DD255671A1

DD255671A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF THROMBOCYTE PREPARATIONS PREFERABLY BY DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION

Info

Publication number: DD255671A1
Application number: DD29604186A
Authority: DD
Inventors: Iris Bergmann; Gianpiero Pescarmona; Torsten Siepmann; Uwe Till
Original assignee: Erfurt Medizinische Akademie
Priority date: 1986-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1988-04-13

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren von Thrombozytenpraeparaten (PRP, PC) unter Anwendung der Differentialzentrifugation bzw. von Zellseparatoren. Diese Praeparate werden in der Medizin angewendet. Erfindungsgemaess wird ein Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch mit N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in einer Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10 mmol/l einer mehrstufigen Differentialzentrifugation unterzogen, oder dem PRP nach der ersten Zentrifugation wird vor der weiteren Zentrifugation N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in solcher Menge zugesetzt, dass die Konzentration 5 bis 15 mmol/l betraegt. Dieses Herstellungsverfahren kann bei physiologischem p H-Wert durchgefuehrt werden. Die Thrombozytenausbeute betraegt etwa 90% auch bei der Anwendung von unsilikonisierten Glasbehaeltnissen.The invention relates to a method for the preparation of platelet injections (PRP, PC) using differential centrifugation or cell separators. These preparations are used in medicine. According to the invention, a whole blood-blood stabilizer mixture with N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in a concentration of preferably 5 to 10 mmol / l is subjected to a multistage differential centrifugation, or the PRP after the first centrifugation N- (2 Mercaptopropionyl) -glycine in such an amount that the concentration is 5 to 15 mmol / l. This preparation method can be carried out at physiological p H value. The platelet yield is about 90% even with the use of unsiliconized Glasbehaeltnissen.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von plättchenreichem Plasma — im weiteren PRP genannt — und Throrribozytenkonzentraten — im weiteren PC genannt — aus Vollblut vorzugsweise durch Differentialzentrifugation. Derartige Präparate finden in der Medizin Anwendung zur Therapie von Thrombozytopenien unterschiedlichster Ätiopathogenese sowie zur Thrombozyten-Funktionsdiagnostik.The invention relates to a process for the production of platelet-rich plasma - hereinafter referred to as PRP - and Throrribozytenkonzentraten - called in another PC - from whole blood, preferably by differential centrifugation. Such preparations are used in medicine for the therapy of thrombocytopenia of different aetiopathogenesis as well as for platelet function diagnostics.

Characteristic of the known state of the art

Bekannt ist es, Thrombozytenpräparate mittels Differentialzentrifugation aus Vollblutkonserven herzustellen; Dabei entsteht im ersten Zentrifugationsschritt bei niedriger Beschleunigung — z.B. 1 000gfür 9min — ein PRP. Im zweiten Zentrifugationsschritt mit hoher Beschleunigung — z.B. 3000g für 10min — erhält man ein PC.It is known to prepare platelet preparations by means of differential centrifugation from whole blood preserves; This results in the first centrifugation step at low acceleration - e.g. 1 000g for 9min - a PRP. In the second centrifugation step with high acceleration - e.g. 3000g for 10min - you get a PC.

Um einer Aggregationsneigung der Thrombozyten insbesondere während des zweiten Zentrifugationsschrittes und beim Resuspendieren vorzubeugen, wird das PRP auf einen pH-Wert von ca. 6,5 eingestellt.In order to prevent an aggregation tendency of the platelets, in particular during the second centrifugation step and during resuspension, the PRP is adjusted to a pH of about 6.5.

Dieser initial niedrige unphysiologische pH-Wert, durch Ansäuern des PRP, wirkt sich ungünstig bei einer späteren Lagerung aus. Sinkt der pH-Wert unter 6,0, so tritt eine irreversible Schädigung der Thrombozyten aus.This initially low nonphysiological pH, due to acidification of the PRP, has an unfavorable effect on later storage. If the pH drops below 6.0, irreversible damage to the platelets occurs.

Eine andere bekannte Präparationsart besteht darin, das abgesetzte Thrombozytensediment bei höherem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 bis 7,3, abhängig vom eingesetzten Blutstabilisator, mindestens V2 Stunde ohne Manipulationen stehen zu lassen, um danach vermittels leichtem Schütteln das Thrombozytensediment zu resuspendieren.Another known type of preparation is to leave the sediment platelet sediment at a higher initial pH of 7.0 to 7.3, depending on the blood stabilizer used, at least V2 hour without manipulation, and then resuspend the platelet sediment by gently shaking.

