DD260867A1 - Verfahren zur herstellung von protein- und fibrinogenarmen kryopraezipitaten mit standardisiertem f viii-gehalt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von protein- und fibrinogenarmen Kryopraezipitaten mit standardisiertem F VIII-Gehalt aus einem Mittelpool von 6 bis 40 Plasmabeuteln, die aus Frischblut oder aus unter definierten Bedingungen gelagertem Blut gewonnen worden sind. Die bei Zimmertemperatur angetauten Plasmabeutel werden waehrend der Zentrifugation vollstaendig aufgetaut und die sich dabei bildende Schichtung der Proteinkonzentration des Plasmaueberstandes dazu genutzt, um nach dem Loesen des Praezipitats in der albuminreichen Zone des Plasmaueberstandes eine weitgehend selektive Repraezipitation des F VIII mit guter Ausbeute zu erreichen. Die Repraezipitation wird ohne jegliche Zusaetze von Faellungshilfsmitteln bei Temperaturen von 0 bis 20C waehrend der Zentrifugation mit 1 800 bis 2 200 U/min zwischen 30 und 60 min lang durchgefuehrt. Dabei wird nach der mit hoeherer Geschwindigkeit ablaufenden Faellung des F VIII die Repraezipitation unterbrochen, um eine bestmoegliche Abtrennung des F VIII von Begleitproteinen, insbesondere Fibrinogen, zu erzielen. Die durch Repraezipitation gewonnenen fibrinogenarmen Repraezipitate werden nach Extraktion mit eisgekuehlter Heparin/NaCl-Loesung und Loesen in Puffer gepoolt und entsprechend dem im Pool unverzueglich ermittelten F VIII:C-Gehalt in Endbehaeltnisse zu 1 000, 500 bzw. 250 I. E. F VIII portioniert. Man erhaelt dabei unter den spezifischen praeparativen Bedingungen des Transfusionsdienstes fibrinogenarme F VIII-Praeparate mit deklariertem F VIII-Gehalt und einer spezifischen Aktivitaet von 0,5 bis 1,5 I. E. F VIII/mg Protein, die bei allen Formen der Haemophilie A therapeutisch eingesetzt werden koennen.

Description

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen · .

Bisher werden Kryopräzipitate im Transfusionsdienst der DDR ausschließlich durch Auftauen von in Flaschen tiefgefrorenen 2-Spender-Plasmapools im Wasserbad bei +4^CC und Lösen des Präzipitates im Puffer hergestellt (Gütevorschrift des IfAR der DDR Nr.48/81 vom 1.4.1981). Die Gewinnung der Frischplasmen erfolgt entweder aus Blutabnahmen in der Flasche oder im Blutbeutel, wobei sich hierbei eine sehr aufwendige, die Vorteile des Blutbeutel wieder aufhebende Überführung des Plasmas vom Beutel in die Flasche erforderlich macht. Die Einfrierzeiten eines Plasmapools von 400 bis 450 ml Plasma betragen in der Flasche ca. 150min bei -30^cC, gegenüber nur 50 bis 55 min im Beutel, was sich nachteilig auf die Aktivität des zeit-und temperaturlabilen FVIII auswirkt. Das Auftauen der gefrorenen Plasmapools im Wasserbad bei +4⁰C über 3 bis 4h mit nachfolgender Zentrifugation bei 0⁰C ist mit einem Verlust von ca. 30 bis 45% des ursprünglichen FVIII-Gehalts verbunden. Der FVIII-Gehalt der Kryopräzipitate variiert auf Grund der biologischen Schwankungsbreite des Ausgangsmaterials in weiten Grenzen um den statistischen Mittelwert und ist kaum standardisierbar.

Die Präparate sind relativfibrinogen-und proteinreich, was sich nachteilig bei der mehrfachen therapeutischen Anwendung der Kryopräzipitate auswirkt (pro Kryopräzipitatsind im Durchschnitt enthalten: 1361.E. FVIII, 0,31 g Fibrinogen, 0,57g Gesamtprotein, Zentrale Testung für gerinnungsaktive Fraktionen, BBZ Plauen 1986).

