige T-Zell-Proliferation, die Zytokinsynthese bei Peripheren Mononuklearen Blutzellen (PBMNC), Natürlichen-Killer-Zellen (NK- Zellen) (Yseel, H. et al., 1991, Exp. Med. 174 : 953) und bei T-Helfer-1-Zellen, insbesondere die Synthese von IFN-g. Im Gegensatz dazu wirkt es immunstimulierend auf B-Zellen und kann bei ihnen die Proliferation, die Sekretion der Immunglobuline und die verstärkte Expression von Molekülen des (MHC) Klasse-2 bewirken (Howard, M. et al., 1992, J. Clin. Immunol. 12 : 239). Bei Anwesenheit von IL-2 und IL-4 stimuliert es Thymozyten (Suda, T. et al., 1990, Cell. Immunol. 129 : 228).Interleukin-10, originally as a cytokine synthesis inhibiting factor - cytokine synthesis inhibitory factors, CSIFs (US (patent) 5231 012) - which is formed by T helper 2 cells and at murine T helper 1 cells inhibit the synthesis of cytokines (Fiorentino, D.F. et al., 1989, J. Exp. Med. 170: 2081), is one of the essential mediators of the immune system. The genes for hIL-10 are localized on chromosome 1 (Kim, J.M. et al., 1992, Immunol. 148: 3618). The cytokine shows one high homology with a protein encoded by Epstein-Barr virus (EBV), the BCRF1 (Moore, K.W. et al., 1990, Science 248: 1230). Human interleukin-10 is a dimer of two identical, not covalently bound subunits. Each of these units consists of 178 amino acids, has one Molecular weight of 18.6 kDa and can be glycosylated at the N-terminal end. The glycosylation does not appear to have any significant influence on the biological effect. In humans, hIL-10 synthesized by the activated T cells, B cells, monocytes, macrophages and keratinocytes and dissected. These two processes can be controlled by human interleukin-4 (hIL-4) and human Interferon-g (hIFN-g) can be inhibited. Human interleukin-10 is a pleiotropic cytokine with immunosuppressive and immunostimulating properties. It has a strong effect on that Morphology, function and cytokine production in human monocytes and macrophages. Human interleukin-10 inhibits the synthesis of pro-inflammatory proteins such as TNF-a, TNF-b, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF (Fiorentino, D.E. et al., 1991, J. Immunol. 146: 3815) and amplified the expression of the interleukin-1 receptor antagonist as one of the anti-inflammatory factors (de Waal, M.R. et al., 1992, Curr. Opin. Immunol. 4: 314). It also suppresses the synthesis of Superoxides, nitrogenous and oxygenating metabolites, lowers major expression Histocompatibility Complexes, MHC class 2 molecules and has a deactivating effect on monocytes and Macrophages. Human interleukin-10 inhibits antigen-dependent T cell proliferation Cytokine Synthesis in Peripheral Mononuclear Blood Cells (PBMNC), Natural Killer Cells (NK- Cells) (Yseel, H. et al., 1991, Exp. Med. 174: 953) and in the case of T helper 1 cells, in particular the synthesis by IFN-g. In contrast, it has an immunostimulating effect on B cells and can do so in them Proliferation, the secretion of immunoglobulins and the increased expression of molecules of the (MHC) class 2 (Howard, M. et al., 1992, J. Clin. Immunol. 12: 239). In the presence of IL-2 and IL-4 stimulates thymocytes (Suda, T. et al., 1990, Cell. Immunol. 129: 228).

Die Verwendung von Interleukin-10 zur Herstellung von Arzneimitteln mit tumorhemmender Wirksamkeit ist Gegenstand des Patents DE 41 22 402 (1993; Diamantstein, T.; Richter, G.; Blankenstein, Th.).The use of Interleukin-10 for the manufacture of drugs with anti-tumor Effectiveness is the subject of patent DE 41 22 402 (1993; Diamantstein, T .; Richter, G .; Blankenstein, Th.).

Interleukin-10 wird gegenwärtig als das wichtigste immunsuppressive Zytokin des menschlichen Organismus angesehen.Interleukin-10 is currently considered the most important immunosuppressive cytokine in human Viewed organism.

Seit der ersten Beschreibung durch Köhler G. und Milstein C. (1975, Nature 256 : 495) sind zahlreiche monoklonale Antikörper gegen unterschiedlichste Antigene produziert worden. Monoklonale Antikörper, wie in der vorliegenden Erfindung, sind in sich homogene Immunglobuline einer Spezifität, die von einem Hybridom in vitro in großen Mengen produziert werden. Hybridome stellen dabei das Verschmelzungsprodukt einer Milzzelle, die in der Kultur nicht überlebensfähig ist und einer permanent wachsenden Myelomzelle (Tumoren von B-Lymphozyten) dar (Hämmerling, U., Eur. J. Immunol. 1.7 743, 1974; J. H. et al., Monoklonale Antikörper, Springer Verlag, 1988).Since the first description by Köhler G. and Milstein C. (1975, Nature 256: 495) there have been numerous monoclonal antibodies against various antigens have been produced. Monoclonal antibodies, As in the present invention, homogeneous immunoglobulins are inherently of a specificity that of a hybridoma can be produced in large quantities in vitro. Hybridomas represent this Fusion product of a spleen cell that is not viable in culture and one that is permanent growing myeloma cell (tumors of B lymphocytes) (Hämmerling, U., Eur. J. Immunol. 1.7 743, 1974; J.H. et al., Monoclonal Antibodies, Springer Verlag, 1988).

Es sind auch zahlreiche mAK bekannt, die gegen Interleukine (IL) gerichtet sind, z. B. gegen IL-2 (US 4845 198, 5104 652; DE 38 15 472) oder gegen NAP (Neutrophilen aktivierendes Peptid)/IL-8, DE 39 28 861).Numerous mAbs are also known which are directed against interleukins (IL), e.g. B. against IL-2 (US 4845 198, 5104 652; DE 38 15 472) or against NAP (neutrophil activating peptide) / IL-8, DE 39 28 861).

Aus der Fachliteratur (J. Immunol. Methods 177, 225-234, 1994) sind monoklonale Antikörper gegen humanes Interleukin 10 (a-hIL-10-mAk) bekannt. Diese Antikörper werden nach folgender Hybridomtechnik gewonnen: Die Zellkulturüberstände werden mit dem radioimmunoprecipitation assay auf die Anwesenheit der a-hIL-10-mAk getestet; sie werden in der Bauchhöhle einer Maus produziert und mit Protein A gereinigt. Die beschriebenen mAk blockieren die biologische Aktivität von Interleukin- 10 erst in sehr hoher Konzentration und sind zur Neutralisierung der biologischen Wirkung des hIL-10 nicht geeignet.From the specialist literature (J. Immunol. Methods 177, 225-234, 1994) are monoclonal Antibodies against human interleukin 10 (a-hIL-10 mAb) are known. These antibodies are obtained using the following hybridoma technology: The cell culture supernatants are with the radioimmunoprecipitation assay for the presence of the a-hIL-10 mAb tested; they are produced in the abdominal cavity of a mouse and with protein A cleaned. The described mAbs block the biological activity of interleukin 10 only in a very high concentration and are used to neutralize the biological Effect of the hIL-10 not suitable.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, zunächst Hybridom-Zellinien zu entwickeln, die die monoklonalen Antikörper gegen humanens Interleukin-10 gemäß Anspruch 1 erzeugen, daraus in nachfolgenden Verfahrensschritten diese monoklonalen Antikörper zu gewinnen, zu reinigen, zu charakterisieren, zu modifizieren sowie daraus geeignete Mittel zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose Interleukin-10- abhängiger Erkrankungen bei Menschen, zur Immunmodulierung von humanem Interleukin-10- abhängigen Prozessen in vivo und in vitro, zur Reinigung und quantitativen Bestimmung von humanen Interleukin-10 und zu experimentellen Zwecken herzustellen.The invention has for its object to first develop hybridoma cell lines that generate monoclonal antibodies against human interleukin-10 according to claim 1, therefrom in the following Process steps for obtaining, purifying, characterizing, obtaining these monoclonal antibodies modify and use it to develop suitable prophylaxis, therapy and diagnosis interleukin-10 dependent diseases in humans, for immunomodulating human interleukin-10 dependent processes in vivo and in vitro, for the purification and quantitative determination of human Interleukin-10 and for experimental purposes.

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß murine Myelomzellen mit den Milzzellen einer gegen humanes Interleukin-10 immunisierten Maus fusioniert wurden (Beispiel 2). Die Vereinigung der Zellmembranen führt zu einer Durchmischung der Chromosomen und der Erbinformation der beiden Zelltypen. Myelomzellen stellen entartete Zellen dar, die von B- Lymphozyten abstammen und permanent in Gewebekulturen wachsen. Heute verfügbare Myelom- Zellinien haben durch Mutation die Fähigkeit zur eigenen Antikörperproduktion verloren. Weiterhin weisen diese Zellen eine Enzymmangelmutation im DNA-Syntheseweg auf, welche bewirkt, daß sie in einem Selektionsmedium (Kulturmedium unter Zusatz von Hypoxantin, Aminopterin und Thymidin (HAT)) nicht überleben können. Eine in dieser Hinsicht gut verwendbare Zellinie ist die Balb/c-Maus Myelom-Zellinie SP2/0-Agt14 (ATCC CRL 8287) (Shulman et al. 1978), Kurzbezeichnung SP2/0. Die Milzen der immunisierten Tiere (weibliche Balb/c-Mäuse) werden unter aseptischen Bedingungen entnommen und durch mechanische Zerkleinerung der Organe die darin enthaltenen antikörperproduzierenden Zellen gewonnen, wie von Hämmerling U. (1974, Eur. J. Immunol. 1,7 743) beschrieben. Diese Zellen zeichnen sich dadurch aus, daß sie Antikörper synthetisieren und sezemieren, unter anderem auch die gewünschten anti-Interleukin-10-Antikörper. Die Milzzellen sind jedoch nur über eine kurze Zeit lebensfähig, produzieren Antikörper nur in geringeren Konzentrationen, die zusätzlich durch andere Zellen und deren Produkte verunreinigt sind. Durch die Verschmelzung von Myelomzellen und antikörperproduzierenden Zellen lassen sich deren Eigenschaften vorteilhaft vereinigen. Man erhält Hybridome, die in Zellkulturen permanent wachsen und Antikörper der gewünschten Spezifität in großen Mengen produzieren.The object was achieved in that murine myeloma cells with the spleen cells a mouse immunized against human interleukin-10 were fused (Example 2). The Union of the cell membranes leads to a mixing of the chromosomes and the Genetic information of the two cell types. Myeloma cells are degenerate cells Lymphocytes descend and grow permanently in tissue cultures. Myeloma available today Cell lines have lost the ability to produce their own antibodies through mutation. Farther these cells have an enzyme deficiency mutation in the DNA synthesis pathway which causes them to a selection medium (culture medium with the addition of hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT)) cannot survive. A cell line that can be used well in this regard is the Balb / c mouse Myeloma cell line SP2 / 0-Agt14 (ATCC CRL 8287) (Shulman et al. 1978), short name SP2 / 0. The Spleens of the immunized animals (female Balb / c mice) are grown under aseptic conditions removed and by mechanical crushing of the organs contained therein antibody-producing cells as described by Hämmerling U. (1974, Eur. J. Immunol. 1,7 743) described. These cells are characterized by the fact that they synthesize antibodies and dissect, including the desired anti-interleukin-10 antibodies. The spleen cells are but only viable for a short time, antibodies only produce in lower concentrations, which are additionally contaminated by other cells and their products. By merging Myeloma cells and antibody-producing cells, their properties can be advantageous unite. Hybridomas are obtained which grow permanently in cell cultures and antibodies of produce the desired specificity in large quantities.

