DD234879A1 - Verfahren zur herstellung von streptomyces klonierungsvektoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein genetisch-biochemisches Verfahren zur Herstellung von neuen Streptomyces-Klonierungsvektoren. Sie verfolgt das Ziel, neue Streptomyces-Klonierungsvektoren bereitzustellen, darunter solche, welche neue isogene Kopiezahlabkoemmlinge, die eine Variation der Gendosage ermoeglichen, sind. Diese Aufgabe wird in der Weise geloest, dass in jeweils einem BamHI-Ort von pMG200 bzw. einem seiner isogenen Abkoemmlinge ein BclI-Fragment, welches die Resistenzdeterminanten gegenueber Thiostrepton und Viomycin enthaelt und vom Streptomyces-Plasmid pIJ364 gewonnen wurde, insertiert wird. Mit Hilfe des Verfahrens sind u. a. die neuen Streptomyces-Klonierungsvektoren pMG2120, pMG304, pMG311, pMG312 und pMG315 gewonnen worden.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Streptomyces-Klonierungsvektoren.

Die Erfindung bietet Anwendungsmöglichkeiten in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit in der Veterinär- und Humanmedizin, in der Pflanzen- und Tierproduktion, in der Nahrungsmittelerzeugung und in der pharmazeutischen Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt ist aus der Patentschrift DD 209 475, welche ein Verfahren zur Herstellung eines Streptomyces-Plasmids zum inhalt hat, das Plasmid pMG200. Dieses Plasmid besitzt neben bestimmten Vorteilen (geringes Molekulargewicht, spezifische Kombination von Restriktase-Spaltorten und niedrige Kopiezahl) die Nachteile,

a) die Kopiezahl nicht verändern zu können und

b) keine selektierbaren Marker zu tragen (kryptisches Plasmid).

Weiterhin wurde bereits ein Verfahren zur Gewinnung von isogenen Streptomyces-Plasmiden vorgeschlagen. Dieses Verfahren ließ sich auch auf Plasmid pMG200 anwenden, und es entstanden dabei verfahrensgemäß die als pJv1G210 und pMG220 bezeichneten isogenen Plasmide. Das Plasmid pMG210 (bzw. das Plasmid pMG220) ist charakterisiert durch eine Kopiezahl-Erhöhung auf 10 bis 30 Kopien (bzw. 100 bis 300 Kopien) pro Wirtsgenom. Auf diese Weise konnte ein ursprünglicher Nachteil von Plasmid pMG200 überwunden werden

Die gegenwärtig bekannten Streptomyces-Vektoren sind zweckmäßig nach folgenden Merkmalen charakterisierbar:

- Wirtsbereich; d. h. Anzahl der Wirtsorganismen, in denen sie stabil vererbt und ausgeprägt werden,

- Kopiezahl; d. h. Anzahl der Plasmidgenome pro Chromosomenäquivalent,

- Molekulargewicht oder Größe; d. h. Anzahl der Basenpaare seiner DNS.

Der von T. Kieser et al. (Mol. Gen. Genet., 185 [1982] 223-228) beschriebene Streptomyces-KIonierungsvektor plJ364, welcher die Gene für die Viomycinphosphotransferase aus S. vinaceus, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Viomycin verleiht, und für die ribosomale Methylase von S. azureus, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton verleiht, trägt, ist beispielsweise ein Plasmid mit geringem Molekulargewicht und weitem Wirtsbereich.

Nachteilig ist zu diesem Plasmid jedoch zu vermerken, daß es ausschließlich nur mit hoher Kopiezahl (80 bis 300 Kopien je Chromosomenäquivalent) vermehrt werden kann. Diese Tatsache birgt Probleme bei der Klonierung, da in einer Transformantenzelle die verschiedensten rekombinanten Klone gleichzeitig, da miteinander kompatibel, existieren können. Zudem ist für die Klonierung von Sekundärstoffwechselmarkern bzw. Teilen von Biosynthesewegen der Einfluß der Genamplifikation nicht überschaubar.