Um einen ausreichenden FVIII-Gehalt der Präparate zu garantieren, sind nach diesem Verfahren nur Frischplasmen als Ausgangsmaterial der Kryopräzipitate zulässig. Da ohnehin, um einen therapeutisch wirksamen Anstieg des FVIII-Spiegels zu erzielen, als therapeutische Dosis in der Regel stets mehrere Kryopräzipitate zur Anwendung kommen, ist die Herstellung eines 2-Spender-Kryopräzipitats weder vom medizinischen noch vom ökonomischen Standpunkt aus gerechtfertigt. Um diese entscheidenden Nachteile der mangelnden Standardisierbarkeit, der ausschließlichen Verwendung von Frischplasmen und der erforderlichen Gabe von mehreren Präparaten als therapeutische Dosis zu umgehen, wurde eine Mittelpoolzubereitung Human-Plasmafraktion Kryopräzipitat 250/500 in der DDR eingeführt (Gütevorschrift Nr.77/86 des IfAR der DDR). Dieses Mittelpoolverfahren geht von 24 bis 50 Blutkonserven in Flaschen aus und erlaubt die Verwendung von gelagertem Blut. Die nach der herkömmlichen Methode hergestellten Kryopräzipitate werden gepoolt und nach dem im Pool ermittelten FVIII-Gehalt in Endbehältnisse zu 250 bzw. 500I. E. F VIII portioniert. Diese FVIII-Präparate sind, da sie in ihrer Qualität mehrfache Kryopräzipitate darstellen, sehrfibrinogen- und proteinreich. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht in der relativ geringen Ausbeute an FVIII und in dem die Qualität der Kryopräzipitate nicht übertreffenden hohen Fibrinogen- und Proteingehalt der Präparate sowie in dem hohen Applikationsvolumen von 100 ml für 5001. E. FVIII bzw. 50 ml für 2501. E. FVIII, was für die Anwendung in der klinischen Praxis mit nicht unwesentlichen Problemen verbunden ist.

Andere Verfahren, die als Ausgangsmaterial zur Herstellung von FVIII-Präparaten direkt von tiefgefrorenen Plasmabeuteln ausgehen, tauen diese im Wasser- oder Luftbad (Transfusion 24 [1984], 516), mittels der „thawsiphon"-Technik (Vox. Sang.38 [1980], 172) oder mit Hilfe von Mikrowellen (Transfusion 24 [1984], 60; Vox.Sang.48 [1985], 65) auf. Der Verlust an FVIII im homogenen Überstandsplasma ist dabei erheblich, die erhaltenen Kryopräzipitate sind proteinreich, da sich das Überstandsplasma nicht vollständig aus dem Beutel entfernen läßt. Um diese Nachteile auszugleichen, werden den gelösten Kryopräzipitaten zur Anreicherung des FVIII Fällungshilfsmittel wie Hydroxyethylstärke, Dextran, Ficoll, PEG oder Albumin in zum Teil beträchtlichen Konzentrationen zugesetzt (Thromb.Haemost. 51 [1984], 338) oder mit festem Glyzin und NaCI der FVIII bzw. das unerwünschte Fibrinogen ausgefällt (Thromb.Haemost.50 [1983], 116). Diese Verfahren sind durch die zusätzlichen Präparationsschritte technologisch aufwendig, da die zugesetzten Fällungshilfsmittel auf Grund ihrer unphysiologischen Natur bzw. unphysiologisch hohen Konzentration wieder vollständig entfernt werden müssen. Das Verlassen des physiologischen Milieus hat zur Folge, daß die Ausbeute an FVIII bei guter Selektivität nur sehr gering bzw. bei vertretbaren Ausbeuten die Selektivität nur mangelhaft ist. Nachteil aller dieser Verfahren ist, daß die Ausbeute an FVIII beim einfachen Kryopräzipitatsverfahren und Mittelpoolverfahren nur zwischen 20 und 35%, beim Anreicherungsverfahren unter Zusatz von Fällungshilfsmitteln sogar nur ca. 15-20% beträgt, was bei dem wachsenden und noch nicht vollständig anzusichemden therapeutischen Bedarf an FVIII gesundheitspolitisch nicht vertretbar ist.

