DD255671A1

DD255671A1 - Verfahren zur herstellung von thrombozytenpraeparaten vorzugsweise durch differentialzentrifugation

Info

Publication number: DD255671A1
Application number: DD29604186A
Authority: DD
Inventors: Iris Bergmann; Gianpiero Pescarmona; Torsten Siepmann; Uwe Till
Original assignee: Erfurt Medizinische Akademie
Priority date: 1986-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1988-04-13

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren von Thrombozytenpraeparaten (PRP, PC) unter Anwendung der Differentialzentrifugation bzw. von Zellseparatoren. Diese Praeparate werden in der Medizin angewendet. Erfindungsgemaess wird ein Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch mit N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in einer Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10 mmol/l einer mehrstufigen Differentialzentrifugation unterzogen, oder dem PRP nach der ersten Zentrifugation wird vor der weiteren Zentrifugation N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in solcher Menge zugesetzt, dass die Konzentration 5 bis 15 mmol/l betraegt. Dieses Herstellungsverfahren kann bei physiologischem p H-Wert durchgefuehrt werden. Die Thrombozytenausbeute betraegt etwa 90% auch bei der Anwendung von unsilikonisierten Glasbehaeltnissen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von plättchenreichem Plasma — im weiteren PRP genannt — und Throrribozytenkonzentraten — im weiteren PC genannt — aus Vollblut vorzugsweise durch Differentialzentrifugation. Derartige Präparate finden in der Medizin Anwendung zur Therapie von Thrombozytopenien unterschiedlichster Ätiopathogenese sowie zur Thrombozyten-Funktionsdiagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bekannt ist es, Thrombozytenpräparate mittels Differentialzentrifugation aus Vollblutkonserven herzustellen; Dabei entsteht im ersten Zentrifugationsschritt bei niedriger Beschleunigung — z.B. 1 000gfür 9min — ein PRP. Im zweiten Zentrifugationsschritt mit hoher Beschleunigung — z.B. 3000g für 10min — erhält man ein PC.

Um einer Aggregationsneigung der Thrombozyten insbesondere während des zweiten Zentrifugationsschrittes und beim Resuspendieren vorzubeugen, wird das PRP auf einen pH-Wert von ca. 6,5 eingestellt.

Dieser initial niedrige unphysiologische pH-Wert, durch Ansäuern des PRP, wirkt sich ungünstig bei einer späteren Lagerung aus. Sinkt der pH-Wert unter 6,0, so tritt eine irreversible Schädigung der Thrombozyten aus.

Eine andere bekannte Präparationsart besteht darin, das abgesetzte Thrombozytensediment bei höherem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 bis 7,3, abhängig vom eingesetzten Blutstabilisator, mindestens V2 Stunde ohne Manipulationen stehen zu lassen, um danach vermittels leichtem Schütteln das Thrombozytensediment zu resuspendieren.

DieThrombozytenausbeute in den Thrombozytenkonzentraten beträgt bei den beschriebenen Präparationsarten im Mittel zwischen 78 und 86%.

Bei Thrombozytenpräparaten der vorbeschriebenen Präparationsarten ergaben sich initial größere Thrombozytenverluste in unsilikonisierten Glasflaschen gegenüber silikonisierten.

Ziel der Erfindung

Es soll ein Verfahren zur Präparation von PC nahe dem physiologischen pH-Wert, in Abhängigkeit zum eingesetzten Antikoagulanz, mit hoher Thrombozytenausbeute, insbesondere auch bei Anwendung von unsilikonisierten Glasflaschen und in salinen Medien gefunden werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Thrombozytenpräparaten, plättchenreichem Plasma und Thrombozytenkonzentraten, mit hoherThrombozytenausbeute in Nähe des physiologischen pH-Wertes zu schaffen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß einem Blutstabilisator vor der Zugabe von Vollblut oder einem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vor dem Zentrifugieren oder plättchenreichem Plasma aus der ersten Zentrifugation vor dem weiteren Zentrifugieren, eine solche Menge N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zugesetzt wird, daß eine Konzentration von 1 bis 30mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins erreicht wird. Danach erfolgt in bekannter Weise die ein- oder mehrstufige Differentialzentrifugation oder Konzentration in Zellseparatoren.

Vorteilhaft ist es, bereits dem Blutstabilisator N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in solcher Menge zuzusetzen, daß im Vollblut mit zugesetztem Stabilisator eine Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins vorliegt. Wie beschrieben, kann N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin auch erst dem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch in solcher Menge zugesetzt werden, daß die Konzentration im Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vorzugsweise 5 bis 10mmol/l beträgt. Wird dem PRP aus der ersten Zentrifugation vor dem weiteren Zentrifugieren N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zugesetzt, ist die Menge so zu wählen, daß die Konzentration im PRP von vorzugsweise 5 bis 15mmol/l des N-)2-Mercaptopropionyl)-glycin erreicht wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, ohne pH-Wertverä.nderung ein PC herzustellen, dessen Resuspension sofort nach der Präparation im Plasma oder in salinen Medien erfolgen kann. Vorzugsweise wird 0,25 bis 0,5mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zugesetzt. Nach Zusatz des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins zum Blutpräparat ist vorteilhafterweise eine Inkubationszeit vor dem Zentrifugieren einzuschalten. Als Blutstabilisator werden vorteilhaft in diesem Verfahren ACD (Citronensäure, Citrat, Dextrose) oder CPD (Citrat, Phosphat, Dextrose) eingesetzt. Sie entsprechen mit ihren Eigenschaften einer Präparation nahe dem physiologischen pH-Wert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Thrombozyten unempfindlicher gegenüber den physikalischen Einwirkungen der Konzentrationsschritte_%wobei gleichzeitig ein physiologisch vorteilhafter pH-Wertbereich eingehalten wird.