International fehlt bisher also ein Streptomyces-KIonierungsvektor, der neben geringem Molekulargewicht und weitem Wirtsbereich die Möglichkeit der definiert variierbaren Kopiezahl bietet, d. h. für den isogene Plasmide mit unterschiedlicher Kopiezahl erzeugt werden können.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat zum Ziel, neue Streptomyces-Klonierungsvektoren bereitzustellen, darunter solche, von denen als Basisvektoren jeweils neue isogene Kopiezahlabkömmlinge, die eine Variation der Gendosage ermöglichen, gewonnen werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe neue Streptomyces-Klonierungsvektoren erzeugt werden können, darunter solche sogenannten Basisvektoren, aus denen jeweils neue isogene Kopiezahlderivate, die eine Variation der Gendosage ermöglichen, gewinnbar sind

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:

Aus den Stämmen Streptomyces chrysomallus 2, Streptomyces chrysomailus 2 (210) sowie Streptomyces chrysomallus 2 (220), hinterlegt in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, DDR -6900 Jena, Beutenbergstr. 11 unter den Registrier-Nummern ZIMET 43 686, ZIMET 43 763 und ZIMET 43 764, werden in an sich bekannter Weise die Plasmide pMG200 sowie pMG210 (Molekülgröße jeweils 6,9 kb) und pMG220 (Molekülgröße 5,3 kb) isoliert. Jedes dieser Plasmide besitzt drei Spaltorte für das Restriktionsenzym BamHI (vgl. Abbn. 1 und 2). Für die nachfolgenden Verfahrensschritte werden pMG200 und seine oben genannten isogenen Abkömmlinge partiell mit BamHI verdaut, d. h. so mit diesem Restriktionsenzym behandelt, daß etwa % der Moleküle in einem der drei Spaitorte linearisiert sind. Die erhaltenen BamHI-Fragmentgemische werden sodann in an sich bekannter Weise mit Bcil-erzeugten Fragmenten von Plasmid plJ364 verknüpft. Dieses literaturbekannte Plasmid verfügt über zwei Spaltorte für das Restriktionsenzym Bell, wovon der Ort BcII(I) in der Replikationsregion liegt, hingegen der Ort Bcll(2) den Verknüpfungspunkt (Fusionspunkt) von Plasmid und Thiostrepton-Resistenzdeterminante bezeichnet.

Für die nachfolgenden Verfahrensschritte werden von Plasmid plJ364 sowohl das in Bcll(2) linearisierte Molekül von 5,3 kb als auch das Bcll(A)-Fragment von 4 kb, in dem seinerseits zwei Orte für BamHI vorhanden sind, verwendet.

BamHI- und Bcll-gebildete DNS-Fragmente verfügen über identische kohäsive Enden, die zu reassoziieren vermögen. Unter Einsatz von T4-Ligase werden diese Fragmentgemische jeweils ligiert, d. h. kovalent verknüpft. Nach Transformation in den Rezipientenstamm Streptomyces noursei MK84 G2, der im Ergebnis der Anwendung des Verfahrens aus einer früheren Patentanmeldung vorliegt und unter der Registrier-Nummer ZIMET 43 760 in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11 hinterlegt ist, und nachfolgender Vermehrung dieser Transformanten werden auf an sich bekannte Weise folgende Rekombinationsprodukte isoliert:

- das neue Hybridpiasmid pMG2120 von 12,25 kb Molekülgröße, bestehend aus den vollständigen Plasmiden pMG200 und plJ364 (vgl. Abb. 3), wobei das Bcll-Iinearisierte plJ364-Molekül am ursprünglichen BamHI-Ort (14) in Plasmid pMG200 eingefügt ist.

- die neuen Plasmide pMG304, pMG311, pMG312, pMG315; diese sind Fusionsprodukte aus dem vollständigen Plasmid pMG200 und dem Bcil(A)-Fragment von plJ364 und haben jeweils eine Molekülgröße von 10,85 kb (vgl. Abbn. 4 bis 6), wobei aus den Abbildungen 4 bis 6 hervorgeht, in welchem BamHI-Ort von pMG200 das Bcll(A)-Fragment jeweils insertiert ist (pMG311 entsteht dabei durch Einbau dieses Bcll(A)-Fragments anstelle des BamHI(C)-Fragments in pMG200).

