DD241917A5 - Verwendung permanent züchtbaren menschlichen oder tierischen Zellinie - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer permanent zuechtbaren menschlichen oder tierischen Zellinie. Ziel der Erfindung ist es, Nachteile bekannter Verfahren zu vermeiden und Moeglichkeiten aufzufinden, beliebige tierische und menschliche Zellen in Kultur zu nehmen und davon gewuenschte Zellprodukte herzustellen. Erfindungsgemaess werden permanent zuechtbare menschliche oder tierische Zellinien, die durch Fusion normaler tierischer und humaner Zellen mit alleine nicht vermehrungsfaehigen Zellfragmenten transformierter Zellen und Zuechtung in einem Kulturmedium ohne Selektionssubstanzen hergestellt wurden, zur Gewinnung von homologen und/oder heterologen Zellprodukten wie monoklonalen Antikoerpern, Gerinnungsfaktoren und Lymphokinen oder zur Pruefung von Wirksubstanzen eingesetzt.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von permanent züchtbaren tierischen und humanen Zellinien zur Gewinnung von Zellprodukten. Seit langem bemüht man sich, sowohl aus wissenschaftlichen als auch aus praktischen Gründen, menschliche und tierische Zellen unabhängig vom normalen tierischen oder menschlichen Gewebe, permanent zu züchten. Bisher ist dies nicht befriedigend gelungen und nur in wenigen Sonderfällen konnte eine permanente Züchtbarkeit bei bestimmten Blutzellen erzielt werden.
Es ist bekannt, zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit definierter Antigen-Bindungsspezifität die sogenannte Hybridoma-Technik anzuwenden. Mit diesem von Köhler und Milstein (Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256,495-497 [1975]) entwickelten Verfahren kann eine einzelne. Antikörper (AK) bildende Zelle potentiell „unsterblich" gemacht und beliebig vermehrt werden. Durch Fusion der AK-bildenden Zellen (B-Lymphocyt) mit einer maligne entarteten Zelle (Myelom) können Zellhybride geschaffen werden, die die Eigenschaften beider Elternteile in sich vereinen: Die Fähigkeit, Antikörper zu produzieren und die Fähigkeit zu permanentem Wachstum. Das neue Wort „Hybridoma" wurde durch Fusion von Hybrid-Zelle und Myeloma gebildet
Bei der Hybridoma-Verwendung treten nun folgende Probleme auf:
1. Chromosomen-Verluste
Nach einer erfolgreichen Fusion muß die neu entstandene Hybridzelle mit etwa der doppelten, von der Natur ursprünglich vorgesehenen Chromosomen-Menge fertig werden. Wie die praktische Erfahrung gezeigt hat, neigen Hybridzellen dazu, Chromosomen zu „verlieren". Bei jeder Zellteilung besteht bei der unphysiologischen Übermenge von Chromosomen die Gefahr, daß diese nicht gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen verteilt werden. Die Tochterzelle, die weniger von dem Übermaß abbekommt und deshalb nicht mit Luxusproduktionen aufgehalten wird, hat gegenüber der anderen einen Selektionsvorteil und wird zur dominierenden Zelle in der Kultur. Die Synthese von Immunglobulin ist aber für die Lebensfähigkeit der Hybridzelle nicht essentiell, sondern stellt eine „Luxus"-Synthese-Leistung dar. Das Erscheinen von Non-Producer-Varianten in einem Hybridoma-Klon ist deshalb ein häufiges Ereignis und erfordert aufwendige Re-Klonierungsmaßnahmen, um die Produktionsfähigkeit eines Klons zu sichern. Die Tendenz, Chromosomen zu verlieren, ist besonders extrem bei Inter-Spezies-Hybriden vorhanden.
2. Hybride Immunglobuline
Myelom-Zellen sind maligne B-Zellen und bilden selbst Immunglobuline (mit bekannter Antigen-Bindungsspezifität). Diese Fähigkeit bringt die Myelomzelle wie die normale B-ZeIIe in das Hybridoma mit ein.
Da die verschiedenen Ketten des Ig-Moleküls getrennt synthetisiert und erst nachträglich zu kompletten Antikörpern zusammengesetzt werden, entstehen in einer Hybridoma-Zelle, in der die zwei verschiedenen L- und Η-Ketten synthetisiert werden, zufallsbedingt 10 verschiedene Kombinationen, von denen der gesuchte „richtige" Antikörper nur Vi6 der Gesamt-Ig-Menge ausmacht. Deshalb sind mit großem Aufwand bereits Maus-Myelom-Zell-Mutanten entwickelt worden, die selbst keine H- oder L-Ketten bilden. Für die Fusion von menschlichen Lymphocyten steht aber bislang noch keine ähnlich weit entwickelte Myelom-Linie zur Verfügung.
Nach gravierendere Probleme liegen vor bei den Alternativen zur Hydridoma-Technik:
1. Immortalisierung von B-Lymphocyten durch Viren
Menschliche B-Lymphocyten von normalen Spendern können durch Infektion mit Epstein-Barr-Virus (EBV) maligne transformiert werden. Die EBV-infizierten, lymphoblastoiden Zellen können kontinuierlich in vitro kultiviert und kloniert werden. Im Vergleich mit Hybridoma produzieren EBV-Iymphoblasoide Linien jedoch nur Vio oder weniger an Immunglobulinen bei unzufriedener Produktionsstabilität. Man nimmt an, daß B-Zellen in einem frühen Differenzierungssstadium durch EBV fixiert werden und deshalb überproportional häufig Klone erhalten werden, die IgM in sehr geringen Mengen produzieren.
In analoger Weise können Maus-B-Lymphocyten durch den Abelson-Mäuse-Leukämie-Virus (MuLV) transformiert werden.
Auch hier werden die Lymphocyten ungünstigerweise in einem frühen Differenzierungsstadium fixiert und sind schlechte
Antikörper-Produzenten
2. Langzeitkulturen von nicht-transformierten B-Lymphocyten
Neueste Veröffentlichungen (Spredni, B. et al.: Long-term culture and cloning of nontransformed human B-lymphocytes.
J.Exp. Med. 154,1500-1516(1981), Howard, M. et al.: Long-therm culture of normale mouse B-lymphocytes. Proc. Natl.Acad.
Sei. USA in press) zeigen die Möglichkeit auf, B-Lymphocyten ohne Transformierung durch spezielle Kulturbedingungen (permanente mitogene Stimulierung; Lymphokin-konditionierte Medien etc.) permanent zur kultivieren und zu klonieren. Für eine routinemäßige Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind diese Verfahren derzeit mit Sicherheit noch nicht geeignet.
