DD247465A5 - Verfahren zur herstellung von 15 alpha-hydroxy-prostaglandinzwischenprodukten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion der 15-Ketogruppe in bicyclischen Prostaglandin-Zwischenproduktion zu 15a-Hydroxyverbindungen der allgmeinen Formel, worin X Sauerstoff oder eine CH2-Gruppe,Aeine trans CHCH oder CC-Gruppe,BSauerstoff, die Resteoderoder den mit R3 in der Bedeutung einer C1C4-Alkylgruppe,R1Wasserstoff, Tetrahydropyranyl, Benzoyl, tert.-Butyldimethylgilyl oder tert.-Butyldiphenylgilyl undR2die Restebedeuten,dadurch gekennzeichnet, dass man ein Keton der allgemeinen Formel II, worin A, B, X, R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit Candida- oder Pichia-Staemmen behandelt und das dabei entstehende 15-Hydroxy-Prostaglandin-Zwischenprodukt isoliert. Formel (I), (II)

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von IBa-Hydroxy-Prostaglandin-Zwischenprodukten.

Die Erfindung eignet sich besonders zur mikrobiologischen Reduktion der nachstehend aufgeführten Prostacyclin-

Zwischenstufen 1 bis 6. . . .

O,

COOCH

O_βCO

"Y

CH-

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Aus der EP-PS 12710 ist der nachfolgende Stand derTechnik bekannt:

Während die chemische Reduktion der 15-Ketogruppen in Prostagiandinen und Prostagiandin-Zwischenprodukten zum Beispiel mit Natriumborhydrid nur über Gemische der entsprechenden 15a- und 15/3-Hydroxyverbindungen und wegen der sich anschließenden Trennung nur unter Ausbeuteverlusten zu den gewünschten 15a-Hydroxyprostaglandinen führt, sind durch die US-PS 3687811 eine Reihe von Mikroorganismen bekannt, die die 15-Ketogruppe in 11-Hydroxy-15-oxo-prostaglandinen je nach bereits vorhandener Konformation der 11-Hydroxygruppe in die entsprechende trans-15-Hydroxygruppe umwandeln. Mit dem Verfahren aus der DE-OS 23 57 815 verfügt der Stand der Technik über eine mikrobiologische Methode, die zum Beispiel ein 11-Hydroxy-15-oxo-prostaglandin in ein Gemisch aus 11a, 15a-, und 11 ß, 15/3-Dihydroxy-prostaglandin umwandelt. Die cis-Anordnung der 1 f a, 15a-Hydroxygruppen entspricht derjenigen in biologisch aktiven Prostagiandinen. Die in der DE-OS 2401761 beschriebene Methode versagt ebenso wie alle genannten Verfahren. Die in der EP-PS 12710 genannten Stämme Kloeckera, Saccharomycesund Hansenula reduzieren die 15-Ketogruppe in Prostacyclin-Zwischenprodukten nur teilweise und die Ausbeuten an Prostacyclin-Zwischenprodukten mit 15«-Hydroxygruppe sind sehr schlecht.

Ziel der Erfindung

Zielder Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten mikrobiologischen Verfahrens zur enantioselektiven Reduktion der 15-Ketofunktion in bicyclischen Prostacyclin-Zwischenprodukten zu den entsprechenden 15a-Hydroxy-Verbindungen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Mikroorganismenstämme für eine mikrobiologische Reduktion aufzufinden.

Erfindungsgemäß wird die mikrobiologische Reduktion an den vorstehend aufgeführten prostacyclin-Zwischenprodukten mit folgenden Mikroorganismen-Stämmen durchgeführt:

Candida solani (NCYC41), Candida guilliermondii (NRRL-y-118) und Pichia farinosa (CBS 185). Besonders bewährt hat sich von diesen Stämmen der Stamm Candida solani.

Bei Verwendung von Candida- oder Pichia-Stämmen lassen sich die oben genannten Prostacyclin-Zwischenstufen in sehr guten Ausbeuten enantioselektivzu den entsprechenden 15a-Hydroxy-Verbindungen reduzieren.

Aus den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten 15a-Hydroxyverbindungen lassen sich unter Erhaltung des Asymmetriezentrums in 15-Position pharmakologisch wirksame Prostacycline herstellen. Beispielsweise gelangt man von (1S, 2S, 4R, 5R)-7,7—Ethylendioxy—3— benzoyloxy—2—[(1E),(4RS)-4—methyl— 3—oxo—oct— 1— en— 6—in—yl]—bicyclo[3.3.0]octan (1_) ausgehend in einer mehrstufigen Synthese zum

Wirkstoff Iloprost (beschrieben in EP 11591) ~

OH

OH

OTHP

OTHP

COOH

COOH

OTHP

OTHP

OH

ÖH

Unter den verschiedenen Arten der angegebenen Klassen von Mikroorganismen treten naturgemäß Unterschiede der Wirksamkeit in der erfindungsgemäßen Reduktion auf. Candida solani (NCYC41), Candida guilliermondii (NRRL-y-118) und Pichiafarinosa (CBS 185), liegen gute Ergebnisse vor, wobei Reduktionen mit dem Stamm Candida solani (NCYC41) besonders gute Ausbeuten ergeben.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zurenantioselektiven Reduktion der 15-Ketogruppe in bicyclischen Prostaglandin-Zwischenprodukten zu 15a-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel

B Il

A-CH-R, ÖH

OR,

worin X Sauerstoff oder eine CH„-Gruppe,

A eine trans -CH=CH- oder -C^C-Gruppe, B Sauerstoff, die Reste ο ο oder

oder den ^ mit R₃ in der Bedeutung einer C.-C^-Alky!gruppe, Wasserstoff, Tetrahydropyranyl, Benzoyl, tert.-Butyldimethylgilyl oder tert.-Butyldiphenylgilyl und

R_ die Reste

CH-

CH.

oder CH

bedeuten,

dadurch gekennzeichnet, daß man ein Keton der allgemeinen Formel I B

(II),

A-C-FL

IK ²

worin A, B, X, R₁ und R₂ die oben angegebene Bedeutung haben, mit Candida- oder Pichia-Stämmen behandelt und das dabei entstehende 1 ö-Hydroxy-Prostaglandin-Zwischenprodukt isoliert.