ROCK (N.Engl. J. Med.311 [1984], 310) beschrieb ein Verfahren, bei dem aus durch Auftauchen im Wasserbad bei +4⁰C mit nachfolgender Zentrifugation gewonnenen und im homogenen Überstandsplasma gelösten Kryopräzipitaten nach dem Poolen im Beutel durch eine zweistündige Repräzipitation bei 0⁰C der FVIII angereichert und mit nachfolgender Zentrifugation abgetrennt wird. Dieses Verfahren, das vollständig im Blutbeutel durchgeführt wird, ist durch die lange Auftau-und Repräzipitationsdauer sehr zeitaufwendig, es bleibt ein relativ großer Anteil an FVIII im Überstandsplasma gelöst und die Repräzipitation wird bis zur Gleichgewichtseinstellung betrieben, was sich in einer unerwünscht hohen Fibrinogen-FVIII-Kopräzipitation niederschlägt.

Industrielle Verfahren zur Herstellung von FVIII-Präparaten mit standardisiertem FVIII-Gehalt gehen von einem Großpool aus und erzielen dabei nur Ausbeuten von weniger als 15% FVIII. Vor allem bei diesen Verfahren spielt die Problematik des Ausschlusses der Möglichkeit der Übertragung von Infektionskrankheiten wie Hepatitis oder AIDS, trotz präparativer bzw. verfahrenstechnischer Schritte zur Abtötung des virogenen Materials mittels Pasteurisierung oder Dampfbehandlung, eine ganz entscheidende Rolle und hat dazu geführt, daß vielfach small-pool-Präparaten der Vorzug vor industriell hergestellten Präparaten gegeben wird. Überhaupt sind bei der Entscheidung, obe Einzel- bzw. Doppelspenderpräparate, Mittelpoolpräparate oder industriell fraktionierte Großpoolpräparate therapeutisch angewandt werden, die Vorteile der gepoolten Präparate mit standardisiertem FVIII-Gehalt mit den Risiken der Injektionsgefährdung kritisch abzuwägen.

Mittelpoolpräparate mit einer begrenzten Anzahl von Blutspendern (maximal 40 bis 50 Einzelspender), die den Vorteil der Standardisierung mit dem auf Grund der Kleinheit des Pools stark verminderten Risikos der Infektionsgefährdung vereinen, stellen einen vernüftigen, therapeutisch optimalen Kompromiß bei der Herstellung von FVIII-Präparaten dar.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, aus dem im Blutbeutel gewonnenen thrombozytenarmen Plasma durch ein Mittelpoolverfahren Kryopräzipitate höherer spezifischer Aktivität mit einem standardisierten FVIII-Gehalt auf sehr rationelle Art und Weise in vertretbar hoher Ausbeute an FVIII herzustellen, die auf Grund ihres deklarierten standardisierten FVIII-Gehalts und des wesentlich verminderten Fibrinogen-und Proteingehalts bessere Voraussetzungen für eine erfolgreiche Therapie gewährleisten.