Die genetische Verwandtschaft von Balb/c-Myelomzellen und Balb/c-antikörperproduzierenden Zellen führt zu stabilen Verschmelzungsprodukten. Die Hybridome, welche durch die Verschmelzung entstehen, werden in einem Selektionsmedium kultiviert, in dem nur sie überleben können, da die Enzymmangelmutation der Myelomzellen durch die Erbinformation der Milzzelle ausgeglichen wird. Myelomzellen selbst und die nicht verschmolzenen Milzzellen sterben ab. Nur ein Teil der erzielten Hybridome produziert erfindungsgemäß Antikörper gegen humanes Interleukin-10. Solche Verschmelzungsprodukte müssen durch die Klonierung und zahlreiche Reklonierungen isoliert werden, um einzelne Klone zu erhalten, die stabil und in großen Mengen mAK produzieren. Ein Klon stellt dabei definitionsgemäß die Gesamtheit der Tochterzellen einer Ursprungszelle dar, d. h. alle diese Zellen sind genetisch und phänotypisch identisch. Diese Zellen, auch als Hybridom-Zellinien bezeichnet, werden unter aseptischen Bedingungen in sterilen Gewebekulturen unter Verwendung entsprechender Nährmedien kultiviert. Auf allen Etappen der Herstellung wurden verschiedene Testmethoden zum Nachweis der Spezifität der Antikörper eingesetzt. Der erfindungsgemäße Nachweis von im Zellkulturüberstand enthaltenen anti-Interleukin-10-Antikörpern wird mit einem selbst entwickelten ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) durchgeführt (Beispiel 1). Diese spezifischen Antikörper werden nach deren Bindung an humanes Interleukin-10 das an Plastikplatten immobilisiert wurde, durch gegen Maus- Immunglobuline gerichtetes Antiserum erkannt. Dieses ist mit einem Enzym, z. B. Peroxidase, gekoppelt, das im positiven Fall durch die Reaktion mit dem Substrat eine Farbreaktion bewirkt. Entsprechend kann die Reaktivität der Antikörper mit anderen Proteinen getestet werden (Beispiel 4). Die neuen Hybridom-Zellinien H-CB/RS/. . . und die durch sie produzierten monoklonalen Antikörper CB/RS1. . . wurden in 6 Gruppen (A bis F) eingeteilt und mitThe genetic relationship between Balb / c myeloma cells and Balb / c antibody-producing cells leads to stable fusion products. The hybridomas caused by the merger arise, are cultivated in a selection medium in which only they can survive, because the Enzyme deficiency mutation of the myeloma cells is compensated by the genetic information of the spleen cell. Myeloma cells themselves and the unmelted spleen cells die. Only a part of the achieved Hybridomas produce antibodies against human interleukin-10 according to the invention. Such merger products must be isolated by cloning and numerous recloning to separate clones obtained that produce stable MAK in large quantities. A clone is by definition the Total of the daughter cells of an original cell, i. H. all of these cells are genetic and phenotypically identical. These cells, also known as hybridoma cell lines, are under aseptic conditions in sterile tissue cultures using appropriate nutrient media cultured. At all stages of production, various test methods were used to prove the Specificity of the antibodies used. The detection according to the invention of in the cell culture supernatant contained anti-interleukin-10 antibodies with a self-developed ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) carried out (Example 1). These specific antibodies are named after them Binding to human interleukin-10 immobilized on plastic plates by against mouse Immunoglobulin-directed antiserum detected. This is with an enzyme, e.g. B. peroxidase, coupled, which in the positive case causes a color reaction by the reaction with the substrate. The reactivity of the antibodies with other proteins can be tested accordingly (Example 4). The new hybridoma cell lines H-CB / RS /. . . and the monoclonal antibodies produced by them CB / RS1. . . were divided into 6 groups (A to F) and with

bezeichnet. Die monoklonalen Antikörper aus den Gruppen A, B, C, D, E innerhalb einer dieser Gruppe binden das gleiche, für jede dieser Gruppen charakteristischen Interleukin-10 Epitop, welches räumlich getrennt von den Epitopen liegt, die durch die mAK CB/SR/8A7 (Gruppe F) erkennt ein nicht genau lokalisierbares Interleukin-10 Epitop (Beispiel 8). Alle in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Hybridom-Zellinien können in vitro über lange Zeit in Kulturgefäßen unterschiedlicher Größe, von kleinen Kulturflaschen bis zu Fermentertanks und Bioreaktoren gehalten werden und eignen sich für die Massenproduktion von mAK, welche aus Kulturüberständen dieser Klone (Hybridom-Zellinien) gewonnen werden. Die mAK können im ungereinigten Kulturüberstand oder nach der Konzentrierung über die Tangentialflußdruckfilteranlage und gereinigt durch Aussalzen oder durch chromatische Verfahren verwendet werden (Beispiel 2).designated. The monoclonal antibodies from groups A, B, C, D, E within one of these Group bind the same interleukin-10 epitope, which is characteristic of each of these groups is not spatially separated from the epitopes by the mAK CB / SR / 8A7 (group F) precisely locatable interleukin-10 epitope (example 8). All in the present invention Hybridoma cell lines described can vary in vitro over a long period in culture vessels Size, from small culture bottles to fermentation tanks and bioreactors, and are suitable for the mass production of MAK, which from culture supernatants of these clones (Hybridoma cell lines) can be obtained. The MAK can be in the unpurified culture supernatant or after the concentration via the tangential flow pressure filter system and cleaned by salting out or by chromatic methods are used (Example 2).

Durch die Verfügbarkeit von in der vorliegenden Erfindung beschriebenen mAK gegen 4 verschiedene Interleukin-10-Epitope - der Gruppen A, B, C, D - ist es möglich, in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Plasma, serösen Flüssigkeiten usw., die Konzentration des humanen Interleukin-10 zu bestimmen. Die zu messenden Proben werden auf Plastikplatten, die mit zwei epitopdifferenten anti-Interleukin-10- mAK vorbeschichtet wurden, inkubiert. Damit wird das Zytokin durch diese Antikörper auf der Plastikplatte gebunden. Der Nachweis des hIL-10 erfolgt darauf mit peroxidasemarkierten mAK, die zwei andere, gut zugängliche Epitope des Zytokins erkennen, dessen Bindung durch eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen wird. Die mAK als homogene Immunglobuline einer Spezifität in praktisch unbegrenzter Menge bieten erhebliche Vorteile gegenüber polyklonalen Antiseren, welche in der Qualität chargenabhängig und quantitativ begrenzt verfügbar sind. Die Messung in einem mit mAK aufgebauten ELISA erlaubt die Bestimmung nur des von dem Antikörper erkannten Antigens, was die Spezifität des Tests erhöht. Die Verwendung einer Mischung aus zwei verschiedene Epitope erkennenden spezifischen monoklonalen Antikörpern für die Adsorption sowie für den Nachweis des hIL-10 erhöht sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität des Enzym-Immuno- Assays. Darüber hinaus kann nach dem gleichen Prinzip die quantitative Bestimmung des Zytokins mit einem Radio-Immuno-Assay durchgeführt werden.Due to the availability of mAK described in the present invention against 4 different Interleukin 10 epitopes - of groups A, B, C, D - it is possible in biological fluids, such as blood, Plasma, serous fluids, etc. to determine the concentration of human interleukin-10. The Samples to be measured are placed on plastic plates which are coated with two epitope-different anti-interleukin-10 MAK were precoated, incubated. This means that the cytokine is on the Plastic plate bound. The hIL-10 is then detected using peroxidase-labeled MAK, which recognize two other accessible epitopes of the cytokine, the binding of which by one enzymatic color reaction is detected. The mAb as a homogeneous immunoglobulin Specificity in practically unlimited quantities offers considerable advantages over polyclonal ones Antisera which are available in batch-dependent and quantitatively limited quality. The Measurement in an ELISA constructed with mAK allows the determination of only that of the antibody recognized antigen, which increases the specificity of the test. The use of a mixture of two specific monoclonal antibodies recognizing different epitopes for adsorption and for detection of the hIL-10 increases both the sensitivity and the specificity of the enzyme immuno- Assays. In addition, the quantitative determination of the cytokine can be carried out using the same principle a radio immunoassay.

Nach der Immobilisierung der beanspruchten anti-Interleukin-10-Antikörper aus den Gruppen A, B, C, D und F an geeigneten Trägermolekülen (z. B. aktivierte Gelmatrix) läßt sich eine Affinitätschromatographie durchführen, die die Reinigung von humanem Interleukin-10 aus verschiedenen Flüssigkeiten ermöglicht. Die Anwendung von spezifischen, verschiedene Interleukin- 10-Epitope erkennenden, monoklonalen Antikörpern erhöht die Menge von gebundenem Zytokin an der Säule und die Spezifität der Reinigung. Danach muß die Säule mit einem neutralen Puffer gewaschen werden. Das hIL-10 wird mit 0,1 M Glyzinpuffer mit dem pH-Wert 2,7 eluiert und anschließend elektrophoretisch auf Reinheit untersucht. Durch UV-Absorption bei 280 nm wird seine Konzentration bestimmt und seine Aktivität im biologischen Test gemessen.After immobilization of the claimed anti-interleukin-10 antibodies from groups A, B, C, D and F on suitable carrier molecules (e.g. activated gel matrix) can be a Perform affinity chromatography, which is the purification of human interleukin-10 different liquids. The application of specific, different interleukin Monoclonal antibodies recognizing 10 epitopes increases the amount of bound cytokine at the Pillar and the specificity of cleaning. The column must then be washed with a neutral buffer will. The hIL-10 is eluted with 0.1 M glycine buffer with a pH of 2.7 and then Electrophoretically examined for purity. Its concentration is determined by UV absorption at 280 nm determined and its activity measured in the biological test.

Die Eigenschaft, Interleukin-10 zu neutralisieren, ermöglicht die Anwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen mAK aus der Gruppe A für verschiedene experimentelle Zwecke (Beispiel 9). Darüber hinaus sind mAK aus den Gruppen A, B, C, D und F als diagnostische Reagenzien geeignet, die einen Nachweis des humanen Interleukin-10 in Zellen und in Flüssigkeiten ermöglichen. Dadurch gelingt es, mit Hilfe dieser Antikörper Zellen zu identifizieren, die hIL-10 produzieren. Bei einer derartigen Anwendung wird einer dieser mAK an eine radioaktive, fluoreszierende oder andere farbbildende Substanz gekoppelt, oder aber man arbeitet mit einem zweiten markierten Antikörper, der spezifisch gegen Maus-Immunglobuline gerichtet ist.The ability to neutralize interleukin-10 enables the use of the present Invention described MAK from group A for various experimental purposes (Example 9). In addition, mAbs from groups A, B, C, D and F are suitable as diagnostic reagents, which enable detection of human interleukin-10 in cells and in liquids. Thereby With these antibodies it is possible to identify cells that produce hIL-10. At a Such application is one of these MAK to a radioactive, fluorescent or other color-forming substance coupled, or one works with a second labeled antibody, the is specifically directed against mouse immunoglobulins.