Der Stand der Technik kann daher zusammenfassend wie folgt beschrieben werden:
B-Lymphocyten von normalen Spendern können artifiziell „immortalisiert" werden. Die Hybridoma-Technik verwendet lebende, in Kultur unbegrenzt vermehrungsfähige Myelom-Zellen, die mit Antigen-stimulierten B-Lymphocyten fusioniert werden. Die durch Zell-Zell-Fusion geschaffenen Hybridzellen werden durch HAT-Selektion isoliert und durch Anlagen von fiinzelzell-Kulturen kloniert. Hybridoma-Klone, die Antikörper mit der gesuchten Spezifität bilden, werden für die Massenproduktion von monoklonalem Antikörper vermehrt. Erhebliche Nachteile ergeben sich jedoch aus der HAT-Selektion, durch Chromosomen-Verluste und hybride Immunglobuline.
In einem anderen Verfahren werden B-Lymphocyten durch Infektion mit speziellen Viren maligne transformiert und in permanent wachsende Zellen umgewandelt, unter Erhalt der Antikörper-Synthese. Sie sind aber notorisch schwache Antikörper-Produzenten.
In Hinsicht auf Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern mit definierter Antigen-Bindungsspezifität ist daher die Hybridoma-Technik den alternativen Verfahren derzeit eindeutig überlegen.
Aber auch die Hybridoma-Technik hat schwerwiegende Nachteile. Der wichtigste Nachteil besteht darin, daß das Verfahren einerseits auf HAT-sensitive Fusionspartner, andererseits auf wenige Zellarten, nämlich Lymphocyten und Nervenzellen beschränkt ist.
Es ist das Ziel der Erfindung, die Nachteile der bekannten Verfahren zu vermeiden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Möglichkeiten aufzufinden beliebige tierische und menschliche Zellen in Kultur zu nehmen und davon gewünschte Zellprodukte herzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch die Verwendung von permanent züchtbaren tierischen und humanen Zellinien, die durch Fusion von normalen tierischen und humanen Zellen mit alleine nicht vermehrungsfähigen Zellfragmenten transformierter Zellen und Züchtung in einem Kulturmedium ohne Selektionssubstanzen erhalten wurden, zur Gewinnung von homologen und/oder heterologen Zellprodukten wie monoklonalen Antikörpern, Gerinnungsfaktoren und Lymphokinen oder zur Prüfung von Wirksubstanzen.
Das Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäß verwendeten Zellinien ist im DDR-Patent (Anmeldung Nr. APC 12 N/
250509) detailliert beschrieben und wird daher hier nicht näher erläutert.
Es stellte sich heraus, daß nicht nur B-Lymphocyten sondern auch alle anderen bisher untersuchten tierischen und menschlichen Zellen sich nach diesem Verfahren „immortalisieren" lassen. Es konnten so unterschiedliche Zelltypen wie T-Lymphocyten (Träger der zeilvermittelten Immunität und Regulatorzellen des Immmunsystems), Endothelzellen (Wandzellen aus menschlichen Nabelschnurvenen) und Melanomzellen (aus krypopräserviertem Tumormetastasenmaterial isoliert) in permanentes Wachstum überführt (immortalisiert) werden.
Damit macht es die Erfindung möglich, beliebige tierische und menschliche Zellen in Kultur zu nehmen und auf diese Weise Zellprodukte wie z. B. Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Enzyme und sonstige, von der Zelle synthetisierte Substanzen in vitro herzustellen. Ebenso machen es die erfindungsgemäß verwendeten Kulturen möglich, in erheblichem Umfange Versuchstiere für die Prüfung chemischer Substanzen entbehrlich zu machen.
Insbesondere kann man erfindungsgemäß permanent züchtbare B-Lymphocyten zur Herstellung monoklonaler Antkörper, permanent züchtbare Endothel-Zellen, Meloanomzellen, Hepatozyten, Nierenzellen und dergleichen zur Gewinnung von Gerinnungsfaktoren, permanent züchtbare T-Lymphocyten + B-Lymphocyten oder/und Makrophagen zur Gewinnung von Lymhokinen, permanent züchtbare Drüsenzellen zur Gewinnung der von den Drüsen sezemierten Produkte wie Hormone und dergleichen verwenden. Man erkennt, daß je nach der Art der für die Immortalisierung verwendeten tierischen Zellen alle interessierenden Zellprodukte gewonnen werden können, so daß es nicht erforderlich erscheint, diese hier detailliert aufzuführen.
Die Gewinnung von Zellprodukten ist jedoch nicht auf die Produkte der Ausgangszellen, also homologe Zellprodukte, beschränkt. Die erfindungsgemäß verwendeten, permanent züchtbaren Zellinien können auch zur Expression von Zellprodukten verwendet werden, die von den Ausgangszellen nicht gebildet werden, also heterolog sind und deren genetische Information erst nach den Methoden der Genneukombination in die bereits permanente Hybridzelle eingebracht wird, die also heterolog sind. Die Herstellung heterologer Zellprodukte durch die permanente Hybridzelle kann z.B. durch Transformation bewirkt werden. So haben Versuche gezeigt, daß in die permanente Zelle gemäß der Erfindung mit Hilfe eines Vektors DNA eingeführt werden kann und somit zur Expression der durch die eingeführte DNA codierten Produkte verwendet werden kann. Erfindungsgemäß können die permanent züchtbaren Zellen darüberhinaus wie erwähnt auch als Prüfobjekte für Wirksubstanzen verwendet werden. Ferner können sie auch als Quelle für die genetische Information, welche die Expression gewünschter Zellprodukte codiert, verwendet werden, derart, daß man den die genetische Information tragenden Bestandteil der Hybridzelle,
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also ihr Genom, Teile des Genoms oder RNA gewinnt und nach den Methoden der Genneukombination in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert und das gewünschte Zellprodukt aus letzterem gewinnt.
Gemäß einer Abwandlung der erfindungsgemäßen Verwendung kann daher die Herstellung der Zellprodukte wie der monoklonalen Antikörper und anderer zellulärer Substanzen, ausch so erfolgen, daß die gebildeten Hybridzellen nicht direkt f die Zellproduktbildung bzw. Substanzsynthese gezüchtet, sondern ihr Genom oder Teile des Genoms oder RNA nach den Methoden der Genneukombination in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert und letzterer zur Gewinnung des monoklonalen Antikörpers oder der zellulären Substanzen gezüchtet wird. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung isoliert man das Genom der Hybridzellen nach den dem Fachmann hierfür bekannten Methoden und transformiert es mit Hilfe eines geeigneten Vektors, wozu die handelsüblichen Vektoren verwendet werden können, nach den hierfür entwickelten Standardmethoden in einen geeigneten Mikroorganismus.
