DD251156B5

DD251156B5 - METHOD FOR OBTAINING HAPTEN-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES

Info

Publication number: DD251156B5
Application number: DD29261386A
Authority: DD
Inventors: Burkhard Dipl-Biol Dr Micheel; Gudrun Scharte; Peter Dipl-Ing Dr Rer Stolley
Original assignee: Max Delbrueck Centrum
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1986-07-18
Publication date: 1993-11-18
Also published as: DD251156A1

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen niedermolekulare Substanzen (Haptene), die an Proteine gekoppelt werden können. Es wird insbesondere die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) beschrieben, den wichtigsten Marker für Immunfluoreszenztests. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, Biologie, Veterinärmedizin, Landwirtschaft und Biotechnologie.The invention relates to a method for obtaining monoclonal antibodies against low molecular weight substances (haptens), which can be coupled to proteins. In particular, the production of monoclonal antibodies against the fluorescent dye fluorescein isothiocyanate (FITC) is described, the most important marker for immunofluorescence tests. Field of application of the invention is medicine, biology, veterinary medicine, agriculture and biotechnology.

Characteristic of the known technical solutions

Antikörper gegen niedermolekulare Substanzen (Haptene) lassen sich durch Kopplung der Haptene an Proteine und anschließende Immunisierung geeigneter Versuchstiere gewinnen.Antibodies to low molecular weight substances (haptens) can be obtained by coupling the haptens to proteins and then immunizing suitable experimental animals.

Werden Mäuse immunisiert, so können nach Fusion der Milzzellen mit entsprechenden Myelomzellen in der Zellkultur mit Hilfe von Polyäthylenglykol (PEG) Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, gewonnen werden. Entsprechend dieser Methode wurden bereits monoklonale Antikörper gegen FITC hergestellt, die jedoch nur für Grundlagenuntersuchungen herangezogen wurden (KRANZ, D. M., und VOSS, E. W., Jr., MoI. Immunol. 18,889,1981).If mice are immunized, after fusion of the spleen cells with corresponding myeloma cells in the cell culture with the help of polyethylene glycol (PEG) hybridomas producing monoclonal antibodies can be obtained. According to this method, monoclonal antibodies against FITC have already been prepared, but these were only used for basic investigations (KRANZ, D. M., and VOSS, E.W., Jr., MoI Immunol., 18,889,1981).

Nach Markierung der Myelomzellen mit FITC und anschließender PEG-Fusion mit Milzzellen von gegen FITC immunisierten Mäusen wurde eine Erhöhung der Ausbeute an Hybridomen beobachtet, die monoklonale Antikörper gegen FITC produzieren (sog. Antigen-gerichtete Fusion; KRANZ, D.M., BILLING, P.A., HERRON, J. N., and VOSS, E.W., Jr., Immunol. Commun. 9,639,After labeling of the myeloma cells with FITC and subsequent PEG fusion with spleen cells from FITC-immunized mice, an increase in the yield of hybridomas producing monoclonal antibodies to FITC (so-called antigen-directed fusion; KRANZ, DM, BILLING, PA, HERRON , JN, and VOSS, EW, Jr., Immunol. Commun., 9,639,

Als Alternative zur konventionellen PEG-Fusion wurde für einige Antigene die Elektrofusion zur Gewinnung von Hybridomen, die entsprechende monoklonale Antikörper produzieren, angewendet. (KARSTEN, U., PAPSDORF, G., ROLOFF, G., STOLLEY, P., ABEL, H., WALTHERS, I., WEISS, H., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21,733,1985).As an alternative to conventional PEG fusion, for some antigens, electrofusion was used to obtain hybridomas that produce corresponding monoclonal antibodies. (KARSTEN, U., PAPSDORF, G., ROLOFF, G., STOLLEY, P., ABEL, H., WALTHERS, I., WHITE, H., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 21, 737, 1985).