Weiterhin sind die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zur Herstellung von Chimären, deren konstanter Teil humanen Ursprungs (humanes Ig) und deren variabler, insbesondere der hypervariable Teil, muriner Herkunft ist, geeignet. Diese Chimären oder die in der Erfindung beschriebenen monoklonalen Antikörper - als homogene murine Antikörper - können als solche oder gekoppelt mit magnetischen Beads, radioaktiven Substanzen, Arzneimitteln oder eingekapselt in Liposomen zur Prophylaxe und Therapie Interleukin-10-abhängiger Erkrankungen beim Menschen eingesetzt werden. Dabei sind sie in so geringen Mengen wirksam, daß keine oder nur sehr schwache Nebenwirkungen während oder als Folge der Verabreichung auftreten. Die mAK, ihre Chimären oder Konjugate, welche die Eigenschaft, die biologische Aktivität von hIL-10 zu inhibieren, besitzen, können bei EBV verursachten Störungen, bei Lymphomen mit eigener hIL-10 Produktion oder bei Tumoren Einsatz finden. Sie eignen sich zur Verabreichung bei T-Zell-vermittelten Allergien, bei Autoimmunerkrankungen sowie nach Transplantationen.Furthermore, the monoclonal antibodies according to the invention for the production of chimeras, their constant part of human origin (human Ig) and its variable, especially the hypervariable Part of Murine origin is suitable. These chimeras or those described in the invention monoclonal antibodies - as homogeneous murine antibodies - can be used as such or coupled with magnetic beads, radioactive substances, drugs or encapsulated in liposomes Prophylaxis and therapy interleukin-10-dependent diseases in humans are used. They are effective in such small amounts that no or only very weak side effects occur during or as a result of administration. The MAK, its chimeras or conjugates, which have the property of inhibiting the biological activity of hIL-10 in EBV caused disorders, with lymphomas with their own hIL-10 production or with tumors Find. They are suitable for administration in case of T cell-mediated allergies Autoimmune diseases as well as after transplants.

Die Konformationsänderung von humanem Interleukin-10 nach der Bindung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen monoklonalen Antikörper an dieses Zytokin und gleichzeitig verstärkter oder verminderter Expression von anderen biologisch wichtigen Epitopen des hIL-10 ermöglicht die spezifische Immunmodulierung der von diesem Zytokin abhängigen Prozesse in vitro und in vivo (Beispiel 8).The conformational change of human interleukin-10 after binding in the present Monoclonal antibodies described to this cytokine and simultaneously enhanced or decreased expression of other biologically important epitopes of the hIL-10 enables the specific immunomodulation of the processes dependent on this cytokine in vitro and in vivo (Example 8).

Humanes Interleukin-10 wird nach der Bindung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an das Zytokin stabilisiert und vor dem Abbau durch proteolytische Enzyme geschützt, wodurch die biologische Halbwertzeit des humanen Interleukin-10 verlängert wird. Human interleukin-10 is turned on after binding of the monoclonal antibodies according to the invention the cytokine is stabilized and protected from degradation by proteolytic enzymes, which makes the biological half-life of human interleukin-10 is prolonged.

Die erfindungsgemäße Lösung besteht, neben der Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen humanes Interleukin-10 (a-IL-10-mAK) gerichtet sind, in der Gewinnung der die a-IL-10-mAK- produzierenden Hybridom-Zellinien, die durch Verschmelzung der Milzzellen von mit humanem Interleukin-10 immunisierten Mäusen mit murinen Myelomzellen entstehen und aus denen nachfolgend a-hIL-10-mAK produzierende Klone isoliert und vermehrt werden. Es werden die Immunglobulienklassen IgA, IgD, IgE, IgM oder IgG-Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 bzw. IgG4 produziert. Die monoklonalen Antikörper sind gekennzeichnet durch die Inhibierung der biologischen Aktivität des humanen Interleukin-10 nach Bindung dieser mAK an das Zytokin. Sie tragen zur Stabilisierung von hIL-10 und zur Verlängerung der biologischen Halbwertzeit des hIL-10 nach Bindung dieser mAK an das Zytokin bei. Ein entscheidendes Kennzeichen der mAk besteht darin, daß sie nach ihrer Bindung an humanes Interleukin-10 die Konformation dieses Zytokins ändern und mit der Konformationsänderung gleichzeitig eine bessere oder schlechtere Präsentation von verschiedenen Epitopen dieses Zytokins hervorrufen, wodurch hIL-10 durch Proteine/Peptide schneller oder langsamer erkannt wird und die biologische Wirkung von hIL-10 verstärkt oder abgeschwächt wird.The solution according to the invention consists, in addition to the production of monoclonal antibodies, against human interleukin-10 (a-IL-10 mAb) are directed in the extraction of the a-IL-10 mAb producing hybridoma cell lines by fusing the spleen cells from human Interleukin-10 immunized mice with murine myeloma cells arise and from which follow clones producing a-hIL-10-MAK can be isolated and propagated. It will be the Immunoglobulin classes IgA, IgD, IgE, IgM or IgG subclasses IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 produced. The monoclonal antibodies are characterized by the inhibition of the biological ones Activity of human interleukin-10 after binding this mAb to the cytokine. You contribute to Stabilization of hIL-10 and to extend the biological half-life of hIL-10 after binding this mac to the cytokine. A crucial characteristic of the mAb is that it follows their binding to human interleukin-10 change the conformation of this cytokine and with the Conformational change at the same time a better or worse presentation of different ones Epitopes of this cytokine elicit, making hIL-10 faster or faster through proteins / peptides is recognized more slowly and the biological effect of hIL-10 is enhanced or weakened.

Die mAk der Gruppen A bis F binden innerhalb einer Gruppe an das gleiche - für diese Gruppe charakteristische Epitop des hIL-10 binden, welches räumlich von den Epitopen der anderen Gruppen getrennt ist. Dabei bewirken mAK der Gruppen A und B eine Konformationsänderung des Zytokins bewirken mit dem Ergebnis, daß andere Epitope des hIL-10 besser oder schlechter präsentiert werden und dadurch die Geschwindigkeit verändert wird, mit der diese Epitope durch andere Proteine/Peptide erkannt werden. Die mAK der Gruppe C erkennen das Zytokin schneller, wenn ein mAk der Gruppe A oder B an das Zytokin gebunden wird. Die erfindungsgemäßen Chimären dieser mAK im konstanten Teil bestehen aus humanem Ig und im variablen, insbesondere im hypervariablen Teil, aus den beanspruchten monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interleukin-10. Die Fab-Fragmente dieser mAK entstehen durch proteolytische Einwirkung von Papain im Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 15 zu dem jeweiligen mAK unter leicht reduzierenden Bedienungen im Gegenwart von Cystein in Konzentration von 5 bis 15 mM. Die Konjugate dieser mAk bestehen aus magnetischen Beads, radioaktiven Substanzen, Arzneimitteln, fluoreszierenden oder farbbildenden Substanzen und aus den monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interleukin-10. In speziellen Ausführungsformen sind die monoklonalen Antikörper gegen humanes Interleukin-10, ihre Chimären, Konjugate oder Fab- Fragmente in Liposomen eingekapselt.The mAbs of groups A to F bind to the same within a group - for this group characteristic epitope of the hIL-10 bind which is spatially different from the epitopes of the other groups is separated. Here, MAK of groups A and B cause a change in the conformation of the cytokine with the result that other epitopes of the hIL-10 are presented better or worse and thereby changing the rate at which these epitopes are affected by other proteins / peptides be recognized. Group C mAbs recognize the cytokine more quickly when a group A mAb or B is bound to the cytokine. The chimeras of this mAb according to the invention in constant Part consist of human Ig and in the variable, especially in the hypervariable part, from the claimed monoclonal antibodies to human interleukin-10. The Fab fragments of this MACs are caused by the proteolytic action of papain in a ratio of 1: 5 to 1:15 to that respective MAK under slightly reducing operations in the presence of cysteine in concentration from 5 to 15 mM. The conjugates of this mAb consist of magnetic beads, radioactive Substances, drugs, fluorescent or color-forming substances and from the monoclonal antibodies to human interleukin-10. In special embodiments, the monoclonal antibodies against human interleukin-10, their chimeras, conjugates or Fab- Fragments encapsulated in liposomes.

Die monoklonalen Antikörper, ihre Fab-Fragmente, Chimären oder Konjugate lassen sich zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Interleukin-10-abhängigen Erkrankungen sowie für Immunaffinitätssäulen verwenden. Sie dienen zur quantitativen Bestimmung von humanem Interleukin- 10 in verschiedenen Flüssigkeiten in einem Sandwich-ELISA. Sie können zur Immunmodulierung von humanem Interleukin-10 abhängigen Prozessen verwendet werden.The monoclonal antibodies, their Fab fragments, chimeras or conjugates can be used Diagnosis, prophylaxis and therapy of interleukin-10-dependent diseases as well as for Use immunoaffinity columns. They are used for the quantitative determination of human interleukin 10 in different liquids in a sandwich ELISA. You can use it to immunomodulate human interleukin-10 dependent processes can be used.

Beim Enzyme Linked Immunosorhent Assay (ELISA) zum Nachweis mAK gegen hIL-10, ihrer Chimären, Konjugate und Fab-Fragmente werden 96-Well-Platten mit hIL-10 beschichtet, mit Rinder- Albumin in ELISA-Puffer geblockt, mit Waschpuffer gewaschen und so gelagert. Die zu testenden Proben werden in den Wells inkubiert, danach gewaschen, mit anti-Mausimmunglobulin-Peroxidase gekoppelten-Antikörpern inkubiert, mit Waschpuffer gewaschen, die Wells mit Peroxidasesubstrat gefüllt, die enzymatische Reaktion mit Stoplösung beendet und die Absorption in einem Photometer gemessen wird. Das Testbesteck zur Bestimmung der a-hIL-10-mAK, ihrer Fab-Fragmente, Chimären und Konjugate besteht aus 96-Well-Platten, h-IL-10-Lösung in Carbonat/Bicarbonatpuffer, Rinder- Albumin-Lösung, ELISA-Puffer aus Na-Phosphat und NaCl mit pH 7,4, Waschpuffer aus ELISA- Puffer und Tween 20, anti Mausimmunglobulin Peroxidase gekoppelten Antikörper Lösung, Peroxidasesubstrat-Lösung aus Orthophenodiamin, H₂O₂ und Na-Citrat mit pH 5,0, sowie aus einer Stopplösung, bestehend aus Schwefelsäure und Na-Sulfit.In the Enzyme Linked Immunosorhent Assay (ELISA) for the detection of mAK against hIL-10, their Chimeras, conjugates and Fab fragments are coated on 96-well plates with hIL-10, with bovine Albumin blocked in ELISA buffer, washed with washing buffer and stored in this way. The ones to be tested Samples are incubated in the wells, then washed with anti-mouse immunoglobulin peroxidase coupled antibodies incubated, washed with wash buffer, the wells with peroxidase substrate filled, the enzymatic reaction ended with stop solution and the absorption in a photometer is measured. The test kit for determining the a-hIL-10 mAb, its Fab fragments, chimeras and conjugate consists of 96-well plates, h-IL-10 solution in carbonate / bicarbonate buffer, beef Albumin solution, ELISA buffer made of Na phosphate and NaCl with pH 7.4, wash buffer made of ELISA Buffer and Tween 20, anti mouse immunoglobulin peroxidase coupled antibody solution, Peroxidase substrate solution of orthophenodiamine, H₂O₂ and Na citrate with pH 5.0, and from one Stop solution consisting of sulfuric acid and Na sulfite.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. The invention is explained in more detail using exemplary embodiments.