Der transformierte Mikroorganismus wird dann in üblicherweise gezüchtet und das gewüschte Zellprodukt aus ihm gewonnen Als Mikroorganismus wird vorzugsweise einer der für die Genneukombination bewährten E. coli-Stämme verwendet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Dabei werden folgende Abkürzungen und Warenbezeichnungen verwendet:
AK
H- bzw. L-Kette Pristan HAT-Selektionsmedium TK HGPRT EBV MuLV CB DMSO DMEM
FKS *
Ficoll PEG PBS POD ABTS EBSS RPM11640 Tris PBL MNC hTSH ß-hTSH FA CFA IFA MethocoM500 CMV FITC-Covaspheres
EAZ
Antikörper
Immunglobulin
„Schwer"- bzw. „Leichf'-Proteinkette von Ig-Molekülen 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan Kulturmedium enthaltend Hypoxanthin,Aminopterin,Thymidin Thymindin-Kinase
Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase Epstein-Barr-Virus
Abelson-Mäuse-Leukämmie-Virus Cytochalasin B Antibioticum (ALDRICH BIOCHEMICALS Milwaukee USA) Dimethylsulfoxid
Dulbecco's Minimal Essential Medium Fetales Kälberserum
polymerer Rohrzucker (PHARMACIA) Polyäthylenglycol
phosphate buffered saline Peroxidase
Ammoniumsalz von 2,2'-azino-di(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid) Earle's Balanced Salt Solution Rosewell Park Memory Institut (Medium) Tris(hydroximethyl)aminomethan periphere Blut-Lymphozyten MononucleäreZellenlLymphocyte^Monocyten) Humanes Thyreoidea-stimulierendes Hormon ß-Kettedes...
Freund'schesAdjuvans komplettes Freund'sches Adjuvans inkomplettes Freund'sches Adjuvans Methylcellulose (FLUKA) Cytoplasma-Membran-Vesikel Fluoreszeinisothiocyanatin Kugelform (COVALE NT TECH NIGALS Ann Arbor, Mich. USA)
Ehrlich-Aszites-Zellen (ATCC; CCL 77)
A Herstellung von Karyoplasten und Cytoplasten aus Maus-Myelomzellen der Linie P3X63 Ag 8.653 ATCC No-CRL-1580 (analog der in Wigler, M. H. and Weinstein, I. B.: A preparative method for obtaining enucleated mammalian cells. Biocher Biophys. Res. Comm. 63,669-674 [1975] beschriebenen Methode).
A.1 Material Cytochalasin B wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, Merck) gelöst (2 mg/ml) und als Stammlösung bei 40C gelage Ficoll-400 (Pharmacia; polymerer Rohrzucker) wurde in redestilliertem Wasser gelöst (1 g/ml), autoklaviert und als 50%ige Stammlösung bei -20°Cgelagert.
Einfach- und doppelkonzentriertes Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), Fetales Kälberserum (FKS), L-Glutamin (200 mmol/1), Streptomycin-Penicillin von Boehringer Mannheim. Cellulose-Nitratröhrchen wurden durch UV-Bestrahlung sterilisiert.
Meyelomzell-Linie Ag 8 653 ATCC CRL-1580: Die Linie ist in Kearney, J. F. et al.: A new mouse myeloma cell line that hat los immunoglobulin expression but permits the construction of antibodysecreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979) beschrieben. Sie ist Azaguinin-resistent, HAT-sensitiv und synthetisiert weder H- noch L-Ig-Ketten. Sie wird in DMEM + 15% FKS + Glutamin + Penicillin-Streptomycin + Pyruvat (= DMEM-Vollmedium) bei 37 °C in 7 % CO2-Atmosphäre gehalten.
A.2 Methoden Enukleierung: 8 χ 107 Ag 8653-Zellen wurden 5 min bei 103 UpM zentrifugiert und in 12 ml einer 12,5%igen Ficoll-DMEM-CB-DMSO-Lösung so lange resuspendiert, bis eine Zellklumpen-freie Suspension hergestellt war. Je 3 ml der Zellsuspension wurden auf 4,12 Stunden vorher präparierte Ficoll-Gradienten, geschichtet und mit 2 ml Ficoll-freier DMEM-CB-DMSO-Lösung überschichtet. Die Röhrchen mit den Gradienten wurden in einer Ultrazentrifuge 60 Minuten lang bei 25 000 UpM (310C) zentrifugiert.
Nach Beendigung der Zentrifugation wurden die makroskopischen sichtbaren Fraktionen („Banden") mit Hilfe einer Injektionsspritze mit langer Kanüle von oben her getrennt gesammelt, in je 20 ml Kulturmedium (DMEM ohne Zusätze) verdünnt, durch Zentrifugation sedimentiert und in frischem DMEM resuspendiert
Folgende 4 Fraktionen wurden erhalten:
a) Zell-Debris(anderGrenzezwischen0und12,5%Ficoll),
b) kernlose Cytoplasten im Bereich von 15 bis 16 %Ficoll),
c) Kerne ohne erkennbaren Plasmasaum und ca. 2 % kernlose „Zellen" an der Grenze zwischen 17 und 25 % Ficoll,
d) kemhaltige, nach morphologischen Kriterien intakte Zellen mit gut erkennbarem Plasmasaum und wenige Kerne ohne Plansmasaum als Sediment auf dem Röhrchenboden.
Die Zellzählung ergab, daß von den 8 χ 107 Ag 8653-Zellen in b) 1,25 x 106 Cytoplasten, in c) 4 χ 106 Karyoplasten und in d) 1,1 χ 107 mutmaßlich intakte Zellen enthalten waren.
B Fusion von Maus-Milz-Zellen mit isolierten Myelom-Karyoplasten, -Cytoplasten und -Sedimentzellen aus Versuch A.
B.1 Material
Fusionsmittel: 20 g Polyethylenglycol (PEG-4000) wurden im Autoklaven geschmolzen, auf 56°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 20 ml vermischt.
HAT-Selektionsmedium:zuDMEM-Vollmedium wurden Aminopterin(4x 10~7M),Thymidin(1 x 10"4M)und Hypoxanthin (3,1 x 10~5) gegeben.
B.2 Methoden
Fusionen: Die im Versuch A präparierten Fraktionen b), c) und d) wurden in getrennten Ansätzen mit Milzzellen im Verhältnis 10:1 vermischt und durch
Zentrifugieren sedimentiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig entfernt. Zu dem Sediment wurden 0,8 ml 50%ige PEG-Lösung (bei 37 °C, gleichmäßig über 1 Minute verteilt, unterständigem, sanften Schütteln) und dann 5 ml DMEM (bei Raumtemperatur, gleichmäßig über 5 Minuten) gegeben. Nach Zugabe von weiteren 20 ml DMEM wurden die Zellen sedimentiert, in frischem DMEM-Vollmedium (5 ml) resuspendiert, und auf je 10, mit „feedercells" beschichtete 24er Costa-Tüpfel Gewebskulturgefäße verteilt. Die Einzelkulturen wurden am Tag 1,2,3,5,7,10,13 mit DMEM-Vollmedium „gefüttert".
Feeder-cells [(Bauchhöhlen-Makrophagen): Am Tag vor der Fusion wurden Inzuchtmäuse (Balb/c) durch Streckung getötet. Unter sterilen Bedingungen wurden 4 bis 5 ml PBS in die Bauchhöhle gespritzt und nach 1 Minute wieder abgesaugt. Die ausgespülten Zellen wurden in DMEM gewaschen, in Vollmedium auf eine Dichte von 2 χ 106 Zellen pro ml auspendiert und in 0,5 ml-Portionen auf 24er Costar-Tüpfel verteilt.