DieThrombozytenausbeute in den Thrombozytenkonzentraten beträgt bei den beschriebenen Präparationsarten im Mittel zwischen 78 und 86%.The platelet yield in the platelet concentrates is on average between 78 and 86% in the described preparation types.

Bei Thrombozytenpräparaten der vorbeschriebenen Präparationsarten ergaben sich initial größere Thrombozytenverluste in unsilikonisierten Glasflaschen gegenüber silikonisierten.In the case of platelet preparations of the preparation types described above, there were initially larger platelet losses in unsiliconized glass bottles compared to siliconized ones.

Object of the invention

Es soll ein Verfahren zur Präparation von PC nahe dem physiologischen pH-Wert, in Abhängigkeit zum eingesetzten Antikoagulanz, mit hoher Thrombozytenausbeute, insbesondere auch bei Anwendung von unsilikonisierten Glasflaschen und in salinen Medien gefunden werden.A method for the preparation of PC close to the physiological pH, depending on the anticoagulant used, with high platelet yield, especially when using unsiliconized glass bottles and in saline media is to be found.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Thrombozytenpräparaten, plättchenreichem Plasma und Thrombozytenkonzentraten, mit hoherThrombozytenausbeute in Nähe des physiologischen pH-Wertes zu schaffen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß einem Blutstabilisator vor der Zugabe von Vollblut oder einem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vor dem Zentrifugieren oder plättchenreichem Plasma aus der ersten Zentrifugation vor dem weiteren Zentrifugieren, eine solche Menge N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zugesetzt wird, daß eine Konzentration von 1 bis 30mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins erreicht wird. Danach erfolgt in bekannter Weise die ein- oder mehrstufige Differentialzentrifugation oder Konzentration in Zellseparatoren.The invention has for its object to provide a method for the preparation of platelet preparations, platelet-rich plasma and platelet concentrates, with high platelet yield in the vicinity of the physiological pH. According to the invention, the object is achieved by adding such an amount of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine to a blood stabilizer prior to the addition of whole blood or a whole blood-blood stabilizer mixture before centrifuging or platelet-rich plasma from the first centrifugation before further centrifugation is that a concentration of 1 to 30mmol / l of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is achieved. Thereafter, in a known manner, the single or multi-stage differential centrifugation or concentration in Zellseparatoren.

Vorteilhaft ist es, bereits dem Blutstabilisator N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in solcher Menge zuzusetzen, daß im Vollblut mit zugesetztem Stabilisator eine Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10mmol/l des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins vorliegt. Wie beschrieben, kann N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin auch erst dem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch in solcher Menge zugesetzt werden, daß die Konzentration im Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch vorzugsweise 5 bis 10mmol/l beträgt. Wird dem PRP aus der ersten Zentrifugation vor dem weiteren Zentrifugieren N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zugesetzt, ist die Menge so zu wählen, daß die Konzentration im PRP von vorzugsweise 5 bis 15mmol/l des N-)2-Mercaptopropionyl)-glycin erreicht wird.It is advantageous to add to the blood stabilizer N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in such an amount that a concentration of preferably 5 to 10 mmol / l of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is present in the whole blood with added stabilizer. As described, N- (2-mercaptopropionyl) -glycine may also first be added to the whole blood-blood stabilizer mixture in such an amount that the concentration in the whole blood-blood stabilizer mixture is preferably 5 to 10 mmol / l. If N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is added to the PRP from the first centrifugation before further centrifuging, the amount should be selected so that the concentration in the PRP is preferably from 5 to 15 mmol / l of the N-) 2-mercaptopropionyl. glycine is achieved.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, ohne pH-Wertverä.nderung ein PC herzustellen, dessen Resuspension sofort nach der Präparation im Plasma oder in salinen Medien erfolgen kann. Vorzugsweise wird 0,25 bis 0,5mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zugesetzt. Nach Zusatz des N-(2-Mercaptopropionyl)-glycins zum Blutpräparat ist vorteilhafterweise eine Inkubationszeit vor dem Zentrifugieren einzuschalten. Als Blutstabilisator werden vorteilhaft in diesem Verfahren ACD (Citronensäure, Citrat, Dextrose) oder CPD (Citrat, Phosphat, Dextrose) eingesetzt. Sie entsprechen mit ihren Eigenschaften einer Präparation nahe dem physiologischen pH-Wert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Thrombozyten unempfindlicher gegenüber den physikalischen Einwirkungen der Konzentrationsschritte_%wobei gleichzeitig ein physiologisch vorteilhafter pH-Wertbereich eingehalten wird.The process according to the invention makes it possible, without changing the pH value, to produce a PC whose resuspension can be carried out immediately after the preparation in plasma or in saline media. Preferably, 0.25 to 0.5 mol / l of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in isotonic NaCl solution is added. After addition of the N- (2-mercaptopropionyl) -glycine to the blood preparation, it is advantageous to switch on an incubation time before centrifuging. As a blood stabilizer, ACD (citric acid, citrate, dextrose) or CPD (citrate, phosphate, dextrose) are advantageously used in this process. They correspond with their properties of a preparation near the physiological pH. By means of the method according to the invention, the platelets become less sensitive to the physical effects of the concentration steps _%, whereby at the same time a physiologically advantageous pH range is maintained.