Embodiments example 1 Enzyme immunoassay for the detection of anti-interleukin-10 antibodies

Zum Nachweis von anti-hIL-10-mAK in den Kulturüberständen der Hybridomzellen sowie zum semi qantitativen Vergleich der Antikörperproduktion verschiedener Klone wird erfindungsgemäß ein ELISA entwickelt. 96 Well-Platten werden über 24 Stunden bei 4°C mit 50 ml pro Napf coating solution (0,5 mg/ml humanes Interleukin-10 in 0,1 M Carbonat/Bicarbonatpuffer mit dem pH 9,6) beschichtet. Die Platten werden danach mit 100 ml pro Well 1%igem Rinder in ELISA-Puffer (0,01 M Na-Phosphat mit dem pH 7,4; 0,3 M NaCl) für 2 Stunden bei Raumtemperatur geblockt und 4 mal mit 150 µl pro Napf Waschpuffer (ELISA-Puffer; 0,1% v:v Tween 20) gewaschen. So vorbereitete ELISA-Platten können ohne Veränderungen der Sensitivität bei -22°C für ein Jahr gelagert werden. Um die nicht spezifische Reaktivität der mAK mit dem Plastikmaterial der Platten auszuschließen, wird für alle Platten eine Negativkontrolle gemessen, bei der die Platten anstatt mit hIL-10 zur Beschichtung nur mit 1%igem Rinder-Albumin in ELISA-Puffer inkubiert werden. 50 ml der zu testenden Hybridomüberstände pro Well werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 4 Waschschritten gibt man 50 ml pro Napf eines Ziege-anti-Maus-IgG-Peroxidasegekoppelten-Antikörpers (0,8 mg/ml), der mit dem Verdünnungspuffer (5% Gelifundol in Waschpuffer) 1 : 2000 verdünnt wird. Nach 1,5 Stunden Inkubation werden die Platten 4 mal gewaschen und mit 50 µl pro Well Peroxidasesubstrat (100 mM Na-Citrat mit dem pH 5,0; 5,5 mM OPD; 0,003 v:v Wasserstoffperoxid) gefüllt. Die enzymatische Reaktion wird mit 50 µl pro Well Stopplösung (2 M Schwefelsäure, 0,05 M Natriumsulfit) gestoppt und die Absorption bei 492 nm in einem Plattenphotometer gemessen.For the detection of anti-hIL-10 mAb in the culture supernatants of the hybridoma cells as well as for the semi According to the invention, an quantitative comparison of the antibody production of different clones is carried out using an ELISA developed. 96 well plates are washed over 24 hours at 4 ° C with 50 ml per well coating solution (0.5 mg / ml human interleukin-10 coated in 0.1 M carbonate / bicarbonate buffer with pH 9.6). The Plates are then mixed with 100 ml per well of 1% cattle in ELISA buffer (0.01 M Na phosphate the pH 7.4; 0.3 M NaCl) blocked for 2 hours at room temperature and 4 times with 150 µl per well Wash buffer (ELISA buffer; 0.1% v: v Tween 20) washed. ELISA plates prepared in this way can Can be stored at -22 ° C for one year without changes in sensitivity. To the non-specific Excluding the reactivity of the MAK with the plastic material of the plates becomes one for all plates Negative control measured, in which the plates instead of hIL-10 for coating only with 1% Bovine albumin can be incubated in ELISA buffer. 50 ml of the hybridoma supernatants to be tested per Wells are incubated for 2 hours at room temperature. After 4 washing steps, 50 ml are added per Well of a goat anti-mouse IgG peroxidase-coupled antibody (0.8 mg / ml), which with the Dilution buffer (5% Gelifundol in wash buffer) is diluted 1: 2000. After 1.5 hours of incubation the plates are washed 4 times and with 50 ul per well peroxidase substrate (100 mM Na citrate with the pH 5.0; 5.5 mM OPD; 0.003 v: v hydrogen peroxide). The enzymatic reaction is carried out with 50 µl per well stop solution (2 M sulfuric acid, 0.05 M sodium sulfite) stopped and the absorption at 492 nm measured in a plate photometer.

Example 2 Immunization, fusion, cloning and recovery of the monoclonal antibodies

Als Fusionspartner verwendete Zellen:Cells used as fusion partners:

A) The myeloma cells of the Balb / c mouse myeloma cell line SP2 / 0-Agt14 (ATCC CRL 8287) (Shuiman et al. 1978), short name SP2 / 0. They represent degenerate cells derived from B lymphocytes and grow permanently in tissue cultures. These myeloma cells have the ability to mutate lost to own antibody production. Furthermore, they have an enzyme deficiency mutation in the DNA Synthetic pathway, which means that they cannot survive in a selection medium.
B) The spleen cells from those with human interleukin-10 (Recombinant Human Interleukin-10) immunized 16 week old female Balb / c mice. The 6 week old female Balb / c Mice are subcutaneously (s.c.) with 50 mg and intraperitoneally (i.p.) with 30 mg human interleukin-10 in Immunized 100 ml 0.7% NaCl solution. 6 weeks later, 40 mg of this antigen is i.p. in 100 µl 0.7% NaCl solution injected. After 4 weeks, the animals received i.p. the last boost of 40 µg human interleukin-10 in 100 µl 0.7% NaCl solution.

Die Fusion wird nach Hämmerling U. (1974, Eur. J. Immunol. 1,7 743) 3 Tage nach der letzten Boosterung durchgeführt. Die Milzen der immunisierten Mäuse werden unter aseptischen Bedingungen entnommen und durch mechanische Zerkleinerung der Organe die darin enthaltenen antikörperproduzierenden Zellen gewonnen. Sie werden mit den murinen Myelomzellen, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, im Verhältnis 1.3 gemischt und in sterilem Basismedium (Iscove′s DMEM/NUT MIX F-12) 3 mal gewaschen. Nach der Zentrifugation wird der Überstand dekantiert, die Zellen resuspendiert und von nun an bis-zum Ende der Fusion durch Schwenken des Röhrchens in einem Wasserbad auf 37°C erwärmt. Die Zellen werden in 1 ml sterilem, auf 37°C vorgewärmten Polyethylenglykol 4000 ausgedünnt, 1 Minute bei 37°C inkubiert und danach schrittweise mit Basismedium auf 30 ml verdünnt. Nach der Zentrifugation wird der Überstand dekantiert, die Hybridome resuspendiert und mit Kulturmedium (10% hitzeaktiviertes fetales Kälberserum in Basismedium) verdünnt. Sie werden dann in einer Dichte von 1.2 × 10⁵ Zellen pro Napf in 96 Well-Platten ausgesät und in feuchter 5%iger CO₂-Atmosphäre kultiviert. Die Platten werden am Tag zuvor mit 3 × 10⁵ Maus-Peritoneal Makrophagen als Feeder Zellen pro Napf beschickt. Einen Tag nach der Fusion wird das Medium gegen Selektionsmedium (10 µM Hypoxanthin; 1,6 µM Thymidin, 0,4 µM Aminopterin in Kulturmedium) ausgetauscht. In solchem Medium können nur Verschmelzungsprodukte überleben, bei denen die Enzymmangelmutation der Myelomzellen durch die Erbinformation der Milzzelle ausgeglichen wird. Myelomzellen selbst und die nicht verschmolzenen Milzzellen sterben ab. 5 Tage danach werden 50% des Mediums durch frisches Selektionsmedium ersetzt, zum gleichen Zeitpunkt sind die ersten Klone sichtbar. Nach weiteren 4 Tagen werden die zellfreien Kulturüberstände (ZKU) zur Testung mit dem im Beispiel 1 beschriebenen ELISA auf die Produktion der spezifischen Antikörper gegen hIL-10 entnommen. Von 792 getesteten ZKÜ′s enthalten 33 Antikörper, die signifikant an hIL-10 binden. Die Hybridome, welche diese Antikörper produzieren, werden in 96 WeIl-Platten mit Maus-Peritoneal-Makrophagen in HT-Medium (Kulturmedium mit Zusatz von Hypoxantin und Thymidin) kloniert. Dabei wird die Hälfte der Platte mit statistisch 10 Zellen pro Napf, die andere Hälfte mit 1 Zelle pro Napf ausgesät. Das HT-Medium wird jeden zweiten Tag zu 50% ausgetauscht und nach 10 Tagen durch Kulturmedium ersetzt. Zellfreie Zellkulturüberstände werden regelmäßig mit dem im Beispiel 1 beschriebenen ELISA auf die Anwesenheit der spezifischen Antikörper gegen hIL-10 getestet. Die Hybridomkulturen, welche diese Antikörper produzieren, werden noch 4 mal mit der limiting dilution Technik rekloniert. Dabei werden die Zellen so verdünnt, daß statistisch 0.5 Zellen pro Well eingesetzt werden. Dadurch isoliert man einzelne Klone, die stabil und in hoher Quantität monoklonale Antikörper produzieren. Nach Klonierung und den Reklonierungen werden aus 33 primär positiven Kulturen 15 verschiedene Hybridom-Zellinien etabliert. Sie werden in Flüssigstickstoff konserviert, unter aseptischen Bedingungen in sterilen Gewebekulturen unter Verwendung entsprechender Nährmedien kultiviert und produzieren dabei 15 neue, verschiedene anti- Interleukin-10-Antikörper. Die Hybridom-Zellinien H-CB/RS/. . . und die durch sie produzierten monoklonalen Antikörper wurden als:According to Hämmerling U. (1974, Eur. J. Immunol. 1,7 743), the fusion was carried out 3 days after the last Booster carried out. The spleens of the immunized mice are grown under aseptic conditions removed and by mechanical crushing of the organs contained therein antibody-producing cells. You will be familiar with the murine myeloma cells that are located in the exponential growth phase, mixed in a ratio of 1.3 and in a sterile base medium (Iscove's DMEM / NUT MIX F-12) washed 3 times. After centrifugation, the supernatant is decanted, the cells resuspended and from now until the end of the fusion by swirling the Tube heated to 37 ° C in a water bath. The cells are sterile in 1 ml, at 37 ° C Pre-warmed polyethylene glycol 4000, incubated for 1 minute at 37 ° C and then gradually diluted to 30 ml with base medium. After centrifugation, the supernatant is decanted, the hybridomas resuspended and with culture medium (10% heat-activated fetal Calf serum in basic medium) diluted. They are then in a density of 1.2 × 10⁵ cells per well sown in 96 well plates and cultivated in a humid 5% CO₂ atmosphere. The plates are on The day before, 3 × 10⁵ mouse peritoneal macrophages were fed as feeder cells per well. A day after the fusion, the medium is against selection medium (10 uM hypoxanthine; 1.6 uM thymidine, 0.4 µM aminopterin in culture medium). In such a medium can only Fusion products survive in which the enzyme deficiency mutation of the myeloma cells by the Genetic information of the spleen cell is balanced. Myeloma cells themselves and those not fused Spleen cells die. 5 days later, 50% of the medium is passed through fresh selection medium replaced, at the same time the first clones are visible. After another 4 days, the cell-free culture supernatants (ZKU) for testing with the ELISA described in Example 1 for the Production of specific antibodies against hIL-10 taken. Of 792 tested ZKÜ's included 33 antibodies that bind significantly to hIL-10. The hybridomas that produce these antibodies are in 96 well plates with mouse peritoneal macrophages in HT medium (culture medium with additive of hypoxanthine and thymidine). Half of the plate is statistically 10 cells per Well, the other half sown with 1 cell per well. The HT medium is 50% every other day exchanged and replaced after 10 days by culture medium. Cell-free cell culture supernatants will be regularly with the ELISA described in Example 1 for the presence of the specific Antibodies tested against hIL-10. The hybridoma cultures that produce these antibodies become recloned 4 times using the limiting dilution technique. The cells are diluted so that statistically 0.5 cells can be used per well. This isolates individual clones that are stable and in produce high quantity of monoclonal antibodies. After cloning and recloning 15 different hybridoma cell lines established from 33 primarily positive cultures. You will be in Liquid nitrogen preserved, under aseptic conditions in sterile tissue cultures Cultivated using appropriate nutrient media and produce 15 new, different anti Interleukin-10 antibody. The hybridoma cell lines H-CB / RS /. . . and those produced by them monoclonal antibodies were:

bezeichnet.designated.