Milzzellen: Einer Balb/c-Maus wurde unmittelbar vor Fusion unter aspetischen Bedingungen die Milz extirpiert und deren Zellen in DMEM suspendiert. Zellaggregate und Gewebsstücke wurden mit Mullgaze abfiltriert.
Elisa auf Maus-Immunoglobulin: Mikrotiterplatten wurden mit Maus-Ig-Antikörpern vom Scharf (IgG-Fraktionen: 10jug/ml 0,9%ige NaCI-Lösung; 150 μ\ Antikörper-Lösung pro Tüpfel) beschichtet. Je 100 μ\ Kulturüberstand wurden in die beschichteten Tüpfel pipettiert und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Überstände und zweimaligem Waschen wurden die Tüpfel mit 100 /xlanti-Maus-lg-POD-Konjugat-Lösung (gleicher Antikörper wie oben; kovalent verbunden mit Meerettich-Peroxidase) beschickt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkübiert. Nach dreimaligen Waschen wurden pro Tüpfel 100 μ,Ι Substrat-Lösung (ABTS) pipettiert und die Farbentwicklung photometrisch bestimmt.
B.3 Ergebnisse
Die gemäß A präparierten Cytoplast-, Karyoplast- und Sediment-Fraktionen wurden parallel mit Milzzellen einer BaIb/ c-SMaus fusioniert und auf je 101-ml-Kulturen verteilt. Je 5 der Teilkulturen wurden ohne (Platte I) und je 5 mit HAT-Zusatz (Platte II) gefüttert.
Bis zum Tag 21 nach Fusion (n. F.) war in keinem derTüpfel Wachstum von lymphoiden Zellen makroskopisch oder mikroskopisch nachweisbar, mit Ausnahme derTüpfel 4A,4B,4C,3Cund3Dauf Platte I, die das Fusionat der Sedimentfraktion ohneHAT-Medium enthielten. In diesen Tüpfeln waren bereits 5Tage nach Fusion (n. F.) Kolonien erkennbar, die sich rapide vergrößerten. Am Tag 8 n. F. wurde in diese Tüpfel HAT-Medium gegeben: innerhalb von 4Tagen waren daraufhin alle sichtbaren Kolonien abgestorben.
Ab Tag 27 n. F. wurden zunächst vereinzelt, dann in nahezu allen Tüpfeln Kolonien sichtbar, die aus großen, kugeligen, transparenten, nicht-adhärentwachsenden Zellen bestanden. Am Tag 65 n. F. waren mit Ausnahme von I-3 B, 11-1 A, II-4 A alle Tüpfel mit multiplen Kolonien von lymphoiden Zellen besetzt. Die Prüfung der Kulturüberstände auf Gehalt an Maus-Ig an diesem Tag ergab, wie die Zusammenstellung in Tabelle 1 zeigte, positive bis stark positive Werte im ELISA in allen Teilkulturen mit Ausnahme der obengenannten koloniefreien Tüpfel:
ELISA zum Nachweis von Maus-Immunglobulin in den Kulturüberständen des Versuchs B (Tag 65 nach Fusion)
Tüpfel-KulturplatteI: ohne HAT (Ausnahmen: 4 A, 4 B,4 C, 3 C, 3 D:+ HAT, Tag 8 bis 15)
- 5 - Ζ4Ί Sl
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 664 | 601 | 706 | 632 | ||
| B | 526 | 766 | Oil | 633 | ||
| C | 576 | 769 | 855 | 623 | ||
| O | 794 | 150C | 791 |
t f t3
1 = Cytoplasten-Fusionat
2 = Karyoplasten-Fusionat
3 = Sedimentzellen-Fusionat
Tüpfel-Kulturplatte II: mit HAT (Tag Ibis 14)
| 1 , 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | . 6 " | |
| A | 008 | 568 | 580 | 000 | ||
| B | 267 | 538 | 539 | 547 | ||
| C | 656 | 530 | 729 | 822 | ||
| D | 848 | 570 | 605 |
t T f
negativ-Ktr.1(DMEM-Vollmedium):-010 negativ-Ktr. 2 (DMEM, ohne FKS): · positiv-Ktr. 1 (Mausserum 1 x 10~3): -723 positiv-Ktr. 2 (Mausserum 1 χ 10~2): > 1
a) Die Fusion von Karyoplasten mit Maus-Milz-Zellen führte zu in vitro vermehrbaren, Immunglobulinsezernierenden Zellen. Obwohl nur ein kleiner Teil des Cytoplasmas des malignen Partners in das Hybrid eingebracht wurde, kam es nicht zu der möglichen Extinktion des Merkmals „permanentes Wachstum".
b) Die mit Karyoplasten erzeugten Hybridzellen synthetisierten und sezernierten Maus-Immunglobulin in „Hybridoma"-Quantitäten. Das Fehlen des Cytoplasma-Anteils der Ag 8653 beeinträchtigte demnach die Produktions- und Sekretionsfähigkeit der Karyoplast-Milzzell-Hybride nicht.
c) aus der Fusion von Cytoplasten mit Milzzellen gingen ebenfalls Zeilklone hervor, die in vitro proliferierten und Antikörper sezernierten. Eine befriedigende Erklärung ist für dieses besonders überraschende Phänomen z. Z. nicht zu geben.
Zellfragmentierung mittels Glycerin-Lyse und Fusion mit humanen Blut-Lymphocyten Material
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), Kulturmedium APM11640, Fetales Kälberserum (FKS), 8-Azaguanin (8-Ag), Agar (Bacto-Agar 1614). Die humane Plasmacytom-Linie HS SULTAN ATCC CRL-1484 wurde als kryopräserviertes Zellmaterial nach ATCC-Vorschrift aufgetaucht und in Kultur genommmen.
Nachdem Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 71,2676-2683(1974) beschriebenen Verfahren wurden 8 χ 107HS Sultan-Zellen in 100ml RPMI 1640-Vollmedium, das20^.M 8-Ag enthielt, 48 Stunden lang kultiviert. Die überlebenden Zellen wurden in 10ml RPMI 1640-Vollmedium ohne 8-Ag aufgenommen und über 10 Tage vermehrt. Die Zellen wurden sodann auf Soft-Agar-Platten (COFFINO, P. et al: Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 68,219-223 [1971]), die mit RPMI 1640-Vollmedium + 20μΜ 8-Ag hergestellt worden waren, ausgesät (ca. 500 Zellen pro Petrischale) und im C02-Inkubator bebrütet. Nach 9 Tagen wurden isoliert wachsende Kolonien steril von der Agaroberfläche entnommen und in RPMI 1640-Vollmedium + 8-Ag vermehrt. Ein Klon (als HS-SULTAn-8 Ag-R 1 bezeichnet), der mit einer Verdopplungszeit von ca. 20 Stunden wuchs, wurde für den folgenden Versuch verwendet. Die HS-R 1-Zellen waren HAT-sensitiv: Zellen, die in einer Dichte von 1 bis 5 χ 105pro ml HAT-Medium (RPMI 1640-Vollmedium mit 0,1 mM Hypoxanthin, 40OnM Aminopterin, 31 μΓηΤηγηιΐαίη) kultiviert wurden, vermehrten sich nicht und starben innerhalb von 7 Tagen vollständig ab.