Unter Ci-C^AIkyl werden Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl und tert.-Butyl verstanden.

Besonders vorteilhaft arbeitet das Verfahren, wenn R₁ in Verbindungen der Formel Il Benzoyl bedeutet.

Je nach der letztlich gewünschten Bedeutung von R₁ können die Schutzgruppen nach an sich bekannten Methoden abgespalten werden.

Zunächst werden unter den für die genannten Mikroorganismen überlicherweise verwendeten Kulturbedingungen in einem geeigneten Mährmedium und unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Forrri'oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starkerTurbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispie!

Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin"", Tagat^(RI und Span^IF" beispielsweise genannt.

Oft ermöglicht die Emulgierung der Substrate einen erhöhten Substratdurchsatz und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren andere Methoden zur Steigerung des Substratdurchsatzes, wie sie dem Fermentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Umwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Die Stämme Candida solani (NCYC.41) und Pichiafarinosa (CBS 185) wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter den Nummern DSM 3315 und DSM 3316 am 21.5.1985 hinterlegt.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Ein 2-l-Erlenmeyerkolben, der 500ml einer 30 Min. bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung, bestehend aus 1,5% Glucose-Monohydrat, 0,5% Yeast-Extract (Difco), 0,5% Corn steep liquor und 0,5% Ammoniumsulfat, pH auf 6,3 eingestellt, enthält, wird mit einer Schrägarkultur des Stammes Candida solani (NCYC41) beimpft und 2¹Λ Tage auf einem Rotationsschüttler bei 30°C geschüttelt.

Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur wird ein 20-l-Vorfermenter beimpft, der.mit 151 eines 30 Min. bei 121⁰C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie die Anzuchtskultur beschickt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 25°C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 1/Min.) und Rühren (220 U/Min.) 36 Stunden germiniert.

Danach werden 0,91 dieser Vorfermenterkultur unter sterilen Bedingungen entnommen und damit ein 20-l-Hauptfermenter beimpft, der 101 sterilisierte Nährlösung dergleichen Zusammensetzung wie die Vorfermenterkultur enthält. Nach einer Anwachsphase von 6 Stunden unter Vorfermenterbedingungen wird eine sterilisierte Lösung von 4g (1 S, 2S, 3R, 5R)-7,7-Ethylendioxy-3-benzoyloxy-2-[(1E), (4RS)-4-methyl-3-oxo-ocM-en-6-in-yl]-bicyclo[3.3.0]octan gelöst in 100 ml Dimethylformamid, zugegeben und weiter gerührt und belüftet.

Nach 90 Stünden Kontaktzeit ist die Umsetzung beendet. Die Kulturbrühe wird 3mal mit Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte vereinigt und i.V. zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wird in Methanol aufgenommen, von Siiiconöl abfiltriert und wieder zur Trockne eingedampft. Das hinterbliebene ölige Rohprodukt wird in Methylenchlorid gelöst und zur weiteren Reinigung über eine Kieselgelsäule mittels eines Lösungsmittelgradienten 51 Hexan/4I Hexan + 11 Aceton chromatographiert.

Manerhälthierbei2,75greines(iS,2S,3R,5R)-7,7-Ethylendioxy-3-benzoyloxy-2-[(1E), (3S,4RS)-3-hydroxy-4-methyl-oct-1-en-6-in-yl]-bicyclo[3.3.0]octan in Form eines farblosen Öls.

Beispiel 2

Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird zur gewünschten Ketoreduktion der Stamm Candida guilliermondii (NRRL-y-118) verwendet.

Beispiel 3

Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird zur gewünschten Ketoreduktion der Stamm Pichiafarinosa (CBS 185) verwendet.

Beispiel 4

Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird die Verbindung 3_mit Hilfe des Stammes Candida solani (NCYC41)azur entsprechenden 15a-Hydroxyverbindung reduziert.

Beispiel 5

Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird die Verbindung 5_ mit Hilfe des Stammes Candida solani (NCYC41)zur entsprechenden 15a-Hydroxyverbindung reduziert.

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von IBa-Hydroxy-Prostaglandin-Zwischenprodukten derallgemeinen Formel

   A-GH-R₂
   OH

   OR₁

   worin

   X Sauerstoff oder eine GH₂-Gruppe, A eine trans-GH=GH- oder -C = C-Gruppej

   B Sauerstoff, dfe Reste 0 0 oder 6 0

   GOOR., \ ' .

   ₍ 1 3

   oder den 1 mit R₇ in der Bedeutung einer

   NGH ^J

   G-,-G^-Alky !gruppe,

   R₁ Wasserstoff, Tetrahydropyranyl, Benzoyl, tert.-Butyldimethylsilyl oder tert.-Butyl-diphenylsilyl und

   die Reste GH₀ GH^ oder

   ' I

   bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Keton der allgemeinen Formel I

   (II),

   - A - C - R₀

   OR,

   worin A, B, X, Ri und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit Candida- oder Pichia-Stämmen behandelt und das dabei entstehende 15-Hydroxy-Prostaglandin-Zwischenprodukt isoliert.