Die Unterschiedlichkeit der 15 Hybridom-Zellinien und der von ihnen erzeugten mAK beruht nicht allein auf der Tatsache, daß sie aus getrennten Primärkulturen entstammen, sondern auch auf Unterschieden im Isotyp, im isoelektrischen Punkt, in der Reaktion mit hIL-10, im Vermögen, die Aktivität des hIL-10 in biologischen Testsystemen zu inhibieren, im Epitop, das sie erkennen wie auch in der Kreuzreaktivität mit anderen Zytokinen und Antigenen.The difference between the 15 hybridoma cell lines and the mAK they generate is not due solely on the fact that they come from separate primary cultures, but also on differences in the isotype, in the isoelectric point, in the reaction with hIL-10, in ability, the activity of hIL-10 inhibit in biological test systems, in the epitope that they recognize as well as in the Cross reactivity with other cytokines and antigens.

Example 3 Production, purification, peroxidase labeling and manufacture of Fab fragments of the monoclonal antibody

10⁶ Zellen einer in der Erfindung beschriebenen Hybridom-Zellinie werden aus Flüssigstickstoff aufgetaut, im Basismedium gewaschen, mit 30 ml Kulturmedium verdünnt und in eine 260-ml- Zellkulturflasche überführt. Nach 3 Tagen sind die Zellen gut angewachsen. Die werden auf zwei Flaschen verteilt. Wenn sie eine Dichte von etwa 100 000 Zellen pro ml erreichen, werden sie aus beiden Flaschen suspendiert und in eine Rollerflasche überführt. Diese wird mit Kulturmedium auf 150 ml aufgefüllt. Die Zelldichte in der Rollerflasche wird alle zwei Tage kontrolliert, und es wird jeweils soviel Kulturmedium zugegeben, daß sie im Bereich zwischen 50 000 und 150 000 Zellen pro ml gehalten werden kann. Wenn das gewünschte Suspensionsvolumen erreicht ist, läßt man die Zellen ungestört in der Rollerflasche wachsen, bis sie eine Dichte von 300 000 Zellen pro ml erreichen. Bei dieser Zelldichte stoppt die Proliferation der Zellen. Die Produktion von mAK geht jedoch noch weiter und die Rollerflasche wird deshalb noch einen Tag kultiviert. Durch Abzentrifugieren der Suspension gewinnt man den zellfreien mAK-haltigen Kulturüberstand. Die erfindungsgemäßen mAK können je nach Verwendungszweck in diesem ungereinigten Überstand oder nach einer Reinigung verwendet werden.10⁶ cells of a hybridoma cell line described in the invention are made of liquid nitrogen thawed, washed in the base medium, diluted with 30 ml culture medium and placed in a 260 ml Cell culture bottle transferred. After 3 days, the cells have grown well. They will be on two Bottles distributed. When they reach a density of around 100,000 cells per ml, they become out both bottles suspended and transferred to a roller bottle. This is reduced to 150 with culture medium ml filled up. The cell density in the roller bottle is checked every two days, and it is always so much culture medium added that they are in the range between 50,000 and 150,000 cells per ml can be held. When the desired suspension volume is reached, the cells are allowed to leave grow undisturbed in the roller bottle until they reach a density of 300,000 cells per ml. At this cell density stops the proliferation of the cells. However, the production of mAK continues and the roller bottle is therefore cultivated for another day. By centrifuging the suspension one obtains the cell-free culture supernatant containing MAK. The MAK according to the invention can each used in this unpurified supernatant or after cleaning according to the intended use will.

Der zellfreie, mAK-haltige Kulturüberstand wird über eine Tangentialdruckanlage mit einer Filterfläche von 260 cm² und einer Ausschlußgrenze von 30 kD auf 1120 konzentriert. Der pH-Wert des Konzentrates wird mit 1 M NaOH-Lösung auf 4,7 eingestellt und dann das Konzentrat auf eine Protein- G-Sepharose-Säule mit einem Gelvolumen von 10 ml aufgetragen. Danach muß die Säule mit 0,02 M NaH₂PO₄ × H₂O mit dem pH 7,0 gewaschen werden. Der mAK wird mit 0,1 M Glyzinpuffer mit dem pH 2,7 eluiert, durch eine Dialysemembran gegen PBS mit dem pH 7,4 umgepuffert und auf seine Reinheit elektrophoretisch (SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach Swank R. T. und Munkres K. D., Anal. Biochem. 39, 462, 1971) untersucht. Die Konzentration des mAK′s wird durch UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Verwendung von Protein G hat gegenüber Protein A zwei Vorteile. Zum einen werden die murinen Antikörper durch Protein-G wesentlich besser gebunden als durch Protein-A. Zum anderen bindet Protein, G bei pH 4,7 zwar die murinen Antikörper, nicht jedoch die bovinen, die durch Zugabe von FKS ins Kulturmedium gelangen. Je nach FKS Charge liegen diese im Kulturmedium zwischen 10 und 200 mg/ml vor. Bei der Reinigung über Protein A ist es nicht möglich, diese unspezifischen bovinen Antikörper von den gewünschten murinen anti-hIL-10-mAK zu trennen. The cell-free, MAK-containing culture supernatant is over a tangential pressure system with a filter surface of 260 cm² and an exclusion limit of 30 kD concentrated to 1120. The pH of the Concentrate is adjusted to 4.7 with 1 M NaOH solution and then the concentrate is placed on a protein G-Sepharose column applied with a gel volume of 10 ml. Then the column with 0.02 M NaH₂PO₄ × H₂O can be washed with pH 7.0. The mAb is mixed with the 0.1 M glycine buffer pH 2.7 eluted, buffered through a dialysis membrane against PBS with pH 7.4 and on his Purity electrophoretic (SDS polyacrylamide gel electrophoresis according to Swank R. T. and Munkres K. D., Anal. Biochem. 39, 462, 1971). The concentration of the MAK's is determined by UV absorption determined at 280 nm. Using Protein G has two advantages over Protein A. To the the murine antibodies are bound much better by Protein-G than by Protein-A. On the other hand, protein, G binds the murine antibodies at pH 4.7, but not the bovine antibodies get into the culture medium by adding FCS. Depending on the FKS batch, these are in the Culture medium between 10 and 200 mg / ml before. When cleaning with Protein A, it is not possible to separate these non-specific bovine antibodies from the desired murine anti-hIL-10 mAb.

Die in der Erfindung beschriebenen mAK können nach der Methode von Wilson und Nakane (Immunologische Arbeitsmethoden, G. Fischer, 1984) mit der Peroxidase aus Meerrettich markiert werden. Im ersten Schritt werden durch Oxidation mit Natriumperiodat Aldehydgruppen im Kohlenhydratanteil der Peroxidase erzeugt. Im dem nächsten bilden diese mit den Aminogruppen des mAK′s Schiffsche Basen aus, aus denen nach Reduktion mit Natriumborhydrid stabile Bindungen (stabile sekundäre Amine) erzeugt werden. Eine Eigenvernetzung der Peroxidase findet praktisch nicht statt, da diese nur wenige freie Aminogruppen besitzt und die Oxidation bei einem niedrigem pH-Wert durchgeführt wird.The MAK described in the invention can be according to the Wilson and Nakane method (Immunological Working Methods, G. Fischer, 1984) labeled with the horseradish peroxidase will. In the first step, oxidation with sodium periodate aldehyde groups in Carbohydrate content of the peroxidase generated. In the next, these form with the amino groups of the mAK's Schiff bases, from which stable bonds after reduction with sodium borohydride (stable secondary amines). There is practically no self-crosslinking of the peroxidase instead, since it has only a few free amino groups and the oxidation at a low pH is carried out.

Aus den erfindungsgemäßen mAK können die monoklonalen murinen Fab-Fragmente hergestellt werden. Das geschieht durch die proteolytische Einwirkung von Papain unter leicht reduzierenden Bedingungen. Die Konzentration der mAK wird auf 1,3 mg/ml eingestellt. Dazu wird EDTA bis zur Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Zu dieser Lösung wird Cystein (Endkonzentration 10 mM) gegeben. Anschließend wird diese Lösung sofort mit Papain versetzt. Das Verhältnis von Papain zu mAK beträgt 1 : 10 (w : w). Nach 65 Minuten Inkubation bei 37°C wird zur Lösung Iodessigsäure bis zur Endkonzentration von 25 mM gegeben. Die Rolle des Cysteins bei der Spaltung von murinen IgG mit Papain besteht nicht nur in der Aktivierung des Papains, sondern auch in der Reduktion der Disulfidbrücken zwischen den g-Ketten. Die Endkonzentration von 10 mM ist essentiell für diese Spaltung: ist sie niedriger, entstehen Fab₂-Fragmente; ist sie höher, werden die Disulfidbrücken zwischen der leichten (L) und der schweren (H) Kette gelöst. Diese Spaltungsbedingungen wurden für die erfindungsgemäßen mAK als die günstigsten unter verschiedenen getesteten (von 0,1 mM bis 20 mM Cystein, von 1 : 200 bis 1 : 10 w : w Papain zu dem mAK) ermittelt. Die höhere Konzentration von Papain als bei anderen Protokollen (Immunologische Arbeitsmethoden, G. Fischer, 1984; Monoklonale Antikörper, Springer Verlag, 1988) bewirkt die schnellere und effektivere Spaltung - durch kürzere Zeit für die Reduktion der Disulfidbrücken zwischen der L- und der H-Kette. Die erfolgte Fragmentierung des mAK′s wird durch eine SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese überprüft. Die Fab-Fragmente können sofort nach der Spaltung oder erst nach Aufreinigung mit der Anionenaustausch-Chromatographie oder mit der Protein-A-Sepharose-Säule (Monoklonale Antikörper, Springer Verlag, 1988) verwendet werden.The monoclonal murine Fab fragments can be produced from the mAbs according to the invention will. This happens through the proteolytic action of papain under slightly reducing Conditions. The concentration of the MAK is adjusted to 1.3 mg / ml. For this EDTA will be up to Final concentration of 2 mM was added. Cysteine (final concentration 10 mM) is added to this solution given. Then this solution is immediately mixed with papain. The relationship of papain to MAK is 1:10 (w: w). After 65 minutes of incubation at 37 ° C, iodoacetic acid is added to the solution Given a final concentration of 25 mM. The role of cysteine in the cleavage of murine IgG with Papain consists not only in the activation of papain, but also in the reduction of Disulfide bridges between the g chains. The final concentration of 10 mM is essential for this Cleavage: if it is lower, Fab₂ fragments arise; if it is higher, the disulfide bridges become loosened between the light (L) and the heavy (H) chain. These conditions of division were for the MAK according to the invention as the cheapest among various tested (from 0.1 mM to 20 mM cysteine, from 1: 200 to 1:10 w: w papain to the mAb). The higher concentration of Papain than in other protocols (Immunological Working Methods, G. Fischer, 1984; Monoclonale Antibody, Springer Verlag, 1988) brings about the faster and more effective cleavage - due to the shorter time for the reduction of the disulfide bridges between the L and H chains. The fragmentation that occurred the mAK's is checked by an SDS-polyacrylamide electrophoresis. The Fab fragments can immediately after cleavage or only after purification with anion exchange chromatography or with the Protein A Sepharose column (monoclonal antibodies, Springer Verlag, 1988) will.

