DD277087A1 - Verfahren zur gewinnung von neutralisierenden monoklonalen antikoerpern gegen humanes interferon-alpha - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neutralisierender monoklonaler Antikoerper, die zur Reaktion mit humanem Interferon-alpha (HuIFN-alpha) befaehigt sind. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern zur Neutralisation der biologischen Wirkung von HuIFN-alpha. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man nach intralienaler Immunisierung von BALB/c-Maeusen mit nativem HuIFN-alpha deren Milzzellen mit Plasmozytomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 fusioniert, Hybridome, die neutralisierende Antikoerper bilden, selektiert und durch Klonierung und mehrfache Reklonierung der Hybridomzellen mittels Mikromanipulation eine stabile Hybridomlinie etabliert, die in ueblicher Weise weiter vermehrt wird. Nach dem erfindungsgemaessen Verfahren werden durch Kultivierung von Hybridomzellen der Linien H/B71C6 und H/B71E3 die neutralisierenden neuen monoklonalen Antikoerper ZIMET B71C6 bzw. ZIMET B71E3 gewonnen. Die neuen Hybridomzellinien H/B71C6 und H/B71E3 wurden unter den Nummern ZIM-0283 bzw. ZIM-0284 in der Hinterlegungsstelle fuer Zellinien im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der AdW der DDR hinterlegt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Humanmedizin, Biologie, Veterinaermedizin und die Biotechnologie.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha (HulFN-alpha). Diese Antikörper können zur Neutralisation der biologischen Wirkung von HulFN-alpha in Biologie und Medizin, zur immunchemischen Bestimmung von nativem HulFN-alpha sowie zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung von HulFN-alpha in der Biotechnologie eingesetzt werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die biologische und medizinische Forschung, die klinische Diagnostik und die Biotechnologie.
Monoklonal Antikörper gegen HulFN-alpha sind seit 1980 bekannt (SECHER, D. S., und D. C. BURKE, Nature 285,446-450,1980; STAEHELIN.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA78,1848-1852,1981; IMAI, M. et al., J. Immunol. 128,2824-2825,1982; BERG, K., J.Interferon Res. 4,481-491,1984; NOVAK, M., et al., Acta Virol. 30,228-233,1986). Die Neutralisation von HulFN-alpha durch konventionelle und monoklonale Antikörper wurde von KAWADE und WATANABE untersucht (KAWADE. Y, und Y. WATANABE, Immunology 56,489-495,1985).
In der DDR sind die Schutzrechte WP 231007 und WP 254593 bekannt, welche die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen HulFN-alpha betreffen. Die darin beschriebenen Antikörper haben den Nachteil, daß sie die biologische Aktivität des HulFN-alpha nicht odar nicht wesentlich hemmen. Diese Antikörper binden Teilstrukturen des HulFN-alpha-Moleküls, die für seine biologische Wirkung und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren nicht essentiell sind. Daraus ergibt sich als weiterer Nachteil, daß die Bindung dieser Antikörper an das HilFN-alpha die native Struktur von Molekülbereichen nicht voraussetzt, die für die biologische Aktivität des HulFN-alpha und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren essentiell sind.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen HulFn-alpha zu gewinnen, welche die biologische Wirkung des HulFN-alpha noutralisioron.
Dor Erfindung liogt dio Aufgabe zugrunde, ein hinreichend einfaches und zuverlässig handhabbares Verfahren zur Gewinnung von noutralisiorondsn monoklonalen Antikörpern gegen HulFN-alpha anzugeben, die zur immunchemischen Bestimmung und immunaffinitätschromatographischen Anreicherung dos nativen HulFN-aipM einsotzbar sein sollen.
Erfindungsgemäß wird clioso Aufgabo wie folgt golöst:
BALB/c-lnzuchimäuse werden mit nativem HulFN-alpha mehrmals intralienal immunisiert, ihre Milzzellen in bekannter Weise mit murinen Plasmozytomzellon dor Linie P3-X63-Ag 8.653 in vitro fusioniert, die daraus entstandenen Hybridzellklone durch
Kultivierung in einem Hypoxanthin-Azaserin-Medium seloktoniert und ihrer Kulturüberstände mit Hilfe eines biologischen Neutralisationstestes in an sich bekannter Weise auf HulFN-alpha-neutralisierende Wirkung getestet. Die Hybridomzellklone, die neutralisierende Antikörper bilden, werden verfahrensgemäß mit Hilfe einer speziellen Mikromanipulationsvorrichtungkloniert und mehrfach rekloniert. Die Hybridomzellen der nach diesem Verfahren neu etablierten Linien H/B71 C6 und H/B71 E 3 werden in vitro oder nach intraperitonealer Inokulation in Paraffinum perliquidumstimulierte Mäuse in Aszitesform in vivo vermehrt. Die Gewinnung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper erfolgt aus Kulturüberstän Jen der H/B71 C6- bzw. H/B71 E3-Zellen oder aus der Aszitesflüssigkeit Hybridom-tragender BALB/c-Mäuse bzw. vorzugsweise (BALB/c χ NMRI)F1- oder (NMRI χ BALB/c)FrHybridmäuse nach gebräuchlichen isolierungwerfahren.
Die Lagerung von Konserven der Hybridomzellinien H/B71 C6 bzw. H/B71 E3 erfolgt in flüssigem Stickstoff. Din HybridomzellinienH/B71 C6undH/B71 E 3 wurden unter den Nummern ZIM-0283 bzw. ZIM-0284 in dsr Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR-1115 Berlin, Robert-Rössle-Str. 10, hinterlegt.