Das Verfahren sollte sich unproblematisch in die fachliche Zielsetzung des Blutspende- und Transfusionsdienstes integrieren lassen und sowohl die Nutzung von Frischplasma als auch die Verwendung von über Nachtgelagertem Blut als Ausgangsmaterial zur Herstellung von tiefgefrorenem Plasma erlauben. Da die weitere Erhöhung des Aufkommens an FVIII-Präparaten bei konstant bleibenden bzw. nurin Grenzen ausdehnbaren Blutabnahmezahlen ein dringendes gesellschaftliches Erfordernis darstellt, kommt besonders der Nutzung von bisher der FVIII-Fraktionierung nicht oder nur bedingt zugänglich gelagertem Blut in einem Verfahren, das durch die Beibehaltung des physiologischen Milieus ohne Verwendung von Fällungshilfsmitteln unphysiologischer Natur oder in unphysiologisch hohen Konzentrationen charakterisiert ist, und damit hohe Ausbeute an FVIII garantiert, herausragende gesundheitspolitische Bedeutung bei.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mangel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen: Nach den bisher durchgeführten Herstellungsverfahren für Kryopräzipitate ist eine direkte Verwendung von Plasmabeuteln nicht möglich, da sich die Präzipitate nicht vollständig vom Überstandsplasma abtrennen lassen und somit sehr fibrinogen- und proteinreiche Präparate zur Folge haben. Deshalb ist, um die geltenden Qualitätsparameter einzuhalten, eine zeitaufwendige und arbeitsintensive Überführung des Plasmas vom Beutel in die Flasche erforderlich, die die Vorteile, die der Blutbeutel bietet, wieder zunichte macht. Die Herstellung von Mittelpoolpräparaten, die den Vorteil der Standardisierung des FVIII-Gehaltsals Möglichkeit beinhalten und auch die Verwendung von unter definierten Bedingungen gelagertem Blut einschließen, ist bisher ebenfalls nur aus der Blutflasche, nicht aber aus dem Blutbeutel, als einfaches Kryopräzipitationsverfahren mit anschließendem Poolen möglich. Die Qualität der Mittelpoolpräparate unterscheidet sich dabei keineswegs von der der normalen Kryopräzipitate. In keinem anderen bekannten Präparationsverfahren aus dem Blutbeutel wurde ein Auftauen der tiefgefrorenen Plasmabeutel während der Zenrifugation und die sich daraus ergebende Möglichkeit, die entstehende Schichtung der Proteinkonzentration im Beutel zur selektiven Repräzipitation des FVIII aus dem autologen proteinreichen Plasmaüberstand zu nutzen, beschrieben. In allen Verfahren wurden Auftau- und Zentrifugations- sowie Repräzipitations- und Zentrifugationsschritte getrennt. Die Repräzipitation wurde stets bis zur Einstellung des Fällungsgleichgewichts im System FVIII-Fibrinogen-Plasma betrieben, die Möglichkeit der Nutzung der unterschiedlichen Fällungsgeschwindigkeit von FVIII und Fibrinogen durch kurze Repräzipitationszeiten bei tiefen Temperaturen zur selektiven Fällung des FVIII wurde nicht in Betracht gezogen. Um diese Ursachen zu beseitigen, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem das in Blutbeuteln in hoher Effektivität und schonender Weise gewonnene Frischplasma oder das aus bei +8⁰C bis +12°C über 12 bis 24 Stunden gelagertem Blut abgetrennte Plasma unter Nutzung der Vorteile des Schockgefrierens im Beutel direkt und ohne Überführung in die Flasche als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines im FVIII-Gehalt standardisierten Kryopräzipitat-Mittelpoolpräparates verwendet werden kann. Die Überführung des Plasmas vom Beutel in die Flasche, die mit einem zusätzlichen Zeit- und Materialaufwand verbunden ist, erweist sich als unvorteilhaft, da infolge der etwa dreifachen Einfrierzeit des Plasmas in der Flasche gegenüber dem Beutel (150min bis -3O⁰C in der Flasche gegenüber 50 min im Beutel) mit einem beträchtlichen Verlust des zeit- und temperaturlabilen FVIII zu rechnen ist.