Characterization of the monoclonal antibodies against human interleukin-10 Example 4 Reaction of the monoclonal antibodies with human interleukin-10 in that in Example 1 described ELISA and in the Western immunoblot

Es wird eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von hIL-10 durchgeführt. Die Proteinbanden werden nach Kyhse-Andersen (Biochem Biophys. Methods 10, 203, 1984) auf Nitrozellulosefolie übertragen. Die Folie wird mit Verdünnungspuffer über 30 Minuten bei Raumtemperatur geblockt, danach 3 mal in Waschpuffer gewaschen und anschließend mit den jeweiligen mAK (10 mg/ml) über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 3 Waschschriften wird sie für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG-Peroxidasekonjugat) inkubiert. Danach wird die Nitrozellulosefolie wieder 3 mal gewaschen und mit einem Peroxidasesubstrat (0,1 M Tris mit dem pH 7,57; 1,2 mM DAB; 0,1% v : w NiCl₂) behandelt. Im positiven Falle, wenn der untersuchte mAK an das an der Folie immobilisierte Protein bindet, kommt es zur Farbreaktion. Im so durchgeführten Western- Immunoblot erkennen 15 in der Erfindung beschriebene mAK die gleiche Proteinbande in dem erwarteten Molekulargewichtsbereich von hIL-10.SDS polyacrylamide gel electrophoresis of hIL-10 is performed. The protein bands according to Kyhse-Andersen (Biochem Biophys. Methods 10, 203, 1984) on nitrocellulose film transfer. The film is blocked with dilution buffer for 30 minutes at room temperature, then washed 3 times in washing buffer and then with the respective mAb (10 mg / ml) Incubated at 4 ° C overnight. After 3 washes, it is washed with the for 2 hours at room temperature secondary antibody (anti-mouse IgG peroxidase conjugate) incubated. After that the Nitrocellulose film washed again 3 times and with a peroxidase substrate (0.1 M Tris with the pH 7.57; 1.2 mM DAB; 0.1% v: w NiCl₂) treated. In the positive case, if the examined MAK to the When protein immobilized on the film binds, there is a color reaction. In the Western Immunoblots recognize 15 mAbs described in the invention as the same protein band in the expected molecular weight range of hIL-10.

Die erfindungsgemäßen mAK binden an hIL-10 auch in dem im Beispiel 1 beschriebenen ELISA (ELISA-B.1). Die Ergebnisse des Testes sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt:The mAbs according to the invention bind to hIL-10 also in the ELISA described in Example 1 (ELISA-B.1). The results of the test are summarized in Table 1:

Tabelle 1 Table 1

Example 5 Determination of reactivity with other antigens, isotype and light chains of the monoclonal antibodies

Die erfindungsgemäßen mAK werden auf ihre Reaktivität mit anderen Antigenen als hIL-10 getestet. Die Untersuchung wird mit mehreren selbst entwickelten ELISA′s vorgenommen. Sie verläuft wie im Beispiel 1 beschrieben. Lediglich das für die Beschichtung der Platten verwendete Antigen wird variiert. Es wurden hIL-2, hIL-6, hIFN-g, hTNF-a, Tetanustoxin, Diphtherietoxin, humanes Kollagen Typ 2, Lipopolisacharid (LPS) von Pseudomonas aeruginosa Srotyp 10, LPS von Klebsiella pneumoniae, Lipid A von E. coli und k Casein mit Konzentration je nach Antigen zwischen 1 mg/ml und 40 mg/ml in 0,1 M Carbonat/Bicarbonatpuffer mit dem pH 9,6 an der Plastikplatte adsorbiert. Die mAK der Gruppen A, B, C, D, F binden in solchen Tests an keines der Antigene. Der mAK CH/RS/5H7 (Gruppe E) erkennt in diesen ELISA hIFN-g und hTNF-a. Um die nicht spezifische Reaktivität der mAK mit dem Plastikmaterial der Platten auszuschließen, wird für alle Platten eine Negativkontrolle gemessen, bei der die Platten anstatt mit oben erwähnten Antigenen nur mit 1%igem Rinder-Albumin in ELISA-Puffer inkubiert werden.The mAbs according to the invention are tested for their reactivity with antigens other than hIL-10. The investigation is carried out with several self-developed ELISA's. It runs like in Example 1 described. Only the antigen used to coat the plates is varied. HIL-2, hIL-6, hIFN-g, hTNF-a, tetanus toxin, diphtheria toxin, human collagen type 2, Lipopolisacharid (LPS) from Pseudomonas aeruginosa Srotyp 10, LPS from Klebsiella pneumoniae, Lipid A of E. coli and k casein with a concentration between 1 mg / ml and 40 mg / ml in 0.1 M, depending on the antigen Carbonate / bicarbonate buffer with pH 9.6 adsorbed on the plastic plate. The MAK of groups A, B, C, D, F do not bind to any of the antigens in such tests. The mAK CH / RS / 5H7 (group E) recognizes in this ELISA hIFN-g and hTNF-a. The non-specific reactivity of the MAK with the To exclude plastic material from the plates, a negative control is measured for all plates of the plates instead of with the above-mentioned antigens, only with 1% bovine albumin in ELISA buffer be incubated.

Mit dem Mouse-Hybridoma-Subtyping wurde gezeigt, daß die mAK der Gruppen A, B, C, F zur Subklasse IgG1, die mAk der Gruppen D und E zur Klasse IgM gehören und die mAK aller Gruppen leichte Ketten des Typs Kappa besitzen.With mouse hybridoma subtyping it was shown that the MAK of groups A, B, C, F for Subclass IgG1, the mAbs of groups D and E belong to the IgM class and the mAbs of all groups have light chains of the Kappa type.

Example 6 Analytical polyacrylamide gel isoelectric focusing (PAG-IEF) of monoclonal Antibodies

Die Durchführung von PAG-IEF erfolgt mittels Phast-System^TM (Pharmatia, Schweden). Es wurden 5%ige PhastGels® mit einem pH-Gradienten von pH 3,0-9,0 genutzt. Die untersuchten mAK werden 60 Minuten mit einer Spannung von 200 V bei 15°C fokussiert. Zum Nachweis der Proteinbanden wird die Silbernitratfärbemethode durchgeführt. Die Proteine werden am Gel in 20%iger Trichloressigsäure fixiert, mit einem Gemisch aus Ethanol/Essigsäure/Wasser (1/0,5//8,5) und nachfolgend mit 8%iger Glutaraldehödlösung inkubiert. Nach wiederholtem Waschen des Gels mit Ethanol/Essigsäure/ Wasser (1/0,5//8,5) wird es in 0,5%iger Silbernitratlösung inkubiert und die Farbreaktion mit 2,5%iger Natriumcarbonatlösung mit pH 10,5 entwickelt. Die Gele werden vor dem Lufttrocknen mit 5%iger Glycerollösung konserviert. Die 15 erfindungsgemäßen mAK zeigen für jeden dieser mAK ein charakteristisches Muster aus mehreren Banden. Diese Mikroheterogenität beruht vermutlich auf unterschiedlicher Glykosylierung (bei identischer Aminosäuresequenz) oder auf posttranslationalen Modifikationen.PAG-IEF is carried out using the Phast-System ^TM (Pharmatia, Sweden). 5% PhastGels® with a pH gradient of pH 3.0-9.0 were used. The examined MAK are focused for 60 minutes with a voltage of 200 V at 15 ° C. The silver nitrate staining method is used to detect the protein bands. The proteins are fixed on the gel in 20% trichloroacetic acid, with a mixture of ethanol / acetic acid / water (1 / 0.5 // 8.5) and then incubated with 8% glutaraldehyde solution. After repeated washing of the gel with ethanol / acetic acid / water (1 / 0.5 // 8.5), it is incubated in 0.5% silver nitrate solution and the color reaction is developed with 2.5% sodium carbonate solution with pH 10.5. The gels are preserved with 5% glycerol solution before air drying. The 15 MAK according to the invention show a characteristic pattern of several bands for each of these MAK. This micro heterogeneity is probably due to different glycosylation (with identical amino acid sequence) or to post-translational modifications.

Example 7 Determination of the affinity constant

Die Affinitätskonstanten (K_A=1/K_D) der erfindungsgemäßen mAK zu hIL-10 werden nach der Methode von Friguet et al. (1985, J. Immunol. M. 77 : 305) bestimmt. Die mAK werden mit Verdünnungspuffer auf die erwünschten Konzentrationen (je nach mAK zwischen 0,4 µg/ml und 3,0 µg/ml) verdünnt und mit fallender hIL-10-Konzentration (von 5 µg/ml bis 0,05 µg/ml) zur Einstellung des Gleichgewichtszustandes über 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgt die Bestimmung des freien, an dem hIL-10 nicht gebundenen mAK (mAK_f) mit dem im Beispiel 1 beschriebenen ELlSA, indem 50 µl des Inkubationsgemisches in die Kavitäten der ELISA-Platte überführt und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach Entfernung der ungebundenen Reaktanten erfolgte die Quantifizierung des gebundenen mAK mit Hilfe entsprechenden Konjugates. Die Berechnung des K_D- Wertes basiert auf dem linearen Zusammenhang zwischen Absorption (Enzymaktivität im ELISA) und Konzentration des an den mit hIL-10 beschichteten Plastikplatten gebundenen mAK, welche der Konzentration des mAK_f gleich ist. Unter der Voraussetzung daß die Konzentration von totalem mAK, totalem hIL-10 und von dem mAK_f bekannt sind, ist es möglich, mit dem Programm CBEIA_C (Glaser R W., 1993, J. Immunol. Methods 179 : 265) den K_D-Wert zu ermitteln (Tabelle 2).The affinity constants (K _A = 1 / K _D ) of the mAK according to the invention for hIL-10 are determined by the method of Friguet et al. (1985, J. Immunol. M. 77: 305). The MAK are diluted with the dilution buffer to the desired concentrations (depending on the MAK between 0.4 µg / ml and 3.0 µg / ml) and with decreasing hIL-10 concentration (from 5 µg / ml to 0.05 µg / ml ) incubated at 4 ° C for 24 hours to establish the equilibrium state. The free MAK (mAK _f ) not bound to the hIL-10 is then determined using the ELISA described in Example 1 by transferring 50 .mu.l of the incubation mixture into the cavities of the ELISA plate and incubating for 90 minutes at room temperature. After removing the unbound reactants, the bound MAK was quantified using the appropriate conjugate. The calculation of the K _D value is based on the linear relationship between absorption (enzyme activity in the ELISA) and concentration of the MAK bound to the plastic plates coated with hIL-10, which is the same as the concentration of the MAK _f . Provided that the concentration of total mAK, total hIL-10 and of the mAK _{f are} known, it is possible to use the program CBEIA_C (Glaser R W., 1993, J. Immunol. Methods 179: 265) to determine the K _D Value to be determined (Table 2).