- die Plasmide der Serie pMG401, pMG402, pMG403 (Molekülgröße jeweils 10,85 kb) einerseits

- sowie der Serie pMG501, pMGS02 und pMG503 andererseits, welche jeweils eine Molekülgröße von 9,3 kb aufweisen. Bei ersteren handelt es sich um Rekombinanten aus pMG210 und dem Bcll(A)-Fragment von plJ364; bei letzteren um Rekombinanten von pMG220 mit dem Bcll(A)-Fragment von plJ364. Dabei ist in sonstiger Beziehung pMG401 (bzw. pMG402 oder pMG403) zu pMG304 (bzw. pMG311 oder pMG315) äquivalent, usw.

Jedes dieser Neuplasmide ist dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Resistenzmarker wie in plJ364 direkt nacheinander angeordnet sind.

Nach den im Zuge der Erarbeitung des Verfahrens gewonnenen vertieften Erkenntnisse über die BamHI-Orte-Verteilung im Ausgangsplasmid pMG200 (vgl. Abb. 1) wie in seinen isogenen Abkömmlingen pMG210 und pMG220 (vgl. Abb. 3) resultiert für nachstehende Neuplasmide folgender Zustand:

Im pMG200-Anteil von pMG312 bleiben die BamHI-Orte (17; 25) aktiv. Von pMG304 sind entsprechend die Orte (5; 24) sowie von pMG315 und pMG2120 die Orte (5; 6) spaltbar, bei Plasmid pMG311 entsprechend hingegen nur der Ort (25). Der Rezipientenstamm S. noursei MK84 G2 vermag bei 40 ,ug/ml Viomycin und 50 ,ug/ml Thiostrepton nicht zu wachsen. Nach Einführung eines jeden verfahrensgemäß erhaltenen neuen Rekombinantenplasmids werden die entstehenden Stämme jedoch befähigt, bei den angegebenen Konzentrationen noch zu wachsen. Das heißt, durch Expression der Resistenzdeterminanten werden den diese Plasmide enthaltenden Stämmen neue Eigenschaften verliehen. Die verfahrensgemäß erhaltenen neuen Rekombinantenplasmide weisen damit die Merkmale von Klonierungsvektoren auf.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Neuplasmide zeichnen sich im o. g. Rezipientenstamm durch stabile Vererbung sowie durch hohe strukturelle und funktioneile Stabilität aus.

Diese Klonierungsvektoren sind, wie weiterhin gefunden wurde, in eine größere Gruppe von Streptomyces-Stämmen, zu der wenigstens Stämme aus den Arten Streptomyces griseus Streptomyces noursei Streptomyces chrysomallus Streptomyces luteoiutescens Streptomyces lividans Streptomyces hygroscopicus gehören, transformierbar.

Folgende Stämme, die ausgewählte Vertreter der neuen Klonierungsvektoren enthalten, wurden als S. noursei MK84 G2 + pMG304 unter Registrier-Nummer ZlMET43 758 S. noursei MK84G2 +pMG312 unter Registrier-Nummer ZIMET 43 761 S. noursei MK84 G2 + pMG315 unter Registrier-Nummer ZlMET 43 759 S. noursei MK84 G2 + pMG2120 unter Registrier-Nummer ZIMET 43 762

in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11 hinterlegt

Aus der Erfindung ergeben sich folgende Vorteile:

- Erstmals liegen Streptomyces-Klonierungsvektoren vor, die auf der Basis von Plasmid pMG200 bzw. seiner isogenen Abkömmlinge entstanden sind und die damit den Vorzug bewahren, mit unterschiedlicher Kopiezahlregulation vermehrbar zu sein und folglich eine gezielte Genamplifikation zu ermöglichen.

- Mit den verfahrensgemäß erhaltenen neuen Streptomyces-Plasmiden liegen Klonierungsvektoren mit hoher funktioneller und struktureller Stabilität vor.

- Mit den verfahrensgemäß erhaltenen neuen Plasmiden liegen Klonierungsvektoren für eine größere Gruppe von Wirtsstämmen aus der Gattung Streptomyces, die auch industriell genutzte Streptomyces-Stämme umfaßt, vor.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

1 a) DNS des Plasmides pMG200 wird mit dem Restriktionsenzym BamHI so lange verdaut, bis der überwiegende Teil der Moleküle in nur einem der drei BamHI-Spaltorte geschnitten ist:

50 μΙ DNS (100 Mg/ml)

14 μΙ 5 x TM

2 μ! Triton

3 μΙ H₂O

1 μΙ BamHI (5 Ε/μς)