Humane Lymphocyten (aus dem peripheren Blut: PBL): 300ml Venenblut wurden steril in Heparin-Lösung (2U/ml Blut) gesammelt und die Fraktion der mononukleären Zellen (MNC: Lymphocyten, Monocyten) mit Standard-Methoden isoliert. 3 χ 108MNCwurden in 100ml RPM11640 x 10%FKSsuspendiertundzur Abtrennung der Monocyten 24 h in Kulturgefäßen bei 370C in 5% CO2-Atmosphäre inkubiert
Methoden
Fragmentierung von HS-R1: Die Zellen wurden nach (Jett, M. et al.: Isolation and characterization of plasma membranes and intact nuclei from lymphoid cells. J. Biol. Chem. 252,2134-2142 [1977])mit Glycerin beladen und durch Inkubation in 1OmM Tris-HCL-Pufferlysiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation mit 200 g (10 Minuten, 4°C) von den Membranvesikeln abgetrennt, die ihrerseits durch Zentrifugation bei 5000g (40 Minuten, 40C) sedimentiert wurden.
Fusion Ca. 1 x 108729 HS-R 1-Kerne wurden mit Human-Lymphocytsn in RPM11640 im Verhältnis 1:1 suspendiert und, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, mittels PEG fusioniert.
Das Sediment von Membranvesikeln aus etwa 1 x 108HS-R1-Zellen wurde mit einer Suspension von 1 χ 107Human-Lymphocyten überschichtet und mittels PEG fusioniert.
In einem Kontrollansatz wurden ca. 2 χ 107 HS-R1-Kerne in RPMI 1640-Vollmedium (ohne HAT) aufgenommen und in 4 24er Costar-Tüpfeln im CO2-lnkubatorin Kultur genommen.
Alle Fusionate und die Kontroll-Kultur wurden auf Maus-Bauchhöhlen-Makrophagen wie in Beispiel 1 beschrieben, als feedercells kultiviert.
Nachweis von Human-Ig in Kulturüberständen: Mikrotiter-ELISAwiein Beispiel 1, B.2 beschrieben. Zur Beschichtung wurde immunadsorptiv gereinigtes anti-human-lg vom Schaf verwandt. Die gleiche AK-Präparation wurde zur Herstellung des antihuman- Ig-POD-Konjugats verwandt. Der Schaf-Ak reagierte mit allen menschlichen Ig-Klassen und zeigte keine Kreuzreaktivität mit bovinem oder murinem Ig
Ergebnisse
Fragmentierung durch Glycerin-Tris-HCI-Lyse: Die Behandlung zerlegte HS-R1-Zellen in eine kemhaltige Fraktion, die bei 200g sedimentierte und in eine kernlose Cytoplasma-Membran-Vesikel-Fraktion, die bei 5000g sedimentierbarwar. Unter dem Mikroskop waren in keiner der beiden Fraktionen intakte HS-R 1-Zellen erkennbar. Die Kernewaren mit mehr oder weniger, unregelmäßig begrenzten Cytoplasma-Fetzen umgeben. Die Auszählung ergab eine Kern-Ausbeute von 85%. Die Vesikel-Fraktion enthielt neben wenigen Debris massenhaft 0,5 bis 2 μπι große Vesikel ohne erkennbare Kernbestandteile. Die Kultur von 2 χ 107 Kernen in RPMI-Vollmedium (ohne HAT) führte in einem Beobachtungszeitraum von 12 Wochen zu keinem Wachstum von HS-R1-Zellen.
Kultur der Fusionate: Die Kern-Lymphocyten-und Cytoplasma-Vesikel-Lymphocyten-Fusionate wurden auf 96 bzw. 10 24er Costar-Tüpfel verteilt und je zur Hälfte mit und ohne HAT-Zusatz in RPMI-Vollmedium auf Maus-Makrophagen kultiviert. Ab der zweiten Woche nach Fusion wurden Kolonien von lymphoiden Zellen sichtbar, die kontinuierlich an Größe zunahmen. Produktion von humanem Immunglobulin: Am Tag 21 nach Fusion wurden Kulturüberstände (am Tag 19 war ein kompletter Medium-Wechsel vorgenommen worden) auf Gehalt an menschlichem Immunglobulin geprüft. Die Ergebnisse zeigen die Tabellen 2a und 2b.
Tabelle 2 a .
ELISA zum Nachweis von Human-Immunglobulin in Kulturüberständen (Karyoplasten-Fusion,21 Tage nach Fusion).
I + HAT
I - HAT
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | A | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 029 | 147 | 286 | 147 | 228 | 270 | B | 660 | 233 | 175 | 270 | 410 | 322 |
| B | 171 | 086 | 050 | 144 | 846 | 121 | C | 103 | 264 | 229 | 253 | 271 | 260 |
| C | 118 | 156 | 250 | 082 | 179 | 059 | D | 045 | 343 | 370 | 128 | 150 | 126 |
| D | 120 | 1148 | 024 | 096 | 023 | 151 | 171 | 173 | 141 | 116 | 218 | 699 | |
II + HAT
II - HAT
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | A | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 135 | 290 | 107 | 279 | 530 | 674 | B | 381 | 235 | 489 | 514 | 608 | 217 |
| B | 116 | 500 | 469 | 315 | 315 | 627 | C | 348 | 239 | 214 | 158 | 367 | 163 |
| C | 120 | 050 | 068 | 159 | 226 | 145 | D | 185 | 275 | 235 | 234 | 322 | 316 |
| D | 191 | 078 | 686 | 110 | 242 | 561 | 219 | 202 | 292 | 283 | 220 | 052 | |
Cytoplasten-Fusion, 21 Tage nach Fusion.
| Ί | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 052 | 627 | 917 | |||
| B | 041 | 326 * | 715 | |||
| c- | 071 | 400 | 826 | 0889 | ||
| D | 079 | 917 | 494 | 1016 |
1 = Kern-Kontroll-Kultur
2 = mit HAT.