Die verfahrensgemäß gewonnenen neutralisierenden Antikörper ZIMcT B71 C6 und ZIMET B71 E3 haben gegenüber anderen monoklonalen Antikörpern den Vorteil, daß sie die biologische Wirkung von HulFN-alpha aufheben und bevorzugt natives HulFN-alpha binden. Sie erlauben infolge ihrer differenzierten Spezifität ei.ie Unterscheidung der biologischen Wirkung von HulFN-alpha 1 und HulFN-alpha 2.
Ausführungsbeispiel
Die Gewinnung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper erfolgt in den folgenden Arbeitsschritten:
- Weibliche Mäuse des Stammes BALB/c werden in mehrwöchigen Abständen mit jeweils 107I. U. HulFN-alpha immunisiert. Drei Tage nach der letzten intralienalen Antigeninjektion erfolgt die Fusion der Milzzellen mit murinen Plasmozytomzellen der Linie P3-X63-Ag 8.653 nach bekannten Verfahren.
- Die in einem Hyproxanthin-Azaserin-Selektionsmedium wachsenden Hybridomzellklone werden nacheinander mittels ELISA auf Produktion von murinem Immunglobulin und mittels eines zweiten ELISA auf Freisetzung von HulFN-alpha-spezifischen Antikörpern untersucht. Die neutralisierende Wirkung der monoklonalen Antikörper wird im Virus-Wirts-System Vcsicularstomat'tisviius/Madin Darby bovine Nierenzellen (MDBK) geprüft. Es werden Antikörperverdünnungsreihen mit Faktor 2 hergestellt und mit verschiedenen Interferonkonzentrationen (500,250,125 usw. bis 0,5!E/ml) 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Reduktion der IFN-Wirkung durch Bestimmung der noch vorhandenen 50%igen Hemmung der viralen Zellzerstörung im Mikrotitertest ermittelt.
- Hybridomzellklone, die neutralisierende monoklonal Antikörper mit Spezifität für HulFN-alpha freisetzen, werden mit Hilfe einer speziellen Mikromanipulationsvorrichtung kloniert und bis zur Etablierung einer stabilen Hybridomzellinie mehrfach rekloniert.
- Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper ZIMET B71C6 bzw. ZIMET B71 E 3 werden Hybridomzellen der neuen Linien H/B71C6bzw. H/B71E 3 entweder in vitro oder in Aszitesform in geeigneten Mäusen, vorzugsweise (NMRI χ BALB/c)F|-oder (BALB/c χ NMRIJFi-Hybridmäusen, vermehrt. Die neutralisierenden monoklonalen Antikörper werden aus dem Kulturüberstand bzw. aus der Aszitesflüssigkeit nach üblichen Methoden angereichert und gereinigt.
- Eigenschaften der neutralisierenden monoklonalen Antikörper ZIMET B71C6 und ZIMET B71E3:
| ZIMETB71C6 | ZIMETB71E3 | |
| Ig-Subklasse | IgGI | IgGi |
| Dissoziationskon- | ||
| stante(für | ||
| IFN-alphaD" | 5 χ 10"" M | |
| Immunglobulingehalt | ||
| imAszites | 7mg/ml | 11 mg/ml |
| Neutralisationstiter | ||
| desAszitesfür: | ||
| IFN-alpha121 | 10 500 | 3500 |
| IFN-alpha221 | 130 |
1.1 Bestimmt nach FRIGUET, B., et al., J. Immunol. Methods 77, 305-319,1<)85.
2.) Bostimmt nach KAWADE, Y„ und Y. WATANABE, Immunology 56,489-495,198G.
Claims (2)
1. Verfahren zur Gewinnung von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-alpha (HulFN-alpha) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit HulFN-alpha, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der erhaltenen Hybridome, Bestimmung ihrer Antigendeterminantenspezifität, Auswahl der spezifischen Hybridome, Etablierung von Hybridomlinien durch Klonierung und mehrfache Reklonierung und Kultivierung der Hybridomlinien bzw. Transplantation der Hybridome auf Mäuse und Passagierung in Aszitesform, gekennzeichnet dadurch, daß
- die Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit nativem HulFN-alpha erfolgt,
- die Antigendeterminatenspezif ität mittels ELISA und Festphasenbioassay bestimmt wird,
- die biologische Charakterisierung der jeweils gewonnenen monoklonalen Antikörper durch einen Neutralisationstest vorgenommen wird,
- die Klonierung bzw. Reklonierung der Hybridome durch Mikromanipulation von Einzalzellen mit Hilfe einer speziellen Vorrichtung erfolgt,
- zur Kultivierung bzw. Transplantation die neuen Hybridomlinien H/B71 C6bzw. H/B71 E3 eingesetzt und
- die monoklonalen Antikörper ZIMET B71 C6bzw. ZIMET B71 E3 aus Kulturüberständen von Hybridomzellen bzw. aus der Aszitesf lüssigkeit von Hybridom-tragenden Mäusen isoliert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die monoklonalen Antikörper
ZIMET B71 C6 bzw. ZIMET B71 E3 aus mit Paraffinum perliquidum stimulierten (NMRI χ BALE.7c) roder(BALB/c x NMRI)FrHybridmäusen isoliert werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32197888A DD277087A1 (de) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | Verfahren zur gewinnung von neutralisierenden monoklonalen antikoerpern gegen humanes interferon-alpha |
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|---|---|
| DD277087A1 true DD277087A1 (de) | 1990-03-21 |
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|---|---|
| DD (1) | DD277087A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
-
1988
- 1988-11-21 DD DD32197888A patent/DD277087A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8349331B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-01-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8557967B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-10-15 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
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