Das von der Auftauzeit betrachtet vorteilhafte Auftauen während der Zentrifugation (in Abhängigkeit von den verwendeten Bechern und der Anzahl der Beutel zwischen 45 und 70 min) ermöglicht durch die sich während des Auftauvorganges vollziehende Schichtung der Proteinkonzentration des Überstandsplasmas ein Repräzipitationsverfahren, bei dem das ausgefällte Kryopräzipitat in der unmittelbar überstehenden proteinreichen Plasmazone gelöst wird, so daß sich in der Lösung die für die selektive Repräzipitation des FVIII optimale Albumin-Konzentration von 4 bis 6 Ma.-% von selbst, ohne Zusätze von Fällungshilfsmitteln, einstellt. Das Problem der Selektivität der Präzipitation des FVIII wird dadurch auf überraschend einfache und rationelle Weise gelöst, daß die Repräzipitation unter Ausnutzung der unterschiedlichen Fällungskinetik von FVIII und Fibrinogen direkt während der kurzzeitigen Zentrifugation (30 bis 60 min) unter wesentlich extremeren Temperaturen als bisher beschrieben (0⁰C bis -2O⁰C, vorzugsweise -8⁰C bis -15°C) erfolgt. Da nicht bis zur Einstellung des Fällungsgleichgewichts FVIII-Fibrinogen-Plasma repräzipitiert wird, sondern die Repräzipitation nach der mit höherer Geschwindigkeit ablaufenden Fällung des FVIII abrupt unterbrochen wird, gelingt es, eine weitgehend selektive Repräzipitation des FVIII mit der Abzentrifugation des präzipitierten FVIII in einem einzigen Arbeitsschritt zu verbinden. Die zwischenzeitliche Bestimmung des FVIII-Gehalts im Mittelpool und die darauf besierende Konfektionierung in FVIII-Präparate mit einheitlichen, standardisierten FVIII-Gehalt erlaubt auch die Verwendung von gelagertem Blut und damit von im FVIII-Gehalt vermindertem und bisher nicht verwertbarem Ausgangsmaterial. Auf diesem Wege lassen sich gegenüber herkömmlichen Verfahren wesentlich fibrinogen- und proteinärmere Kryopräzipitate auf eine rationelle und wenig zeit-, arbeits- und kostenintensive Weise herstellen. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß jeweils 6 bis 40 tiefgefrorene Plamabeutel mit jeweils 250 bis 350 ml ACD-, ACD-AG-, CPD- oder Heparin-Frischplasma oder Plasma, das aus über 12 bis 24h nach der Blutabnahme bei +8⁰C bis +12⁰C gelagertem Blut gewonnen wurde, bei Zimmertemperatur ca. 20 bis 40 min lang angetaut werden, so daß das im Block gefrorene Plasma brüchig und weich wird. Die angetauten Beutel werden dann in Zentrifugen ohne Windkessel innerhalb von 30 bis 120min mit 1800 bis 2200U/min bei +4⁰C bis +25⁰C, vorzugsweise bei +15⁰C bis +22⁰C, vollständig aufgetaut. Der Auftauvorgang während der Zentrifugation hat die Ausbildung eines Gradienten der Proteinkonzentration im Überstandsplasma zur Folge. Das Überstandsplasma, das nur 10 bis 20% des ursprünglichen FVIII-Gehalts enthält, wird unter Erhaltung der Geometrie des Beutels und damit der Schichtung in der Proteinkonzentration auf jeweils 20 bis 60ml der proteinreichsten Plasmazone abgequetscht und das Präzipitat bei +35⁰C in dieser Plasmazone gelöst. Damit wird die für eine optimale selektive Repräzipitation des FVIII erforderliche Albuminkonzentration von 4 bis 6 Ma.-% ohne andere Zusätze von Fällungshilfsmitteln im autologen Milieu erreicht. Die gelösten Präzipitate von jeweils 9 bis 23 Beuteln werden in einer 500-ml-Flasche gepoolt und zur Stabilisierung des FVIII mit 0,2 bis 21. E. Heparin/ml Plasma versetzt. Die Pools werden zur selektiven Repräzipitation des FVIII bei Temperaturen von O⁰C bis -20⁰C, vorzugsweise von -8⁰C bis -15⁰C, in einer vorgekühlten Zentrifuge 30 bis 60 min lang mit 1800 bis 2 200 U/min zentrifugiert. Der scharfe Temperaturgradient zwischen gepooltem Plasma und der vorgekühlten Zentrifuge und die während der Zentrifugation ablaufende Repräzipitation bewirken unter Ausnutzung der höheren Präzipitationsgeschwindigkeit von FVIII gegenüber Fibrinogen eine optimale selektive Trennung des FVIII vom Fibrinogen, so daß damit 90 bis 95% des ursprünglichen Fibrinogens entfernt werden können. Die Präzipitate können zur weiteren Verminderung des Proteingehalts mit 20 bis 100ml eisgekühlter Heparin/NaCI-Lösung (5 bis 201.E. Heparin/ml) bei 0⁰C unter Schütteln extrahiert und anschließend bei 0⁰C mit 1800 bis 2200U/min 10-15min lang abzentrifugiert werden.