Tabelle 2 Table 2

Example 8 Characterization of the epitopes of human interleukin-10 to which the monoclonal antibodies bind and impact of this bond

Die Bindung der erfindungsgemäßen mAK an hIL-10 wurde auch mit BIAlite^TM (Pharmacia Biosensor AB) untersucht. Dabei werden 2 unterschiedliche Methoden verwendet. Bei der Methode 1. wird das hIL-10 kovalent am Sensor Chip (Pharmacia Biosensor AB) gebunden. Bei der Messung fließt über dem Chip Lösung mit untersuchtem mAK. Wenn der mAK an den immobilisierten hIL-10 gebunden wird, kommt es zur Veränderung des Reflexionswinkels des Lichtes, mit welchem das Sensor Chip bestrahlt wird. Die Winkeländerung (RU) entspricht der Menge des Chip-gebundenen Proteins (1 RU = 10^-9 kg/m²). Die Auswertung erfolgt mit dem Programm BIAevaluation 2.0 (Pharmacia Biosensor AB). Von den 15 erfindungsgemäßen mAK erkennen das immobilisierte hIL-10 im solchen Testsystem 12 verschiedene mAK. Nach der Immobilisierung von 400 RU hIL-10 an dem Sensor Chip wird für jeden der 12 mAK (mAK₁) die Menge (RU₁) des mAK₁ ermittelt, die während 100 s bei 3 µl/min Fließgeschwindigkeit der Antikörperlösung aus dieser Lösung an dem Chip gebunden wird. Danach wird der an hIL-10 gebundene mAK₁ mit 1 M Glyzinpuffer mit pH 2,7 vor dem Sensor Chip eluiert und ein anderer mAK (mAK₂) so lange auf dieses Chip gegeben, bis er an alle für ihn zugänglichen Epitope des Zytokins gebunden wird und keine Veränderungen des Reflexionswinkels mehr meßbar sind. Anschließend wird die Menge (RU₂) des mAK₁ gemessen, die jetzt während gleicher Zeit, bei gleicher Fließgeschwindigkelt der Antikörperlösung am Zytokin bindet. Wenn das Verhältnis RU₁ zu RU₂ größer als 0,60 ist, erkennt der mAK₁ ein Epitop, das räumlich getrennt von dem Epitop des mAK₂ liegt. Ist das Verhältnis größer als 1,2 bewirkt der mAK₂ eine Konformationsänderung des hIL-10 mit gleichzeitiger verstärkter Präsentation des Epitops, an das der mAK₁ bindet. Wenn die beiden mAK das gleiche Epitop erkennen, ist das Verhältnis unter 0,25. Die Ergebnisse der Testung nach der Methode 1. sind in der Tabelle 3 dargestellt.The binding of the mAb according to the invention to hIL-10 was also investigated using BIAlite ^™ (Pharmacia Biosensor AB). Two different methods are used. In method 1, the hIL-10 is covalently bound to the sensor chip (Pharmacia Biosensor AB). During the measurement, a solution with the examined MAK flows over the chip. If the MAK is bound to the immobilized hIL-10, the angle of reflection of the light with which the sensor chip is irradiated changes. The change in angle (RU) corresponds to the amount of chip-bound protein (1 RU = 10 ^-9 kg / m²). The evaluation is done with the program BIAevaluation 2.0 (Pharmacia Biosensor AB). Of the 15 MAK according to the invention, the immobilized hIL-10 recognizes 12 different MAK in such a test system. After immobilization of 400 RU hIL-10 on the sensor chip, the amount (RU₁) of the mAK₁ is determined for each of the 12 mAK (mAK₁) which bound to the chip from this solution for 100 s at 3 µl / min flow rate of the antibody solution becomes. Then the mAK 1 bound to hIL-10 is eluted with 1 M glycine buffer with pH 2.7 in front of the sensor chip and another mAK (mAK 2) is added to this chip until it is bound to all epitopes of the cytokine that are accessible to it and no changes in the angle of reflection can be measured. Then the amount (RU₂) of the mAK₁ is measured, which now binds to the cytokine for the same time at the same flow rate of the antibody solution. If the ratio RU₁ to RU₂ is greater than 0.60, the mAK₁ recognizes an epitope that is spatially separate from the epitope of the mAK₂. If the ratio is greater than 1.2, the mAK₂ causes a change in the conformation of the hIL-10 with simultaneous increased presentation of the epitope to which the mAK₁ binds. If the two mAbs recognize the same epitope, the ratio is below 0.25. The results of testing according to method 1 are shown in table 3.

Tabelle 3 Table 3

Die 12 mAK, welche im oben beschriebenen Testsystem mit immobilisiertem hIL-10 reagieren, werden in 3 Gruppen: A, B, C eingeteilt.The 12 mAbs that react with immobilized hIL-10 in the test system described above will divided into 3 groups: A, B, C.

Die mAK innerhalb einer Gruppe binden an das gleiche, für diese Gruppe charakteristische Epitop des hIL-10, welches räumlich getrennt von den Epitopen der anderen Gruppen ist. Die Bindung eines mAK aus der Gruppe A am hIL-10 bewirkt die Konformationsänderung des Zytokins. Gleichzeitig werden andere Epitope besser oder schlechter präsentiert, was die Geschwindigkeit verändert, mit welcher diese Epitope durch andere Peptide erkannt werden (z. B. mAK aus der Gruppe C bindet an hIL-10 bis 700% schneller, wenn daran bereits ein mAK aus der Gruppe A gebunden ist). Die Eigenschaft, die Konformation von hIL-10 zu ändern, besitzen auch die mAK aus der Gruppe B; wenn ein mAK aus dieser Gruppe am hIL-10 gebunden wird, erkennen die mAK der Gruppe C das Zytokin bis 177% schneller.The MAK within a group bind to the same epitope of the group that is characteristic of this group hIL-10, which is spatially separated from the epitopes of the other groups. The binding of a mAK from group A on hIL-10 causes the conformational change of the cytokine. Be at the same time other epitopes better or worse presented, which changes the speed at which these epitopes can be recognized by other peptides (e.g. group C mAb binds to hIL-10 bis 700% faster if a MAK from group A is already bound to it). The property that The conformation of hIL-10 also have the MAK from group B; if a MAK from this group is bound to hIL-10, the MAK of group C recognize the cytokine up to 177% more quickly.

Solche Effekte sind bei Zytokinen bis jetzt noch nicht beschrieben worden. Sie können in der Zukunft die größte Bedeutung für die Modulierung der Zytokin-Wirkung in vivo und in vitro haben. Die Konformationsänderung des Zytokins mit gleichzeitiger besserer oder schlechterer Präsentation von verschiedenen Epitopen bewirkt, daß diese Epitope durch Peptide schneller oder langsamer erkannt werden und die Bindung zwischen dem Zytokin und dem Peptid stabiler oder instabiler wird. Das muß Einfluß auf die biologische Wirkung dieses Zytokins haben - sie verstärken oder abschwächen. Die Anwendung von Verbindungen, die solche Konformationsänderung auslösen, wird die biologische Aktivität von Zytokinen lokal in die erwünschte Richtung ändern, ohne gleichzeitiges Auftreten von systemischen Nebenwirkungen.Such effects have not yet been described in cytokines. You can in the future have the greatest importance for the modulation of the cytokine effect in vivo and in vitro. The Conformational change of the cytokine with simultaneous better or worse presentation of different epitopes causes these epitopes to be recognized faster or slower by peptides and the bond between the cytokine and the peptide becomes more stable or unstable. It has to Have an influence on the biological effect of this cytokine - they increase or decrease. The Application of compounds that trigger such a change in conformation becomes biological Change the activity of cytokines locally in the desired direction without the simultaneous occurrence of systemic side effects.

Die Einteilung der oben erwähnten 12 mAK in 3 Gruppen wurde durch den Test nach der Methode 2. bestätigt. Dabei wird an dem Sensor Chip ein Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper immobilisiert und einer der 12 mAK (mAK₁) so lange auf das Chip gegeben, bis keine mehr Veränderungen von RU nachweisbar sind. Die immer noch freien Bindungsstellen der anti-Maus-IgG-Antikörper werden mit einem murinen, polyklonalen Immunglobulingemisch besetzt. Danach wird hIL-10 (10 µg/ml) so lange hinzugegeben, bis keine Veränderungen des Reflexionswinkels gemessen werden. Anschließend ermittelt man die Menge von jedem der 12 mAK (mAK₂), die während 100 s bei 5 µl/min Fließgeschwindigkelt der Antikörperlösung aus dieser Lösung an den Sensor-Chip gebunden wird. Wenn diese Menge signifikant ist, erkennt der mAK₂ ein Epitop, welches räumlich getrennt von dem Epitop des mAK₁ liegt. Die Ergebnisse dieses Tests sind am Beispiel eines mAK′s aus jeder Gruppe in der Tabelle 4 dargestellt:The division of the above-mentioned 12 mAb into 3 groups was carried out by the test according to method 2. approved. A goat anti-mouse IgG antibody is immobilized on the sensor chip and one the 12 mAK (mAK₁) placed on the chip until no more changes in RU are detectable. The still free binding sites of the anti-mouse IgG antibodies are identified a murine, polyclonal immunoglobulin mixture. Then hIL-10 (10 µg / ml) is so long added until no changes in the angle of reflection are measured. Subsequently one determines the amount of each of the 12 MAK (mAK₂), which during 100 s at 5 µl / min Flow rate of the antibody solution from this solution is bound to the sensor chip. If this amount is significant, the mAK₂ recognizes an epitope that is spatially separated from that Epitope of the mAK₁ lies. The results of this test are based on the example of a MAK from each group in shown in Table 4:

Tabelle 4 Table 4

Zur Charakterisierung der Epitope, an welche der mAK CB/RS/6F6 und der mAK CB/RS/5H7 binden, wurde ein Epitopen-ELISA entwickelt. Die 96 Well-Platten werden mit jedem dieser mAK (10 µg/ml), wie im Beispiel 1 beschrieben, beschichtet. Die 15 mAK (Konzentration zwischen 0,5 µg/ml und 3 µg/ml) werden über 24 Stunden mit 0,2 µg/ml hIL-10 bei 4°C inkubiert. Danach wird dieses Inkubationsgemisch auf die mit CB/SR/6F6 und auf die mit CB/RS/5H7 beschichteten Platten für 2 Stunden übertragen. Nach 4 Waschschritten gibt man bei IgG-Antikörper als sekundären Antikörper ein Ziege-anti-Maus-IgG-Peroxidasekonjugat, bei IgM-Antikörper ein Ziege-anti-Maus-IgM- Peroxidasekonjugat. Es folgen, wie im Beispiel 1 beschrieben, 4 Waschschritte und die Zugabe von Peroxidasesubstrat und Stopplösung. Im positiven Falle, wenn der an der Plastikplatte adsorbierte mAK und der mit hIL-10 vorinkubierte mAK räumlich getrennte Epitope des Zytokins erkennen, kommt es zur Farbreaktion. Als Negativkontrolle wird die Lösung des entsprechenden mAK ohne hIL-10 verwendet. Die in diesem Test gemessene OD-Werte sind am Beispiel eines mAK′s aus jeder Gruppe in der Tabelle 5 dargestellt.To characterize the epitopes to which the mAK CB / RS / 6F6 and the mAK CB / RS / 5H7 bind, an epitope ELISA was developed. The 96-well plates are mixed with each of these mAbs (10 µg / ml), as described in Example 1, coated. The 15 mAb (concentration between 0.5 µg / ml and 3 µg / ml) are incubated for 24 hours with 0.2 µg / ml hIL-10 at 4 ° C. After that, this will Incubation mixture on the plates coated with CB / SR / 6F6 and on the plates coated with CB / RS / 5H7 for 2 Hours transferred. After 4 washing steps, IgG antibodies are entered as secondary antibodies Goat anti-mouse IgG peroxidase conjugate, for IgM antibodies a goat anti-mouse IgM Peroxidase conjugate. As described in Example 1, 4 washing steps and the addition of Peroxidase substrate and stop solution. In the positive case, if the adsorbed on the plastic plate recognize mac and the spatially separated epitope of the cytokine comes pre-incubated with hIL-10 it to the color reaction. As a negative control, the solution of the corresponding MAK without hIL-10 used. The OD values measured in this test are based on the example of a MAK from each group shown in Table 5.