3 = ohne HAT
Setzt man die Extinktionswerte von 0 bis 99 als negativbiszweifelhaft, die Werte von 100 bis 200 als positiv, die Werte >200 als stark positiv an, dann ergißt sich für die durch Kernfusion erzeugten Kulturen folgende Verteilung:
| Kern-Lymphoeyten- | η | ELISA auf | Human-Immunglobulin | stark positiv |
| Hybride, kultiviert | 19 | |||
| (%) | negativ | positiv | ||
| η | 11 | 18 | ( 40) | |
| mit HAT | 34 | |||
| (n = 48) | /Ο/Λ Κ/ο) | (23) | (37). | |
| 2 | 12 | (71) | ||
| ohne HAT | ||||
| (n = 48) | (4) | (25) | ||
Die Ergebnisse lassen folgendes erkennen:
Fusionate, die mit Lyse-Fraktionen hergestellt werden, können ohne HAT-Selektion kultiviert werden. Das Verfahren ist sehr viel weniger arbeitsaufwendig als die Cytochalasin-B-Extrusion und liefert fusionsfähiges Material in hoher Ausbeute. Eine klare Auftrennung in „Kern-" und „Cytoplasma-Membran"-Fraktionen wird mit keinem der beiden Verfahren erreicht. Sowohl die überwiegend Kern-Material enthaltende wie die überwiegend Cytoplasma-Membran-Vesikel enthaltende Fraktion erzeugt nach Fusion mit menschlichen Lymphocyten aus dem Blut in vitro vermehrungsfähige, AK-produzierende Zell-Klone. Der Parallel-Ansatz der Kern-Lymphocyten-Hybride mit und ohne HAT-Zusatz dokumentiert die negativen Auswirkungen des Selektionsmediums: Mit HAT sind 23% der Primärkulturen Ig-negativ und nur 40% stark positiv; ohne HAT sind über 70% stark positiv und nur 4% Ig-negativ.
Fusion von Milzzellen einer immunisierten Maus mit negativen und fragmentierten Myelomzellen Ag 8653 Material
Humanes Thyreoidea-stimulierendes Hormon (htSH) und desen isolierte ß-Kette (ß-hTSH), Komplettes und Inkomplettes Freund'sches Adjuvans (CFA, IFA), Methocel 1500, und FITC-Covaspheres
Methoden
Immunisierung: Balb/c-Mäuse wurden mit ßhTSH (40μς in CFA, intraperitoneal) primär immunsisiert (Tag 1), und am Tag 196 mit hTSH (50 μg in IFA, i. p.), am Tag 266 mit hTSH ohne Adjuvans i. p. sowie am Tag 294 mit hTSH intravenös „geboostert". Milzzellen (ca. 1 χ 10~) wurden von einer der immunisierten Mäuse 3 Tage nach der letzten Booster-Immunisierung, wie in Beispiel 1,B.2 beschrieben, gewonnen und je zur Hälfte für zwei Fusionen verwandt.
Fusion1:5 x 107 Milzzellen und 1 x 107Ag 8653-Zellen wurden vermischt, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, fusioniert und in 48 24er Tüpfel mit Maus-Makrophagen-Zellen in HAT-haltigem DMEM-Vollmedium kultiviert.
Fusion 2:1 χ 107Ag 8653-Zellen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben, durch schrittweise Behandlung mit Glycerin und 1OmM Tris-HCI-Puffer lysiert. Die Cytoplasma-Membran-Vesikel-(CMV-)Fraktion wurde pelletiert (5000g, 40 Minuten, 4°C). Die Kern-Fraktion wurde mit 7 x 107 Milzzellen vermischt, durch Zentrifugation auf das CMV-Sediment geschichtet und mittels PEG nach dem Standardverfahren, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, fusioniert. Das Fusionat wurde im DMEM-Vollmedium auf 24 24er Costar-Tüpfeln mit Makrophagen erteilt und ohne HAT-Zusätze kultiviert.
Antigenspezifische Markierungen von Hybridzellen und Klonierung: (FITC-) Covaspheres wurden nach der allgemeinen Vorschrift des Herstellers mit hTSH kovalent beschichtet (TSH-CS) und in 5o/oo Natriumazid-Lösung gelagert. Nach dem in PARKS, D. R. et al.: Proc, Natl. Acad. Sei. USA 76,1982-1966 (1979) beschriebenen Verfahren wurden die Zellen mit den beschichteten Covaspheres markiert und mit Hilfe eines Cytofluorographen große, Fluoreszenz-positive Zellen einzeln in Tüpfel und 96er Costar-Platten „abgelegt". Die Tüpfel waren 24 Stunden zuvor mit Maus-Makrophagen in DMEM-Vollmedium beschichtet worden.
ELISAfürTSH-spezifische Antikörper: Beschichtung, Inkubation der Kulturüberstände, Substrat-Reaktion und Ablesung wie in Beispiel 1, B.2, beschrieben. Anstelle von anti-Maus-lg-POD wurde TSH-POD-Konjugat verwendet. Als positive Kontrolle wurde Serum einer hTSH-hyperimmunisierten Maus, 10~3 verdünnt, eingesetzt; als Negativ-Kontrolle diente ein Klon, welcher Antikörper gegen ein nichtverwandtes Antigen bildete (Maus-anti-Digoxin)
Ergebnisse
Sowohl in den Kulturen aus Fusion 1 (mit intakten Ag 8653-Zellen) als auch denen aus Fusion 2 (mit Ag 8653-Lyse-Fragmenten) waren am Tag 14 in allen Tüpfeln Kolonien von großen, lymphoiden Zellen erkennbar. Der mit Kulturüberständen vom Tag 14 durchgeführte ELISAzum Nachweis von TSH-spezifisGhen Antikörpern ergab die inTabelle 3 zusammengefaßten Werte: In allen Teilkulturen wurde anti-TSH nachgewiesen.
a)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | A | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 235 | 236 | 212 | 149 | 119 | 212 | B | 271 | 268 | 267 | 286 | 194 | 291 |
| B | 109 | 221 | 119 | 104 | 176 | 068 | C | 288 | 278 | 362 | 317 | 280 | 305 |
| C | 116 | 108 | 135 | 139 | 093 | 135 | D | 207 | 292 | 252 | 226 | 292 | 271 |
| 171 | 128 | 120 | 228 | 137 | 145 | 295 | 376 | 370 | 338 | 310 | 333 | ||
Negativ-Kontrolle (DMEM-Vollmedium): 000 Positiv-Kontrolle (Anti-TSH-Masserum): 362
ELISAzum Nachweis von Anti-TSH in Kulturüberständen am Tag 14 nach Fusion, a) Fusion 1 (intakte Ag 8653), b) Fusion 2 (Ag 653-Fragmente) ^
Am Tag 15 wurden die nicht-adhärenten Zellen aus den Einzel-Tüpfeln von Fusion 1 und 2 herausgespült und in getrennten Ansätzen TSH-Antigen-spezifisch markiert (Grundlage: Hybridoma tragen in der Regel wie B-Lymphocyten einen Teil der von ihnen synthetisierten Antikörpermoleküle in der Zellmembran verankert, mit „nach außen" gerichteten Antigen-Bindungsstellen) und mit Hilfe des Zellsorters kloniert.
Fusion von Humanen PBL mit intakten und mit fragmentierten Ag 8653-Zellen.
Material
Inaktiviertes Hepatitis-B-Surface-Antigen (HB''; Biotest) wurde durch Immunadsorption von Serumproteinen gereinigt. ELISA zum Nachweis von humanen HBS-Antikörpern: Mikrotiter-Platten wurden mit gereinigtem HBsi(20^g/ml0,9%ige NaCI-Lösung) beschichtet. Inkubation der Kulturüberstände, Konjugat- und Substrat-Reaktion sowie Ablesung wie im Beispiel 1. B.2 beschrieben. Anstelle von Anti-Maus-Ig-POD wurde (Schaf-)Anti-Human-lg-POD verwendet.