Nach Inkubation für 5 Minuten bei 37°C wird eine Probe des Reaktionsgemisches durch elektrophoretische Trennung auf den Grad der Verdauung getestet. Wenn etwa % der Ausgangsmenge linearisiert ist, wird die Probe durch Behandlung mit Phenol, Chloroform und Äther gereinigt. Wenn die Verdauung nicht ausreicht, werden weitere 5 Einheiten des Enzyms zugegeben und

1 b) Die DNS des Plasmides plJ364 wird mit dem Enzym Bell partiell verdaut: 20 μ! DNS (500 Mg/ml)

1 μΙ BcI (2 Ε/μΙ) Dieser Reaktionsansatz wird 5 Minuten bei 60 °C inkubiert und bei Erreichen von etwa Y₃ linearisierter Moleküle gereinigt und weiter verwendet.

1 c) Die Ligation der partiell BamHI-verdauten DNS von pMG200 mit der partiell Bcll-verdauten DNS von plJ364 erfolgt in folgendem Ansatz:

25 μΙ DNS von 1 a) 20 μΙ DNS von 1 b) 19μΙΗ₂Ο 5μΙΟΤΤ ΙΟμΙΑΤΡ 20 μΙ 5 x Ligations-Puffer 1 μΙ T4-Ligase (1 Ε/μΙ) durch Inkubation für 16 Stunden bei 15°C. Hierbei entsteht das neue Hybridplasmid pMG2120 nach Transformation in S. noursei MK84 G2.

Beispiel 2:

Wie im Beispiel 1, nur anstelle von 1 b) wird die DNS von plJ364 mit dem Enzym Bell vollständig verdaut, so daß 2 Fragmente BcII(A) und BcII(B) entstehen, wobei das Bcll(A)-Fragment die beiden Resistenzdeterminanten enthält: 20 μΙ DNS (500 μg/ml)

1 μΙ Bell (2 Ε/μΙ).

Die Inkubation erfolgt für eine Stunde bei 60°C.

Nach Transformation in S. noursei MK84 G2 entsteht das Plasmid pMG304, wenn das Bcll(A)-Fragment von plJ364 in der Orientierung (tsr; vph) im BamHI-Ort (6) (in Uhrzeigerrichtung) von pMG200 insertiert ist.

Beispiel 3: wie Beispiel 2, aber das Bcll(A)-Fragment von plJ364 wird in umgekehrter Richtung, (vph; tsr) eingebaut in den BamHI-Ort (5) von pMG200. Nach Transformation entsteht das rekombinante Plasmid pMG312.

Beispiel 4: wie Beispiel 3, der Einbau des Bcll(A)-Fragmentes von plJ364 erfolgt als Substitution für das BamHI-C-Fragment von pMG200. Nach Transformation entsteht das Neuplasmid pMG311.

Beipsiel 5: wie Beispiel 2, mit Einbau des Bcll(A)-Fragmentes von plJ364 im BamHI-Ort (14) von pMG200 in der Orientierung (vph; tsr). Nach Transformation entsteht der neue Klonierungsvektor pMG315. Zu den Abbildungen:

Abb. 1: Physische Karte des Ausgangsplasmids pMG200 Abb. 2: Physische Karte des zu pMG200 isogenen Ausgangsplasmids pMG220 Abb. 3: Physische Karte des neuen Hybridplasmids pMG2120 (12,25 kb) Abbn. 4 bis 6: Physische Karten der Neuplasmide pMG304, pMG315 und pMG312 (je 10,85 kb)

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Streptomyces-Klonierungsvektoren unter Nutzung von an sich bekannten Standardmethodiken der Gentechnologie, gekennzeichnet dadurch, daß

   - Plasmid pMG200 und/oder seine isogenen Abkömmlinge pMG210 und pMG220 mit dem Restriktionsenzym BamHI partiell verdaut,

   - diese BamHI-Fragmentgemische sodann mit Bcll-erzeugten Fragmenten von Plasmid plJ364 mit T4-Ligase verknüpft und

   - die dabei entstehenden neuen Streptomyces-KIonierungsvektoren
   PMG2120

   pMG304, pMG311, pMG312, pMG315

   pMG401, pMG402, pMG403 sowie

   pMG501, pMG502 und pMG503

   nach Transformation in den Rezepientenstamm Streptomyces noursei MK84 G2 und nachfolgender Vermehrung dieser Transformaten isoliert werden.