Ausführungsbeispiele

Nachfolgend werden Ausführungsbeispeile des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert.

1. Einem bekannten Blutstabilisator, z.B. ACD, werden vor der Blutentnahme soviel einer 0,5mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zugesetzt, daß die Konzentration von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin im zugegebenen Vollblut mit Stabilisator ca. 7 mmol/l beträgt. Erfindungsgemäß ist es ebenfalls möglich, 0,5 mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung direkt dem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch in einer Menge zuzusetzen, daß die Konzentration im vorgenannten Gemisch ca. 7 mmol/l beträgt. Danach erfolgt in jedem Fall eine Inkubation von 1 Stunde. Mittels Differentialzentrifugation des vorgenannten Gemisches, z. B. 250 ml für 10 min bei 250 g, wird ein PRP und danach aus diesem durch weiteres Zentrifugieren für 8min bei 1000g ein PC hergestellt. Der Überstand, plättchenarmes Plasma, kann sofort abgehoben werden. Es folgt die Resuspension im verbliebenen Plasmarest bzw. in N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin freiem Plasma. DieThrombozytenfunktionen sind ca. 1,5 Stunden nach der Resuspension in N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin freiem Plasma voll restituiert.

2. 250ml Citratvollblut werden 10min bei 250g zentrifugiert, das hiernach überstehende RPR wird abgehoben. Dem PRP-Volumen fügt man soviel einer 0,25 mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zu, daß sich eine Konzentration von etwa 7,0 mmol/l von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin im PRP ergibt. Nach einer Inkubationszeit von ca. 1 Stunde erfolgt die Zentrifugation für 8 min bei 1 000g. Der Überstand, plättchenarmes Plasma, wird abgehoben. Das Thrombozytensediment kann sofort im verbliebenen Plasmarest bzw. in N-(2-Mercaptopropionyl!-glycin freiem Plasma resuspendiert werden. Die Funktion der Thrombozyten ist 1,5 Stunden nach Einbringen in ein N-(2-Mercaptopropionyl(-glycin freies Medium voll restituiert.

Die Ausbeute an Thrombozyten im PC beträgt bezogen auf ihre Anzahl im Ausgangs-PRP ca. 90% bei einer Plasmaresuspension und etwa 80% in einer salinen Resuspension. Der pH-Wert kann während der Präparation stets größer 7,3 sein. Die Präparation erreicht auch die gleiche Ausbeute in unsilikonisierten Glasbehältnissen.

Folgende Parameter werden in vitro zur Prüfung der Funktionsfä.higkeit herangezogen; die dazu verwandten Prüfverfahren sind in den angezogenen Literaturangaben beschrieben.

— Morphologieindex, Lit. 10; ADP induzierte Aggregation, Lit. 11; Reaktion auf hypotonen Schock, Lit. 12; Serotoninaufnahme,

Alle Parameter zeigten vergleichbare oder bessere Werte von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin behandelten Thrombozyten im Vergleich zu unbehandelt präparierten Thrombozyten. Die Inkubation von PRP mit N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin führt dementsprechend nicht zur Thrombozytenlyse.

Bei der Anwendung von Zellseparatoren zur Konzentration von Thrombozyten erweist sich die Zugabe von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zum Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch gleichermaßen als vorteilhaft.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Thrombozytenpräparaten vorzugsweise durch mehrstufige Differentialzentrifugation, in deren Verlauf plättchenreiches Plasma und ein Thrombozytenkonzentrat entstehen, oder in Zellseparatoren gekennzeichnet dadurch, daß einem Blutstabilisator vor der Zugabe von Vollblut oder einem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vor dem Zentrifugieren oder dem plättchenreichen Plasma aus der ersten Zentrifugation vor dem weiteren Zentrifugieren, eine solche Menge N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zugesetzt wird, daß eine Konzentration von 1 bis 30 mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins erreicht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß einem Blutstabilisator N-(2-MercaptopropionyD-glycin in solcher Menge zugesetzt wird, daß im Vollblut mit zugesetztem Stabilisator eine Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin erreicht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß einem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vor dem Zentrifugieren N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß eine Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10 mmol/l .erreicht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß dem plättchenreichen Plasma aus der ersten Zentrifugation N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in solcher Menge zugesetzt wird, daß eine Konzentration von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin im plättchenreichen Plasma vorzugsweise 5 bis 15mmol/l beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise 0,25 bis 0,5 mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß nach Zusatz des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins zum Blutpräparat vor dem Zentrifugieren eine Inkubationszeit eingeschaltet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Blutstabilisator ACD oder CPD eingesetzt wird.