HPBL von einem Spender mit hohem anti-HBs-Titer wurden aus 200 ml Venenblut durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation isoliert. Zur Anreicherung der B-Lymphocyten wurden die T-Zellen mit Schaferythrocyten (nach Standardverfahren) rosettiert und mittels einer zweiten Ficoll-Gradienten-Zentrifugation abgetrennt. Die Fraktion der nicht-rosettierenden Zellen [HPBL(B)] wurden in einer Dichte von 5 x 107 Zellen in RPM11640 + 10%autologem Plasma (30min/56°C-hitzeinaktiviert) mit ca. 1^g HBsi im CO2-!nkubator kultiviert (Mediumwechsel alle 12 Stunden).
Fusion"!: 1 χ 107 der vorbehandelten HPBL(B) wurden mit 1rx 107 Ag 8653 vermischt und, wie in Beispiel 1, B.2 beschrieben, mittels PEG fusioniert. Das Fusionat wurde in RPM11640 + 10% Humanplasma + HAT in 4 24er Costar-Tüpfeln kultiviert.
Fusion 2:1,1 χ 108Ag 8653-Zellen wurden mittels Glycerin-Lyse fragmentiert. 1 χ 107Ag 8653-Kerne wurden mit 1 χ 107 HPBL(B) vermischt und auf das Sediment von Membran-Cytoplasma-Vesikeln (aus 1 χ 108Ag 8653-Zellen) geschichtet. Nach Fusion mit PEG wurde das Fusionat in 4 24er Costar-Tüpfeln in RPM11640 + 10% Humanplasma (ohne HAT-Zusatz) kultiviert.
Ergebnisse .
In allen Tüpfeln von Fusion 1 und 2 trat abTag 3 starkes Wachstum von sehr großen, adhärenten Zellen auf. Am Tag 5 wurde die Hauptmasse der nicht-adhärenten Zellen vorsichtig suspendiert und auf zwei neue 24er Costar-Tüpfel verteilt (z. B. A1, B1 und C1). Am Tag 28 in Fusion 1: kleine Kolonien in A2 und A3, in den restlichen Tüpfeln nur adhärente Zellen; in Fusion 2: massives Wachstum multipler Kolonien in allen Tüpfeln mit Ausnahme von C3. Der mit Kulturüberständen vom Tag 35 durchgeführte ELISA zum Nachweis von humanen Immunglobulinen mit Spezifität gegen Hepatitis-B-Antigen ergab das in Tabelle 4 zusammengefaßte Ergebnis: die Fusion 1 (intakte Ag 8653-Zellen, Kultur in HAT-Medium) lieferte keine positive Kultur; dagegen waren 5 von 12 Kulturen der Fusion 2 (Ag 8653-Fragmente, Kultur in Normal-Medium) eindeutig Anti-HBs-positiv.
a)
| 1 | 2 | 3 | 4 | A | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| A | 000 | 000 | 000 | 000 | B | 010 | 000 | 189 | 553 |
| B | 0OO | 001 | Oll | 000 | C | 000 | 003 | 198 | 032 |
| C | 005 | 000 | 000 | 004 | 000 | 173 • | 000 | 107 | |
Negativ-Kontrolle (Anti-HBs-neg. Humanserum): 000 Positiv-Kontrolle (Anti-HBs-pos. Humanserum): 185
ELISAzum Nachweis von Human-Anti-HBS in Kulturüberständen am Tag 35 nach Fusion, a) Fusion 1 (intakte Ag 8653), b) Fusion 2 (Ag 8653-Fragmente).
Einführung eines eukaryontischen DNA-Vektors in immortalisierte menschliche Endothel-Zellen.
5.1. Nachweis von transfiziertem Material in den Zellen durch Abklatschen (Southern blotting) von Hirt-Überständen.
5.1.1. Material
Plasmid Z-pBR 322/Rchrß-A425B (Dierks, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,1411-1415 [1981]) enthält ein 2070 Basenpaare (Bp) Kaninchen-ß-globin-Genfragment.
Das Cla-Pvu I-Fragment von pBR322 wurde durch ein 3039 Bp Hpal-Bam H 1 -Fragment ersetzt, welches die gesamte Region der frühen Gene und den Anfang der Region der späten Gene von SV40 enthält (Tooze, J. [1980], in „DNATumor Viruses", J.Tooze, ed., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory und B. Wieringa et al., Cetus-UCLA Symposium on Gene regulation 1982). Dieses Plasmid wird im folgenden als pBR322 RßG SV40 bezeichnet.
5.1.2. Methoden
Menschliche Endothelzellen wurden, wie im Beispiel 7 beschrieben, immortalisiert und wachsen gelassen. Je 106 Zellen wurden Γηϊί6μ9 pBR322RßG SV 40 und mit4Mg mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus DNA transfiziert unter Anwendung der Kalziumphosphatfällungsmethode (Graham, F. L. et al., Virology 52,456-467 [1973] und Wigler, M. et al., Cell 14,725-731 [1978]). 10 Stunden und 40 Stunden nach derTransfektion wurden Hirt-Überstände hergestellt (Hirt, B., J.Mol. Biol. 26,365-169 [1967]). Die Hirt-Überstände wurden auf einem 1%igen Agarosegel getrennt und nach der Methode von Southern (Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 [1975]) auf Nitrocellulosepapier übertragen. Plasmid pBR322 RßG SV40 wurde mit32p unter Anwendung der Nick-Translationsmethode von Rigby, P.W. et al., J. Mol. Biol. 113,237-251 [1977]) markiert und mit der übertragenden DNA auf den Nitrocellulosefiltern hybridisiert wie beschrieben bei Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Der Filter wurde auf Röntgenfilm bei-70°C belichtet.
5.1.3. Ergebnisse
Menschliche Endothelzellen, die mit Plasmid pBR322 RßG SV 40 transfiziert wurden, ergeben ein starkes Hybridisierungssignal, welches dem authentischen Plasmid entspricht hinsichtlich seiner Mobilität auf Agarosegel. Ein Vergleich der Signale der Hirt-Überstände der Zellen 40 Stunden nach derTransfektion mit denen der Zellen 10 Stunden nach derTransfektion ergab eine vier- bis fünffache Steigerung der Intensität des Hybridisierungssignals.
Eine Hybridisierung an DNA-Spezies, die kleiner sind als das eingebrachte Plasmid wurde ebenfalls beobachtet. Diese Signale waren in nicht transfizierten immortalisierten menschlichen Endothelzellen nicht feststellbar.
Die gleiche Intensitätsverteilung der Hybridisierungssignale wurde beobachtet, wenn HeLa-Zellen mit Plasmid pBR322 RßG SV40 transfiziert wurden.