embodiments

Nachfolgend werden Ausführungsbeispeile des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert.Below Ausführungsbeispeile the process of the invention are explained.

1. Einem bekannten Blutstabilisator, z.B. ACD, werden vor der Blutentnahme soviel einer 0,5mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zugesetzt, daß die Konzentration von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin im zugegebenen Vollblut mit Stabilisator ca. 7 mmol/l beträgt. Erfindungsgemäß ist es ebenfalls möglich, 0,5 mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung direkt dem Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch in einer Menge zuzusetzen, daß die Konzentration im vorgenannten Gemisch ca. 7 mmol/l beträgt. Danach erfolgt in jedem Fall eine Inkubation von 1 Stunde. Mittels Differentialzentrifugation des vorgenannten Gemisches, z. B. 250 ml für 10 min bei 250 g, wird ein PRP und danach aus diesem durch weiteres Zentrifugieren für 8min bei 1000g ein PC hergestellt. Der Überstand, plättchenarmes Plasma, kann sofort abgehoben werden. Es folgt die Resuspension im verbliebenen Plasmarest bzw. in N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin freiem Plasma. DieThrombozytenfunktionen sind ca. 1,5 Stunden nach der Resuspension in N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin freiem Plasma voll restituiert.1. A known blood stabilizer, e.g. ACD, as much of a 0,5mol / l N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in isotonic NaCl solution is added before the blood withdrawal, that the concentration of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in the added whole blood with stabilizer approx mmol / l. According to the invention, it is likewise possible to add 0.5 mol / l N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in isotonic NaCl solution directly to the whole blood-blood stabilizer mixture in an amount such that the concentration in the abovementioned mixture is about 7 mmol / l is. Thereafter, in each case, an incubation of 1 hour. By differential centrifugation of the aforementioned mixture, for. B. 250 ml for 10 min at 250 g, a PRP and then made from this by further centrifuging for 8 min at 1000g a PC. The supernatant, platelet-poor plasma, can be lifted off immediately. This is followed by resuspension in the remaining plasma residue or in N- (2-mercaptopropionyl) -glycine-free plasma. The platelet functions are fully restored approximately 1.5 hours after resuspension in N- (2-mercaptopropionyl) -glycine-free plasma.

2. 250ml Citratvollblut werden 10min bei 250g zentrifugiert, das hiernach überstehende RPR wird abgehoben. Dem PRP-Volumen fügt man soviel einer 0,25 mol/l N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin in isotoner NaCI-Lösung zu, daß sich eine Konzentration von etwa 7,0 mmol/l von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin im PRP ergibt. Nach einer Inkubationszeit von ca. 1 Stunde erfolgt die Zentrifugation für 8 min bei 1 000g. Der Überstand, plättchenarmes Plasma, wird abgehoben. Das Thrombozytensediment kann sofort im verbliebenen Plasmarest bzw. in N-(2-Mercaptopropionyl!-glycin freiem Plasma resuspendiert werden. Die Funktion der Thrombozyten ist 1,5 Stunden nach Einbringen in ein N-(2-Mercaptopropionyl(-glycin freies Medium voll restituiert.2. 250ml of citrate whole blood are centrifuged for 10 min at 250g, after which the protruding RPR is lifted off. To the volume of PRP add as much of a 0.25 mol / l N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in isotonic NaCl solution to give a concentration of about 7.0 mmol / l of N- (2-mercaptopropionyl) glycine in the PRP yields. After an incubation period of about 1 hour, the centrifugation is carried out for 8 min at 1 000g. The supernatant, platelet-poor plasma, is lifted off. The platelet sediment can be immediately resuspended in the remaining plasma residue or in N- (2-mercaptopropionyl! -Glycine-free plasma. The function of the platelets is fully restored 1.5 hours after introduction into an N- (2-mercaptopropionyl- glycine-free medium ,