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Die Präzipitate werden mit 5 bis 10 ml 0,13Aminoessigsäure-Zitrat-Puffer pro Plasmabeutel versetzt und bei +35°C gelöst. Durch eine zehnminütige Zentrifugation der gelösten Präzipitate mit 1800 bis2200U/min bei +2O⁰C bis +25⁰C werden schwerlösliche Begleitproteine abgetrennt. Der FVIII-haltige Überstand von bis zu 40 Plasmabeuteln wird in einer 50-bzw. lOOOml-Flasche gepoolt und der FVIII-Gehalt unverzüglich bestimmt. Innerhalb von 1 h nach dem Lösen und Poolen muß die Bestimmung der FVIIhC-Aktivitätunddas Portionieren in die Endbehältnisse erfolgt sein. Die Portionierung in die Endbehältnisse erfolgt so, daß je Endbehältnis ein FVIII-Gehalt von 250,500 oder 1 0001. E. eingestellt wird. Der Fibrinogengehalt der Endbehältnisse beträgt, jeweils <0,20g, <0,35g bzw. <0,65g. mit einer spezifischen Aktivität von 0,5 bis 1,51.E. FVIII/mg Gesamtprotein. Die Endbehältnisse werden nach dem Portionieren unverzüglich eingefroren, bei Temperaturen < — 30°C gelagert und anschließend lyophilisiert.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindungsoll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

18 tiefgefrorene CPD-Frischplasmabeutel (5,07 kg Plasma; 40501. E. FVIII; 16,0g Fibrinogen) wurden bei Zimmertemperatur ca. 30min lang angetaut, der massive Eiskern zerschlagen und anschließend in einer Zentrifuge ohne Windkessel 70 min lang bei +22⁰C und 2200 U/min zentrifugiert. Die vollständig aufgetauten Plasmabeutel wurden sofort aus der Zentrifuge in Beutelständer gestellt, um die Schichtung in der Proteinkonzentration zu erhalten, und in der Plasmaquetsche bis auf jeweils ca. 30ml proteinreichen Plasmaüberstand abgequetscht. Die 18 Präzipitate wurden bei +35⁰C im Überstand gelöst und in einer 500-ml-Flasche gepoolt. Ach Zugabe von 15ml Heparin/NaCI-Lösung (100I.E.Heparin/ml) wurde 45 min lang in derauf-10°C vorgekühlten Zentrifuge mit 2200 U/min repräzipitiert. Dasfibrinogenreiche Überstandsplasma wurde vollständig abgezogen und verworfen, das Präzipitatin 100 ml eiskalte Heparin/NaCI-Lösung (10I.E.Heparin/ml) 10 min lang bei O⁰C extrahiert und anschließend 10 min mit 2 000 U/min bei 0°C zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wurde verworfen und das Präzipitat in 90 ml 0,13m Aminoessigsäure-Zitrat-Puffer bei +35⁰C gelöst. Der FVIIhC-Gehalt in der leicht getrübten Lösung wurde unverzüglich bestimmt und betrug 17501. E. in 125 ml Gesamtvolumen bzw. 14I.E. FVIII/ml, was einer Ausbeute an FVIIhC von 43,2% entspricht.

Der Pool wurde in 3 Endbehältnisse zu je 35 ml (Ä 500I.E.FVIII) und 1 Endbehältnis zu 20 ml

(^ 2501. E. FVIII) portioniert, die sofort eingefroren und anschließend lyophilisiert wurden. Je Endbehältnis zu 5001. E. FVIII, das in 30ml aqua ad Injektionen zu lösen ist, waren 0,31 g Fibrinogen, im Endbehältnis zu 250I.E.FVIII, das in 20ml zu lösen ist, 0,15g Fibrinogen bei einer spezifischen Aktivität von 0,711. E. F Vllll/mg Protein enthalten.