Die Elektrofusion bietet die Möglichkeit einer besseren Steuerung des Fusionsgeschehens. Über die Avidin-Biotin-Bindung ist es gelungen, eine erhöhte Rate Antigen-spezifischer Hybridome mit Hilfe der Elektrofusion herzustellen. Voraussetzung für diese Methodik ist die Kopplung von Avidin an die Myelomzellen sowie die Inkubation der Milzzellen mit Biotin-markiertem Antigen.Electrofusion offers the possibility of better control of the fusion process. The avidin-biotin binding has been able to produce an increased rate of antigen-specific hybridomas with the aid of electrofusion. The prerequisite for this methodology is the coupling of avidin to the myeloma cells as well as the incubation of the spleen cells with biotin-labeled antigen.

Die Kopplungsprozeduren sind verhältnismäßig aufwendig, zudem ist die Gesamtmethodik in erster Linie für höhermolekulare Substanzen, wie Proteine, geeignet (LO, M.M.S.,TSONG, T. Y., CONRAD, M.K., STRITTMATTER, S. M., HESTER, L.D., and SNYDER, S. H., Nature 310,792,1984).The coupling procedures are relatively expensive, and the overall methodology is primarily suitable for higher molecular weight substances, such as proteins (LO, MMS, TSONG, TY, CONRAD, MK, STRITTMATTER, SM, HESTER, LD, and SNYDER, SH, Nature 310,792, 1984).

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen niedermolekulare Verbindungen (Haptene) in guten Ausbeuten mit starker Bindungsfähigkeit und hoher Spezifität herzustellen.The invention aims to produce monoclonal antibodies against low molecular weight compounds (haptens) in good yields with strong binding ability and high specificity.

Explanation of the essence of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-Hapten-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit einem Hapten-Protein-Komplex immunisiert, die Milzzellen entnimmt und über Elektrofusion mit Myelomzellen fusioniert, die an ihrer Oberfläche mit dem gleichen Hapten markiert wurden, das auch zur Immunisierung verwendet wurde. Die fusionierten Zellen werden in Mikrotestplatten ausgesät, die Haptenspezifischen Antikörper-produzierenden Hybridzellen selektiert, kloniert, weitervermehrt, ggf. in flüssigem Stickstoff gelagert und zur Produktion der monoklonalen Antikörper in an sich bekannter Weise kultiviert oder Mäusen in Aszitesform transplantiert.The process according to the invention for the production of monoclonal anti-hapten antibodies is characterized in that mice are immunized with a hapten-protein complex, which takes out spleen cells and fused via electrofusion with myeloma cells which have been labeled on their surface with the same hapten, the also used for immunization. The fused cells are seeded in microtest plates, the hapten-specific antibody-producing hybrid cells selected, cloned, weitervermehrt, optionally stored in liquid nitrogen and cultured for the production of monoclonal antibodies in a conventional manner or transplanted mice in ascites form.

Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist die Markierung der zur Fusion verwendeten Myelomzellen mit dem Hapten, gegen das monoklonale Antikörper hergestellt werden sollen, unter gleichzeitiger Anwendung der Elektrofusion. Durch die Markierung der Myelomzellen mit dem Hapten wird eine bevorzugte Bindung dieser Zellen an Milzzellen möglich gemacht, die Rezeptoren für das Hapten besitzen und die Vorläufer der Antikörper-produzierenden Zellen darstellen. Durch Elektrofusion werden dann diese Zellanlagerungen bevorzugt zur Fusion gebracht. Das Verfahren ist für die verschiedensten Haptene, wie Markierungssubstanzen oder Farbstoffe, die an Proteine gebunden werden können, anwendbar. So können z. B. monoklonale Antikörper gegen den wichtigsten Fluoreszenzmarker Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) hergestellt werden, die nicht mit dem strukturell nahe verwandten Marker Tetramethylrhodamin-isothiozyanat (TRITC) reagieren. Erfindungsgemäß wird dafür der Klon B 13-DE1 (ZIM-Liste 1986: 0109) eingesetzt.An essential component of the invention is the labeling of the myeloma cells used for the fusion with the hapten, against which monoclonal antibodies are to be produced, with simultaneous use of the electrofusion. By labeling the myeloma cells with the hapten, it is possible to preferentially bind these cells to spleen cells which possess receptors for the hapten and which are precursors of the antibody-producing cells. By electrofusion, these cell attachments are then preferably brought to fusion. The method is applicable to a wide variety of haptens, such as labeling substances or dyes that can be bound to proteins. So z. B. monoclonal antibodies against the main fluorescent marker fluorescein isothiocyanate (FITC) are produced, which do not react with the structurally closely related marker tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). According to the clone B 13-DE1 (ZIM list 1986: 0109) is used.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) wurde an Helix pomatia-Hämozyanin gekoppelt, und Balb/c-Mäuse wurden mit diesem Hapten-Protein-Komplex immunisiert.1. Fluorescein isothiocyanate (FITC) was coupled to Helix pomatia hemocyanin and Balb / c mice were immunized with this hapten-protein complex.

2. Vitale X63-AG8.653 Myelomzellen wurden mit FITC unter physiologischen Bedingungen markiert und mit den Milzzellen der immunisierten Tiere durch Elektrofusion fusioniert. Kultivierung und Klonierung erfolgten entsprechend den üblichen Methoden.2. Vitale X63-AG8.653 myeloma cells were labeled with FITC under physiological conditions and fused with the spleen cells of the immunized animals by electrofusion. Cultivation and cloning were carried out according to the usual methods.

3. Die Selektion der Antikörper-produzierenden Klone erfolgte mit einem Festphasen-Radioimmuntest unter Verwendung von FITC-markiertem Rinderserumalbumin und ¹²⁶J-markiertem Anti-Maus-Immunglobulin, mit dem nur Anti-FITC-Antikörper erfaßt werden.3. The selection of the antibody-producing clones was carried out by a solid-phase radioimmunoassay using FITC-labeled bovine serum albumin and ¹²⁶ J-labeled anti-mouse immunoglobulin, which detects only anti-FITC antibodies.

4. Die Klone, die Anti-FITC-Antikörper produzierten, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren und in der Zellkultur und in Inzuchtmäusen in Aszitesform zur Antikörpergewinnung weitervermehrt.4. The clones producing anti-FITC antibodies were frozen in liquid nitrogen in a known manner and further amplified in cell culture and in ascites for antibody recovery.

5. Antikörper des Kfons B 13-DE1 zeichnen sich durch gute Bindungseigenschaften aus und besitzen eine außerordentlich hohe Spezifität. So reagieren sie überhaupt nicht mit Tetramethyl-rhodamin-isothiozyanat (TRITC), das dem FITC in seiner Struktur außerordentlich ähnlich ist.5. Antibodies of the Kfons B 13-DE1 are characterized by good binding properties and have an extremely high specificity. Thus, they do not react at all with tetramethyl-rhodamine-isothiocyanate (TRITC), which is extremely similar in structure to the FITC.

Der Klon wurde im ZIM (Liste 1986) unter der Nr.0109 als B 13-DE1 hinterlegt.The clone was deposited in ZIM (List 1986) under No. 0109 as B 13-DE1.

Claims

A process for obtaining hapten-specific monoclonal antibodies, characterized in that myeloma cells in the cell culture are labeled with the hapten and fused with spleen cells of mice immunized against the same hapten by electro-fusion producing the anti-hapten antibodies Hybrid clones are selected in a conventional manner, cloned and further propagated for antibody production in the cell culture or in mice in the form of ascites.

2. The method according to item 1, characterized in that for the production of monoclonal antibodies against fluorescein isothiocyanate (FITC) of the clone B 13-DE1 (ZIM list 1986: 0109) is used.