Tabelle 5 Table 5

Mit diesem Test wird gezeigt, daß die mAK CB/RS/6F6 und CB/RS/5H7 zwei Epitope erkennen, welche räumlich getrennt von den Epitopen der Gruppen A, B, und C lokalisiert sind. Diese mAK werden in zwei neue Gruppen D und E eingeteilt:
D: CB/RS/6F6
E: CB/RS/5H7.This test shows that the mAK CB / RS / 6F6 and CB / RS / 5H7 recognize two epitopes which are located spatially separated from the epitopes of groups A, B, and C. These MAK are divided into two new groups D and E:
D: CB / RS / 6F6
E: CB / RS / 5H7.

Der mAK CB/RS/8A7 bindet an ein Epitop, welches räumlich getrennt von den Epitopen der Gruppen D und E liegt. Deswegen wurde CB/RS/8A7 in eine neue Gruppe F eingeteilt:
F: CB/RS/8A7.The mAK CB / RS / 8A7 binds to an epitope that is spatially separated from the epitopes of groups D and E. Therefore CB / RS / 8A7 has been divided into a new group F:
F: CB / RS / 8A7.

Example 9 Influence of monoclonal antibodies on the biological activity of the human Interleukin-10

Der Einfluß der mAK auf die biologische Aktivität des hIL-10 wird in einem selbst entwickelten Testsystem mit mononuklearen Zellen bestimmt. Diese Zellen sind in der Lage, nach Stimulation mit LPS TNF-a zu synthetisieren und zu sezemieren. Das hIL-10 hemmt die beiden Prozesse. Der untersuchte mAK (mit fallender Endkonzentration von 50 µg/ml bis 0,0 µg/ml) wird mit hIL-10 (Endkonzentration 300 µg/ml) gemischt und 12 Stunden bei 37°C vorinkubiert. Die für den Test benötigen Zellen werden aus heparinisiertem Venenblut gewonnen, welches unter sterilen Bedingungen entnommen und mit PBS 1 : 1 gemischt wird. 10 ml steriles Lymphozyten-Separationsmedium wird in 50 ml Zentrifugenröhrchen vorgelegt und mit 20 ml Blut-PBS-Gemisch vorsichtig überschichtet. Nach der Zentrifugation werden die ringförmige Zwischenschicht mit den mononuklearen Zellen entnommen und die Zellen mit Basismedium 3 mal gewaschen. Danach werden sie mit LPS-freien Kulturmedium auf 10⁶ Zellen pro ml verdünnt, mit LPS (Endkonzentration 100 µg/ml) und mit der 12 Stunden vorinkubierten Lösung gemischt und über 4 Stunden in feuchter 5%iger CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Das Verhältnis der TNF-a Konzentration im Zellüberstand (ZÜ) der Proben mit mAK zu der TNF-a Konzentration im ZÜ der Proben, in denen die mAK-Konzentration 0,0 µg/ml beträgt, beschreibt den Einfluß des untersuchten mAK auf die biologische Aktivität des hIL-10. Die biologische Aktivität des hIL-10 wird inhibiert, wenn das Verhältnis größer 1,25 beträgt. Sind die TNF-a- Konzentrationen in den beiden Proben gleich, hat der untersuchte mAK keinen signifikanten Einfluß auf die Wirkung dieses Zytokins.The influence of the MAK on the biological activity of the hIL-10 is developed in-house Test system with mononuclear cells determined. These cells are able to stimulate with LPS TNF-a to synthesize and secrete. The hIL-10 inhibits the two processes. Of the investigated MAK (with a falling final concentration of 50 µg / ml to 0.0 µg / ml) is tested with hIL-10 (Final concentration 300 µg / ml) mixed and preincubated at 37 ° C for 12 hours. The one for the test cells are obtained from heparinized venous blood, which is under sterile conditions removed and mixed with PBS 1: 1. 10 ml sterile lymphocyte separation medium is in 50 ml centrifuge tubes are placed and carefully overlaid with 20 ml blood-PBS mixture. After The annular interlayer with the mononuclear cells is removed and centrifuged the cells were washed 3 times with base medium. Then they are put on with LPS-free culture medium Diluted 10⁶ cells per ml, with LPS (final concentration 100 µg / ml) and with the 12 hours pre-incubated solution and mixed for 4 hours in a humid 5% CO₂ atmosphere at 37 ° C cultured. The ratio of the TNF-a concentration in the cell supernatant (ZÜ) of the samples with mAb to that TNF-a concentration in the AT of samples in which the MAK concentration is 0.0 µg / ml describes the influence of the investigated MAK on the biological activity of the hIL-10. The biological HIL-10 activity is inhibited when the ratio is greater than 1.25. Are the TNF-a- Concentrations in the two samples were the same, the examined MAK had no significant influence the effect of this cytokine.

In der Tabelle 5 sind die Konzentrationen der erfindungsgemäßen mAK (in M/l) dargestellt, bei welchen die biologische Aktivität des hIL-10 um 50% vermindert ist. Table 5 shows the concentrations of the mAb according to the invention (in M / l) at which reduces the biological activity of the hIL-10 by 50%.

Tabelle 5 Table 5

Claims

1. Monoclonal antibodies which are directed against the cytokine human interleukin-10 (a-hIL-10-MAK) and which are produced by hybridoma cell lines, characterized in that the binding of the MAK to human interleukin-10 is the conformation of this cytokine changes and that MAK of groups A to F within a group bind the same epitope of hIL-10 which is characteristic of this group and which is spatially separated from the epitopes of the other groups.

2. Monoclonal antibodies according to claim 1, characterized by the Stabilization of hIL-10 and the prolongation of the biological half-life of hIL-10 after binding this mAb to the cytokine.

3. Monoclonal antibodies according to claim 1, characterized in that the Binding of this MAK to human interleukin-10 with its Conformational change and with a simultaneous better or worse Presentation of various epitopes associated with this cytokine and whereby hIL-10 is recognized faster or slower by proteins / peptides and the biological effects of hIL-10 are enhanced or weakened.

4. Monoclonal antibodies according to claim 1 to 3, characterized in that the MAK

- Groups A and B change the conformation of the cytokine, with the result that other epitopes of the hIL-10 are presented better or worse, thereby changing the speed at which these epitopes are recognized by other proteins / peptides
- Group C recognize the cytokine more quickly if a group A or B mAb is bound to the cytokine
- Groups D and E, which recognize two epitopes which are spatially separated from the epitopes of groups A, B and C.
- bind group F to an epitope that is spatially separated from the epitopes of groups D and E.

5. Monoclonal antibodies according to claim 1 to 3, characterized in that Chimeras of this MAK in the constant part from human Ig and in the variable as well in the hypervariable part from the claimed monoclonal antibodies against human interleukin-10 exist.

6. Monoclonal antibodies according to claim 1 to 3, characterized in that Fab fragments of this MAK by proteolytic action of papain on the monoclonal antibodies against human interleukin-10 arise.

7. Monoclonal antibodies according to claim 1 to 3, characterized in that Conjugates of this mAb from magnetic beads, radioactive substances, Medicines, fluorescent or color-forming substances and from the claimed monoclonal antibodies to human interleukin-10 exist or the claimed monoclonal antibodies against human Interleukin-10, its chimeras or Fab fragments encapsulated in liposomes are.

8. Medicines, characterized in that they are the monoclonal active ingredients Antibodies according to claims 1 to 4, their chimeras, Fab fragments or conjugates according to claim 5 to 7 included.

9. Hybridoma cell lines according to claim 1, characterized in that they are a-hIL-10- produce mac.

10. Hybridoma cell lines according to claim 1 and 9, characterized in that they by fusing spleen cells from mice immunized with hIL-10 murine myeloma cells develop and then the a-hIL-10-MAK producing Clones are isolated and multiplied.

11. Hybridoma cell lines according to claim 1, 9 and 10, characterized in that Clones are isolated and propagated, the immunoglobulin classes IgA, IgD, IgE, IgM or produce IgG subclasses IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

12. Use of monoclonal antibodies according to claims 1 to 4, their chimeras, Fab fragments or conjugates according to claims 5 to 7 for targeted purification of human interleukin-10 from various liquids, thereby characterized in that immunoaffinity columns are used for this.

13. Use of monoclonal antibodies according to claims 1 to 4, their chimeras, Fab fragments or conjugates according to claims 5 to 7 for quantitative Determination of human interleukin-10 in different liquids in a sandwich ELISA.

14. Use of monoclonal antibodies according to claim 1 to 4, their Fab Fragments, chimeras or conjugates according to claim 5 to 7 for inhibiting the biological activity of the hIL-10 after binding this mAb to the cytokine.

15. Use of monoclonal antibodies according to claim 1 to 4, their Fab Fragments, chimeras or conjugates according to claims 5 to 7 for stabilization of hIL-10 and to prolong the biological half-life of hIL-10 after Binding of this mAb to the cytokine.

16. Use of monoclonal antibodies according to claim 1 to 4, their Fab Fragments, chimeras or conjugates according to claim 5 to 7 for Conformational change of human interleukin-10.

17. Use of monoclonal antibodies according to claim 1 to 4, their Fab Fragments, chimeras or conjugates according to claim 5 to 7 for Immunomodulation of hIL-10 dependent processes.

18. Use of monoclonal antibodies of groups A or B according to claim 1 and 4, for immunomodulation according to claim 17, characterized in that a conformational change of hIL-10 is induced.

19. A method for producing monoclonal antibodies according to claims 1 to 4, characterized in that spleen cells of human interleukin-10 immunized mice and murine myeloma cells fused together and then the fusion products (hybridomas) are cloned and clones producing a-hIL-10-MAK can be isolated and propagated.

20. The method for producing the Fab fragments according to claim 6 proteolytic action of papain, characterized in that papain in the Ratio of 1: 5 to 1:15 to the respective MAK under slightly reducing Conditions in the presence of cysteine at a concentration of 5 to 15 mM is used.

21. A method for producing chimeras and conjugates according to claim 5 and 7, characterized by the use of monoclonal antibodies against human Interleukin-10 according to claim 1 to 4 as a starting material.

22. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the detection of MAK against hIL- 10, their chimeras, conjugates and Fab fragments according to claims 1 to 7, characterized in that corrugated sheets coated with hIL-10, with cattle Album blocked in ELISA buffer, washed with wash buffer and stored in this way and the samples to be tested are incubated in the wells, then washed, incubated with anti-mouse immunoglobulin peroxidase-coupled antibodies, with Wash buffer washed, the wells filled with peroxidase substrate, the enzymatic reaction with stop solution and the absorption in one Photometer is measured.

23. Test kit according to claim 22 for determining the a-hIL-10 mAb, its Fab fragments, chimeras or conjugates according to claims 1 to 7, consisting of a) 96-well plates, b) hIL- 10 solution in carbonate / bicarbonate buffer, c) bovine albumin solution, d) ELISA Buffer from Na phosphate and NaCl with pH 7.4, e) Wash buffer from ELISA buffer and Tween 20, f) anti-mouse immunoglobulin peroxidase coupled antibody Solution, g) peroxidase substrate solution of orthophenodiamine, H₂O₂ and Na Citrate with pH 5.0, h) Stop solution made of sulfuric acid and Na sulfite.