Beispiel 2

40tiefgefroreneCPD-Plasmabeutel (11,27kg Plasma,72001.E.VIII,34,0g Fibrinogen),deren Plasma ausüber 16h bei +10⁰C gelagertem Blut entstammt, wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgetaut. Nachdem die Überstandsplasmen bis auf 20-25ml des proteinreichen Plasmaüberstandes abgequetscht worden waren, wurden die Präzipitate bei +35⁰C im Überstandsplasma gelöst und jeweils-20 Beutel in 500-ml-Flaschen gepoolt. Die beiden Pools wurden nach Zugabe von jeweils 15 ml Heparin/NaCI-Lösung (100I.E.Heparin/ml)45min lang in derauf-10⁰C vorgekühlten Zentrifuge mit 2 000 U/min repräzipitiert. Das fibrinogenreiche Überstandsplasma wurde vollständig entfernt und die Präzipitate in jeweils 100ml eiskalter Heparin/NaCI-Lösung (101. E. Heparin/ml), wie in Beispiel 1 angegeben, gewaschen. Die beiden Präzipitate wurden in jeweils 100ml 0,13m Aminoessigsäure-Zitrat-Puffer bei +35⁰C gelöst, anschließend in einer Flasche gepoolt und unverzüglich der FVIIhC-Gehaltim Pool bestimmt. Der FVIII:C-Gehalt betrug 34701. E. in einem Poolvolumen von 280ml bzw. 12,41. E. FVIII/ml und entsprach damit einer Ausbeute von 48,2%.

Der Pool wurde in je 3 Endbehältnisse von jeweils 80ml (A 10OOI. E. FVIII) und 1 Endbehältnis von 40 ml (A 5001. E. FVIII) portioniert, die Endbehältnisse eingefroren und anschließend lyophylisiert.

Je Endbehältnis zu 10001. E. FVIII waren 0,47g Fibrinogen, im Endbehältnis zu 5001. E. FVIII 0,23g Fibrinogen enthalten. Die spezifische Aktivität der Präparate betrug 1,061. E. FVIII/mg Gesamtprotein. Zur therapeutischen Anwendung ist das Endbehältnis zu 10001. E. FVIII in 60ml und das Endbehältnis zu 5001. E. in 30 ml aqua ad Injektionen zu lösen.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von protein- und fibrinogenarmen Kryopräzipitaten mit standardisiertem FVlll-Gehalt, gekennzeichnet dadurch, daß aus ACD-, ACD-AG- oder CPD-Frischblut oder über 12 bis 24 Stunden nach der Blutabnahme bei +8°C bis +12⁰C gelagertem Blut gesunder, unausgewählter Blutspender ein im Blutbeutel tiefgefrorenes Plasma gewonnen wird, aus dem durch kurzzeitiges Antauen bei Zimmertemperatur mit anschließendem vollständigen Auftauen durch Zentrifugation mit 1 800 bis 2200 U/min bei +4⁰C bis +25⁰C, vorzugsweise +15°C bis +22⁰C, innerhalb von 45 bis 120 min und Lösen des erhaltenen Präzipitats in jeweils 20 bis 60 ml des proteinreichen Plasmaüberstandes bei +35⁰C und Poolen von 6 bis 40 Blutbeuteln ein Mittelpool gebildet wird, der nach Heparinzusatz bei O⁰C bis -2O⁰C, vorzugsweise -1O⁰C bis -15⁰C, durch Zentrifugation mit 1800 bis 2200 U/min 30 bis 60min lang repräzipitiert wird und die so erhaltenen Repräzipitate gegebenenfalls gewaschen sowie nach dem Lösen im Puffer bei +35⁰C durch Zentrifugation bei Zimmertemperaturvon schwerlöslichen Begleitproteinen befreit werden und der gepoolte F Vlll-haltige, fibrinogen- und proteinarme Überstand entsprechend dem unverzüglich ermittelten FVIII-Gehalt in Endbehältnisse mit definiertem FVIII-Gehalt portioniert wird, die sofort eingefroren und lyophilisiert werden.