5.1.4. Beurteilung
Die Tatsache, daß in den Hirt-Überständen menschlicher immortalisierter Epithelzellen, die mit Plasmid pBR322 RßG SV40 transfiziert worden waren, eine DNA-Hybridisierung an 32P-markiertem eingebrachten Plasmid festgestellt wurde, jedoch nicht bei nichttransfizierten Zellen, ist ein Beweis dafür, daß der Vektor in die eukaryontische Zellinie eingeführt wurde. Die Beobachtung, daß das Hybridisierungssignal bei transfizierten Zellen 40 Stunden nach derTransfektion vier- bis fünffach stärkere Intensität aufwies als bei Zellen 10 Stunden nach derTransfektion, läßt die Schlußfolgerung zu, daß das transfizierte Plasmid in den Zellen repliziert wurde.
5.2. Nachweis von Kaninchen-ß-globin spezifischen Transcripten in immortalisierten menschlichen Endothelzellen, die mit Plasmid pBR322 RßG SV40 transfiziert wurden.
5.2.1. Material
Als Nuklease S1, T4 Polynukleotidkinase und Kälberdarmphosphatase wurden handelsüblichen Präparate verwendet.
5.2.2. Methoden
Immortalisierte menschliche Epithelzellen wurden wie in 5.1.2. beschrieben, vermehrt und mit dem das Kaninchen-ß-globin-Gen enthaltenden Vektor transfiziert. 48 Stunden nach derTransfektion wurden 1 bis 2 χ 106 Zellen lysiertund die RNA nach der LiCI-Hamstoff-Methode (Auffray, C. et al., Eur. J. Biochem. 107,303-314 [1980]) extrahiert. Herstellung einer Kaninchen-ß-globin spezifischen Hybridisierungssonde.
Plasmid pBR322 RßG SV40 wurde mit Hae III abgebaut und das sich von +135 bis —75 erstreckende Fragmente (Dierks, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,1411-1415 [1981]) und Van Oyen, A. et al., Science 206,337-344 (1981) wurde auf einem 2%igen Agarosegel isoliert und durch DEAE-Cellulose-Chromatographie weiter gereinigt (Müller, W. et. al., J. Mol. Biol. 124,343-358 [1978]). Das Fragment wurde mit Kälberdarmphosphatase und 32P-dephosphoriliert und mit γ-32-Ρ-ΑΤΡ und T4 Polynukleotidkinase markiert wie beschrieben in (Mantei, N. et al., Gene 10,1-8 [1980]). Nuklease Si Kartierung
Das mit der Kinase behandelte Fragment wurde zusammen mit 10pg E. colit-RNA durch Äthanol gefällt und in 100μΙ 0,4M/1 NaCI, 1 mM/1 EDTA, 40mM/1 Pipes-Puffer, pH6,4 und 80% Formamid gelöst (Mantei, N. et al., Nature 281,40-46 [1979]). Die cellulareRNA(= 25Mg) wurde vakuumgetrocknet, in 10μΙ Sonde (0,01 pMol^OOOOcpm) in Puffer, wie oben beschrieben gelöst, denaturiert, in Glaskapillare eingeschmolzen und 16 Stunden bei48°C hybridisiert. In einem Kontrollversuch wurde die Sonde mit Kaninchen-ß-globin m-RNA (Miles) hybridisiert. Die Probe wurde mit 100 μΙ 0,2 M/1 NaCI, 50 mM/1 Natriumacetatpuffer pH4,5,1 mM/1 ZnSO4 und 0,5% Glycerin verdünnt und mit 50 Einheiten Nuklease Si 60 Minuten bei 3O0C inkubiert (Weaver, R. et al., Nucl. Acid Res. 7,1175-1193 [1979]).
Die Proben wurden mit Phenol behandelt, zusammen mit 10Mg E. coli t-RNA durch Äthanol gefällt, mit 80%igem Äthanol gewaschen (20 Minuten bei —700C), vakuumgetrocknet, in 5μΙ Färbelösung gelöst (0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylolxyanol, 1 mM/1 EDTA, 90% V/V Formamid), 2 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt und der Elektrophorese auf 5% Polyacrylamidgel (89mM/1 Trisbase, 89mM/1 Borsäure, 1 mM/1 EDTA und 7 M/1 Harnstoff) unterworfen. Das Gel wurde mit Röntgenfilm und einem Verstärkerschirm bei -700C autoradiographiert.
5.2.3. Ergebnisse
Die Größe der geschützten Fragmente konnte durch Vergleich mit Größenmarkern (32P-markiertes pBR 322 χ Hinf 1 und pBR322 x Haelll) beurteilt werden. Nicht transfizierte Zellen ergaben keinerlei globinspezifische Hybridisierungssignale (ausgenommen renaturierte Hybridisierungssonde = 21 OBP). Aus den transfizierten immortalisierten menschlichen Epithelzellen extrahierte RNA schützte zwei Fragmente, deren Größe mit 80 bis 90 Bp bestimmt wurde. Derartige Transkripte wurden auch durch Grosveld et al.. Nature 295,120-126(1982) und Weidle, U. et al., Nature (1981) gefunden und werden dem Vorhandensein einer internen cryptischen Spleißstelle auf dem Kaninchen-ß-globin-Gen zugeschrieben. Transcripte, die von dercap-Stelledes Kaninchen-ß-globin-Gens stammen, konnten nicht festgestellt werden. In einem Vergleichsversuch wurden HeLa-Zellen mit Plasmid pBR322 RßG SV40transfiziert. Korrekt iniziierte Transcripte (135Bp geschützt) sowie Transcripte, die auf das Vorhandensein einer internen cryptischen Pleißstelle zurückgeführt werden (Grosveld, G. et al., Nature 295,120-126 [1982] und Weidle, U. et al., Nature [1983]) wurden durch SrKartierung festgestellt.
5.2.4. Beurteilung
Die Tatsache, daß Kaninchen-ß-globin spezifische Transcripte in immortalisierten menschlichen Epithelzellen feststellbar sind, welche mit einem von SV40 stammenden eukaryotischen Vektor, der das Kaninchen-ß-globin-Gen enthält, transfiziert wurden, zeigt, daß sich diese Zellinie als Wirtsystem für die Expression von wieder eingeführten geklonten Genen eignet.
Claims (2)
1. Verwendung einer permanent züchtbaren menschlichen oder tierischen Zellinie, die durch Fusion normaler tierischer und humaner Zellen mit alleine nicht vermehrungsfähigen Zellfragmenten transformierter Zellen und Züchtung in einem Kulturmedium ohne Selektionssubstanzen hergestellt wurde, gekennzeichnet dadurch, daß sie zur Gewinnung von homologen oder/und heterologen Zellprodukten wie monoklonalen Antikörpern, Gerinnungsfaktoren und Lymphokinen oder zur Prüfung von Wirksubstanzen eingesetzt werden.
2. Abänderung der Verwendung nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man aus den Hybridzellen der hergestellten Zellinien die Gene oder die Messenger-RNAfür das gewünschte Zellprodukt gewinnt und mit Hilfe eines geeigneten Vektors in einem Mikroorganismus, insbesondere E.coli, transformiert und das Zellprodukt aus dem transformatierten Mikroorganismus gewinnt.
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