Die Ausbeute an Thrombozyten im PC beträgt bezogen auf ihre Anzahl im Ausgangs-PRP ca. 90% bei einer Plasmaresuspension und etwa 80% in einer salinen Resuspension. Der pH-Wert kann während der Präparation stets größer 7,3 sein. Die Präparation erreicht auch die gleiche Ausbeute in unsilikonisierten Glasbehältnissen.The yield of platelets in the PC is based on their number in the starting PRP about 90% in a plasma suspension and about 80% in a saline resuspension. The pH can always be greater than 7.3 during the preparation. The preparation also achieves the same yield in unsiliconized glass containers.

Folgende Parameter werden in vitro zur Prüfung der Funktionsfä.higkeit herangezogen; die dazu verwandten Prüfverfahren sind in den angezogenen Literaturangaben beschrieben.The following parameters are used in vitro to test their ability to function; the related test methods are described in the references cited.

— Morphologieindex, Lit. 10; ADP induzierte Aggregation, Lit. 11; Reaktion auf hypotonen Schock, Lit. 12; Serotoninaufnahme,- Morphology Index, Ref. 10; ADP induced aggregation, ref 11; Response to hypotonic shock, ref 12; Serotonin uptake,

Alle Parameter zeigten vergleichbare oder bessere Werte von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin behandelten Thrombozyten im Vergleich zu unbehandelt präparierten Thrombozyten. Die Inkubation von PRP mit N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin führt dementsprechend nicht zur Thrombozytenlyse.All parameters showed comparable or better values of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine treated platelets compared to untreated prepared platelets. Accordingly, incubation of PRP with N- (2-mercaptopropionyl) -glycine does not result in platelet lysis.

Bei der Anwendung von Zellseparatoren zur Konzentration von Thrombozyten erweist sich die Zugabe von N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin zum Vollblut-Blutstabilisator-Gemisch gleichermaßen als vorteilhaft.When using cell separators for the concentration of platelets, the addition of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine to the whole blood-blood stabilizer mixture proves equally beneficial.

Claims

1. A process for the preparation of platelet preparations preferably by multi-stage differential centrifugation, in the course of platelet-rich plasma and a platelet concentrate, or in Zellseparatoren characterized in that a blood stabilizer before the addition of whole blood or a whole blood-blood stabilizer mixture before centrifuging or platelet-rich plasma from the first centrifugation before further centrifuging, such an amount of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is added to reach a concentration of 1 to 30 mmol / l of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine.

2. The method according to claim 1, characterized in that a blood stabilizer N- (2-mercaptopropionyl-glycine added in such an amount that in the whole blood with added stabilizer, a concentration of preferably 5 to 10mmol / l of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is achieved.

3. The method according to claim 1, characterized in that a whole blood-blood stabilizer mixture before centrifugation N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is added in such an amount that a concentration of preferably 5 to 10 mmol / l .erreicht ,

4. The method according to claim 1, characterized in that the platelet-rich plasma from the first centrifugation N- (2-mercaptopropionyl) -glycine is added in such an amount that a concentration of N- (2-mercaptopropionyl) -glycine in the platelet-rich plasma preferably 5 to 15mmol / l.

5. The method according to claim 1, characterized in that preferably 0.25 to 0.5 mol / l N- (2-mercaptopropionyl) glycine is added in isotonic NaCl solution.

6. The method according to claim 1, characterized in that after addition of the N- (2-mercaptopropionyl) -glycine to the blood preparation, an incubation time is switched on before centrifuging.

7. The method according to claim 1, characterized in that is used as a blood stabilizer ACD or CPD.