2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch das Auftauen der gefrorenen Blutbeutel in der Zentrifuge eine Schichtung der Proteinkonzentration im Überstandsplasma erfolgt.

3. Verfahren gemäß Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Präzipitate in dem proteinreichen Plasmaüberstand gelöst werden, so daß sich eine Albuminkonzentration von 4 bis 6 Ma.-% einstellt.

4. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß den gepoolten FVIII- und proteinreichen Lösungen 0,2 bis 2 I. E. Heparin pro ml Plasma zur Stabilisierung zugesetzt werden.

5. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß zur selektiven Repräzipitation des fibrinogenarmen Kryopräzipitats die unterschiedliche Fällungskinetik von FVIII und Fibrinogen ausgenutzt wird, so daß keine Gleichgewichtseinstellung im Fällungsgleichgewicht FVIII-Fibrinogen-Plasma erfolgt und damit die Repräzipitation vor der Fällung des Fibrinogens unterbrochen wird.

6. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Repräzipitate zur weiteren Verminderung des Proteingehalts jeweils mit 20 bis 100 ml eiskalter Heparin/NaCI-Lösung (5 bis 201. E. Heparin/ml) unter Schütteln mit anschließender Zentrifugation bei O⁰C gewaschen werden.

7. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Repräzipitate in 5 bis 10 ml Aminoessigsäure-Zitrat-oderTromethamol-Zitronensäure-Pufferpro Plasmabeutel gelöst werden.

8. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Abtrennung schwerlöslicher Begleitproteine durch eine zehnminütige Zentrifugation der gelösten und gepoolten Präzipitate bei 1 800 bis 2200U/min und 20°C bis 25⁰C erfolgt.

9. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Proportionierung des Pools in Endbehältnisse so erfolgt, daß je Endbehältnis ein FVIII-Gehalt von 250, 500 bzw. 1 0001. E. mit einem Fibrinogengehalt von < 0,20g, < 0,35g bzw.<0,65g mit einer spezifischen Aktivität von 0,5 bis 1,51. E. FVIII/mg Protein eingestellt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von protein- und fibrinogenarmen Kryopräzipitaten mit standardisiertem FVIII-Gehalt aus einem Mittelpool unter Verwendung von in Blutbeuteln gefrorenen Plasmen im Blutspende- und Transfusionswesen. Die Problematik der Durchsetzung einer optimalen Hämotherapie, insbesondere eine ausreichende Versorgung mit den für die Behandlung der Hämophilie A wichtige FVIII-Präparaten erfordert die Erfassung sämtlicher, als Ausgangsmaterial zur FVIII-Präparation in Betracht kommender Möglichkeiten, also auch und im besonderen die Verwendung von gelagertem Blut.

Mittelpoolverfahren stellen auf Grund der spezifischen Bedingungen im Transfusionsdienst eine optimale Variante dar, um die Nutzung alles anfallenden Blutspendermaterials mit den Vorzügen der sonst nur im industriellen Maßstab möglichen Standardisierung und Deklaration eines einheitlichen FVIII-Gehalts als wirksamen Gerinnungsfaktor zu verbinden. Kryopräzipitate werden ausschließlich zur Substitutionsbehandlung von Gerinnungsstörungen mit FVIII-Mangel, besonders der Hämophilie A, eingesetzt.

Die Anwendung von proteinärmeren, speziell fibrinogenärmeren FVIII-Präparaten ist auf Grund der höheren spezifischen Wirksamkeit besonders indiziert bei schwerer Hämophilie A, zur Massivsubstitution bei großen chirurgischen Eingriffen, beim Vorhandensein eines Hemmkörpers oder nach vorausgegangenen Unverträglichkeitsreaktionen mit proteinreicheren Kryopräzipitaten. Die verbesserte Reinheit dieser Präparate und das damit verbundene verminderte Risiko von Nebenreaktionen empfehlen den Einsatz vor allem bei hämophilen Kindern, in der kontrollierten Selbstbehandlung und bei Reisen von hämophilen Patienten.